ES2342246B1 - Plantas transgenicas con alto rendimiento en peso seco y almidon cuyos organos de reserva presentan elevada textura, elevado contenido en almidon y elevado rendimiento en peso seco. - Google Patents
Plantas transgenicas con alto rendimiento en peso seco y almidon cuyos organos de reserva presentan elevada textura, elevado contenido en almidon y elevado rendimiento en peso seco. Download PDFInfo
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Abstract
Plantas transgénicas con alto rendimiento en
peso seco y almidón cuyos órganos de reserva presentan elevada
textura, elevado contenido en almidón y elevado rendimiento en peso
seco. La presente invención proporciona plantas transgénicas con
alto rendimiento en peso seco y almidón cuyos órganos de reserva
presentan elevada textura, elevado contenido en almidón y elevado
rendimiento en peso seco.
Description
Plantas transgénicas con alto rendimiento en
peso seco y almidón cuyos órganos de reserva presentan elevada
textura, elevado contenido en almidón y elevado rendimiento en peso
seco.
La presente invención puede englobarse dentro
del campo de la ingeniería genética y la fisiología vegetal.
Concretamente, la presente invención proporciona plantas
transgénicas con alto rendimiento en peso seco y almidón cuyos
órganos de reserva presentan elevada textura, elevado contenido en
almidón y elevado rendimiento en peso seco.
El almidón constituye la forma principal de
almacenamiento de carbohidratos en plantas. Se acumula en grandes
cantidades en órganos tales como semillas (trigo, cebada, maíz,
guisante, etc.) y tubérculos (patata y batata entre otros) y es un
constituyente fundamental de la dieta del ser humano. Por otro lado,
el almidón es utilizado frecuentemente en las industrias papeleras,
cosmética, farmacéutica y alimentaria, y también se utiliza como
componente fundamental para la fabricación de plásticos
biodegradables y pinturas de bajo impacto medioambiental. Además,
últimamente ha aumentado la demanda de plantas productoras de este
polímero como consecuencia del creciente uso del bioetanol,
obtenible a partir del almidón, como combustible. Constituidos por
moléculas de glucosa unidas covalentemente, el estudio de los
procesos implicados en la síntesis de este polisacárido constituye
un tema prioritario en diversos ámbitos de la producción
industrial.
El ADPG es el precursor universal de la
biosíntesis del almidón en plantas y está ampliamente asumido que su
producción está exclusivamente controlada por el enzima ADPG
pirofosforilasa (AGPasa) o ADPG sintasa (EC 2.7.7.27) (Okita, T. W.
(1992) Is there an alternative pathway for starch synthesis? Plant
Physiol. 100, 560-56; Müller-Röber,
B., Sonnewald, U. Willmitzer, L. (1992) Inhibition of the
ADP-glucose pyrophosphorylase in transgenic potatoes
leads to sugar-storing tubers and influences tuber
formation and expression of tuber storage protein genes. EMBO J. 11,
1229-1238; Stark, D.M., Timmerman, K.P., Barry,
G.F., Preiss, J., Kishore, G.M. (1992) Regulation of the amount of
starch in plant tissues by ADPglucose pyrophosphorylase. Science
258, 287-282; Neuhaus, E.H., Häusler, R.E.,
Sonnewald, U. (2005) No time to shift the paradigm on the metabolic
pathway to transitory starch in leaves. Trends Plant Sci. 10,
154-156). Las diferentes aplicaciones del almidón
producido en una planta están basadas principalmente en el balance
de amilosa y amilopectina, el cual determina la estructura del
gránulo de almidón, así como su viscosidad en suspensiones acuosas.
Tal proporción de amilosa y amilopectina depende, entre otras
razones, de la concentración de ADPG en la célula vegetal (Clarke,
B.R., Denyer, K., Jenner, C.F., Smith, A.M. (1999) The relationship
between the rate of starch synthesis, the adenosine
5'-diphosphoglucose concentration and the amylose
content of starch in developing pea embryos. Planta 209,
324-329).
La SS (EC 2.4.1.13, SS)
(UDP-glucose:D-fructose-2-glucosyl
transferase) es una enzima reversible que cataliza la producción de
UDPG y fructosa a partir de la sacarosa y UDP. Aunque, tal y como se
ilustra en la Fig. 1A, clásicamente se ha atribuido a la SS el papel
de producir el UDPG cuyo procesamiento metabólico dé lugar a la
producción eventual de almidón en tejidos heterotrófícos tales como
endospermos y tubérculos (Zrenner, R., Salanoubat, M., Willmitzer,
L., Sonnewald, U. (1995) Evidence for the crucial role of sucrose
synthase for sink strength using transgenic potato plants. Plant J.
7, 97-107; Baroja-Fernández, E.,
Muñoz, F.J., Saikusa, T., Rodríguez-López, M.,
Akazawa, T., Pozueta-Romero, J. (2003) Sucrose
synthase catalyzes the de novo production of ADPglucose linked to
starch biosynthesis in heterotrophic tissues of plants. Plant Cell
Physiol. 44, 500-509;
Pozueta-Romero, J., Muñoz, F.J.,
Rodríguez-López, M.,
Baroja-Fernández, E., Akazawa, T. (agosto 2003) New
waves in the starch field. Lett. Plant Cell Physiol.
24-32), existen referencias sobre la potencialidad
del enzima de utilizar in vitro otros nucleótidos difosfato
para la producción de los correspondientes
azúcares-nucleótido (Murata, T., Sugiyama, T.,
Minamikawa, T., Akazawa, T. (1966) Enzymic mechanism of starch
synthesis in ripening rice grains. Mechanism of the
sucrose-starch conversión. Arch. Biochem. Biophys.
113, 34-44; Delmer, D. P. (1972) The purification
and properties of sucrose synthase from etiolated Phaseolus
aureus seedlings. J. Biol. Chem. 247,
3822-3828;). Aunque de cuestionada relevancia
fisiológica (Okita, T. W. (1992) Is there an alternative pathway for
starch synthesis? Plant Physiol. 100, 560-56;
Müller-Röber, B., Sonnewald, U. Willmitzer, L.
(1992) Inhibition of the ADP-glucose
pyrophosphorylase in transgenic potatoes leads to
sugar-storing tubers and influences tuber formation
and expression of tuber storage protein genes. EMBO J. 11,
1229-1238), se ha sugerido que la SS está capacitada
para producir directamente ADPG utilizable para la producción de
almidón tanto en tejidos heterotróficos como tejidos
foto-sintéticos (Figs. 1B y 2B)
(Pozueta-Romero, J., Perata, P., Akazawa, T. (1999)
Sucrose-starch conversión in heterotrophic tissues
of plants. Crit. Rev. Plant Sci. 18, 489-525;
Baroja-Fernández, E., Muñoz, F.J., Akazawa, T.,
Pozueta-Romero, J. (2001) Reappraisal of the
currently prevailing model of starch biosynthesis in photosynthetic
tissues: a proposal involving the cytosolic production of
ADP-glucose by sucrose synthase and occurrence of
cyclic turnover of starch in the chloroplast. Plant Cell Physiol.
42, 1311-1320; Baroja-Fernández, E.,
Muñoz, F.J., Saikusa, T., Rodríguez-López, M.,
Akazawa, T., Pozueta-Romero, J. (2003) Sucrose
synthase catalyzes the de novo production of ADPglucose linked to
starch biosynthesis in heterotrophic tissues of plants. Plant Cell
Physiol. 44, 500-509;
Baroja-Fernández, E., Muñoz, F.J.,
Zandueta-Criado, A., Morán-Zorzano,
M.T., Viale, A.M., Alonso-Casajús, N.,
Pozueta-Romero, J. (2004) Most of ADPglucose linked
to starch biosynthesis occurs outside the chloroplast in source
leaves. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 13080-13085;
Muñoz, F.J., Baroja-Fernández, E.,
Morán-Zorzano, M.T., Viale, A.M., Etxeberria, E.,
Alonso-Casajús, N., Pozueta-Romero,
J. (2005) Sucrose synthase controls the intracellular levels of
ADPglucose linked to transitory starch biosynthesis in source
leaves. Plant Cell Physiol. 46, 1366-1376).
De acuerdo a esta hipótesis (basada única y circunstancialmente en
evidencias de tipo bioquímico), la SS sería responsable de la
síntesis de un pool importante de moléculas de ADPG necesarias para
la biosíntesis del almidón. Tal hipótesis sin embargo no ha sido
demostrada experimentalmente mediante ingeniería genética o técnicas
de mejora tradicional de cultivos, y no es consistente con las
innumerables pruebas de tipo genético y molecular que indican que la
AGPasa es la única fuente de ADPG en plantas (Okita, T. W. (1992) Is
there an alternative pathway for starch synthesis? Plant Physiol.
100, 560-56; Müller-Röber, B.,
Sonnewald, U. Willmitzer, L. (1992) Inhibition of the
ADP-glucose pyrophosphorylase in transgenic potatoes
leads to sugar-storing tubers and influences tuber
formation and expression of tuber storage protein genes. EMBO J. 11,
1229-1238; Neuhaus, E.H., Häusler, R.E., Sonnewald,
U. (2005) No time to shift the paradigm on the metabolic pathway to
transitory starch in leaves. Trends Plant Sci. en prensa).
Azúcares-nucleótidos tales como
el UDPG o el ADPG se producen para su comercialización a partir de
reacciones pirofosforilásicas catalizadas por enzimas tales como la
UDPG pirofosforilasa (UGPasa) y la ADPG pirofosforilasa (AGPasa),
respectivamente, basadas en la utilización de una sustancia de alto
coste económico denominada
glucosa-1-fosfato (G1P). Una
alternativa a esta práctica de producción de
azúcares-nucleótidos se basa en la utilización de SS
cuyo desarrollo se ha visto impedido en gran medida por las
limitaciones de Escherichia coli para expresar y procesar de
manera eficiente un gran número de proteínas eucariotas. Tal
limitación ha impulsado a algunos investigadores a producir SS
recombinante haciendo uso de factorías biológicas de tipo eucariota
tales como las levaduras (Zervosen, A., Römer, U., Elling L. (1998)
Application of recombinant sucrose synthase-large
scale synthesis of ADP-glucose. J. Mol. Catalysis B:
Enzymatic 5, 25-28; Römer, U., Schrader, H.,
Günther, N., Nettelstroth, N., Frommer, W.B., Elling, L. (2004)
Expression, purification and characterization of recombinant sucrose
synthase I from Solanum tuberosum L. For carbohydrate
engineering. J. Biotechnology 107, 135-149).
Alternativamente, la SS destinada a la producción de
azúcares-nucleótidos ha tenido que ser purificada
mediante costosos procesos de purificación de proteínas a partir de
extractos vegetales (patente DE4221595 (1993), Purified sucrose
synthase enzyme useful for production of
nucleotide-activated sugars or oligosaccharides).
Tal SS obtenida desde extractos vegetales tiene el inconveniente de
que presenta una predilección por el UDP y muy baja afinidad por el
ADP (Pressey R (1969) Potato sucrose synthase: purification,
properties, and changes in activity associated with maturation.
Plant Physiol. 44, 759-764;
Nguyen-Quock B., Krivitzky, M., Huber, S. C.,
Lecharny, A. (1990) Sucrose synthase in developing maize leaves.
Plant Physiol. 94, 516-523; Morell, M., Copeland, L.
(1985) Sucrose synthase of soybean nodules. Plant Physiol. 78,
149-154). Recientemente se ha logrado producir SS
recombinante a partir de cultivos de E. coli (Nakai, T.,
Tonouchi, N., Tsuchida, T., Mori, H., Sakai, F., Hayashi, T. (1997)
"Expression and characterization of sucrose synthase from mung
bean seedlings in Escherichia coli" Biosci. Biotech.
Biochem. 61, 1500-1503; Nakai, T., Konishi, T.,
Zhang, Z-Q., Chollet, R., Tonouchi, N., Tsuchida,
T., Yoshinaga, F., Mori, H., Sakai, F., Hayashi, T. (1997) "An
increase in apparent affinity for sucrose of mung bean sucrose
synthase is caused by in vitro phosphorylation or directed
mutagenesis of Ser11" Plant Cell Physiol. 39,
1337-1341; Barratt, D.H.P., Barber, L, Kruger, N.J.,
Smith, A.M., Wang, T.L., Martin, C. (2001) Múltiple, distinct
isoforms of sucrose synthase in pea. Plant Physiol. 127,
655-664; Christopher, B., William, B., Robert, H.
"Bacterial sucrose synthase compositions and methods of use"
Patente WO9803637). Sin embargo, la producción de SS en este sistema
procariota estaba asociada a problemas tales como (1) la cantidad de
SS producida era muy baja (30 microgramos/gramo de bacteria, Nakai,
T., Tonouchi, N., Tsuchida, T., Mori, H., Sakai, F., Hayashi, T.
(1997) "Expression and characterization of sucrose synthase from
mung bean seedlings in Escherichia coli" Biosci. Biotech.
Biochem. 61, 1500-1503; Li, C.R., Zhang, X.B., Hew,
C.S. (2003) "Cloning, characterization and expression analysis of
a sucrose synthase gene from tropical epiphytic orchid Oncidium
Goldiana". Physiol. Plantarum 118, 352-360),
(2) la cantidad de SS activa obtenida era muy baja o nula
(0.05-1.5 unidades/mg (Nakai, T., Tonouchi, N.,
Tsuchida, T., Mori, H., Sakai, F., Hayashi, T. (1997) "Expression
and characterization of sucrose synthase from mung bean seedlings in
Escherichia coli" Biosci. Biotech. Biochem. 61,
1500-1503; Li, C.R., Zhang, X.B, Hew, C.S. (2003)
Cloning, characterization and expression analysis of a sucrose
synthase gene from tropical epiphytic orchid Oncidium
Goldiana. Physiol. Plantarum 118, 352-360); 5.6
U/mg (Römer, U., Schrader, H., Günther, N., Nettelstroth, N.,
Frommer, W.B., Elling, L. (2004) Expression, purification and
characterization of recombinant sucrose synthase I from Solanum
tuberosum L. For carbohydrate engineering. J. Biotechnology 107,
135-149,), (3) la SS recombinante debía ser
purificada por métodos convencionales de purificación de proteínas
tales como cromatografía, electroforesis, isoelectroenfoque, etc.
que, combinados, resultan costosos y no garantizan la purificación
de la proteína en estado homogéneo y (4) la mayor parte de la SS es
enviada a cuerpos de inclusión o bien se acumulaba en forma de
agregados inactivos como resultado de la incapacidad de la
maquinaria de la bacteria de plegar correctamente la proteína
(Miroux, B., Walker, J.E. (1996) "Over-production
of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow
synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high
levels" J. Mol. Biol. 260, 289-298).
La presente invención describe el desarrollo de
un sistema basado en la utilización de una cepa apropiada de E.
coli y en el uso de un vector de expresión adecuado que permita
la producción a gran escala y purificación rápida y fácil de
distintas versiones de SS recombinante en su forma activa. Algunas
de estas versiones presentan una afinidad por ADP muy superior a las
obtenidas desde extractos vegetales y pueden ser empleadas tanto
para la producción de UDPG como ADPG a partir de sustancias de bajo
coste económico tales como la sacarosa, el UDP o el ADP.
Las técnicas cromatográficas constituyen una
poderosa herramienta de determinación de contenido de sacarosa en
muestras complejas tales como extractos vegetales, sueros, orina,
zumos, vinos, frutos y alimentos (D'Aoust, M-A.,
Yelle, S, Nguyen-Quoc, B. (1999) Antisense
inhibition of tomato fruit sucrose synthase decreases fruit setting
and the sucrose unloading capacity of young fruit. Plant Cell 11,
2407-2418; Tang, G-Q., Sturm, A.
(1999) Antisense repression of sucrose synthase in carrot affects
growth rather than sucrose partitioning. Plant Mol. Biol. 41,
465-479; Frias, J., Price, K.R., Fenwich, G.R.,
Hedley, C.L., Sorensen, H., Vidal-Valverde, C.
(1996) J. Chromatogr. A 719, 213-219). Tales
técnicas requieren personal técnico altamente especializado y están
asociadas a una alta inversión económica en equipamientos.
Lamentablemente, métodos alternativos basados en la hidrólisis de la
molécula de sacarosa por acción de la enzima invertasa y posterior
determinación espectrofotométrica o fluorométrica de las moléculas
de glucosa y/o fructosa (Sweetlove, L.J., Burrell, M.M., ap Rees, T.
(1996) Starch metabolism in tubers of transgenic potato with
increased ADPglucose pyrophosphorylase. Biochem. J. 320,
493-498; Stitt, M., Lilley, R.M., Gerhardt, R.,
Heldt, H.W. (1989) Metabolite levels in specific cells and
subcellular compartments of plant leaves. Methods Enzymol. 174,
518-552; Holmes, E.W. (1997) Coupled enzymatic assay
for the determination of sucrose. Anal. Biochem. 244,
103-109; Methods of Analysis (1996) Code of Practice
for Evaluation of Fruit and Vegetable Juicess. Association of the
Industry of Juices and Nectars from Fruits and Vegetables of the
European Economic Community) están sujetos a limitaciones de tipo
técnico tales como la sustracción de las medidas correspondientes a
la glucosa y/o fructosa endógenas existentes en la muestra. La
abundancia de la glucosa y/o fructosa en la muestra puede aportar un
ruido de fondo tal que impida la determinación fiable y exacta de
sacarosa. En la gran mayoría de los casos es preciso realizar
controles exhaustivos antes de emitir un dato fiable sobre el
verdadero contenido de sacarosa de una muestra (Worrell, A.C,
Bruneau, J-M., Summerfelt, K., Boersig, M., Voelker,
T.A. (1991) Expression of a maize sucrose phosphate synthase in
tomato alters leaf carbohydrate partitioning. Plant Cell 3,
1121-1130). Kits de determinación de sacarosa
basados en la utilización de la invertasa están disponibles en
compañías tales como Sigma, Biopharm GmbH y Megazyme.
Alternativamente se ha desarrolado un método automatizado de
determinación de la sacarosa basado en la determinación de la
glucosa-1-fosfato liberada por la
acción de la sacarosa fosforilasa de origen bacteriano (Vinet, B.,
Panzini, B., Boucher, M., Massicotte, J. (1998) Automated enzymatic
assay for the determination of sucrose in serum and urine and its
use as a marker of gastric damage. Clin. Chem. 44,
2369-2371). La presente invención describe el
desarrollo de un método alternativo simple, fiable y poco costoso
para la determinación de la sacarosa en una muestra basado en la
utilización de la SS y enzimas acopladores que hidrolizan el ADPG o
el UDPG.
Las reflexiones acerca de los factores que
gobiernan los niveles intracelulares de ADPG han girado
fundamentalmente en torno a la regulación del enzima sintetizador,
la AGPasa (Preiss, (1988) Biosynthesis of starch and its regulation.
The Biochemistry of Plants. Vol. 14, Academic Press, New York, pp.
182-249; Pozueta-Romero, J., Perata,
P., Akazawa, T. (1999) Sucrose-starch conversión in
heterotrophic tissues. Crit. Rev. Plant. Sci. 18,
489-525). De hecho, gran parte de las patentes y
publicaciones científicas relacionadas con la obtención de ADPG y
con la obtención de plantas productoras de almidones de interés
industrial, giran en torno a la utilización de la AGPasa (Stark,
D.M., Timmerman, K.P., Barry, G.F., Preiss, J., Kishore, G.M. (1992)
Regulation of the amount of starch in plant tissues by ADPglucose
pyrophosphorylase. Science 258, 287-282; Slattery,
C.J., Kavakli, H., Okita, T.W. (2000) Engineering starch for
increased quantity and quality. Trends Plant Sci 5,
291-298). Sin embargo, pendiente de ser confirmado
por evidencias de tipo genético/molecular, recientes aportaciones
científicas de tipo bioquímico indican que, tal y como se ilustra en
las Figs. 1B y 2B, la SS podría estar implicada en la síntesis
directa de ADPG necesario para la biosíntesis del almidón
(Baroja-Fernández, E., Muñoz, F.J., Saikusa, T.,
Rodríguez-López, M., Akazawa, T.,
Pozueta-Romero, J. (2003) Sucrose synthase catalyzes
the de novo production of ADPglucose linked to starch biosynthesis
in heterotrophic tissues of plants. Plant Cell Physiol. 44,
500-509). Esta hipótesis es especialmente
conflictiva, teniendo en cuenta que (a) jamás se ha vinculado la SS
con la producción de almidón en hojas, (b) es preciso la existencia
de un translocador de ADPG en las membranas de los plastidios que
conecte el pool citosólico del ADPG producido por SS con la almidón
sintasa existente en el interior del plastidio y (c) la implicación
de la SS como fuente productora de ADPG riñe frontalmente con
multitud de pruebas de tipo bioquímico/genético/molecular que
aparentemente muestran que la AGPasa es la única fuente de ADPG
(Okita, T. W. (1992) Is there an alternative pathway for starch
synthesis? Plant Physiol. 100, 560-56;
Müller-Röber, B., Sonnewald, U. Willmitzer, L.
(1992) Inhibition of the ADP-glucose
pyrophosphorylase in transgenic potatoes leads to
sugar-storing tubers and influences tuber formation
and expression of tuber storage protein genes. EMBO J. 11,
1229-1238; Stark, D.M., Timmerman, K.P., Barry,
G.F., Preiss, J., Kishore, G.M. (1992) Regulation of the amount of
starch in plant tissues by ADPglucose pyrophosphorylase. Science
258, 287-282; Neuhaus, E.H., Häusler, R.E.,
Sonnewald, U. (2005) No time to shift the paradigm on the metabolic
pathway to transitory starch in leaves. Trends Plant Sci. en
prensa). Quizás por todo ello jamás hasta ahora se hayan diseñado
plantas que sobre-expresan SS para la producción de
altos niveles de almidón.
Sin embargo, este trabajo describe por primera
vez la producción de plantas transgénicas que
sobre-expresan SS para incrementar su producción de
ADPG y almidón. Por otro lado demostramos que plantas deficitarias
en almidón como resultado de la ausencia de AGPasa poseen niveles
normales de ADPG. Con todo ello se demuestra que, tal y como se
ilustra en las Figs. 1B y 2B, la SS está implicada en la síntesis
directa del ADPG necesario para la biosíntesis del almidón y es
responsable de la síntesis de la mayor parte del ADPG acumulado en
la célula vegetal. Además, sorprendentemente, la
sobre-expresión de SS en las plantas transgénicas
obtenidas en la presente invención consigue que dichas plantas
presenten alto rendimiento en peso seco y almidón. Por otro lado,
extraordinariamente, los órganos de reserva como por ejemplo raíces,
semillas o tubérculos de dichas plantas transgénicas presentaron
elevado rendimiento en almidón y peso seco (rendimientos superiores
a los observados en las plantas silvestres tal y como se expone en
la Tabla 3). Además, los tubérculos de dichas plantas transgénicas
presentaron una textura superior a las plantas silvestres tal y como
se cita en la Tabla 3.
Aunque basados en el planteamiento ilustrado en
la Fig. 1A según el cual la SS está implicada en la síntesis del
UDPG (no ADPG) en tejidos de reserva, varios trabajos han descrito
la producción de plantas con reducido contenido de almidón como
consecuencia de la reducción de la actividad SS (Chourey, P.S.,
Nelson, O.E. (1976) The enzymatic deficiency conditioned by the
shrunken-1 mutations in maize. Biochem. Genet. 14,
1041-1055; Zrenner, R., Salanoubat, M., Willmitzer,
L., Sonnewald, U. (1995) Evidence for the crucial role of sucrose
synthase for sink strength using transgenic potato plants. Plant J.
7, 97-107; Tang, G-Q., Sturm, A.
(1999) Antisense repression of sucrose synthase in carrot (Daucus
carota L.) affects growth rather than sucrose partitioning. Plant
Mol. Biol. 41, 465-479). En este sentido, no existen
evidencias experimentales de que la sobre-expresión
de la SS pueda utilizarse para la producción de plantas con alto
contenido en almidón como resultado del incremento de los niveles de
ADPG acorde a los esquemas metabólicos representados en las Figs. 1B
y 2B. Por el contrario, basados en la capacidad de la SS de producir
la molécula precursora de la biosíntesis de polisacáridos de pared
celular (la UDPG) se han publicado y patentado trabajos en los que
se describe la producción de plantas de algodón con alto contenido
en fibra o cereales con alto contenido en celulosas como resultado
de la sobre-expresión de la SS (Timothy, H J.,
Xiamomu N., Kanwarpal, S "Manipulation of sucrose synthase genes
to improve stalk and grain quality" Patente WO02067662; Robert,
F., Danny, L, Yong-Ling, R. "Modification of
sucrose synthase gene expression in plant tissue and uses
therefor" Patente WO0245485; Christopher, B., William, B.,
Robert, H. "Bacterial sucrose synthase compositions and methods of
use" Patente WO9803637).
Un objeto de la invención es, en primer lugar,
la puesta a punto y optimización de un método de producción de
grandes cantidades de SS recombinante soluble, fácilmente
purificable y de alta actividad específica basado en la utilización
de una cepa de E. coli apropiada y en la utilización de un
vector de expresión que permite la obtención de la SS con una cola
de histidinas. Otro objeto de la invención es el procedimiento
seguido para la elaboración de dispositivos o kits de determinación
de sacarosa basados en el empleo del producto enzimático con
actividad SS acoplado a enzimas que metabolizan el ADPG o el UDPG.
Otro objetivo es la optimización de la producción de
azúcares-nucleótidos tales como el ADPG o el UDPG a
partir de versiones de la SS especialmente diseñadas a tal efecto.
Finalmente, la sobre-expresión de SS en las plantas
transgénicas obtenidas en la presente invención consigue que dichas
plantas tengan alto rendimiento en peso seco, que sus hojas y
tejidos de reserva acumulen altos niveles de ADPG y almidón. Además,
sorprendentemente, los órganos de reserva como por ejemplo raíces,
semillas o tubérculos de dichas plantas transgénicas presentaron
elevado rendimiento en almidón y peso seco (rendimientos superiores
a los observados en las plantas silvestres tal y como se expone en
la Tabla 3). Por otro lado, los tubérculos de dichas plantas
transgénicas presentaron una textura superior a las plantas
silvestres tal y como se cita en la Tabla 3.
La presente invención describe un procedimiento
de producción eficiente de grandes cantidades SS recombinante
soluble en su forma activa, mediante expresión del gen que codifica
para la SS en una cepa de Escherichia coli. El vector de
expresión utilizado permite que la SS recombinante producida posea
una cola de histidinas que facilita su purificación de manera
rápida. Asimismo se describen secuencias de versiones mutadas del
gen de la SS que codifican para isoformas de la SS adecuadas para la
producción de ADPG. Haciendo uso de las versiones "silvestre" y
"mutada" de SS recombinante, se describe un método eficiente de
producción de ADPG y UDPG. También se describe la utilización de la
SS para la producción de dispositivos de ensayo de determinación de
sacarosa. Por último la presente invención describe la obtención de
las plantas transgénicas con alto rendimiento en peso seco y
almidón. Además, extraordinariamente, los órganos de reserva como
por ejemplo raíces, semillas o tubérculos de dichas plantas
transgénicas presentaron elevado rendimiento en almidón y peso seco
(rendimientos superiores a los observados en las plantas silvestres
tal y como se expone en la Tabla 3). Además, los tubérculos de
dichas plantas transgénicas presentaron una textura superior a las
plantas silvestres tal y como se cita en la Tabla 3.
Tal y como se cita en la presente invención, el
órgano de reserva de la planta puede seleccionarse del grupo
comprendido por: tubérculos, semillas, bulbos, cormos, rizomas o
raíces tuberosas.
Además, aunque los ejemplos se refieran a
tubérculos, los efectos técnicos mostrados en la presente invención
son extrapolables a otros tipos de órganos de reserva arriba
mencionados.
Por otro lado, aunque los ejemplos se refieren a
plantas de patata, los resultados técnicos derivados, objeto de la
presente invención, serían extrapolables a plantas de tabaco,
tomate, arroz, cebada, trigo o maíz.
Figura 1. Mecanismos de biosíntesis de almidón
en órganos heterotróficos. (A) Mecanismo "clásico" según el
cual la SS está implicada en la producción de UDPG, el cual es
eventualmente convertido en almidón tras la acción combinada de la
UDPG pirofosforilasa (UGPase), fosfoglucomutasa (PGM) citosólica,
fosfoglucomutasa plastidial, ADPG pirofosforilasa (AGPase) y almidón
sintasa. (B) Mecanismo "alternativo" según el cual SS está
implicada en la producción directa de ADPG en el citosol. El ADPG es
transportado posteriormente al amiloplasto por acción de un
translocador. Una vez en el interior del amiloplasto, la almidón
sintasa utiliza el ADPG para producir almidón.
Figura 2. Mecanismos de biosíntesis de almidón
en hojas. (A) Mecanismo "clásico" según el cual todo el proceso
de biosíntesis del almidón tiene lugar en el interior del
cloroplasto. Según esta visión, el metabolismo del almidón y la
sacarosa no están conectados. Además, la SS no interviene en el
proceso gluconeogénico. (B) Mecanismo "alternativo" de
biosíntesis del almidón según el cual la SS está implicada en la
síntesis directa de ADPG en el citosol. El ADPG es posteriormente
transportado al interior del plastidio donde la almidón sintasa lo
utiliza como sustrato para la reacción de síntesis del almidón.
Figura 3. Etapas de construcción del plásmido de
expresión pET-SS a partir de
pET-28a(+) y pSS.
Figura 4. Etapas de construcción del plásmido de
expresión pBIN35S-SS-NOS a partir de
pBIN20 y p35S-SS-NOS.
Figura 5. Etapas de construcción del plásmido de
expresión pRBCS-SS-NOS a partir de
pGEMT-RBCSprom,
p35S-SS-NOS y pBIN20.
Figura 6. Expresión de pET-SS en
diferentes cepas de Escherichia coli. (A) Actividad SS (en
miliunidades (mU) por miligramo de proteína bacteriana) en extractos
bacterianos transformados con pET o con pET-SS. La
reacción tuvo lugar en la dirección de degradación de sacarosa y
producción de ADPG. El cocktail de reacción contenía 50 mM HEPES (pH
7.0), 1 mM EDTA, 20% polietilenglicol, 1 mM MgCl2, 15 mM de KCl y 2
mM de ADP. La reacción tuvo lugar durante 10 minutos a 37ºC. (B)
SDS-PAGE de extractos proteicos de las las
diferentes cepas de E. coli transformadas con pET y con
pET-SS. Con un asterisco se indica la posición de la
SSX recombinante.
Figura 7. Determinación de la sacarosa en
diferentes estadios de desarrollo de endospermos de cebada haciendo
uso del kit basado en las reacciones acopladas de la SS, la ADPG
(UDPG) pirofosfatasa, la PGM y la G6PDH. Los resultados fueron
idénticos a los obtenidos paralelamente mediante (a) la utilización
de un kit basado en las reacciones acopladas de SS y la UDPG
deshidrogenasa y (b) la utilización de cromatografía de alta presión
(HPLC) con detección amperométrica en un sistema
DX-500 Dionex ajustado a una columna
Carbo-Pac PA1.
- Eje de abcisas: Días tras floración
- Eje de ordenadas: Contenido en sacarosa (\mumol/gFW).
Figura 8. Actividad SS en hojas de plantas de
patata silvestres (WT) y plantas de patata que sobreexpresan SSX
tras integrar en su genoma las construcciones
35S-SS-NOS (por acción de la cepa de
Agrobacterium tumefaciens CECT:5851) o
RBCS-SS-NOS. La actividad está
referida en miliunidades (mU) por gramo de peso fresco. La unidad se
define como la cantidad de SS necesaria para producir un micromol de
ADPG por minuto.
Figura 9. Contenido de almidón en hojas de
plantas de patata silvestres (WT) y plantas de patata que
sobreexpresan SSX tras integrar en su genoma las construcciones
35S-SS-NOS (por acción de la cepa de
Agrobacterium tumefaciens CECT:5851) o
RBCS-SS-NOS.
Figura 10. Contenido de ADPG en hojas de plantas
de patata silvestres (WT) y plantas de patata que sobreexpresan SSX
tras integrar en su genoma las construcciones
35S-SS-NOS (por acción de la cepa de
Agrobacterium tumefaciens CECT:5851) o
RBCS-SS-NOS.
Figura 11. Acumulación transitoria de (A)
almidón y (B) ADPG durante un fotoperíodo de 8 horas de luz y 16
horas de obscuridad en hojas de plantas WT (\medbullet),
35S-SS-NOS (\blacksquare) y
RBCS-SS-NOS (\ding{115}).
Figura 12. Actividad SS en tubérculos de plantas
de patata silvestres (WT) y plantas de patata que sobreexpresan SSX
tras integrar en su genoma la construcción
35S-SS-NOS (por acción de la cepa de
Agrobacterium tumefaciens CECT:5851). La actividad está
referida en miliunidades (mU) por gramo de peso fresco. La unidad se
define como la cantidad de SS necesaria para producir un micromol de
ADPG por minuto.
Figura 13. Contenido de almidón (referido a peso
fresco) en tubérculos de plantas de patata silvestres (WT) y plantas
de patata que sobre-expresan SSX tras integrar en su
genoma la construcción 35S-SS-NOS
(por acción de la cepa de Agrobacterium tumefaciens
CECT:5851).
Figura 14. Contenido de ADPG referido a peso
fresco en tubérculos de plantas de patata silvestres (WT) y
controles de regeneración y plantas de patata que sobreexpresan SSX
tras integrar en su genoma la construcción
35S-SS-NOS (por acción de la cepa de
Agrobacterium tumefaciens CECT:5851).
Figura 15. Contenido de (A) almidón y (B) ADPG
en hojas de Arabidopsis thaliana TL25 deficitarias en
AGPasa
Figura 16. Contenido de (A) almidón y (B) ADPG
en hojas de patata AGP62 y AGP85 deficitarias en AGPasa
Figura 17. Actividad SS en tubérculos de plantas
de patata control (WT) y plantas de patata que
sobre-expresan SS
(35S-SS-NOS). Las actividades se
representan en miliunidades por peso fresco, siendo la unidad la
cantidad de enzima necesaria para convertir un micromol de sacarosa
en ADPG y fructosa.
Figura 18. Cantidad de ADPG en tubérculos de
plantas de patata control (WT) y plantas de patata que
sobre-expresan SS. La cantidad de ADPG está referida
en forma de nanogramos de ADPG por gramo de peso fresco.
Figura 19. Cantidad de almidón en tubérculos de
plantas de patata control (WT) y plantas de patata que
sobre-expresan SS. La cantidad de almidón está
referida en forma de microgramos de glucosa por gramo de peso
fresco.
Conocida la secuencia nucleotídica de Sacarosa
sintasa silvestre SS4 (Fu, H., Park, W.D. (1995) Sink- and
vascular-associated sucrose synthase functions are
encoded by different gene classes in potato. Plant Cell 7,
1369-1385) se crearon dos cebadores específicos
correspondientes a los extremos 5' y 3' del gen. Haciendo uso de
estos cebadores se amplificó por métodos convencionales de PCR un
fragmento de DNA de 2418 pares de bases, designado con SSX, a partir
de una genoteca de cDNA de hoja de patata. Tal fragmento de PCR se
introdujo en el plásmido pSK Bluescript (Stratagene) dando lugar a
la construcción pSS (Fig. 3A) la cual fue amplificada en la bacteria
hospedadora XL1
Blue.
Blue.
pSS fue digerido con los enzimas de restricción
NcoI y NotI. El fragmento liberado (que contiene al cDNA que
codifica para SS, SSX) fue clonado en los mismos sitios de
restricción del plásmido de expresión pET-28a(+)
(Novagen) (Fig. 3B) el cual posee una secuencia nucleotídica en la
región polylinker que codifica para una secuencia rica en
histidinas, la cual queda fusionada con la proteína recombinante. El
plásmido resultante (designado con el nombre de
pET-SS, Fig. 3C) fue introducido por electroporación
en varias cepas de E. coli. La cepa de E. coli
BLR(DE3) (Novagen) transformada con pET-SS
fue depositada en la Colección Española de Cultivos tipo el 29 de
octubre de 2003, sita en el Edificio de Investigación de la
Universidad de Valencia, Campus de Burjassot, Burjassot 46100
(Valencia, España) con el nº de depósito CECT:5850. Las bacterias
fueron incubadas a 20ºC en medio LB. La
sobre-expresión de SSX tuvo lugar mediante la
adición de 1 mM
isopropyl-\Box-D-thiogalactopyranoside
(IPTG) en 100 ml de cultivo celular crecido a 20ºC. Tras seis horas
de cultivo inducido se recogieron las bacterias y se resuspendieron
en 4 mi de "binding buffer" (Novagen, His-bind
purification kits), se sonicaron y se centrifugaron a 40.000 g
durante veinte minutos. El sobrenadante que contiene la SS
recombinante con una secuencia amonoacídica rica en residuos de
histidinas en el extremo N-terminal se hizo pasar a
través por una columna de afinidad del kit de purificación de
proteínas "His-bind" de Novagen. Siguiendo las
instrucciones del kit se eluyó SS con 6 ml del tampón de elución
recomendado, en el que se había incluido 200 mM de imidazol en lugar
de 1 molar. Tras la elución la proteína fue sometida rápidamente a
una diálisis para retirar cualquier traza de imidazol que inactive
irreversiblemente a la SS.
Haciendo uso de cebadores adecuados y utilizando
pSS como molde, se diseñó la versión mutada SS5, dando lugar a la
construcción pSS5. Para ello, se hizo uso del kit QuikChange
Site-Directed Mutagenesis (Stratagene). pSS5 fue
digerido con NcoI y NotI. El fragmento liberado (que contiene a SS5)
se clonó en los mismos sitios de restricción del plásmido de
expresión pET-28a(+) dando lugar a
pET-SS5, el cual se introdujo por electroporación en
E. coli BLR(DE3). La cepa de E. coli XL1 Blue
transformada con pSS5 fue depositada en la colección Española de
Cultivos Tipo el 29 de octubre de 2003, sita en el Edificio de
Investigación de la Universidad de Valencia, Campus de Burjassot,
Burjassot 46100 (Valencia, España), con el nº de depósito
CECT:5849.
En la presente invención SS ha sido
sobre-expresada (a) constitutivamente, (b)
específicamente en hojas y (c) específicamente en órganos de reserva
tales como tubérculos.
Para la producción de plantas que
sobre-expresen SS de manera constitutiva, se crearon
construcciones gobernadas por la acción del promotor constitutive
35S del virus del mosaico del tabaco. La introducción secuencial en
pSS del promotor 35S y del terminador NOS en las regiones 5' y 3' de
SSX, dio lugar a la producción del plásmido
p35S-SS-NOS cuyo mapa de restricción
se representa en la Fig. 4B.
Para poder transferir esta construcción al
genoma de las plantas vía Agrobacterium tumefaciens, es
preciso que previamente sea clonada en un plásmido binario. Para
ello, p35S-SS-NOS fue digerido
secuencialmente con los enzimas NotI, T4 DNA polimerasa y HindIII y
se clonó dentro del plásmido binario pBIN20 (Fig. 4A) Hennegan,
K.P., Danna, K.J. (1998) pBIN20: An improved binary vector for
Agrobacterium-mediated transformation. Plant Mol.
Biol. Rep. 16, 129-131) que previamente había sido
digerido secuencialmente con los enzimas EcoRI, T4 DNA polimerasa y
HindIII. El plásmido así obtenido se designó con el nombre de
pBIN35S-SS-NOS (Fig. 4C).
Para sobre-expresar SS
específicamente en hojas iluminadas se amplificó por PCR la región
promotora del gen que codifica para la subunidad pequeña de la
RUBISCO de tabaco (Barnes, S.A., Knight, J.S., Gray, J.C. (1994)
Alteration of the amount of the chloroplast phosphate translocator
in transgenic tobáceo affects the distribution of assimilate between
starch and sugar. Plant Physiol. 106, 1123-1129) y
se introdujo en el vector pGEMT-easy (Promega),
dando lugar a pGEMT-RBCSprom (Fig. 5A). Esta
construcción fue digerida con HindIII y NcoI y el fragmento liberado
fue clonado en los sitios de restricción correspondientes de
p35S-SS-NOS, dando lugar a
pRBCS-SS- NOS (Fig. 5B). Esta construcción fue
digerida secuencialmente con HindIII, T4 DNA polimerasa y NotI. El
fragmento liberado fue clonado en pBIN20 digerido secuencialmente
con HindIII, T4 DNA polimerasa y EcoRI. La construcción resultante
se designó con el nombre de
pBINRBCS-SS-NOS (Fig. 5C).
Tras amplificarse en E. coli (XL1 Blue),
tanto pBIN35S-SS-NOS como
pBINRBCS-SS-NOS se introdujeron en
A. tumefaciens C58:GV2260 (Debleare, R., Bytebier, B., de
Greve, H., Debroeck, F., Schell, J., van Montagu, M., Leemans, J.
(1985) "Efficient octopine Ti plasmid-derived
vectors of Agrobacterium mediated gene transfer to plants" Nucl.
Acids Res. 13, 4777-4788) el cual fue utilizado para
transformar especies tales como tomate (Lycopersicon
sculentum), tabaco (Nicotiana tabacum), patata
(Solanum tuberosum) y arroz de acuerdo a técnicas
convencionales (Horsch, R.B., Fry, J.E., Hoffmann, N.L., Eichholtz,
D., Rogers, S.G., Fraley, R.T. (1985) "A simple and general method
for transferring genes into plants" Science 277,
1229-1231; Pozueta-Romero, J.,
Houlné, G., Schantz, R., Chamarro, J. (2001) "Enhanced
regeneration of tomato and pepper seedling explants for
Agrobacterium-mediated transformation" Plant Cell
Tiss. Org. Cult. 67, 173-180; Hiei, Y., Ohta, S.
Komari, T., Kumashiro, T. (1994) "Efficient transformation of rice
(Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence
analysis of the boundaries of the T-DNA". Plant
J. 6, 271-282). La cepa de A. tumefaciens
C58:GV2260 transformada con
pBIN35S-SS-NOS fue depositada en la
Colección Española de Cultivos tipo el 29 de octubre de 2003, sita
en el Edificio de Investigación de la Universidad de Valencia,
Campus de Burjasot, Burjasot 46100 (Valencia, España), con el nº de
depósito CECT:5851.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron plantas control no transformadas y
las líneas 5, 6, 7, 10 y 12 de plantas de patata que
sobre-expresan SS constitutivamente como resultado
de la integración en su genoma de la construcción
35S-SS-NOS. Las plantas fueron
cultivadas entre Mayo y Septiembre de 2006 en una parcela del
término 25 de Sartaguda (Navarra, España). Las plantas fueron
distribuidas al azar en parcelas de 50 metros cuadrados, haciendo
uso de 30 plantas por línea. La separación entre carriles fue de 90
cm. La separación entre planta y planta de un mismo carril fue de 35
cm. Las medidas de almidón, 30 azúcares solubles y actividades
enzimáticas tuvieron lugar según se describe en (Muñoz, F.J.,
Baroja-Fernández, E., Morán-Zorzano,
M.T., Viale, A.M., Etxeberria, E., Alonso-Casajús,
N. and Pozueta-Romero, J (2005) Sucrose synthase
controls both intracellular ADPglucose levels and 35 transitory
starch biosynthesis in source leaves. Plant Cell Physiol. 46,
1366-1376). Las medidas de textura se llevaron a
cabo haciendo uso de un texturómetro TA-XT2Í según
las instrucciones del fabricante.
\vskip1.000000\baselineskip
Uno de los kits diseñados para la determinación
de sacarosa, ilustrado en el siguiente Esquema I de reacciones
enzimáticas implicadas en el kit de determinación
espectrofotométrica/fluorimétrica de sacarosa basado en la
transformación de la sacarosa en un
azúcar-nucleótido y posterior transformación de éste
en glucosa-1-fosfato,
glucosa-6-fosfato y
NAD(P)H.
El kit está basado en la acción de la SS sobre
la molécula de sacarosa en presencia de un nucleótido difosfato (ej.
UDP o el ADP), liberando cantidades equimolares de fructosa y el
azúcar-nucleótido correspondiente. Si el
azúcar-nucleótido resultante de la reacción es UDPG,
éste se somete a la acción de enzimas hidrolíticos del UDPG tales
como la UDPG pirofosfatasa de tipo Nudix (EC 3.6.1.45) (Yagi, T.,
Baroja-Fernández, E., Yamamoto, R., Muñoz, F.J.,
Akazawa, T., Pozueta-Romero, J. (2003) Cloning,
expression and characterization of a mammalian Nudix
hydrolase-like enzyme that cleaves the pyrophosphate
bond of UDP-glucose. Biochem. J. 370,
409-415) o la UDPG hidrolasa (Burns, D.M., Beacham,
I.R. (1986) Nucleotide sequence and transcriptional analysis of the
E. coli ushA gene, encoding periplasmic
UDP-sugar hydrolase
(5'-nucleotidase): regulation of the ushA gene, and
the signal sequence of its encoded protein product. Nucl. Acids Res.
14, 4325-4342). La G1P liberada por acción de estos
enzimas hidrolíticos es transformada por acción de la
fosfoglucomutasa (PGM), rindiendo
glucosa-6-fosfato (G6P), que a su
vez puede hacerse reaccionar acopladamente con NAD(P)+ por
acción del enzima G6P deshidrogenasa (G6PDH), obteniéndose
6-fosfogluconato y NAD(P)H, fácilmente
determinable por fluorimetría y por espectrofotometría a 340 nm. A
su vez, el NAD(P)H liberado puede acoplarse a la
acción de la FMN-oxidoreductasa/luciferasa,
rindiendo luz que es cuantificada espectrofotométricamente.
Alternativamente, y tal y como se ilustra en el
esquema II, el UDPG producido puede acoplarse con la UDPG
deshidrogenasa (EC 1.1.1.22) que, en presencia de NAD, da lugar a
cantidades equimolares de UDP-glucuronato y NADH
determinable por fluorometría o por espectrofotometría a 340 nm. A
su vez, el NADH liberado puede acoplarse a la acción de la
FMN-oxidoreductasa/luciferasa, rindiendo luz que es
cuantificada espectrofotométricamente.
Si el producto de la reacción catalizada por la
SS es ADPG, éste se somete a la acción de enzimas hidrolíticos del
ADPG tales como la ADPG pirofosfatasa bacteriana (EC 3.6.1.21)
(Moreno-Bruna, B., Baroja-Fernández,
E., Muñoz, F.J., Bastarrica-Berasategui, A.,
Zandueta-Criado, A.,
Rodríguez-López, M., Lasa, I., Akazawa, T.,
Pozueta-Romero, J. (2001) Adenosine diphosphate
sugar pyrophosphatase prevents glycogen biosynthesis in
Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98,
8128-8132). La G1P liberada es transformada por
acción de la fosfoglucomutasa, rindiendo
glucosa-6-fosfato (G6P), que a su
vez puede hacerse reaccionar acopladamente con NAD(P)+ por
acción del enzima G6P deshidrogenasa, obteniéndose
6-fosfogluconato y NAD(P)H, fácilmente
determinable por fluorometría o espectrofotometría a 340 nm.
En cualquier caso, los esquemas de reacciones
enzimáticas acopladas a la producción de un
azúcar-nucleótido por mediación de la SS, son
perfectamente susceptibles de ser aplicados a la detección
amperométrica.
Se describen a continuación ejemplos en los que
se muestra detalladamente el procedimiento de clonaje de un cDNA que
codifica para una isoforma de SS de patata en un vector de expresión
adecuado y en una cepa de E. coli optimizada para la
producción y acúmulo del enzima en su forma activa. Otros ejemplos
muestran la utilización de la SS recombinante para la producción de
kits (dispositivos de ensayo) de determinación de sacarosa en
muestras vegetales, suero, orina, zumos, néctares, bebidas
refrescantes, etc.. Otro ejemplo muestra la utilización de versiones
de SS optimizadas para la producción a gran escala de
azúcares-nucleótidos tales como UDPG y ADPG. Por
último otro ejemplo muestra la obtención de plantas con alto
contenido en sacarosa, ADPG y almidón como resultado de la alta
actividad productora de ADPG en plantas que sobreexpresan la SS.
El conocimiento de la secuencia nucleotídica del
gen SS4 que codifica para una isoforma de SS de patata permitió la
creación de dos cebadores específicos cuyas secuencias son, en
sentido 5' - 3', SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2. Haciendo uso de estos
cebadores se amplificó por métodos convencionales de PCR un
fragmento de DNA, designado como SSX, a partir de una genoteca de
cDNA de tubérculo de patata, que se introdujo en un plásmido pSK
Bluescript (Stratagene) el cual fue amplificado en la bacteria
hospedadora XL1 Blue. La secuencia nucleotídica de SSX es SEQ ID NO:
3 que es ligeramente diferente a SS4 (número de accesión en GenBank
U24087). La secuencia aminoacídica deducida de SEQ ID NO: 3 es
ligeramente diferente a SS4 y por ello se designa con el nombre de
SSX. La secuencia aminoacídica deducida tras la expresión de SEQ ID
NO: 3 en el plásmido pET-28a(+) es SEQ ID NO: 4, la
cual incluye una secuencia de 38 aminoácidos rica en histidinas
fusionada con el extremo amino-terminal de la
secuencia aminoacídica deducida de SEQ ID NO: 3.
La inducción de la producción de SSX en
bacterias BL21(DE3) transformadas con pET-SS
tuvo lugar al añadir 1 mM IPTG. Tras seis horas adicionales de
cultivo a 37ºC, se observó que las bacterias transformadas con
pET-SS acumulaban una proteína en forma agregada
cuyo tamaño se corresponde al de la SS. Sin embargo, tales bacterias
no tenían actividad SS. Tal fracaso en la expresión de una forma
activa de SS es atribuible a los problemas que posee E. coli
en el correcto plegado de algunas proteínas eucariotas de alto peso
molecular (Miroux, B., Walker, J.E. (1996)
"Over-production of proteins in Escherichia
coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane
proteins and globular proteins at high levels" J. Mol. Biol. 260,
289-298). Con el fin de superar este problema, se
investigó la capacidad de producción de SS activa en otras cepas
bacterianas y a una temperatura de 20ºC. En todas ellas la inducción
de la producción de SSX tuvo lugar al añadir 1 mM de IPTG. Tras 6
horas de incubación adicional, las bacterias fueron sonicadas y
centrifugadas. El sobrenadante resultante fue analizado para la
actividad SS. En estas condiciones, tal y como se ilustra en la Fig.
6, la cepa BLR(DE3) resultó ser la más eficiente desde el
punto de vista de la producción de SS activa y soluble. La cepa de
E. coli BLR(DE3) (Novagen) transformada con
pET-SS fue depositada en la Colección Española de
Cultivos tipo el 29 de octubre de 2003, con el nº de depósito
CECT:5850. La contribución de la SSX recombinante en el pool
proteico total de CECT:5850 es de aproximadamente un 20%, frente a
la muy escasa productividad de SS recombinante (30 microgramos por
gramo de bacteria) descrita en la literatura (Nakai, T., Tonouchi,
N., Tsuchida, T., Mori, H., Sakai, F., Hayashi, T. (1997)
"Expression and characterization of sucrose synthase from mung
bean seedlings in Escherichia coli" Biosci. Biotech.
Biochem. 61, 1500-1503; Li, C.R., Zhang, X.B, Hew,
C.S. (2003) Cloning, characterization and expression analysis of a
sucrose synthase gene from tropical epiphytic orchid Oncidium
Goldiana. Physiol. Plantarum 118, 352-360). El
sobrenadante se hizo pasar a través de la columna de afinidad
"His-Bind" (Novagen) en la que se queda
retenida específicamente la proteína recombinante poseedora de una
cola de histidinas. Tras eluir y dializar la SS purificada, ésta fue
incubada con 50 mM HEPES, pH 7.0/1 mM EDTA/20% polyethilenglycol/1
mM MgCl2/15 mM KCl/2 mM UDP. La actividad específica, estimada en
términos de producción de UDPG, era de 80 unidades/mg de proteína,
muy superior a la actividad de 0.05-5 unidades/mg de
SS recombinante descrita en la literatura (Nakai, T., Tonouchi, N.,
Tsuchida, T., Mori, H., Sakai, F., Hayashi, T. (1997) "Expression
and characterization of sucrose synthase from mung bean seedlings in
Escherichia coli" Biosci. Biotech. Biochem. 61,
1500-1503; Li, C.R., Zhang, X.B, Hew, C.S. (2003)
Cloning, characterization and expression analysis of a sucrose
synthase gene from tropical epiphytic orchid Oncidium
Goldiana. Physiol. Plantarum 118, 352-360;
Römer, U., Schrader, H., Günther, N., Nettelstroth, N., Frommer,
W.B., Elling, L. (2004) Expression, purification and
characterization of recombinant sucrose synthase I from Solanum
tuberosum L. For carbohydrate engineering. J. Biotechnology 107,
135-149) y superior a 3 unidades/mg correspondiente
a la SS purificada desde extractos vegetales (Pressey R (1969)
Potato sucrose synthase: purification, properties, and changes in
activity associated with maturation. Plant Physiol. 44,
759-764). La unidad se define como la cantidad de
enzima que cataliza la producción de un micromol de UDPG por minuto.
La afinidad por UDP en presencia de 500 mM sacarosa fue de
Km(UDP)= 0.25 mM, mientras que la Km por sacarosa fue de 30
mM en presencia de 1 mM UDP. Esta afinidad por sacarosa en presencia
de UDP es significativamente superior a la mostrada por la SS
recombinante obtenida en levaduras (Km= 95 mM, Römer, U., Schrader,
H., Günther, N., Nettelstroth, N., Frommer, W.B., Elling, L. (2004)
Expression, purification and characterization of recombinant sucrose
synthase I from Solanum tuberosum L. For carbohydrate
engineering. J. Biotechnology 107, 135-149).
La producción económica y eficiente de 3 gramos
de UDPG de alta pureza tuvo lugar tras la incubación durante 12
horas a 37ºC de 100 mililitros de una solución con 1 M sacarosa, 50
mM HEPES, pH 7.0/1 mM EDTA/20% polyethilenglycol/1 mM MgCl2/15 mM
KCl/100 mM UDP y 30 unidades de SS recombinante de patata obtenida
tras la expresión de pET-SS en BLR(DE3) y
posterior purificación. La reacción finalizó tras calentar la
solución a 100ºC durante 90 segundos y posterior centrifugación a
10.000 g durante 10 minutos. El sobrenadante se aplicó a un
cromatógrafo HPLC (Waters Associate's) a escala preparativa y el
UDPG se purificó según se describe en la literatura
(Rodríguez-López, M.,
Baroja-Fernández, E.,
Zandueta-Criado, A., Pozueta-Romero,
J. (2000) Adenosine diphosphate glucose pyrophosphatase: a
plastidial phosphodiesterase that prevents starch biosynthesis.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 8705-8710).
La producción de ADPG requirió la generación de
una forma mutada de SS con una afinidad por el ADP mucho mayor que
la descrita para la SS extraída desde tejidos vegetales (Pressey R
(1969) Potato sucrose synthase: purification, properties, and
changes in activity associated with maturation. Plant Physiol. 44,
759-764; Nguyen-Quock B., Krivitzky,
M., Huber, S. C., Lecharny, A. (1990) Sucrose synthase in developing
maize leaves. Plant Physiol. 94, 516-523; Morell,
M., Copeland, L. (1985) Sucrose synthase of soybean nodules. Plant
Physiol. 78, 149-154).
Tal isoforma, designada como SS5 se obtuvo
mediante mutagénesis puntual de SSX haciendo uso del kit QuikChange
Site-directed Mutagenesis (Stratagene) y utilizando
secuencialmente las siguientes parejas de cebadores cuyas secuencias
son [SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6], [SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8] y
[SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10]. La secuencia nucleotídica obtenida,
designada como SS5, es SEQ ID NO: 11. Los cambios en la secuencia
aminoacídica de SS5 (SS 5) respecto a SS4-SS
4-(existente en bancos de datos) se ilustran a continuación en la
Tabla 1 sombreados. La secuencia aminoacídica deducida tras la
expresión de SEQ ID NO: 11 en el plásmido pET-28a(+)
es SEQ ID NO: 12, la cual incluye una secuencia de 38 aminoácidos
rica en histidinas fusionada con el extremo
amino-terminal de la secuencia aminoacídica deducida
de SEQ ID NO: 11.
En la Tabla 1 se incluye dicha secuencia de 38
aminoácidos rica en histidinas fusionada a la parte
amino-terminal de SS5.
La SS5 recombinante obtenida tras la expresión
de pET-SS5 tuvo una Vmax de 80 unidades/mg de
proteína y 65 unidades/mg de proteína en presencia de UDP y ADP,
respectivamente. Las afinidades por UDP y ADP en presencia de 500 mM
sacarosa resultaron ser similares (Km= 0.2 mM tanto para ADP como
para UDP), mientras que la Km por sacarosa fue de 30 mM y 100 mM en
presencia de concentraciones saturantes de UDP y ADP,
respectivamente. Estos parámetros cinéticos son muy diferentes a los
descritos para la SS extraída desde tubérculo de patata y otros
órganos de otras especies, según los cuales la Vmax del enzima es 10
veces superior en presencia de UDP que en presencia de ADP (Pressey
R (1969) Potato sucrose synthase: purification, properties, and
changes in activity associated with maturation. Plant Physiol. 44,
759-764; Morell, M., Copeland, L. (1985) Sucrose
synthase of soybean nodules. Plant Physiol. 78,
149-154; Nguyen-Quoc, B., Krivitzky,
M., Huber, S.C., Lecharny, A. (1990) Sucrose synthase in developing
maize leaves. Plant Physiol. 94, 516-523). La cepa
de E. coli XL1 Blue transformada con pSS5 fue depositada en
la colección Española de Cultivos Tipo con el nº de depósito
CECT:5849.
La producción económica y eficiente de 3 gramos
de ADPG de alta pureza tuvo lugar tras la incubación durante 12
horas a 37ºC de 100 mililitros de una solución con 1 M sacarosa, 50
mM HEPES, pH 7.0/1 mM EDTA/20% polyethilenglycol/1 mM MgCl2/15 mM
KCl/100 mM ADP y 30 unidades de SS recombinante de patata obtenida
tras la expresión de pET-SS5 en BLR(DE3) y
posterior purificación en una columna His-bind. La
reacción finalizó tras calentar la solución a 100ºC durante 90
segundos y posterior centrifugación a 10.000 g durante 10 minutos.
El sobrenadante se aplicó a un cromatógrafo HPLC (Waters
Associate's) a escala preparativa para la purificación del ADPG.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la determinación de sacarosa se elaboraron
los siguientes cocktails de reacción con los siguientes elementos y
cantidades/concentraciones finales:
- a.
- 2 unidades de SS (recombinante o no)
- b.
- 2 mM de ADP o UDP (según se produzca ADPG o UDPG, respectivamente)
- c.
- 2 unidades de ADPG pirofosfatasa o 2 unidades de UDPG pirofosfatasa (según se incluya en el cocktail de reacción ADP o UDP, respectivamente)
- d.
- 2 unidades de PGM
- e.
- 2 unidades de G6PDH
- f.
- 0.5 mM de NAD(P)
- g.
- tampón de reacción: 50 mM HEPES, pH 7.0/1 mM EDTA/20% polyethilenglycol/1 mM MgCl2/15 mM KCl
- h.
- muestra problema previamente filtrada
\vskip1.000000\baselineskip
- a.
- 2 unidades de SS (recombinante o no)
- b.
- 2 mM de UDP
- c.
- 2 unidades de UDPG deshidrogenasa
- d.
- 0.5 mM de NAD
- e.
- tampón de reacción: 50 mM HEPES, pH 7.0/1 mM EDTA/20% polyethilenglycol/1 mM MgCl2/15 mM KCl
- f.
- muestra problema previamente filtrada.
\vskip1.000000\baselineskip
La determinación de la cantidad de sacarosa
presente en la muestra problema se basa en la determinación
fluorométrica o espectrofotométrica a 340 nm del
NAD(P)H producido según las reacciones acopladas
ilustradas en los esquemas I y II. Para la determinación del
contenido de sacarosa en semillas de cebada con diferentes grados de
desarrollo (Figura 7), las reacciones tuvieron lugar en pocillos de
300 microlitros de una placa de Elisa durante 3 minutos a 37ºC. El
volumen de muestra problema fue de 20 microlitros, mientras que el
volumen del cocktail resultante de la combinación de los reactivos
a-g (kit #1) y a-e (kit #2) fue de
280 microlitros. Los blancos contenían todos los componentes del
cocktail excepto la SS. La medición tuvo lugar en un
espectrofotómetro MultiSkan. Los valores obtenidos, tanto por el kit
de tipo "1" como por el kit de tipo "2" resultaron ser
comparables a las determinados haciendo uso de técnicas
cromatográficas descritas en la introducción
(Baroja-Fernández, E., Muñoz, F.J., Saikusa, T.,
Rodríguez-López, M., Akazawa, T.,
Pozueta-Romero, J. (2003) Sucrose synthase catalyzes
the de novo production of ADPglucose linked to starch biosynthesis
in heterotrophic tissues of plants. Plant Cell Physiol. 44,
500-509).
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Las Figuras 8-10 ilustran los
resultados obtenidos en hojas de plantas de patata que sobreexpresan
la SS tanto de manera constitutiva
(35S-SS-NOS), como de manera
específica (RBCS-SS-NOS).
Tal y como se ilustra en la Fig. 8, la actividad
SS en las hojas de cualquiera de estas plantas es
2-10 veces superior a la existente en el mismo
órgano de una planta silvestre (WT). Tales hojas presentaron las
siguientes características:
- 1.
- Clara correlación entre la actividad SS productora de ADPG (Fig. 8) y niveles de almidón (Fig. 9) y ADPG (Fig. 10). Tal característica se observó no solamente en hojas, sino también en tejidos de reserva tales como tubérculos y semillas (ver después).
- 2.
- Alto contenido en almidón (Fig. 9) respecto a hojas de plantas silvestres. Así por ejemplo, el contenido en almidón de una hoja de planta de patata "silvestre" crecida en un fotoperíodo de 8 horas luz/16 horas obscuridad y a 20ºC es de 5 micromoles/gramo de peso fresco, mientras que en una hoja de una planta transgénica que sobreextresa la SS es de 8 micromoles/gramo peso fresco. Las diferencias entre plantas silvestres y transgénicas se acentúan cuando el fotoperíodo es largo, de tal modo que las hojas de una planta que sobreexpresa SS contiene 4 veces más almidón que las de una silvestre.
- 3.
- Alto contenido en ADPG respecto al mismo tejido u órgano de la planta no transformada (Fig. 10). El contenido promedio de una hoja de planta de patata silvestre crecida en un fotoperíodo de 8 horas luz/16 horas obscuridad y a 20ºC es de 0.35 nanomoles/gramo de peso fresco, mientras que las hojas de las plantas que sobreexpresan SS pueden tener un contenido de 2.5 nanomoles/gramo de peso fresco.
\newpage
- 4.
- Tanto el ADPG como el almidón se acumulan de manera transitoria a lo largo del fotoperíodo (Fig. 11). La tasa de acúmulo de ambas sustancias guarda una correlación positiva con la actividad SS, indicando que, contrariamente a lo que el modelo "clásico" de biosíntesis de almidón sugiere (Fig. 2A) y confirmando las tesis del modelo "alternativo" ilustrado en la Fig. 2B, la SS juega un papel fundamental en la producción de ADPG y en la conexión del metabolismo de la sacarosa con el metabolismo del almidón.
- 5.
- Niveles normales de azúcares solubles tales como glucosa y fructosa. Sin embargo, los niveles de glucose-6-P y sacarosa en hojas transgénicas son superiores a los observados en las hojas de patata silvestres. La Tabla 2 muestra los niveles de metabolitos (reflejados en nmol/g peso fresco) en hojas de plantas control (WT) y 35S-SS-NOS source leaves. Valores significativamente diferentes a los observados en WT se indican en negrita.
- 6.
- La morfología externa de las plantas que sobreexpresan SS no es aberrante, tras ser comparada con la de las plantas no transformadas.
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Las Figuras 12-14 ilustran los
resultados obtenidos en tubérculos de patata que sobreexpresan la SS
de manera constitutiva (35S-SS-NOS).
Tales resultados son esencialmente idénticos a los observados en
tubérculos que sobre-expresan la SS bajo el control
de un promotor específico de tubérculo (promotor del gen de la
patatina).
Tal y como se ilustra en la Fig. 12, la
actividad SS en los tubérculos de cualquiera de estas plantas es
superior a la existente en el mismo órgano de una planta silvestre.
Tales tubérculos presentaron las siguientes características:
- 1.
- Clara correlación entre la actividad SS productora de ADPG (Fig. 12) y niveles de almidón (Fig. 13) y ADPG (Fig. 14).
- 2.
- Alto contenido en almidón (Fig. 13) respecto a tubérculos de plantas no transformadas. Así por ejemplo, el contenido en almidón de tubérculo de planta "silvestre" es de 300 micromoles/gramo de peso fresco, mientras que en tubérculo que sobreextresa la SS es de 450-600 micromoles/gramo peso fresco.
- 3.
- Alto contenido en ADPG respecto a tubérculos de plantas silvestres (Fig. 14). El contenido promedio de un tubérculo silvestre es de 5 nanomoles/gramo de peso fresco, mientras que los tubérculos que sobreexpresan SS pueden tener un contenido de 7-9 nanomoles/gramo de peso fresco.
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados obtenidos en semillas de arroz,
maíz, cebada y trigo, hojas de tomate y tabaco, así como en frutos
de tomate, son cualitativamente similares a los mostrados en las
Figuras 8-14. En todo caso se dio un incremento del
contenido de almidón.
La producción de plantas con alto contenido en
ADPG y almidón tras sobre-expresar SS es un
resultado totalmente inesperado según la percepción actual de la
biosíntesis del almidón (ilustrado en las Figs. 1A y 2A) y quizás
ello explica por qué no se han diseñado hasta ahora plantas que
sobre-expresen SS como estrategia de incremento de
producción de almidón. Los resultados obtenidos a partir de este
trabajo sugieren que la SS, pero no la AGPasa, es la fuente
fundamental de ADPG que se acumula en las plantas. Según los modelos
aún vigentes, la AGPasa es la única fuente de ADPG.
Sorprendentemente sin embargo, los niveles de ADPG jamás han sido
investigados en plantas deficitarias en AGPasa. Para explorar la
relevancia de nuestra invención hemos analizado por primera vez los
niveles de ADPG y almidón en plantas de Arabidopsis y patata con
reducida actividad AGPasa. Tal y como se ilustra en la Fig. 15A, los
niveles de almidón en plantas TL25 de arabidopsis deficitarias en
AGPasa (Lin, T.P., Caspar, T., Somerville, C.R., Preiss, J. (1988)
Isolation and characterization of a starchless mutant of
Arabidopsis thaliana lacking ADPglucose pyrophosphorylase
activity. Plant Physiol. 88, 1131-1135) son
reducidos respecto a los observados en las plantas WT. Sin embargo,
los niveles de ADPG son normales (Fig. 15B). Por otro lado, los
niveles de almidón en plantas AGP62 y AGP85 de patata
(Müller-Röber, B., Sonnewald, U., Willmitzer, L.
(1992) Inhibition of the ADPglucose pyrophosphorylase in transgenic
potatoes leads to sugar-storing tubers and
influences tuber formation and expression of tuber storage protein
genes. EMBO J. 11, 1229-1238) son reducidos con
respecto a los observados en hojas de plantas silvestres (Fig. 16A).
Sin embargo, los niveles de ADPG son totalmente normales (Fig. 16B).
En conjunto, todas estas observaciones (a) demuestran que SS, pero
no AGPasa, es la fuente principal de ADPG en plantas y (b)
contrastan la relevancia de nuestra invención tras demostrar que la
sobreexpresión de SS da lugar a plantas con alto contenido en
almidón.
Las Figuras 17-19 ilustran los
resultados obtenidos en tubérculos de plantas
35S-SS-NOS de patata cultivadas en
campo que sobre-expresan SS de manera constitutiva.
Tales resultados son esencialmente idénticos a los observados en
tubérculos que sobre-expresan SS bajo el control de
un promotor específico de tubérculo (promotor del gen de la
patatina).
La morfología externa de las plantas que
sobreexpresan SS no es aberrante, tras ser comparada con la de las
plantas no transformadas. Tal y como se ilustra en la Fig. 17, la
actividad SS en los tubérculos de cualquiera de estas plantas es
1.5-2 veces superior a la existente en el mismo
órgano de una planta silvestre. Además, tales tubérculos presentaron
un incremento de 35%-80% en el contenido en ADPG (Figura 18) y de un
40%-55% en el contenido en almidón (Figura 19). Así por ejemplo, el
contenido en almidón de tubérculo de las plantas control es de
aproximadamente 450 micromoles de glucosa/gramo de peso fresco,
mientras que en los tubérculos de las plantas que sobreextresan SS
es de 600-670 micromoles de glucosa/gramo peso
fresco. Por otro lado, el contenido promedio de ADPG de un tubérculo
control es de 4.5 nanomoles/gramo de peso fresco, mientras que los
tubérculos que sobreexpresan SS pueden tener un contenido de ADPG de
5.5-8 nanomoles/gramo de peso fresco. Al igual que
ocurre con el almidón, el aumento de la actividad SS da lugar a
tubérculos con una mayor textura que los tubérculos control (Tabla
3). La Tabla 3 muestra parámetros cualitativos (textura) y
cuantitativos (peso fresco, peso seco y contenido en almidón) de
tubérculos de plantas control y plantas que
sobre-expresan SS. Los resultados recogen la media y
desviación típica de 90 plantas diferentes por línea. Los valores
significativamente diferentes a los registrados en plantas control
se indican en negrita.
Los datos de productividad por unidad de
superficie indican que, si bien la productividad en Kg de peso
fresco por hectárea no se ve alterada por la
sobre-expresión de SS (tanto las plantas control
como las transgénicas producen entre 54 y 62 toneladas de tubérculos
por hectárea), tanto el peso seco como el almidón se ven
significativamente incrementados por la
sobre-expresión de SS (Tabla 3). Así, en la campaña
de 2006 el peso seco de tubérculos producido por hectárea por las
plantas control fue de 9606 \pm 543 kilogramos, mientras que el
peso seco de 5 líneas que sobre-expresan SS varió
entre 10,248 \pm 579 y 12,078 \pm 1,046 kilogramos por hectárea.
Por otro lado, el almidón de tubérculos producido por hectárea por
las plantas control fue de 4,468 \pm 181, mientras que el almidón
de tubérculos que sobre-expresan SS varió entre
6,022 \pm 20 179 y 7,466 \pm 180 kilogramos por hectárea.
Los datos de productividad (tanto de peso seco
como de almidón) por planta son consistentes con los obtenidos por
unidad de superficie. Así, una planta control produce 191.7 \pm
22.13 gramos de peso seco por planta, mientras que las plantas que
sobre-expresan SS producen entre 222.6 \pm 14.18 y
264.6 \pm 41.76 gramos de peso seco por planta. Por otro lado,
mientras que una planta control produce 134.0 \pm 7.78 gramos de
almidón por planta, las plantas que sobreexpresan SS producen entre
180.7 \pm 7.67 y 224.0 \pm 7.70 gramos de almidón por
planta.
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(Esquema pasa a página
siguiente)
\newpage
Esquema
I
\newpage
Esquema
II
\newpage
\newpage
\newpage
<110> UNIVERSIDAD PÚBLICA DE NAVARRA
\vskip0.400000\baselineskip
<120> "Plantas transgénicas con alto
rendimiento en peso seco y almidón cuyos órganos de reserva
presentan elevada textura, elevado contenido en almidón y elevado
rendimiento en peso seco".
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P-01712
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Solanum tuberosum
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de la región 5' de
SS4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctgccatggc tgaacgtgtt ttgac
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Solanum tuberosum
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador de la región 3' de
SS4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttcattcac tcagcagcca atggaac
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2418
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Solanum tuberosum
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SSX
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 841
\vskip0.400000\baselineskip
<212> proteína
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Solanum tuberosum
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SSX fusionada con una cola
aminoacídica rica en histidinas deducida tras la expresión de
SSX en el plásmido de expresión
pET-28a(+)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Solanum tuberosum
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador "forward" necesario
para la mutagénesis puntual de SSX.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgaacatgca ttcgaagaac ccctgaaatc cactcaggaa g
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Solanum tuberosum
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador "reverse" necesario
para la mutagénesis puntual de SSX.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcttcctgagt ggatttcagg ggttcttcga atgcatgttc g
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Solanum tuberosum
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador "forward" necesario
para la mutagénesis puntual de SSX.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcggagaagag acttacagca tctcaccctg aaattgatga gc
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Solanum tuberosum
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador "reverse" necesario
para la mutagénesis puntual de SSX.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctcatcaat ttcagggtga gatgctgtaa gtctcttctc cg
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Solanum tuberosum
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador "forward" necesario
para la mutagénesis puntual de SSX y obtención de
SS5.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 76
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<212> ADN
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<213> Solanum tuberosum
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador "reverse" necesario
para la mutagénesis puntual de SSX y obtención de
SS5.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2418
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Solanum tuberosum
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SS5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 841
\vskip0.400000\baselineskip
<212> proteína
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Solanum tuberosum
\vskip0.400000\baselineskip
<223> SS5 fusionada con una secuencia
aminoacídica rica en histidinas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400>
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (10)
1. Plantas transgénicas con alta actividad SS
caracterizadas por haber sido transformadas con una
construcción génica que codifica para la enzima SS y por presentar
rendimientos en peso seco y en almidón, superiores a los observados
en las correspondientes plantas silvestres.
2. Plantas transgénicas según la reivindicación
1 caracterizadas por que se han transformado con la
construcción génica 35S-SS-NOS.
3. Plantas transgénicas, según la reivindicación
2, caracterizadas porque sus órganos de reserva presentan un
rendimiento en almidón y en peso seco y adicionalmente, una textura,
superiores a los observados en los mismos órganos de las
correspondientes plantas silvestres.
4. Plantas transgénicas, según la reivindicación
2, caracterizadas porque la textura de los tubérculos de las
mismas es superior a 252 Newtons.
5. Plantas transgénicas, según la reivindicación
2, caracterizadas porque la textura de los tubérculos de las
mismas está entre 272 y 321 Newtons.
6. Plantas transgénicas, según la reivindicación
2, caracterizadas porque el rendimiento en peso seco de los
tubérculos de las mismas es superior a 214 g/planta.
7. Plantas transgénicas, según la reivindicación
2, caracterizadas porque el rendimiento en peso seco de los
tubérculos de las mismas está entre 208 y 307 g/planta.
8. Plantas transgénicas, según la reivindicación
2, caracterizadas porque el rendimiento en almidón de los
tubérculos de las mismas es superior a 142 g/planta.
9. Plantas transgénicas, según la reivindicación
2, caracterizadas porque el rendimiento en almidón de los
tubérculos de las mismas se encuentra entre 173 y 232 g/planta.
10. Plantas transgénicas, según cualquiera de
las reivindicaciones anteriores, caracterizadas por
seleccionarse preferentemente entre plantas de tabaco, patata,
tomate, arroz, cebada, trigo o maíz.
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| ES200703413A Active ES2342246B1 (es) | 2004-02-05 | 2007-12-21 | Plantas transgenicas con alto rendimiento en peso seco y almidon cuyos organos de reserva presentan elevada textura, elevado contenido en almidon y elevado rendimiento en peso seco. |
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