DE102020111560A1

DE102020111560A1 - Enzymkaskaden auf Basis von Saccharose Synthase und Pyrophosphorylase zur Umsetzung von ADP zu ATP

Info

Publication number: DE102020111560A1
Application number: DE102020111560.1A
Authority: DE
Inventors: Lothar Elling; Johannes Gottschalk; Hannes Frohnmeyer
Original assignee: Rheinisch Westlische Technische Hochschuke RWTH
Current assignee: Rheinisch Westlische Technische Hochschuke RWTH
Priority date: 2020-04-28
Filing date: 2020-04-28
Publication date: 2021-10-28
Also published as: EP4143328A1; WO2021219463A1; US20230175029A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur mehrstufigen enzymatischen Umsetzung von Adenosindiphosphat (ADP) zu Adenosintriphosphat (ATP), wobei das Verfahren die Schritte umfasst:a) Enzymkatalysierte Umsetzung von Adenosindiphosphat in Gegenwart von Saccharose und einer Saccharose Synthase zu Adenosindiphosphat-Glucose; und b) Enzymkatalysierte Umsetzung der im Verfahrensschritt a) gebildeten Adenosindiphosphat-Glucose in Gegenwart von anorganischem Pyrophosphat und einer Pyrophosphorylase zu Adenosintriphosphat und Glucose-1-Phosphat. Des Weiteren betrifft die Erfindung die Verwendung des Verfahrens zur Herstellung von Zuckerphosphaten, Nukleotidzuckern, Glykanen, Glykoproteinen, Glykolipiden oder Glykosaminoglykanen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur mehrstufigen enzymatischen Umsetzung von Adenosindiphosphat (ADP) zu Adenosintriphosphat (ATP), wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

a) Enzymkatalysierte Umsetzung von Adenosindiphosphat in Gegenwart von Saccharose und einer Saccharose Synthase zu Adenosindiphosphat-Glucose; und b) Enzymkatalysierte Umsetzung der im Verfahrensschritt a) gebildeten Adenosindiphosphat-Glucose in Gegenwart von anorganischem Pyrophosphat und einer Pyrophosphorylase zu Adenosintriphosphat und Glucose-1-Phosphat. Des Weiteren betrifft die Erfindung die Verwendung des Verfahrens zur Herstellung von Zuckerphosphaten, Nukleotidzuckern, Glykanen, Glykoproteinen, Glykolipiden oder Glykosaminoglykanen.

Die effiziente und reproduzierbare Synthese definierter Makromoleküle bildet bis heute für die Wissenschaft und Industrie immer noch eine große Herausforderung. Zwar lassen sich für eine Vielzahl von Synthesen prinzipiell mögliche Lösungswege angeben, dennoch ist die erfolgreiche Überführung in den Großmaßstab, unter den Randbedingungen einer kostengünstigen und ausbeutestarken Produktion, nicht in sämtlichen Fällen darstellbar. Dies gilt insbesondere für biologische Makromoleküle, deren Funktionalität, neben der eigentlichen Zusammensetzung, auch auf einer spezifischen, dreidimensionalen Struktur basiert. Ein Vertreter dieser Substanzklasse ist die Hyaluronsäure (Hyaluronan, HA), ein nicht-sulfatiertes Glykosaminoglykan (GAG), welches aus sich wiederholenden Disaccharideinheiten von β1,4-D-Glucuronsäure und β1,3-N-Acetyl-D-glucosamin (4G1cAβ1-3G1cNAcβ1-) aufgebaut ist. Die HA stellt die Hauptkomponente der extrazellulären Matrix (ECM) dar und ein einzelnes Molekül kann ein Molekulargewicht (MW) von bis zu 10 MDa erreichen. Während es in den letzten Jahren gelungen ist, eine Vielzahl biologischer Herstellverfahren zur Marktreife zu bringen, wiesen diese Verfahren aber immer noch den Nachteil auf, dass HA mit nur relativ „geringen“ Molekulargewichten, beispielsweise bis zu 500 kDa, wirtschaftlich vernünftig bereitgestellt werden kann. Insbesondere höhere Molekulargewichte mit definierter Molekulargewichtsverteilung sind zurzeit in größeren Mengen zu vertretbaren Kosten noch nicht erhältlich. Letzteres liegt unter anderem daran, dass für die üblicherweise über Fermentation gewonnene HA, teure Edukte, wie beispielsweise Adenosintriphosphat (ATP), eingesetzt werden müssen.
In der Biotechnologie findet Adenosintriphosphat (ATP) eine breite Anwendung in der Synthese von Feinchemikalien, Pharmazeutika, oder Biopolymeren durch Biotransformation und Biokatalyse. Da ATP ein großer Kostenfaktor ist, wird eine Regeneration verbrauchten ATPs angestrebt. Dadurch können einerseits Kosten gesenkt und andererseits die Limitationen ATP abhängiger Reaktionen gemindert werden.
Die am häufigsten genutzte Methode für die ATP Regeneration umfasst die Phosphorylierung von ADP mit Phosphoenolpyruvat (PEP) mittels einer Pyruvatkinase (PK). Dieses System ist aber Limitationen unterworfen, da in dieser Reaktion Pyruvat freigesetzt wird, welches inhibitorisch auf die PK wirkt. Diese Freisetzung beeinträchtigt die gesamte Effizienz der ATP Regeneration. Zum anderen ist PEP ein sehr teures Substrat und teurer als ATP, was direkt die Wirtschaftlichkeit der ATP Regeneration reduziert. Neuere Ansätze zur ATP Regeneration nutzen Polyphosphate (PolyP) und Polyphosphatkinasen (PPK). Es werden langkettige PolyPs eingesetzt, um mit hoher Effizienz ATP aus ADP zu regenerieren. Allerdings wird dieses System durch undefinierte Kettenlängen der PolyPs beeinträchtigt, da Polyphosphate bisher nicht in einheitlichen Kettenlängen gewonnen werden können. Daher variieren die erreichbaren ATP Regenerationszyklen. Des Weiteren können Polyphosphate durch PPKs nicht vollständig abgebaut werden, was eine Verunreinigung des Syntheseansatzes mit Polyphosphatresten zur Folge hat. Diese müssen wiederum abgebaut oder vom Produkt abgetrennt werden. Die Möglichkeit PPi direkt für die ATP Synthese zu verwenden, ist bisher für diese Enzymklasse nicht beschrieben.
Auch in der Patentliteratur finden sich die unterschiedlichsten Ansätze zu enzymatischen Umsetzungen von ATP-Derivaten oder -Abbauprodukten wie ADP.
So offenbart beispielsweise die DE 60 2005 026 917 D1 ein Verfahren zur Herstellung rekombinanter Saccharose-Synthase, Verwendung davon bei der Herstellung von Kits zur Saccharosebestimmung, sowie Verfahren zur Herstellung von ADP-Glucose und Verfahren zur Erhaltung transgener Pflanzen mit Blättern und Speicherorganen, in denen sich ADP-Glucose und Stärke in hoher Konzentration anreichern.
Des Weiteren offenbart die CN 101 294 167 A ein Verfahren zur Herstellung von Wasserstoff durch Kultivieren von wasserstoffproduzierenden Mikroben in einem Kulturmedium, das Phosphatöle enthält. In dieser Schrift wird Phosphat in einer zellulären Umgebung hinzugefügt, um gleichzeitig ein schnelles Wachstum und eine schnelle Gewinnung von ATP zu fördern, wodurch der ATP-Spiegel und das Oxidations-Reduktions-Potential in Zellen gesteuert und der Verbrauch der Kohlenstoffquelle sowie die Produktionseffizienz und der Wasserstoff beschleunigt werden. Zusätzlich kann das Phosphat im Kultursystem recycelt werden, ohne die Umwelt zu kontaminieren.
In einem weiteren Patentdokument, der US 2007 005 4283 A1 , wird ein kostengünstiges DNA-Sequenzierungsverfahren mit hoher Empfindlichkeit bereitgestellt. Das Verfahren umfasst die Schritte des Hinzufügens einer gegebenen Menge an dATP für die schrittweise komplementäre Strangsynthese und des Subtrahierens der durch dATP verursachten Hintergrundlumineszenzintensität von der gemessenen Lumineszenzintensität, um die an der komplementären Strangsynthese beteiligte Lumineszenzintensität zu erhalten.
Derartige aus dem Stand der Technik bekannte Lösungen können noch weiteres Verbesserungspotential bieten, insbesondere hinsichtlich der gesteuerten enzymatischen Bereitstellung von ATP innerhalb komplexer Umsetzungen durch die Aufarbeitung von ATP-Abbauprodukten, wobei die Umsetzungen im hohen Maße flexibel in größeren Enzymkaskaden einsetzbar ist.
Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die aus dem Stand der Technik bekannten Nachteile zumindest teilweise zu überwinden. Es ist insbesondere die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein verbessertes Verfahren und eine verbesserte Verwendung bereitzustellen, in welchen ATP aus ATP-Abbauprodukten enzymatisch wiedergewonnen wird, wobei die Aufarbeitung auch in komplexen Reaktionsumgebungen mit weiteren Enzymen und Edukten ohne signifikante Wechselwirkungen erfolgt.
Die Lösung der Aufgabe erfolgt durch die Merkmale der unabhängigen Ansprüche, gerichtet auf das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Verwendung des Verfahrens. Bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen, in der Beschreibung oder den Figuren angegeben, wobei weitere in den Unteransprüchen oder in der Beschreibung oder den Figuren beschriebene oder gezeigte Merkmale einzeln oder in einer beliebigen Kombination einen Gegenstand der Erfindung darstellen können, solange sich aus dem Kontext nicht eindeutig das Gegenteil ergibt.
Die Lösung der Aufgabe erfolgt erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur mehrstufigen enzymatischen Umsetzung von Adenosindiphosphat zu Adenosintriphosphat, wobei das Verfahren mindestens die Schritte umfasst:

a) Enzymkatalysierte Umsetzung von Adenosindiphosphat in Gegenwart von Saccharose und einer Saccharose Synthase zu Adenosindiphosphat-Glucose; und
b) Enzymkatalysierte Umsetzung der im Verfahrensschritt a) gebildeten Adenosindiphosphat-Glucose in Gegenwart von anorganischem Pyrophosphat und einer Pyrophosphorylase zu Adenosintriphosphat und Glucose-1-Phosphat;

Überraschenderweise wurde gefunden, dass sich mittels einer Kombination aus einer Saccharose Synthase (Sucrose Synthase, SuSy) und einer ADP-Glucose Pyrophosphorylase (AGPase) sich aus Saccharose (Suc) und anorganischem Pyrophosphat (PPi) ATP aus ADP zurückbilden lässt. Die erfindungsgemäße Enzymkaskade generiert kein freies Phosphat (Pi) und die 2-stufige Kaskade ist zudem im hohen Maße robust und flexibel, sodass sich diese mit anderen oder weiteren Enzymkaskaden kombinieren lässt, in denen ATP benötigt wird (z.B. Kinasen). Zudem können diese Teilschritte in Kombination mit Enzymkaskaden genutzt werden, in denen PPi gebildet wird, welches dann aus dem Gleichgewicht entfernt und effizient zur ATP Synthese genutzt werden kann. Die eingesetzten Edukte sind im Vergleich zu den im Stand der Technik vorgeschlagenen Edukten preiswert und die einzelnen Verfahrensschritte können zusammen oder unabhängig voneinander in breiten Temperatur- und Konzentrations-Parameterbereichen gefahren werden. Im Vergleich zum Stand der Technik ist das System also befähigt, in einem Pyrophosphat (PPi) freisetzendem Prozess eine ATP Regeneration aus PPi und Saccharose in mehreren Zyklen durchzuführen. Die dazu nötige Energie wird durch den Zusatz von Saccharose und PPi erhalten, was zum einen die Menge an insgesamt zuzusetzenden ATP reduziert und zum anderen den Prozess phosphatfrei hält. Des Weiteren kann das System auch für Prozesse verwendet werden, welche kein PPi freisetzen, indem diesen dann PPi separat zugeführt wird. Dabei ist die Menge an regeneriertem ATP äquivalent zur eingesetzten PPi-Menge. Dies kann ebenfalls die Menge an einzusetzenden ATP in der Reaktion deutlich verringern. Die Enzymkaskade kann mit ATP verbrauchenden Synthesen einfach kombiniert und für die ATP Regeneration aus den preiswerten und stabilen Substanzen Saccharose und PPi angewendet werden. Die Enzymkaskade setzt kein Phosphat frei, welches die Synthese und Produktaufreinigung im großen Maßstab begünstigt. So fällt beispielsweise kein Magnesiumphosphat an. Aufgrund der günstigen Marktpreise der Energielieferanten bietet sich diese Umsetzung insbesondere für large-scale in vitro Synthesen an, welche zudem durch die Möglichkeit einer einfachen Prozessführung in nur einer Reaktionslösung besonders einfach ausgestaltet werden können.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist ein Verfahren zur mehrstufigen enzymatischen Umsetzung von Adenosindiphosphat zu Adenosintriphosphat. Die Umsetzung von ADP zu ATP erfolgt also über den Einsatz mindestens zweier, unterschiedlicher Enzyme, wobei das ATP nicht innerhalb eines einzigen, sondern über mehrere Schritte, also über mindestens ein, potentiell isolierbares, Zwischenprodukt gebildet wird. Innerhalb der Umsetzung wird ADP nach der folgenden Strukturformel
in ATP mit der folgenden Strukturformel
an den katalytischen Zentren mindestens zweier Enzyme umgewandelt.
Das Verfahren umfasst den Verfahrensschritt a) der enzymkatalysierten Umsetzung von Adenosindiphosphat in Gegenwart von Saccharose und einer Saccharose Synthase (SuSy) zu Adenosindiphosphat-Glucose. Der erste Schritt erfolgt mittels einer bakteriellen oder pflanzlichen Saccharose Synthase in einer wässrigen Lösung. Zur Reaktion ist die Gegenwart, die Zugabe oder die Bildung von Saccharose in der Lösung zwingend und durch die Aktivität der Synthase wird das ADP in Adenosindiphosphat-Glucose (ADP-Glc) unter Abbau der Saccharose (Suc) zu Fructose (Fru) umgewandelt. Die Reaktion im ersten Teilschritt lässt sich über folgende Reaktionsteilgleichung darstellen: ADP + Suc ↔ ADP-Glc + Fru.
Der Reaktionsteilschritt kann bei einer Temperatur von größer oder 15°C und kleiner oder gleich 50°C, bevorzugt von größer oder 25°C und kleiner oder gleich 40°C durchgeführt werden. Die Reaktionslösung kann über ein Puffersystem im pH-Wert gepuffert vorliegen. Die SuSy Konzentrationen können größer oder 0,001 µg/L und kleiner oder gleich 5 µg/L, bevorzugt von größer oder 0,01 µg/L und kleiner oder gleich 1 µg/L betragen. Bevorzugte Konzentration der Suc können größer oder 50 mM und kleiner oder gleich 500 mM, bevorzugt größer oder 100 mM und kleiner oder gleich 350 mM betragen.
Das Verfahren umfasst den Verfahrensschritt b) der enzymkatalysierten Umsetzung der im Verfahrensschritt a) gebildeten Adenosindiphosphat-Glucose (ADP-Glc) in Gegenwart anorganischem Pyrophosphats (PPi) und einer Pyrophosphorylase (AGPase) zu Adenosintriphosphat (ATP) und Glucose-1-Phosphat (Glc-1-P). Der zweite Schritt erfolgt mittels einer AGPase in einer wässrigen Lösung. Zur Reaktion ist die Gegenwart, die Zugabe oder die Bildung von PPi in der Lösung zwingend und durch die Aktivität der AGPase wird das ADP-Glc unter Verbrauch des PPi in Glc-1-P und ATP umgewandelt. Die Reaktion im zweiten Teilschritt lässt sich über folgende Reaktionsteilgleichung darstellen: ADP-Glc + PP_i ↔ Glc-1-P + ATP.
Der Reaktionsteilschritt kann bei einer Temperatur von größer oder 15°C und kleiner oder gleich 50°C, bevorzugt von größer oder 25°C und kleiner oder gleich 40°C durchgeführt werden. Die Reaktionslösung kann über ein Puffersystem im pH-Wert gepuffert vorliegen. Die AGPase Konzentrationen können größer oder 500 µg/L und kleiner oder gleich 5000 µg/L, bevorzugt von größer oder 1000 µg/L und kleiner oder gleich 4000 µg/L betragen. Bevorzugte PPi-Konzentrationen können größer oder 0,1 mM und kleiner oder gleich 100 mM, bevorzugt größer oder 1 mM und kleiner oder gleich 35 mM betragen.
In Summe lassen sich also beide enzymatischen Verfahrensschritte über folgende Reaktionsgleichung beschreiben: ADP + Suc + PP_i ↔ ATP + Fru + Glc-1-P.
Die Verfahrensschritte a) und b) werden in wässriger Lösung durchgeführt und können gleichzeitig oder nacheinander erfolgen. Die mehrstufige Reaktion kann in einer einzigen Lösung oder aber auch in getrennten Lösungen ablaufen, wobei dann Teilmengen der Flüssigkeiten ausgetauscht werden. Die Verfahrensführung kann dabei so ausgestaltet sein, dass die Edukte von Anfang der Umsetzung in der Reaktionslösung vorliegen. Es ist aber auch möglich, dass die Edukte und oder die Enzyme im Laufe der Reaktion zugegeben werden. Weiterhin ist es möglich, dass die zur Syntheseleistung der Enzyme nötigen Substanzen erst durch andere Reaktion im Verlauf der Reaktion gebildet werden. Dazu können diese weiteren Reaktionen an anderen Reaktionsorten oder aber in ein der derselben Lösung der Verfahrensschritte a) und/ oder b) stattfinden. Die beiden Enzyme können sich dabei „frei“ in der Reaktionslösung bewegen oder aber ein oder beide Enzymsysteme können an oder auf Trägern gebunden in der Lösung vorliegen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens können die Verfahrensschritte a) und b) in einer gemeinsamen wässrigen Reaktionslösung durchgeführt werden. Für einen effizienten Verfahrensablauf können die Verfahrensschritte a) und b) als „Eintopf“-Reaktion in ein und derselben Reaktionslösung stattfinden. Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass die vorgeschlagenen Verfahrensschritte mit hoher Effizienz unter denselben Reaktionsbedingungen durchgeführt werden können. Durch die Kopplung der beiden Teilschritte in einer Lösung kann der Verfahrensaufwand geringgehalten werden. Es ergeben sich signifikante Reaktionsgeschwindigkeiten und hohe Raum-Zeitausbeuten. Dies ist insbesondere deshalb erstaunlich, da bei den hier vorgeschlagenen enzymatischen Teilumsetzungen man mit kompetitiven Hemmungen oder anderen negativen Effekten in der enzymatischen Leistungsfähigkeit rechnen musste. Diese wurden aber erstaunlicherweise nicht oder nur in geringen Maßen festgestellt, wobei sich auch eine synergistische Steigerung der Leistung durch die Kopplung beider Systeme in der Lösung einstellen kann.
Im Rahmen einer bevorzugten Verfahrensausgestaltung können die Verfahrensschritte a) und b) gleichzeitig durchgeführt werden. Es hat sich zudem als besonders vorteilhaft herausgestellt, dass beide Umsetzungsschritte gleichzeitig durchgeführt werden. Beide Schritte werden gleichzeitig durchgeführt, indem zumindest Teil- oder Gesamtmengen beider Enzyme zu Anfang der Reaktion in einer gemeinsamen Reaktionslösung vorliegen und das gebildete Zwischenprodukt immer im Gleichgewicht zu beiden Enzymsystemen steht. Die gleichzeitige Verfahrensausgestaltung umfasst explizit nicht, dass beide Teilschritte mit derselben Geschwindigkeit oder aber, dass zeitlich gesehen immer die gleiche Menge an Zwischen-/Endprodukt erhalten wird.
Innerhalb eines weiteren, bevorzugten Aspektes des Verfahrens kann der pH-Wert im Verfahrensschritt a) und/oder b) größer oder gleich 5,0 und kleiner oder gleich 8,5 betragen. Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass sowohl der Verfahrensschritt a) wie auch der Verfahrensschritt b) innerhalb eines relativ begrenzten pH-Wertebereiches mit hohen Umsätzen durchgeführt werden können. Die Reaktionsgeschwindigkeiten der Teilschritte der hier vorgestellten Enzymkaskade liegen also in denselben Teilbereichen des pH-Spektrums und ermöglichen somit die bevorzugte gleichzeitige Ausführung der Teilreaktionen in nur einer wässrigen Prozesslösung, ohne dass sich eine signifikante Reduzierung der Reaktionsgeschwindigkeiten in den einzelnen Teilstufen einstellt.
In einer bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens kann der Verfahrensschritt a) und/oder b) in Gegenwart von Fruktose-1,6-Bisphosphat in einer Konzentration von größer oder gleich 5 µM und kleiner oder gleich 200 µM durchgeführt werden. Zur Steigerung der Reaktionsgeschwindigkeit und zur Verbesserung der ATP-Regeneration hat sich der Zusatz von Fruktose-1,6-Bisphosphat in oben angegebener Konzentration als besonders geeignet erwiesen. Durch den Zusatz wird nicht nur ein, sondern beide Teilschritte der Umsetzung beschleunigt, welches in dieser Art nicht zu erwarten war. Insofern kann der Zusatz insbesondere die Durchführung der Reaktion in nur einer Reaktionslösung verbessern und die ATP-Regenerationsleistung erhöhen.
Innerhalb einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens kann das anorganische Pyrophosphat im Verfahrensschritt b) durch eine enzymkatalysierte Umsetzung in der wässrigen Lösung gebildet werden. Zur Steuerung der Umsetzung innerhalb der Kaskade hat es sich als besonders vorteilhaft herausgestellt, dass das anorganische Pyrophosphat in-situ gebildet und nicht separat von außen dazugegeben wird. Dies hat den Vorteil, dass die lokalen PPi-Mengen klein gehalten werden können, welches wiederum die katalytische Leistung der Enzyme durch Reduzierung inhibitorischer Substanzen verbessert.
Nach einer bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens kann das im Verfahrensschritt b) gebildete Glucose-1-Phosphat durch eine weitere enzymatische Umsetzung aus der wässrigen Lösung entfernt werden. Zur Erhöhung der ATP-Synthese hat es sich als besonders vorteilhaft herausgestellt, dass ein Teil der Produkte durch eine weitere enzymatische Umsetzung aus dem Gleichgewicht entfernt werden. Diese Entfernung kann beispielsweise durch einen weiteren, enzymkatalysierten Schritt mit einem Enzym ausgesucht aus der Gruppe bestehend aus Phosphoglucomutase, Glucose-1-Phosphatase, Nukleosid-Triphosphat-Mononsaccharid-l-Phosphat-Nukleotidylyltransferasen, Uridin-Triphosphat-Monosaccharid-l-Phosphat-Uridylyltransferase, Disaccharid-Phosphorylasen wie beispielsweise Saccharose Phosphorylase oder Trehalose Phosphorylase oder Mischungen mindestens zweier dieser Enzyme erfolgen. Diese Enzyme haben sich für diese Aufgabe als besonders geeignet herausgestellt und interagieren in nur geringen Maßen mit den weiteren Kaskadenschritten, sodass auch hier eine Eintopf-Reaktion ohne Reduzierung der Grundausbeute gefahren werden kann.
Des Weiteren erfindungsgemäß ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur in-situ Bereitstellung von Adenosintriphosphat in mehrstufigen, Adenosintriphosphat-verbrauchenden Enzymkaskaden in der Herstellung von Verbindungen ausgesucht aus der Gruppe bestehend aus Zuckerphosphaten, Nukleotidzuckern, Glykanen, Glykoproteinen, Glykolipiden, Glykosaminoglykanen, Phospho-Adenosin-Phosphosulfat, nukleotidaktivierte Verbindungen oder Mischungen mindestens zweier Verbindungen aus dieser Gruppe. Die vorliegende Bereitstellung von ATP durch die Regeneration von ATP-Abbauprodukten kann sich insbesondere für die Herstellung obenstehender Substanzen in größeren Enzymkaskaden eignen. Die zwei-schrittige Umsetzung ist robust und tolerant gegenüber der Anwesenheit weiterer Enzyme und Verbindungen und es kann insofern eine langanhaltende, gesteuerte ADP-Aufarbeitung erfolgen, ohne dass neues Enzym oder ATP dem System zugesetzt werden muss. Die vorgeschlagene Kaskade ist zudem unter verschiedenen Umgebungsbedingungen einsetzbar, sodass die ATP-Regeneration als ein flexibler Baustein im Rahmen der Substanzsynthese eingesetzt werden kann. Zudem kann über die Wahl der einzelnen Enzymkonzentrationen genau die benötigte Regenerierungsrate eingestellt werden. Insofern kann über einen einfachen Zusatz der erfindungsgemäßen Kaskade zu den Synthesekaskaden eine zusätzliche Steigerung der Syntheseleistung erzielt werden. Insgesamt kann die Regenerations-Kaskade zu einer Verlängerung der Standzeiten der Synthesekaskaden und zu einer Optimierung der Raum-Zeit-Ausbeuten beitragen.
Innerhalb einer bevorzugten Ausführungsform der Verwendung kann die Adenosintriphosphat-verbrauchende Enzymreaktion die Umsetzung von N-Acetylglucosamin (GlcNAc) und Adenosintriphosphat (ATP) zu N-Acetylglucosamin-l-Phosphat (GlcNAc-1-P) und Adenosindiphosphat (ADP) mittels einer N-Acetylhexosamin 1-kinase (BlNahK) umfassen. Die vorgeschlagene ATP-Regenration kann insbesondere mit Teil- oder Gesamtkaskaden im Rahmen einer enzymatischen Hyaluronsäureproduktion besonders effiziente Synthesen ermöglichen. So kann beispielsweise die oben beschriebene Umsetzung des N-Acetylglucosamins nach folgender Gleichung dem Gleichgewicht der vorgeschlagenen zwei-schrittigen Kaskade vor- oder parallelgeschaltet sein: GlcNAc + ATP ↔ GlcNAc-l-P + ADP.
Die Reaktion läuft mittels BlNahK katalysiert unter Verbrauch von ATP zu ADP enzymkatalysiert ab. Das verbrauchte ATP kann über die Umwandlung oder durch den Einsatz von PPi wieder dem System zugeführt werden. Diese Regeneration kann die Laufzeiten der Synthese ohne Zusatz weiteren ATPs verlängern. Die Gesamtreaktion im Rahmen dieser Verwendung lässt sich inklusive der beschriebenen ATP-Regeneration wie folgt darstellen: GlcNAc + PP_i + Suc ↔ GlcNAc-l-P + Glc-l-P + Fru.
In einer bevorzugten Ausgestaltung der Verwendung kann das N-Acetylglucosamin-l-Phosphat in einer weiteren enzymatischen Umsetzung unter Einsatz von Uridin-Triphosphat mittels einer Uridin-Diphosphat-N-acetylglucosamine diphosphorylase zu Uridin-Diphosphat-N-Acetylglucosamin und anorganischem Pyrophosphat umgesetzt werden. Zur Verschiebung des Gleichgewichtes der Enzymeinzelschritte hat es sich als besonders vorteilhaft herausgestellt, dass beispielsweise für eine Hyaluronsäuresynthese das gebildete N-Acetylglucosamin-l-Phosphat im Rahmen einer weiteren Umsetzung aus dem System entfernt wird. Neben der Verschiebung des Gleichgewichtes wird über die hier beschriebene Art der Entfernung zudem erreicht, dass im Prozess gezielt PPi generiert wird. Dieses PPi kann in den nachfolgenden Schritten als Edukt herangezogen werden, sodass bestenfalls auf die Zugabe weiteren PPi verzichtet werden kann. Dieser Teilschritt lässt sich über folgende Gleichung darstellen: GlcNAc-l-P + UTP ↔ UDP-GlcNAc + PPi.
In Rahmen einer Gesamtbetrachtung des 4-stufigen Systems inklusive der zwei Schritte der ATP-Regeneration kann sich folgende Gesamtreaktionsgleichung ergeben: GlcNAc + Suc + UTP ↔ UDP-GlcNAc + Fru + Glc-l-P.
In einem weiter bevorzugen Aspekt der Verwendung kann das im Verfahrensschritt b) gebildete Glucose-1-Phosphat durch weitere enzymatische Umsetzung unter Einsatz von Uridin-Triphosphat mit einer Uridin-Triphosphat-Monosaccharid-l-Phosphat-Uridylyltransferase zu Uridin 5'-diphosphoGlucose und anorganischem Pyrophosphat umgesetzt werden. Generell kann es, unabhängig von den vorgelagerten Kaskadenschritten sinnvoll sein, dass das im letzten Schritt der Regeneration gebildete Glc-1-P aus dem Gleichgewicht entfernt wird. Dabei hat es sich als besonders effizient erwiesen, diesen Schritt ebenfalls enzymatisch auf Basis einer Uridylyltransferase zu vollziehen. Durch diesen Schritt wird nicht nur Produkt aus dem Gleichgewicht entfernt und das Gleichgewicht in Richtung Produkte verschoben, es wird auch gleichzeitig PPi zur weiteren Reaktion bereitgestellt. Dies kann die gesamten Produktionskosten reduzieren und zu einer bedarfsgerechten PPi Bereitstellung beitragen. Eine mögliche Reaktionsgleichung für diesen Einzelschritt ergibt sich zu: Glc-1-P + UTP ↔ UDP-Glc + PPi.
Innerhalb einer Gesamtbetrachtung mit den vorgelagerten Kaskadenschritten zur Produktion von Hyaluronsäure oder -derivaten kann sich folgende Gleichung ergeben: GlcNAc + Suc + 2UTP ↔ UDP-GlcNAc + Fru + UDP-Glc + PP_i.
Im Rahmen eines bevorzugten Aspektes der Verwendung kann das im Verfahrensschritt b) gebildete Glucose-1-Phosphat durch weitere enzymatische Umsetzung mit einer Phosphoglucomutase zu Glucose-6-Phosphat umgesetzt werden. Eine weitere Möglichkeit zur Umsetzung des Glc-1-P in der Reaktionslösung durch einen enzymatischen Schritt ist über den Einsatz einer Phosphoglucomutase gegeben. Der Einsatz kann in derselben Reaktionslösung der vorherigen Schritte erfolgen und insofern ergibt sich ein flexibles und effizientes ATP-Regenerationssystem. Diese Umsetzung lässt sich darstellen als: Glc-1-P ↔ Glc-6-P.
Im Rahmen der Gesamtbetrachtung der Verwendung ergibt sich folgende Gesamtgleichung: GlcNAc + Suc + UTP ↔ UDP-GlcNAc + Fru + Glc-6-P.
Weitere Vorteile und vorteilhafte Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Gegenstände werden durch die Beispiele und Zeichnungen veranschaulicht und in der nachfolgenden Beschreibung erläutert. Dabei ist zu beachten, dass die Zeichnungen nur beschreibenden Charakter haben und nicht dazu gedacht sind, die Erfindung einzuschränken.
Die Figuren zeigen:

1 eine erfindungsgemäße zwei-schrittige Enzymkaskade;
2-4 die analytischen Ergebnisse der zwei-schrittigen Enzymkaskade;
5 eine erfindungsgemäße zwei-schrittige Enzymkaskade unter in-situ Generation von PPi;
6-9 die analytischen Ergebnisse der zwei-schrittigen Enzymkaskade;
10 eine 3-schrittige Kaskade auf Basis der erfindungsgemäßen Einzelschritte;
11-13 die analytischen Ergebnisse der drei-schrittigen Enzymkaskade;
14 eine 4-schrittige Kaskade auf Basis der erfindungsgemäßen Einzelschritte;
15-16 die analytischen Ergebnisse der 4-schrittigen Enzymkaskade;
17 eine 5-schrittige Kaskade auf Basis der erfindungsgemäßen Einzelschritte;
18-21 die analytischen Ergebnisse der 5-schrittigen Enzymkaskade;
22 eine 5-schrittige Kaskade auf Basis der erfindungsgemäßen Einzelschritte.
23-25 die analytischen Ergebnisse der 5-schrittigen Enzymkaskade;
26-28 die analytischen Ergebnisse zur Charakterisierung der EcAGPase.

Beispiele
I. Die verwendeten Enzyme

In den folgenden Beispielen wurden die folgenden Enzyme verwendet:

Enzym	EC-Nummer	Herkunft	MWC O [kDa]	Vektor pET	Produktionsstamm	Tag
EcAGPase	2.7.7.27.	E.coli	49	22b	E.coli BL21 (DE3)	Hi_S6
CgAGPase	2.7.7.27.	Corynebacterium glutamicum	44	22b
NeSuSy	2.4.1.13.	Nitrosomonas europea	91	22b
AtUSP	2.7.7.64.	Arabidopsis thaliana	68	16b
SzGlmU	2.7.7.23.	Streptococcus equi zooepidemicus	49	22b
BlNahK	2.7.1.162.	Bifidobacterium longum	40	22b
PmPpA	3.6.1.1.	Pasteurella multocida	19	22b

Die Zellen wurden mit dem entsprechenden Vektor über Hitzeschock transformiert und die Proteine in „terrific broth“ (TB) Medium über Nacht mittels Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) Induktion exprimiert. Der Zellaufschluss erfolgte durch Ultraschallbehandlung und die exprimierten Enzyme wurden mittels Ni²⁺-Immobilisierte-Metallionen-Affinitätschromatographie (IMAC) auf HisTrap ™ HP Säulen (GE Healthcare, Chicago, USA) an einem ÄKTApurifier ™ (GE Healthcare, Chicago, USA) System gereinigt. Anschließend erfolgte die Dialyse des Eluates mittels Dialyseschlauch (C. Roth, Karlsruhe, Deutschland) über Nacht im jeweiligen Lagerpuffer des Enzyms. Die Lagerung der EcAGPase und der CgAGPase erfolgte in 100 mM HEPES pH 8; die NeSuSy in 100 mM Tris-HCl pH 7 und die restlichen Enzyme in 100 mM HEPES pH 7,5. Die Proteinkonzentrationen der Eluate wurden nach der Dialyse mittels Bradford-Assay durch Nutzung der Lösung RotiQuant (C. Roth, Karlsruhe, Germany) durchgeführt.
II. Die erfindungsgemäße zwei-stufige Enzym-Kaskade
Das Reaktionsschema der ATP Synthesereaktion aus Saccharose (Suc) und anorganischem Pyrophosphat (PPi) mittels der Kopplung von EcAGPase und CgAGPase ergibt sich in den Teilschritten a) und b) und in der Gesamtbetrachtung zu:

a) ADP + Suc ↔ ADP-Glc + Fru
b) ADP-Glc + PP_i ↔ Glc-l-P + ATP
Σ) ADP + Suc + PP_i ↔ ATP + Fru + Glc-l-P

Das Zusammenspiel der einzelnen enzymatischen Kaskadenelemente ist in der 1 dargestellt.
EcAGPase (2,9 mg/mL) und NeSuSy (0,1 µg/mL) werden in einer Ein-Topf Synthese zusammengeführt, um ATP aus Saccharose und PPi zu synthetisieren. Hierzu liegen in der Versuchsreihe ADP und PPi in einem Konzentrationsverhältnis von 1:1 in jeweils verschiedenen Konzentrationen (2 mM bis 15 mM) vor. Zusätzlich enthält der Syntheseansatz eine MgCl₂-Konzentration, die der Summe der Konzentration von ADP und PPi im jeweiligen Versuch entspricht (4 mM bis 30 mM). Zusätzlich werden der Reaktion 1 mM Fruktosebisphosphat (Fru-1,6-P₂) zugeführt. Der Ansatz wird mit 100 mM MOPS-NaOH Puffer bei pH 8 gepuffert und die ATP Synthese bei 37°C durchgeführt. Die Synthese wird zu den jeweiligen Messpunkten mit 28 mM SDS (Endkonzentration 7 mM) abgestoppt und die Analytik der Nukleotide (ADP-Glc, AMP, ADP, ATP) mittels Multiplex-Kapillarelektrophorese (interne Standards (Endkonzentrationen): 1 mM para-Aminobenzoesäure und 1 mM 4-Aminophthalsäure) durchgeführt. Die Analyten werden bei 254 nm detektiert.
Die analytischen Ergebnisse dieser Umsetzung sind in den 2 - 4 dargestellt. Die 2 zeigt dabei den Verlauf der ADP-Konzentration, die 3 den Verlauf der ATP-Konzentration und die 4 den Verlauf der ADP-Glc-Konzentration über die Zeit.
Die in der 2-4 dargestellte Reaktion enthielt 2930 µg/mL EcAGPase, 0,1 µg/mL NeSuSy, einen Gradienten von ADP und PPi (1 mM bis 15 mM), während die Konzentrationen von Saccharose (200 mM) und dem Aktivator F-1,6-P₂ (1 mM) konstant gehalten wurden. Die Konzentrationen an MgCl₂ entsprach der Summe der Konzentrationen an ADP und PPi. Die Reaktion wurde bei 37 °C in 100 mM MOPS Puffer, pH 7 für 24 h durchgeführt.
Die Kombination von NeSuSy mit EcAGPase in einer Enzymkaskade zur ATP Synthese aus Saccharose und PPi zeigt, dass bereits nach wenigen Minuten die Konzentration an ADP in der Reaktion abnimmt und ATP entsteht. Allerdings erreicht die Synthese von ATP nach 30 min Reaktionszeit ein ATP Syntheselimit zwischen 1,96 mM und 2,14 mM bei einer ADP und PPi Startkonzentration von 5 mM bzw. 10 mM, was den ATP Ausbeuten von jeweils 39 % (5 mM ADP/PPi) und 21 % (10 mM ADP/PPi) entspricht. Die Versuche mit der EcAGPase zeigen, dass die Synthese von ATP aus PPi und ADP-Glucose dem Reaktionsgleichgewicht der EcAGPase unterworfen ist (1). Aus dem Verlauf der ATP Synthese ist ersichtlich (3), dass ADP-Glc in Anwesenheit von PPi von der EcAGPase sehr schnell in ATP umgesetzt werden kann. Allerdings zeigt sich am Beispiel des Experiments mit 2 mM ADP/PPi, dass ATP bei abnehmender ADP und PPi Konzentration über einen längeren Zeitraum (4 h) wieder umgesetzt wird. Im gleichen Zeitraum nimmt die ADP-Glc Konzentration zu (4). In der ATP-Synthese entsteht neben ATP auch Glc-1-P und führt zur Zunahme der ADP-Glc Konzentration in der Reaktion mit zunehmender Glc-1-P Konzentration. Dies bedeutet, dass das Enzym EcAGPase mit zunehmenden Glc-1-P das Reaktionsgleichgewicht einstellt und weniger ATP synthetisiert.
II. In-situ Generierung von PPi
Diese Reaktionsabfolge beinhaltet die in-situ Generierung von PPi durch den Einsatz einer komplexen Kaskade unter den Einsatz einer AtUSP.
Diese ATP Synthesereaktion kann wie folgt dargestellt werden: Glc-l-P + UTP ↔ UDP-Glc + PPi ADP-Glc + PP_i ↔ Glc-l-P + ATP ADP-Glc + UTP ↔ UDP-Glc + ATP
Das Zusammenspiel der einzelnen enzymatischen Kaskadenelemente ist in der 5 dargestellt.
Die 6-9 zeigen die analytischen Ergebnisse der obigen Umsetzung.
AtUSP und EcAGPase werden in einer Ein-Topf-Synthese zusammengeführt, um in der UDP-Glc Synthese entstehendes PPi in einer Folgereaktion zur Synthese von ATP zu nutzen. Das entstehende Glc-1-P wird von der AtUSP wieder zur Synthese von UDP-Glc genutzt. Dadurch wird die Rückreaktion der EcAGPase in Richtung ADP-Glc Synthese abgeschwächt. Dies ermöglicht eine genauere Beschreibung des Effektes von Glc-1-P auf die ATP Synthese.
Der Versuchsaufbau ist wie folgt: 2,9 mg/mL EcAGPase und 0,5 mg/mL AtUSP werden in einer Reaktion mit 3 mM ADP-Glc, 3 mM UTP und 1 mM F-1,6-P₂ zusammengeführt. UDP-Glc wird mit Startkonzentrationen zwischen 0,5 mM bis 10 mM Glc-1-P über einen Zeitraum von 10 Minuten bei 37 °C in 100 mM HEPES Puffer (pH 8) synthetisiert. Zusätzlich enthält die Reaktion MgCl₂ dessen Konzentration entsprechend der Summe der Konzentrationen an Glc-1-P und UTP eingestellt wurde. Die Synthese wird zu den jeweiligen Messpunkten mit 28 mM SDS abgestoppt (Endkonzentration 7 mM) und die Analytik der Nukleotide (ADP-Glc, AMP, ADP, ATP, UTP, UDP, UMP, UDP-Glc) mittels Multiplex-Kapillarelektrophorese (interne Standards (Endkonzentrationen): 1 mM para-Aminobenzoesäure und 1 mM 4-Aminophthalsäure) durchgeführt und die Analyten bei 254 nm detektiert.
Die Kombination von AtUSP und EcAGPase zeigt, dass ATP aus dem PPi der UDP-Glc Synthesereaktion und ADP-Glc entsteht (6). Zusätzlich zeigt sich, dass sämtliche Reaktionen ein Syntheselimit von 1,2 mM ATP (ca. 40 % Ausbeute bezogen auf UTP) bereits nach einer Minute erreichen und dabei kaum von der initialen Glc-1-P Konzentration beeinflusst werden.
Bemerkenswert ist, dass mit 0,5 mM Glc-1-P bereits nach einer Minute eine ATP-Konzentration von 1,1 mM erreicht wird. Gespiegelt wird das auch am sehr schnellen Umsatz von UTP (7) und an der sehr schnellen Synthese von UDP-Glc (8). Dies bedeutet zum einen, dass PPi nach erfolgter Umsetzung der initialen Glc-1-P Konzentration von der AGPase zur Synthese von ATP aus ADP-Glc (9) genutzt wird. Zum anderen bedeutet dies, dass das gebildete Glc-1-P von dem Enzym AtUSP wiederum für die UDP-Glc Synthese genutzt wird. Hiermit wird ein geschlossener Kreislauf geschaffen, in dem ATP aus ADP-Glc, UTP und in situ generiertem PPi synthetisiert wird. Allerdings ist auch hier die ATP-Synthese bei längerer Versuchszeit dem Reaktionsgleichgewicht der EcAGPase unterworfen. Die Konzentration an ATP nimmt im Laufe des Versuches wieder ab (6). ATP sollte daher möglichst schnell aus der Synthesereaktion durch Kombination mit ATP-verbrauchenden Enzymen abgeführt werden, um den Regenerationszyklus aufrecht zu erhalten.
Durch diesen Versuch wird gezeigt, dass EcAGPase in der Lage ist, in einer gekoppelten Enzymreaktion aus in situ entstehenden PPi, ATP zu synthetisieren. ATP kann wiederum als Substrat von ATP-nutzenden Enzymen umgesetzt werden.
III. Drei-stufige Enzym-Kaskade zur Synthese von GlcNAc-l-P
Diese Reaktionsabfolge beinhaltet die 3-Enzym Kaskade BlNahK/NeSuSy/EcAGPase zur Synthese von GlcNAc-l-P mittels des neuen ATP Regenerationssystems.
Diese ATP Synthesereaktion kann wie folgt dargestellt werden: GlcNAc + ATP ↔ GlcNAc-l-P + ADP ADP + Suc ↔ ADP-Glc + Fru ADP-Glc + PP_i ↔ Glc-l-P + ATP GlcNAc + PP_i + Suc ↔ GlcNAc-1-P + Fru + Glc-1-P
Das Zusammenspiel der einzelnen enzymatischen Kaskadenelemente ist in der 10 dargestellt.
Die 11-13 zeigen die analytischen Ergebnisse der obigen Umsetzung.
Die Reaktionen basieren auf 1,6 mg/mL BlNahK, 1,3 mg/mL EcAGPase, 25 µg/mL NeSuSy, 5 mM GlcNAc, 200 mM Saccharose, 0,5 mM bis 5 mM ATP, 5 mM PPi, 10 mM MgCl₂ und 0,5 mM Fru-l,6-P₂. Der Versuch wurde in 100 mM MOPS Puffer, pH 7 bei 37 °C für 24 h durchgeführt. GlcNAc-1-P und Glc-1-P wurden in einer separaten Reaktion zu UDP-GlcNAc und UDP-Glc umgesetzt und mit MP-CE gemessen. Dabei wurden 250 µg/mL AtUSP; 2,5 mg/mL SzGlmU und 2,6 mg/mL PmPpA mit 10 mM UTP und 10 mM MgCl₂ in 100 mM MOPS Puffer, pH 7 bei RT für 2 h der Reaktion nach entfernen der Syntheseenzyme zugeführt. Die ATP Regeneration wurde anhand der folgenden Formel berechnet: $Reg ._{[ATP]} = \frac{C_{[UDP-GlcNAc]}}{C_{[ATP]}} .$
Das neue ATP-Regenerationssystem NeSuSy/EcAGPase wird mit einem ATP verbrauchendem Enzym, wie z.B. einer Zucker-1-Phosphat Kinase (am Beispiel BlNaHK), zur Synthese von GlcNAc-1-P kombiniert. ATP wird zur Bildung von GlcNAc-1-P von der Kinase BlNahK verbraucht. Das entstehende ADP wird von NeSuSy mit Saccharose zu ADP-Glc und Fruktose umgesetzt. ADP-Glc wird anschließend von der EcAGPase unter Zugabe von PPi zu Glc-1-P und ATP umgesetzt. Auf diese Weise wird ATP aus ADP für die Reaktion der Zuckerkinase wieder bereitgestellt (regeneriert).
Der Versuchsaufbau ist wie folgt: Die Reaktion enthält 1,6 mg/mL BlNahK, 1,3 mg/mL EcAGPase und 25 µg/mL NeSuSy, 5 mM GlcNAc, 200 mM Saccharose, 0,5 mM bis 5 mM ATP, 5 mM PPi und 10 mM MgCl₂ und 0,5 mM Fru-1,6-P₂. Die Enzymreaktionen werden in 100 mM MOPS Puffer, pH 7 bei 37 °C für 24 h in einer 96-Mikrotiterplatte in einem Volumen von 200 µL durchgeführt. Nach jedem Messzeitpunkt werden den Reaktionsansätzen jeweils 150 µL entnommen und die Enzyme mittels Ultrafiltration (30 K Filter, cut-off 30 kDa, AcroPrep™ Advance filters; Pall) für 15 Minuten von der Reaktion abgetrennt. Anschließend werden zu 100 µL Probe, 50 µL einer Lösung aus AtUSP, SzGlmU, PmPpA, 10 mM UTP und 10 mM MgCl₂ zugegeben um die Nukleotidzucker UDP-GlcNAc und UDP-Glc zu synthetisieren. Diese werden anschließend mittels Kapillarelektrophorese analysiert. Die Reaktion der Enzyme aus der Anschlussreaktion zur Nukleotidzuckersynthese werden mit 28 mM SDS (Endkonzentration 7 mM) abgestoppt und die Analytik der Nukleotide (ADP-Glc, ADP, ATP, UTP, UDP, UDP-Glc und UDP-GlcNAc) wird mittels Multiplex-Kapillarelektrophorese (interne Standards (Endkonzentrationen): 1 mM para-Aminobenzoesäure und 1 mM 4-Aminophthalsäure) durchgeführt und die Analyten bei 254 nm detektiert. Die UDP-GlcNAc Konzentration ist proportional zum gebildeten GlcNAc-1-P. Die UDP-Glc Konzentration ist proportional zum entstehenden ATP.
Die Reduktion der ATP-Konzentration (2 mM und 0,5 mM) unterhalb der Substratkonzentration (5 mM GlcNAc) zeigt, dass GlcNAc mit 41 % - 68 % Ausbeute phosphoryliert wird ( 11). Die Kontrollreaktion mit 5 mM ATP ergibt eine Ausbeute von 77%. ATP wird in den Reaktionen mit einer Anfangskonzentration von 2 mM und 0,5 mM in der Enzymkaskade NeSuSy/AGPase 1,7- bzw. 4,1-mal regeneriert (13). Die Reduktion der ATP-Konzentration um mehr als 50 % (von 5 mM auf 2 mM) führt zu ähnlichen Produktausbeuten. Die nachgewiesene Ausbeute an Glc-1-P nach 24 h deutet auf eine ATP-Regeneration über 24 h hin, die auch in Reaktionen mit ATP Überschuss stattfand. Des Weiteren unterstützen diese Ergebnisse die Annahme, dass während des Produktionsprozesses von GlcNAc-1-P, ATP rezykliert wird. Allerdings zeigt sich auch, dass Glc-1-P während der ATP-Rezyklierung eine Sättigung erfährt und während des Syntheseprozesses wieder abgebaut wird (12). Es werden 4 von maximal 10 ATP Regenerationszyklen (bei 0,5 mM ATP) erreicht (Kopplungseffizienz 40%). Eine weitere Steigerung ist durch Optimierung der Enzymverhältnisse möglich.
In Kombination mit einer Zuckerkinase (ATP-verbrauchendes Enzym) ist das neue ATP-Regenerationssystem NeSuSy/AGPase fähig, ATP aus ADP mit Saccharose und PPi zu regenerieren.
IV. 4-Enzym Kaskade für UDP-GlcNAc-Synthese mit erfindungsgemäßen ATP Regenerationssystem
Diese ATP Synthesereaktion unter Verwendung einer 4-Enzymkaskade BINahK/SzGlmU/NeSuSy/EcAGPase zur Synthese von UDP-GlcNAc mit neuem ATP-Regenerationssystem kann wie folgt dargestellt werden: GlcNAc + ATP ↔ GlcNAc-l-P + ADP GlcNAc-l-P + UTP ↔ UDP-GlcNAc + PPi ADP + Suc ↔ ADP-Glc + Fru ADP-Glc + PP_i ↔ Glc-l-P + ATP GlcNAc + Suc + UTP ↔ UDP-GlcNAc-l-P + Fru + Glc-l-P
Das Zusammenspiel der einzelnen enzymatischen Kaskadenelemente ist in der 14 dargestellt.
Die 15 und 16 zeigen die analytischen Ergebnisse der obigen Umsetzung.
Das ATP-Regenerationssystem NeSuSy/EcAGPase wird mit der Enzymkaskade BI-NahK/SzGlmU für die Synthese von UDP-GlcNAc kombiniert. GlcNAc wird mit BlNahK unter Verbrauch von ATP zu GlcNAc-1-P und ADP umgesetzt. GlcNAc-1-P wird anschließend mit SzGlmU zu UDP-GlcNAc unter Freisetzung von PPi umgesetzt. NeSuSy setzt ADP und Saccharose zu ADP-Glc und Fruktose um. EcAGPase nutzt das freigesetzte PPi und ADP-Glc zur Bildung von Glc-1-P und ATP, das somit regeneriert wird.
Der Versuchsaufbau ist wie folgt: Die Synthesereaktion enthält 57,5 µg/mL EcAGPase, 58 µg/mL NeSuSy, 84 µg/mL BlNahK, 94 µg/mL SzGlmU, 5 mM UTP, 200 mM Saccharose, 0,5 mM Fru-1,6-P₂, 10 mM MgCl₂ und die ATP-Konzentration beträgt 0,5 mM bis 5 mM. Die Reaktionen werden im 200 µL Maßstab in einer 96-Mikrotiterplatte bei 37 °C für 24 h in 100 mM HEPES Puffer pH 7 durchgeführt. Mit jedem Messzeitpunkt werden 150 µL einer Reaktion entnommen und die Enzyme mittels Ultrafiltration (30 K Filter, cut-off 30 kDa, AcroPrep™ Advance filters; Pall) für 15 Minuten von der Reaktion abgetrennt. Zur Bestimmung der entstehenden Glc-1-P Konzentration werden anschließend zu 100 µL Probe, 50 µL einer Lösung aus AtUSP, PmPpA, 10 mM UTP und 10 mM MgCl₂ zugegeben. Der entstehende Nukleotidzucker UDP-Glc wird mittels Kapillarelektrophorese analysiert. Die UDP-Glc Konzentration ist proportional zum entstehenden ATP. Die Reaktion der Enzyme aus der Anschlussreaktion zur Nukleotidzuckersynthese werden mit 28 mM SDS (Endkonzentration 7 mM) abgestoppt und die Analytik der Nukleotide (ADP-Glc, ADP, ATP, UTP, UDP, UDP-Glc und UDP-GlcNAc) erfolgt mittels Multiplex-Kapillarelektrophorese (interne Standards (Endkonzentrationen): 1 mM para-Aminobenzoesäure und 1 mM 4-Aminophthalsäure) durchgeführt und die Analyten werden bei 254 nm detektiert.
Die Reduktion der ATP-Konzentration (2 mM und 0,5 mM) unterhalb der Substratkonzentration (5 mM GlcNAc) zeigt, dass UDP-GlcNAc mit 25 % - 63 % Ausbeute synthetisiert wird (15). Die Kontrollreaktion mit 5 mM ATP ergibt eine Ausbeute von 74%. ATP wird in den Reaktionen mit einer Anfangskonzentration von 2 mM und 0,5 mM in der Enzymkaskade NeSuSy/AGPase 1,6- bzw. 2,5-mal regeneriert (16). Die Reduktion der ATP-Konzentration um mehr als 50 % (von 5mM auf 2 mM) führt zu ähnlichen Produktausbeuten. Es werden fast 3 von maximal 10 ATP Regenerationszyklen (bei 0,5 mM ATP) erreicht (Kopplungseffizienz 30%). Eine weitere Steigerung sollte durch Optimierung der Enzymverhältnisse und durch Entfernen von Glc-1-P aus dem Reaktionsgleichgewicht der EcAGPase möglich sein.
In Kombination mit einer Zuckerkinase (ATP-verbrauchendes Enzym) und einer Pyrophosphorylase (PPi generierendes Enzym) ist das neue ATP Regenerationssystem NeSuSy/AGPase fähig, ATP aus ADP mit Saccharose und PPi zu regenerieren.
V. 5-Enzym Kaskade für die UDP-GlcNAc Synthese
Diese ATP Synthesereaktion unter Verwendung einer 5-Enzymkaskade BINahK/SzGlmU/NeSuSy/EcAGPase/AtUSP zur Synthese von UDP-GlcNAc mit dem erfindungsgemäßen ATP Regenerationssystem kann wie folgt beschrieben werden: GlcNAc + ATP ↔ GlcNAc-l-P + ADP GlcNAc-l-P + UTP ↔ UDP-GlcNAc + PPi ADP + Suc ↔ ADP-Glc + Fru ADP-Glc + PP_i ↔ Glc-l-P + ATP Glc-1-P + UTP ↔ UDP-Glc + PPi GlcNAc + Suc + 2 UTP ↔ UDP-GlcNAc + Fru + UDP-Glc + PP_i
Das Zusammenspiel der einzelnen enzymatischen Kaskadenelemente ist in der 17 dargestellt.
Die 18-21 zeigen die analytischen Ergebnisse der obigen Umsetzung.
Die Enzymkaskade zur UDP-GlcNAc Synthese wird mit dem Enzym AtUSP ergänzt. Glc-1-P wird mit AtUSP zu UDP-Glc umgesetzt und damit aus der Reaktion der EcAGPase entfernt, um die Rückreaktion der EcAGPase zu unterdrücken und mehr ATP für die Enzymkaskade BINahK/SzGlmU bereitzustellen. Damit wird eine höhere Produktausbeute für UDP-GlcNAc Synthese erzielt.
Der Versuchsaufbau ist wie folgt: Die Synthese wird in einem Ein-Topf Verfahren mit fünf Enzymen durchgeführt. Dabei werden 41,5 µg/mL NeSuSy, 834 µg/mL BlNahK, 960 µg/mL EcAGPase, 1,2 mg/mL SzGlmU und 75,5 µg/mL AtUSP verwendet. Die Synthese wurde mit 5 mM GlcNAc, 10 mM UTP, 0,5 mM F-1,6-P₂, 10 mM MgCl₂ und 0,25 mM bis 2,5 mM ATP durchgeführt. Die Reaktion wurde in 200 µL in 100 mM HEPES pH 7 bei 37 °C für 24 h in einer 96-Mikrotiterplatte durchgeführt. Die Synthese wurde mit 28 mM SDS (Endkonzentration 7 mM) abgestoppt und die Analytik der Nukleotide (ADP-Glc, AMP, ADP, ATP, UTP, UDP, UMP, UDP-Glc und UDP-GlcNAc) mittels Multiplex-Kapillarelektrophorese (interne Standards (Endkonzentrationen): 1 mM para-Aminobenzoesäure und 1 mM 4-Aminophthalsäure) durchgeführt und die Analyten bei 254 nm detektiert.
Durch Entfernen von Glc-1-P aus dem Reaktionsgleichgewicht der EcAGPase durch Umsatz mit der AtUSP wird die Ausbeute für UDP-GlcNAc und der Regeneration von ATP signifikant gesteigert. Nach 24 h werden UDP-GlcNAc Ausbeuten zwischen 61 % (0,25 mM ATP) bis 85 % (2,5 mM ATP) erreicht (18). ATP wird in den Reaktionen mit einer Anfangskonzentration von 2,5 mM und 0,25 mM in der Enzymkaskade NeSuSy/AGPase 1,7- bzw. 12,5-mal regeneriert (19). Die UDP-Glc Konzentration nach 24 h zeigt, dass diese nicht mit der theoretischen maximalen Konzentration an UDP-Glc korrespondiert (12,1 Regenerationszyklen von 0,25 mM ATP entsprächen beispielsweise 3 mM UDP-Glc). Erwartet wird, dass mit jedem Mol an regeneriertem ATP ein Mol Glc-1-P durch die AGPase produziert und anschließend durch AtUSP zu UDP-Glc umgesetzt wird (20). Die geringe Menge an UDP-Glc basiert vermutlich auf der Hydrolyseaktivität der NeSuSy, die zum Abbau von UDP-Glc führt, was auch durch eine steigende UDP-Konzentration belegt wird (21). Die Reduktion der ATP-Konzentration um 50 % (von 5 mM auf 2,5 mM) führt zu ähnlichen Produktausbeuten (ca. 85%). Es werden 12 von maximal 20 ATP Regenerationszyklen (bei 0,25 mM ATP) erreicht (Kopplungseffizienz 60%). Eine weitere Steigerung sollte durch Optimierung der Enzymverhältnisse möglich sein.
In Kombination mit der UDP-Zucker Pyrophosphorylase AtUSP (PPi generierendes Enzym), einer Zuckerkinase (ATP-verbrauchendes Enzym) und einer weiteren Pyrophosphorylase (PPi generierendes Enzym) ist das neue ATP Regenerationssystem NeSuSy/AGPase fähig, ATP aus ADP mit Saccharose und PPi sehr effizient zu regenerieren und hohe Produktausbeuten zu erzielen. Eine Schlüsselfunktion kommt dem entstehenden Glc-1-P in der Reaktion der EcAGPase zu. Glc-1-P sollte aus dem Reaktionsgleichgewicht entfernt werden. Dies kann z.B. mit dem Enzym AtUSP erreicht werden, das Glc-1-P mit UTP zu UDP-Glc und PPi umsetzt. Mit der AtUSP wird damit zusätzlich PPi gebildet, welches die ATP Synthese und damit die ATP Regeneration antreibt.
Weitere Enzyme wie Zucker-P Mutasen (Phosphoglucomutase, Bildung von Glc-6-P) und Zuckerphosphat-Isomerasen (Fru-6-P Isomerase, Bildung von Fru-6-P) wären auch geeignet, um Glc-1-P aus dem Gleichgewicht der EcAGPAse zu entfernen.
VI. Weitere 5-Enzym Kaskade mit erfindungsgemäße ATP-Regenerationssystem
Die ATP Synthesereaktion kann im Rahmen einer der phosphatfreien UDP-GlcNAc Synthese mit PGM zur Abführung von Glc-1-P nach folgenden Gleichungen ablaufen: GlcNAc + ATP ↔ GlcNAc-1-P + ADP ADP + Suc ↔ ADP-Glc + Fru GlcNAc-l-P + UTP ↔ UDP-GlcNAc + PPi ADP-Glc + PP_i ↔ Glc-l-P + ATP Glc-1-P ↔ Glc-6-P GlcNAc + Suc + UTP ↔ UDP-GlcNAc-l-P + Fru + Glc-6-P
Das Zusammenspiel der einzelnen enzymatischen Kaskadenelemente ist in der 22 dargestellt.
Die 23 bis 25 zeigen die analytischen Ergebnisse der obigen Umsetzung.
Durch Verwendung der AtUSP zur Reduktion von Glc-1-P in der Reaktion entstand eine zusätzliche Einheit PPi, welches von der EcAGPase genutzt werden konnte um ATP zu regenerieren. Daher wird in diesem Versuch geprüft, wie sich das System verhält, wenn nur eine Einheit PPi während der UDP-GlcNAc Synthese bereitgestellt wird.
Der Versuchsaufbau ist wie folgt: Die Synthese wurde in einem Ein-Topf Verfahren auf einer 96-Well Platte mit einem Volumen von 200 µL durchgeführt. Jeder Reaktionsansatz enthielt ATP in verschiedenen Konzentrationen (0,25 mM - 2,5 mM), UTP (7 mM), GlcNAc (5 mM), Saccharose (200 mM), F-1,6-P₂ (0,5 mM), und MgCl₂ (10 mM). Die Reaktionen wurden zusätzlich bei 37 °C in 100 mM MOPS- Puffer pH 7 für 24 h durchgeführt. Die Enzyme BlNahK und SzGlmU wurden in den Konzentrationen 0,5 mg/mL und 5 µg/mL zugegeben. Die Enzyme der ATP Regenerationskaskade wurden in den Konzentrationen 23,5 µg/mL (NeSuSy) und 175 µg/mL verwendet. Das Enzym Phosphoglucomutase (PGM) aus Hasenmuskeln (Sigma Aldrich, USA) wurde in einer Konzentration von 600 µg/mL zu der Kaskade gegeben. Die Reaktionen wurden zu den jeweiligen Messpunkten mittels einer Stopplösung (28 mM SDS, 5 mM PAPA, 1mM PABA) abgestoppt und mittels MP-CE analysiert. Die Nukleotide (ATP, ADP, AMP, UTP, UDP und UMP) und Nukleotidzucker (UDP-GlcNAc und ADP-Glc) wurden auf der MP-CE mit UV bei 254 nm detektiert.
Durch Ersetzen der AtUSP mit PGM konnten aus 5 mM GlcNAc und 2,5 mM ATP nach 24 h, UDP-GlcNAc Ausbeuten von bis zu 73 % erreicht werden (23). Durch weitere Reduktion der ATP Menge zeigten sich Produktausbeuten zwischen 60 % (2 mM ATP) und mindestens 37 % (0,5 mM ATP). Die Regeneration von ATP zeigte sich am deutlichsten in der Synthese mit 0,25 mM ATP. Hier wurden 48 % (2,4 mM) des eingesetzten GlcNAc in UDP-GlcNAc umgesetzt, was einer 9,5- fachen ATP Regeneration entspricht (24). Allerdings zeigten sich erneut durch Reduktion der ATP Konzentration eine Zunahme der UDP Konzentration (25).
Die Verwendung von PGM zur Reduktion von Glc-1-P zeigt, dass eine Kopplung des erfindungsgemäßen Systems mit weiteren Enzymen zur Glc-1-P Reduktion möglich ist.
VII. Charakterisierung der AGPase aus E. coli
VII.1 Einfluss der PP_i Konzentration
Der Einfluss der PPi Konzentrationen auf die ATP Synthese Aktivität der eingesetzten EcAGPase wurde untersucht.
Der Versuch beinhaltete 4,35 µg/mL EcAGPase, 2,5 mM ADP-Glc, 10 mM MgCl₂, 1 mM Fru-1,6-P₂ und PP_i, in den Konzentrationen 0,75 mM bis 10 mM, sowie eine Kontrollreaktion ohne PPi. Die ATP Synthese wurde in 600 µL 100 mM HEPES Puffer, pH 8 bei 37 °C für 12 Minuten durchgeführt. Die Synthese wurde zu den jeweiligen Messpunkten mit 28 mM SDS (Endkonzentration 7 mM) abgestoppt und die Analytik der Nukleotide (ADP-Glc, AMP, ADP, ATP) mittels Multiplex-Kapillarelektrophorese (interne Standards (Endkonzentrationen): 1 mM para-Aminobenzoesäure und 1 mM 4-Aminophthalsäure) durchgeführt und die Analyten bei 254 nm detektiert.
EcAGPase zeigt bei PPi Konzentrationen über 3 mM bereits eine Verringerung der spezifischen Aktivität (26). Bei einer PPi Konzentrationen von 7 mM beträgt die spezifische Aktivität des Enzymes im Vergleich zur nicht gehemmten Reaktion (50 U/mg) nur noch ca. 1 % (0,6 U/mg) der Aktivität.
EcAGPase unterliegt in der ATP-Synthese Richtung einer Substratinhibition durch PPi. Daher kann die ATP-Regeneration durch dieses Enzym in Reaktionen, die sehr viel PPi beinhalten oder sehr schnell viel PPi freisetzen, weniger effizient sein. Dieser Nachteil kann durch Erhöhung der EcAGPase Konzentration kompensiert werden.
VII.2 Einfluss der Fruktose (Fru)-1,6-P₂ Konzentration
Fru-1,6-P₂ wurde als Aktivator für die EcAGPase eingesetzt. Es handelt es sich bei der Fru-1,6-P₂ um eine relativ teure Verbindung, deren Einsatz in der EcAGPase Reaktion möglichst reduziert werden sollte. Daher wurde die Aktivität der EcAGPase für verschiedene Fru-1,6-P₂ Konzentrationen untersucht, um eine minimale Konzentration des Aktivators zu bestimmen.
Der Versuch beinhaltete 3,9 µg/mL EcAGPase, 3 mM ADP-Glc, 3 mM PPi, 10 mM MgCl₂ und Fru-1,6-P₂ in den Konzentrationen 0,1 mM bis 1 mM, sowie eine Kontrollreaktion ohne Fru-1,6-P₂. Die Synthese wurde in 600 µL 100 mM HEPES Puffer, pH 8 bei 37 °C für 12 Minuten durchgeführt. Die Synthese wurde zu den jeweiligen Messpunkten mit 28 mM SDS (Endkonzentration 7 mM) abgestoppt und die Analytik der Nukleotide (ADP-Glc, AMP, ADP, ATP) mittels Multiplex-Kapillarelektrophorese (interne Standards (Endkonzentrationen): 1 mM para-Aminobenzoesäure und 1 mM 4-Aminophthalsäure) durchgeführt und die Analyten bei 254 nm detektiert.
Mit 0,5 mM Fru-1,6-P₂ wird noch eine hohe EcAGPase Aktivität (60 U/mg, 12-fach höher als ohne Aktivator) erreicht (27). Bei 0,25 mM nimmt die Aktivität stark ab (20 U/mg). Die EcAGPase zeigt auch in Abwesenheit des Aktivators noch eine Aktivität von 5 U/mg.
Der Aktivator Fru-1,6-P₂ erhöht die Aktivität der EcAGPase deutlich. Die Konzentration des Aktivators kann deutlich reduziert werden. Daher ist es auch möglich, eine ATP-Regeneration mit EcAGPase mit sehr kleinen Fru-1,6-P₂ Konzentrationen und selbst ohne Aktivator effizient durchzuführen.
VII.3 Einfluss der Verschiebung des Reaktionsgleichgewichtes
Die EcAGPase bevorzugt die ADP-Glc Synthese. Die Akkumulation von Glc-1-P beeinflusst somit das Reaktionsgleichgewicht für die ATP- Synthese negativ. Daher wurde der Effekt von Glc-1-P auf die ATP-Synthese Aktivität der EcAGPase untersucht.
Der Versuch beinhaltete 8,5 µg/mL EcAGPase, 3 mM ADP-Glc, 3 mM PPi, 0,5 mM Fru-1,6-P₂, 10 mM MgCl₂ und Glc-1-P in den Konzentrationen 1 mM bis 10 mM, sowie eine Kontrollreaktion ohne Glc-1-P. Die Synthese wurde in 600 µL 100 mM HEPES Puffer, pH 8 bei 37 °C für 12 Minuten durchgeführt. Die Synthese wurde zu den jeweiligen Messpunkten mit 28 mM SDS (Endkonzentration 7 mM) abgestoppt und die Analytik der Nukleotide (ADP-Glc, AMP, ADP, ATP) mittels Multiplex-Kapillarelektrophorese (interne Standards (Endkonzentrationen): 1 mM para-Aminobenzoesäure und 1 mM 4-Aminophthalsäure) durchgeführt und die Analyten bei 254 nm detektiert.
EcAGPase zeigt bei zunehmenden Glc-1-P Konzentrationen eine stark verringerte ATP-Synthese Aktivität (28). Die Aktivität des Enzyms fällt bereits bei 1 mM Glc-1-P auf 71 % der Aktivität ohne Zusatz von Glc-1-P. Mit 5 mM Glc-1-P betrug die Restaktivität nur noch 27 %. Der ermittelte IC50- Wert für die EcAGPase ATP-Syntheseaktivität beträgt 1,78 mM Glc-1-P.
Die Glc-1-P Konzentration hat einen starken Einfluss auf die Effizienz der ATP-Regenerierung mittels EcAGPase. Daher ist es für das ATP-Regenerationssystem empfehlenswert, dass mit steigender Kaskadendauer Glc-1-P aktiv aus dem Prozess entfernt wird.
Die dieser Patentanmeldung zu Grunde liegende Erfindung entstand in einem Projekt, welches unter dem Förderkennzeichen 031B0104B vom BMBF gefördert wurde.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

DE 602005026917 D1 [0006]
CN 101294167 A [0007]
US 20070054283 A1 [0008]

Claims

Verfahren zur mehrstufigen enzymatischen Umsetzung von Adenosindiphosphat zu Adenosintriphosphat, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren mindestens die Schritte umfasst: a) Enzymkatalysierte Umsetzung von Adenosindiphosphat in Gegenwart von Saccharose und einer Saccharose Synthase zu Adenosindiphosphat-Glucose; und b) Enzymkatalysierte Umsetzung der im Verfahrensschritt a) gebildeten Adenosindiphosphat-Glucose in Gegenwart von anorganischem Pyrophosphat und einer Pyrophosphorylase zu Adenosintriphosphat und Glucose-1-Phosphat; wobei die Verfahrensschritte a) und b) in wässriger Lösung und gleichzeitig oder nacheinander durchgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Verfahrensschritte a) und b) in einer gemeinsamen wässrigen Reaktionslösung durchgeführt werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Verfahrensschritte a) und b) gleichzeitig durchgeführt werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der pH-Wert im Verfahrensschritt a) und/oder b) größer oder gleich 5,0 und kleiner oder gleich 8,5 beträgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Verfahrensschritt a) und/oder b) in Gegenwart von Fruktose-1,6-Bisphosphat in einer Konzentration von größer oder gleich 5 µM und kleiner oder gleich 200 µM durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das anorganische Pyrophosphat im Verfahrensschritt b) durch eine enzymkatalysierte Umsetzung in der wässrigen Lösung gebildet wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das im Verfahrensschritt b) gebildete Glucose-1-Phosphat durch eine weitere enzymatische Umsetzung aus der wässrigen Lösung entfernt wird.
Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur in-situ Bereitstellung von Adenosintriphosphat in mehrstufigen, Adenosintriphosphat-verbrauchenden Enzymkaskaden in der Herstellung von Verbindungen ausgesucht aus der Gruppe bestehend aus Zuckerphosphaten, Nukleotidzuckern, Glykanen, Glykoproteinen, Glykolipiden, Glykosaminoglykanen, Phospho-Adenosin-Phosphosulfat, nukleotidaktivierte Verbindungen oder Mischungen mindestens zweier Verbindungen aus dieser Gruppe.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei die Adenosintriphosphat-verbrauchende Enzymreaktion die Umsetzung von N-Acetylglucosamin und Adenosintriphosphat zu N-Acetylglucosamin-1-Phosphat und Adenosindiphosphat mittels einer N-Acetylhexosamin 1-kinase umfasst.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei das N-Acetylglucosamin-l-Phosphat in einer weiteren enzymatischen Umsetzung unter Einsatz von Uridin-Triphosphat mittels einer Uridin-Diphosphat-N-acetylglucosamine diphosphorylase zu Uridin-Diphosphat-N-Acetylglucosamin und anorganischem Pyrophosphat umgesetzt wird.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei das im Verfahrensschritt b) gebildete Glucose-1-Phosphat durch weitere enzymatische Umsetzung unter Einsatz von Uridin-Triphosphat mit einer Uridin-Triphosphat-Monosaccharid-l-Phosphat-Uridylyltransferase zu Uridin 5'-diphosphoGlucose und anorganischem Pyrophosphat umgesetzt wird.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei das im Verfahrensschritt b) gebildete Glucose-1-Phosphat durch weitere enzymatische Umsetzung mit einer Phosphoglucomutase zu Glucose-6-Phosphat umgesetzt wird.