DE19606651A1

DE19606651A1 - Enzymatisches Verfahren zur Herstellung von GDP-alpha-D-Mannose dafür geeignete Enzyme und deren Gewinnung sowie Enzymtest

Info

Publication number: DE19606651A1
Application number: DE19606651A
Authority: DE
Inventors: Joerg Eberhard Ritter; Lothar Elling; Maria-Regina Kula; Stefan Verseck
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 1995-03-03
Filing date: 1996-02-23
Publication date: 1996-12-05
Also published as: US20030082752A1; DE59611229D1

Description

Gegenstand der Erfindung ist eine neue bezüglich des Hexoserests monofunktionelle GDP-Mannose-Pyrophosphorylase (GDP-Man-PP) mikrobiellen Ursprungs mit einer spezifischen Aktivität 2 U/mg und sie umfaßt ein Verfahren zur Gewinnung derselben sowie deren Verwendung zur Herstellung von GDP-Mannose.

Die GDP-Mannose gehört zu den derzeit umfänglich untersuchten aktivierten Zuckern, die mit Glycosyltransferasen zu Oligosacchariden umgesetzt werden können. Sie bildet außerdem das Ausgangsmaterial für die Gewinnung von GDP-Fucose.

Die GDP-Mannose-Pyrophosphorylase ist seit langem bekannt. Sie kann aus unterschiedlichen Quellen isoliert werden: So wurde bereits 1964 von Preiss u. a. (J. Biol. Chem. 239 (1964) 3119-26) über die Isolierung des Enzyms aus Arthrobacter sp. berichtet. D. Shinabarger u. a. (J. Biol. Chem. 266 (1991) 2080-88) beschreiben die Isolierung einer multifunktionellen GDP-Man-PP aus Pseudomonas aeruginosa mit Phosphomannose-Isomerase- und Pyrophosphorylase-Aktivität.

Eine aus Säugetier-Drüsen isolierte GDP-Man-PP katalysiert sowohl die Synthese von GDP-Mannose als auch von GDP-Glucose. Aus Schweineschilddrüsen wurde eine 70 000fach aufgereinigte GDP-Man-PP gewonnen, die keine GDP-Glucose-Synthese-Aktivität zeigte.

T. Szumilo u. a. (J. Biol. Chem. 268 (1993) 17943-50) berichten über die Isolierung und 5000fache Aufreinigung von GDP-Man-PP aus Schweineleber, wobei aus 1 kg Leber 4 mg Enzym mit einer spezifischen Aktivität von 9,25 U/mg in mehrstufiger Reinigung erzielt wurden. Auch dieses Enzym katalysiert sowohl die Bildung von GDP-Mannose als auch von GDP-Glucose.

In jüngerer Zeit dient als GDP-Man-PP-Quelle vornehmlich Hefe (S. cerevisiae) und das Enzym wird im allgemeinen nicht besonders aufgereinigt (P. Wang u. a. in J. Org. Chem. 58 (1993) 3985-90). In der WO 93/0820 A1 wird über eine Anreicherung von GDP-Man-PP aus Hefe berichtet, bei der aus einem Hefezell-Extrakt durch fraktionierte (NH₄)₂SO₄-Fällung und Dialyse eine Enzymlösung mit einer Aktivität von 0,1 U/ml erhalten wurde.

Zusammenfassend kann mithin festgestellt werden, daß die kommerziell nicht verfügbare GDP-Man-PP entweder mit sehr großem Aufwand isoliert oder in nicht oder nur teilgereinigter Form eingesetzt worden ist, wobei unterschiedliche Formen mit z. T. Multifunktionalitäten vorlagen.

Ziel der Erfindung ist daher eine mit wirtschaftlich tragbarem Aufwand erzielbare GDP-Man-PP, die insbesondere auch wegen ihrer Monofunktionalität in kontinuierlichen mehrstufigen Prozessen über längere Zeiten nicht zu Problemen führt.

Die zu diesem Zweck entwickelte GDP-Man-PP entspricht dem Patentanspruch 1. - Weitere Besonderheiten der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Die GDP-Man-PP wird insb. aus einem rekombinanten Stamm von Mikroorganismen wie Hefen, B. subtilis- und E. coli-Stämmen sowie ggf. auch Zellinien animalischen Ursprungs, die zur gentechnologischen Modifikation unter Bildung von Produktionsstämmen geeignet sind und in die gentechnologisch manipulierte Plasmide der an sich bekannten Art aber mit dem für die gewünschte Bildung von GDP-Man-PP kodierenden Gen eingeschleust sind, gewonnen, in dessen Rohextrakt das Enzym bereits in erheblicher Konzentration vorhanden ist, so daß der Aufwand für die Aufarbeitung und Reinigung im Hinblick auf eine gewerbliche Produktion durchaus tragbar wird.

Die nachstehende Tabelle zeigt die in unterschiedlichen Enzymquellen vorhandenen Enzymgehalte im Rohextrakt, die nach Aufreinigung erhaltenen spezifischen Aktivitäten (soweit bekannt) und die Funktionalität des erhaltenen Enzyms.

Vergleich der Enzymquellen für GDP-Mannose Pyrophosphorylase

Man erkennt deutlich die Überlegenheit der erfindungsgemäßen Strategie der Bereitstellung einer ergiebigen Enzymquelle für ein monofunktionelles ("mannose-spezifisches") Enzym.

Dieses Enzym ist für die Gewinnung von GDP-Mannose in größeren Mengen einsetzbar, wobei zweckmäßigerweise vor dem billigeren Mannose-6-phosphat ausgegangen wird, das zunächst mit Hilfe von Phosphomannomutase in Mannose-1-phosphat umge wandelt wird.

Sowohl GDP-Man-PP als auch Phosphomannomutase werden insbe sondere ausgehend von Produzenten-Stämmen, welche die entsprechenden Gene (rfbM bzw. rfbK) nach Inserierung der selben in ein Plasmid und Einschleusung desselben in den jeweiligen Produzenten-Stamm enthalten, gemäß folgender Strategie:

1. Amplifikation der Gene mit PCR (Vent-Polymerase)
- - nach chemischer Synthese von Primer anhand der bekannten Gensequenzen werden die Gene mittels PCR mit der Vent-Polymerase amplifiziert.
2. Klonierung der Gene in das Plasmid pUC18 (blunt-end mit Enzym Sma I)
Anzucht in E. coli DH5α
- - nach Auftrennung der amplifizierten Gene in einem Agarosegel und Isolation der Gene aus diesem Gel werden die Gene jeweils mit dem dem Vektor pUC18 ligiert (gekoppelt), der zuvor mit Sma I (Restriktionsenzym) zur stumpfendigen (blunt-end) Linearisierung hydrolysiert wurde. Die ligierten Vektoren werden in einen für die DNA-Aufnahme vorbereiteten Stamm E. coli DH5α transformiert und die Zellen auf einem festen Nährmedium aufgezogen.
- - die positiven, transformierten Kolonien (weiße Kolonien auf der Agarplatte) werden isoliert und erneut wie oben angezogen.
3. Klonierung der Gene in den Expressionsvektor pT7-6 über EcoRI und BamHI Schnittstellen
Anzucht in E. coli BL21(DE3)
- - aus den positiven Transformanden wird das Plasmid (Plasmid pUC18 + inseriertes Gen rfbM oder rfbK) isoliert, mit den Enzymen EcoRI und BamHI hydrolysiert. Ebenso wird der Expressionsfaktor pT7-6 mit den Enzymen EcoRI und BamHI hydrolisiert.
- - nach der Ligation von pT7-6 mit dem isolierten Gen rfbM oder rfbK wird ein zur DNA-Aufnahme vorbereiteter Stamm von E. coli BL21 (DE3) mit diesen jeweils transformiert. Die Transformanden werden auf festem Nährmedium angezogen.
- - nach Isolation von einzelnen Kolonien und erneuter Anzucht auf einem festen Nährmedium wird zur Kontrolle das jeweilige Plasmid mit dem jeweiligen Gen isoliert und hydrolisiert.
- - die positiven Transformanden werden erneut auf einem festen Nährmedium angezogen und anschließend konserviert.

Nachfolgend wird die Erfindung mehr im einzelnen und an Hand spezieller Ausführungsdetails erläutert.

Die Biosynthese aktivierte Zucker, insbesondere GDP-alpha-D- Mannose, verläuft in vivo oft ausgehend von einem Mono saccharid (zum Beispiel Mannose), das an C6 phosphoryliert wird. Das Zucker-6-Phosphat (zum Beispiel Mannose-6-Phosphat) wird mit Hilfe einer Phosphomutase (EC 5.4.), insbesondere hier eine Phosphomannomutase (EC 5.4.2.8.), umgesetzt in ein Zucker-1-Phosphat.

Mannose-6-Phosphat ⇄ Mannose-1-Phosphat (I)

Pyrophosphorylasen, die zu den Nucleotidyltransferasen gehören (EC 2.7.7), insbesondere hier die GDP-alpha-D-Mannose- Pyrophospho-rylase (EC 2.7.7.13) katalysieren den Transfer einer Nucleoti-dylgruppe von einem Nucleosidtriphosphat auf ein Zucker-1-Phosphat unter Freisetzung von anorganischem Pyrophosphat (siehe Feingold und Barber, 1990, in Methods in Plant Biochem. 2, 39-78), insbesondere die folgende Reaktion (II)

Mannose-1-Phosphat + GTP ⇄ GDP-Mannose + PP_i (II)

Pyrophosphorylasen stellen Zuckernucleotide als Substrate für Glycosyltransferasen (EC 2.4.), die den Zuckeranteil auf einen Akzeptor übertragen (siehe z. B. Ginsberg, V. (1964) in Adv. Enzymol. 26, 35-88, oder zur Synthese anderer sekundärer aktivierter Zucker, insbesondere hier die GDP-β-L-Fucose, bereit (Yamamoto, K., 1982, in Agric. Biol. Chem. 48, 823-824 und 1993, in Arch. Biochem. Biophys. 300, 694-698).

Da die chemische Synthese oftmals schwierig ist und mit niedrigen Ausbeuten verbunden ist, findet die enzymatische Synthese immer mehr Anwendung.

Die Phosphomannomutase (EC 5.4.2.8) und die GDP-Mannose-Pyro phosphorylase (EC 2.7.7.13) wurden bisher in verschiedenen Quellen nachgewiesen.

Die GDP-Mannose-Pyrophosphorylase wurde erstmals 1956 von Munch-Petersen aus Bäcker-Hefe partiell isoliert, wobei die Menge an verfügbarem Enzym je nach Hefecharge stark schwankte (Munch-Petersen, 1956, Acta Chem. Scand. 10, 928). Das Enzym wurde 1962 von Preiss und Wood (in J. Biol. Chem. 239 (10), 3119-3126) aus Arthrobacter sp. isoliert. Die Autoren konnten jedoch nicht ausschließen, daß die zahlreichen umgesetzten aktivierten Zucker nicht auf Nebenreaktionen anderer Pyro phosphorylasen zurückzuführen sind. In Pseudomonas aeruginosa und Rhodospirillum rubrum wurde ein bifunktionelles Enzym, GDP-Mannose-Pyrophosphorylase gekoppelt mit Phosphomannose- Isomerase-Aktivität, gefunden (Shinabarger et al., 1991, in J. Biol. Chem. 266 (4), 2080-2088 und Ideguchi et al., 1993, in Biochimica et Biophys. Acta 1172, 329-331). Auch aus eukaryotischen Quellen wurde die GDP-Mannose-Pyrophosphorylase isoliert (Szumilo et al., 1993 in J. Biol. Chem. 268 (24), 17943-17950). Die festgestellten Aktivitäten, Umsatz zu GDP- Glucose (100%), IDP-Glucose (72%) und GDP-Mannose (61%), lassen vermuten, daß es sich eher um eine GDP-Glucose-Pyro phosphorylase handelt (EC 2.7.7.34).

Die Phosphomannomutase (EC 5.4.2.8) wurde bisher nur im Zusammenhang mit der Alginat-Biosynthese betrachtet (S- Correira et al., 1987, in J. Bacteriol. 1969, 3224-3231 und Goldberg et al., 1993, in J. Bacteriol. 175 (3), 1605-1611).

Die enzymatische Synthese von GDP-Mannose wurde bisher von Simon et al., 1990 in J. Org. Chem. 55, 1834-1841, Wong et al., 1993 in WO 93/0820, Wang et al., 1993 in J. Org. Chem. 58, 3985-3990 und Palanka und Turner, 1993 in J. Chem. Soc. Perkion Trans 23 (1), 3017-3022, beschrieben. Diese Arbeitsgruppen verwenden alle eine, nach der von Munch- Petersen 1956 beschriebenen Methode, aus Hefezellen gewonnene Proteinpräparation und synthetisieren GDP-Mannose ausgehend von Mannose-1-Phosphat, das zuvor chemisch hergestellt wurde.

Durch Klonierung in einen (Produktions-) Expressionsvektor (Plasmid) (pT7-6 der Firma Novagen) und (Einführung) Transformation in einen (Produktionsstamm) Expressionsstamm Escherichia coli BL21(DE3)pLysS (der Firma Novagen) wurde nunmehr eine Phosphomannomutase und GDP-Mannose- Pyrophosphorylase entwickelt, welche erfindungsgemäß in größeren Mengen gewonnen werden können, als aus den bisher bekannten Quellen (s. Tab. Seite 3). Beide Enzyme stammen aus Salmonella enterica, Gruppe B (früher Salmonella typhimurium LT2). Die Gene (rfb M codiert für die GDP-Mannose- Pyrophosphorylase; rfb K codiert für die Phosphomannomutase) liegen in dem rfb-Gen-Cluster, dessen Struktur und Sequenz von Jiang et al., 1991 in Mol. Microbiol. 5 (3), 695-713 aufgeklärt wurde.

Mit der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) wurden die Gene rfb M und rfb K vervielfältigt (amplifiziert) und je in einen Vektor pUC18 (Firma Novagen) kloniert. Ausgehend von diesem Vektor wurden die Gene rfb M und rfb K je in einen Expressionsvektor pT7-6 der Firma Novagen kloniert und je in einen Expressions stamm Escherichia coli BL21(DE3)pLysS eingeführt (transfor miert). Das Plasmid pT7-6 mit dem inserierten Gen rfb M wurde nunmehr pERJ-1 genannt. Das Plasmid pT7-6 mit dem inserierten Gen rfb K wurde pERJ-2 genannt (siehe Fig. 1-3).

Die Produktion (Expression) der von den Genen rfb M und rfb K codierten Proteine (GDP-Mannose-Pyrophosphorylase und Phosphomannomutase) wurde durch Isopropylthiogalactosid (IPTG) mit 0,4 mM induziert und mit 0,03 mM Rifampicin gesteigert (siehe Fig. 4).

Durch mechanischen Aufschluß der Zellen (Escheria coli) in 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8 und 150 mM KCl und Zentrifugation (2 min bei 10 000 rpm) wurde ein proteinhaltiger Rohextrakt gewonnen. Dieser Rohextrakt wurde auf einen Anionenaus tauscher (Q-Sepharose FF) geladen und die GDP-Mannose- Pyrophosphorylase durch eine Stufenelution mit 150 mM KCl und 400 mM KCl gewonnen. Das Eluat wurde mit 1 M Ammoniumsulfat und 20% Glycerin (v/v) versetzt und auf eine Phenylsepharose FF aufgetragen. Nach Adsorption wurde das Enzym durch einen Gradienten zwischen 1 M Ammoniumsulfat und 0 M Ammoniumsulfat in 50 mM Tris-HCl, pH 8, 20% Glycerin zwischen 0,4 M und 0,1 M Ammoniumsulfat eluiert. Nach Ultrafiltration und Umpuffern mit 50 mM Tris-HCl, pH 8 mit 150 mM KCl wurde die GDP-Mannose- Pyrophosphorylase auf einer Gelfiltrationssäule chromato graphiert.

Nach Ultrafiltration wurde die GDP-Mannose-Pyrophosphorylase mit 3M Ammoniumsulfat versetzt und bei 4°C gelagert.

Die Phosphomannomutase soll über eine Q Sepharose FF partiell gereinigt werden.

Sowohl bei der Phosphomannomutase als auch bei der GDP- Mannose-Pyrophosphorylase handelt es sich um monofunktionelle Enzyme, die spezifisch die für sie beschriebene Reaktion (I und II, siehe oben) katalysieren.

Beide Enzyme sollen eingesetzt werden zur enzymatischen Synthese von GDP-Mannose, ausgehend von Mannose nach dem folgenden Reaktionsschema:

Reaktionsschema 1: (siehe auch Fig. 14)
Mannose + ATP → Mannose-6-Phosphat + ADP (1)
PEP + ATP ⇄ Pyruvat + ATP (2)
Mannose-6-Phosphat ⇄ Mannose-1-Phosphat (3)
Mannose-1-Phosphat + GTP ⇄ GDP-Mannose + PP_i (4)
PP_i → 2 P_i (5)

Reaktion 1: Hexokinase
Reaktion 2: Pyruvat-Kinase
Reaktion 3: Phosphomannomutase
Reaktion 4: GDP-Mannose-Pyrophosphorylase
Reaktion 5: Pyrophosphatase

Reaktion 1 und 2 wurde bereits zur Produktion von Mannose-6- Phosphat von Palanca und Turner, 1993 in J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 3017-3022 eingesetzt.

Die so gebildete GDP-Mannose kann weiter in situ mit Mannosyltransferase zu Oligosacchariden umgesetzt werden.

Die GDP-Mannose-Pyrophosphorylase-Aktivität wurde nachgewiesen mit einem neu entwickelten kontinuierlichen spektrophoto metrischen Test zur Bestimmung von Pyrophosphat (PP_i) produzierenden Nucleotidyltransferasen (EC 2.7). In der im folgenden beschriebenen Weise kann durch Vorgabe der Substrate (Zucker-1-Phosphate bzw. Zucker im Falle der Neuraminsäure) und Nucleosidtriphosphate) jede beliebige Pyrophosphorylase Aktivität, die 0,2 mU/ml Aktivität im Testgemisch ausmachen kann, bestimmt werden.

Der Enzymtest (Nucleotidyltransferase substrate screening assay "NUSSA") beruht darauf, daß das bei der Nucleotidyl transferase-Reaktion (EC 2.7.7) entstehende Pyrophosphat mit einer Pyrophosphat-abhängigen Phosphofuctokinase (PP_iPFK aus Pflanzen oder Bakterien JEC 2.7.1.90) mit Fruktose-6-Phosphat, in Gegenwart von Fructose-2,6-bisphosphat, zu Fructose-1,6- bisphosphat umgesetzt wird. Dieses Produkt wird mit einer Aldolase zu Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) und Glycerin-3- Phosphat (GAP) gespalten. Aus Glycerinaldehyd-3-Phospat entsteht Dihydroxyacetonphosphat durch die Triosephosphat isomerase. Schließlich wird Dihydroxyacetonphosphat durch die Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenase zu Glycerin-3-Phosphat (G-3-P) mit NADH reduziert. Pro Mol Pyrophosphat werden 2 Mol NADH verbraucht, was photometrisch verfolgt werden kann.

Reaktionsschema 2:
GTP + Mannose-1-Phosphat ⇄ GDP-Mannose + PP_i (1)
PP_i + Fructose-6-Phosphat ⇄ Fructose-1,6-P₂ + P_i (2)
Fructose-1,6-P₂ ⇄ DHAP + GAP (3)
DHAP + GAP ⇄ 2 GAP (4)
2 GAP + 2 NADH ⇄ 2 G-3-P + 2 NAD (5)

(1) GDP-Mannose-Pyrophosphorylase
(2) Pyrophosphat-abhängige Phosphofructokinase
(3) Aldolase
(4) Triosephosphat-Isomerase
(5) Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenase

Die nachfolgenden Beispiele zeigen die erfindungsgemäße Arbeitsweise im einzelnen. Dabei wird Bezug genommen auf die angefügten Zeichnungen; es zeigt:

Fig. 1: die Klonierungsstrategie,

Fig. 2: der Expressionsvektor pERJ-1,

Fig. 3: der Expressionsvektor pERJ-2,

Fig. 4: die SDS-Gelektrophorese der exprimierten Genprodukte von pERJ-1 und pERJ-2,

Fig. 5: das Chromatogramm der Gelfiltration zur Molekulargewichtsbestimmung,

Fig. 6: die Stabilität der GDP-Man-Pyrophosphorylase bei 4°C,

Fig. 7: die Substratüberschußinhibierung von GTP,

Fig. 8: die Substratüberschußinhibierung von M-1-P,

Fig. 9: die kompetitive Hemmung von GDP-Man bezogen auf GTP,

Fig. 10: die unkompetitive Hemmung von GDP-Man bezogen auf M-1-P,

Fig. 11: der Einfluß des pH-Wertes auf die Synthese von GDP- Mannose,

Fig. 12: die Abhängigkeit der Synthese von GDP-Mannose von der Enzymkonzentration,

Fig. 13: das E _* t-Diagramm für die Synthese von DGP-Man aus gehend von Mannose-1-Phosphat und GTP,

Fig. 14: Reaktionsschema der Biosynthese von GDP-Mannose aus gehend von Mannose,

Fig. 15: Synthese von GDP-Mannose ausgehend von 5 mM Mannose,

Fig. 16: Kapillarelektrophorese-Chromatogramm der herge stellten GDP-Mannose.

Beispiel I Klonierung der Gene rfb M und rfb K aus dem rfb-Gen-Cluster von Salmonella enterica, Gruppe B

Über eine DNA-Datenbank wurden die Gene rfb M und rfb K im rfb-Gen-Cluster identifiziert und die Leseraster bestimmt.

Für die in vitro-Amplifikation wurden die folgenden Oligo nucleotidprimer für beide Gene bestimmt.

Die Länge der Gene erhöht sich dabei für rfb M auf 1633 Bp. und für rfb K auf 1606 Bp.
Die PCR wurde wie folgt durchgeführt:

Tabelle 1

PCR-Ansatz zur Klonierung von rfb M und rfb K

Die Ansätze wurden mit je 70 µl Mineralöl überschichtet, um Verdunstungen zu vermeiden.
Vent-Polymerase-Puffer (BioLabs, New England) (10x)
200 mM Tris-HCl, pH 8.8, 100 mM KCl, 100 mM (NH₄)₂SO₄, 20 mM MgSO₄, 1% Triton X100 (w/v)

Die Laufbedingungen der PCR wurden wie folgt gewählt:

Nach der PCR wurden die amplifizierten Gene, je 1,6 kB, nach Lau und Sheu, 1992 in Meth. Mol. Cell. Biol. 3, 190-192, aus einem Agarose-Gel isoliert und je in einen Hilfsvektor pUC18 ligiert, der zuvor durch das Restriktionsenzym Sma I 'blund ended' linearisiert wurde. Das Verhältnis von Vektor zu DNA- Fragment betrug ca. 1 : 4. Die Ligation wurde über Nacht bei 14°C durchgeführt.

Tabelle 2

Ansätze zur Ligation der PCR-Produkte in pUC18

Ligase-Puffer (10x): 0,5 Tris-HCl, pH 7,6, 100 mM MgCl₂, 100 mM DTT, 500 µg/ml BSA

Dieser Vektor mit dem inserierten Gen wurde in kompetente Zellen von Escherichia coli DH5alpha (nach Hanahan, 1983 in J. Mol. Biol. 166, 557-580) transformiert. Dazu wurde 5 µl der Ligationsansätze und 15 µl steriles H₂O mit je 200 µl auf Eis aufgetauten kompetenten Zellen versetzt und 30 Min auf Eis inkubiert. Die Ansätze wurden dann für 40 sec auf 42°C erhitzt und wieder für 2 min auf Eis gestellt. Zu den Ansätzen wurden dann 800 µl SOC-Medium (gegeben und diese dann 1 Stunde bei 37°C inkubiert und schließlich auf LB_Amp-100-Agar-Platten ausgestrichen, die mit X-Gal beschichtet waren.

SOC-Medium:
pH 7, 20 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 0,5 g NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 20 mM (sterilfiltrierte) Glucose, H₂O ad 1000 ml

LB_amp-100):
10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 5 g NaCl (und 15 g Bacto-Agar)
Ampicillin 100 mg/Liter

X-Gal:
5-Brom-4-Chlor-indoyl-β-D-Galactose (40 mg/ml)
70 µl pro Agar-Platte

Aus den positiven farblosen Kolonien wurde das Plasmid pUC18/rfb M bzw. rfb K isoliert (nach Birnboim und Doly, 1979).

pUC18/rfb M wurde mit den Restriktionsenzym EcoR I und BamH I linearisiert und das Gen rfb M aus dem Vektor herausgeschnitten. Aus einem Agarose-Gel wurden die Gene rfb M und rfb K isoliert und in den Expressionsvektor (pT7-6) ligiert.

Tabelle 3

Ansätze zur Ligation der Gene rfb M und rfb K in pT7-6

Diese Ligationsansätze (pt7-6/rfb M und pT7-6/rfb K) wurden in kompetente Zellen (nach Cohen, Shng und Hsu, 1972 in Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 69 (8), 2110-2114) von im Falle von rfb M Escherichia coli BL 21 (DE3) pLysS der Firma Novagen und im Falle von rfb K in Escherichia coli BL21(DE3) transformiert.

Der Stamm, der das in pT7-6 inserierte Gen rfbM enthält, wird im folgenden E. coli BL21(DE3)pLysSpERJ-1 genannt. Der Stamm, der das in pT7-6 inserierte Gen rfbK enthält, wird im folgenden E. coli BL21(DE3)pERJ-2 genannt.

Die Expression der Gene rfb M und rfb K wurde wie folgt durchgeführt:

Es wurden aus Vorkulturen von Escherichia coli BL 21(DE3) pLysSpERJ-1 (5 ml LB_{Amp-Chloramp-50} (Ampicillin und Chloram phenicol je 50 mg/Liter) über Nacht bei 120 rpm und 37°C) Hauptkulturen (10 ml) 2%-ig angeimpft und in Erlenmeyer-Kolben mit Schikanen bei 37°C und 120 rpm auf einem Schüttler solange angezogen, bis eine optische Dichte, bei 546 nm, von 0,5 erreicht wurde. Ein Milliliter der Kultur wurde entnommen, abzentrifugiert, der Überstand entfernt und das Pellet mit 50 µl Probenpuffer (SDS und β-mercaptoethanol-haltig) versetzt. Diese Probe wurde 3 min bei 95°C erhitzt und nach Abkühlen auf ein SDS-Polyacrylamidgel (Methode siehe unten) aufgegeben. Der Rest der Kultur wurde mit 0,4 mM IPTG versetzt, 20 min inkubiert, worauf wieder 1 Milliliter entnommen und wie oben behandelt wurde. Der Rest der Kultur wurde mit 0,03 mM Rifam picin versetzt und 60 min inkubiert. Es wurde 1 Milliliter entnommen und wie oben beschrieben behandelt. Von diesen Proben wurden jeweils 10 µl auf ein SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen.

Escherichia coli BL21(D)pERJ-2 wurde wie oben beschrieben angezogen.

SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese wurde nach (Laemmli, 1970, in Nature 227, 680-685) durchgeführt. Ein Foto des Coomassie- Brilliant-Blue gefärbten Gels zeigt Fig. 4.

Isolierung der GDP-Mannose-Pyrophosphorylase aus Escherichia coli BL21

Anzucht von E. coli BL21 und Aufschluß der Zellen: bei 37°C in einem Schüttler bei 120 rpm.

Ausgehend von einer Vorkultur (Über Nacht-Inkubation, 200 ml in einem 1000 ml Erlenmeyer-Kolben mit Schikanen) wurden je 2 Liter LB_{AMP-Chloramp-50} in fünf 5-Liter-Kolben mit Schikanen 1%ig angeimpft und die Kulturen bis zu einer optischen Dichte von 0,8 angezogen (3,5 Stunden). Nach 20minütiger Inkubation mit 0,4 mM IPTG und 60minütiger Inkubation mit 0,03 mM Rifampicin wurden die Kulturen abzentrifugiert (Sorvall GS3, 8000 rpm, 10 min, 20°C) und mit 50 mM Tris-HCl, pH 8 zweimal gewaschen. Anschließend wurde das Feuchtgewicht bestimmt (ca. 25 g) und eine 20%ige (w/v) Zellsuspension hergestellt. Die Zellen wurden anschließend in einem Disintegrator S durch Naßvermahlung aufgeschlossen. Dazu wurden 20 g Zellsuspension mit 80 g Glasperlen (0,3 mm Durchmesser) gemischt und inner halb von 12 min bei 4000 Upm homogenisiert. Die Zelltrümmer und die Glasperlen wurden durch 15minütige Zentrifugation (Sorvall GSA, 10 000 rpm, 20°C) abgetrennt, einmal in 50 mM Tris-HCl, pH 8 gewaschen und wieder zentrifugiert. Die Überstände wurden vereinigt und bildeten den Rohextrakt für die Anionenaustauschchromatographie an Q-Sephrose FF.

Q-Sepharose FF

400 ml Q-Sepharose FF wurden mit 226 ml Rohextrakt (mit 11,1 mg/ml Protein) beladen. Die Stufenelution startet mit ca. 800 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8 und ca. 1400 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8, mit 150 mM KCl. Das Enzym wird mit ca. 900 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8 mit 400 mM KCl eluiert. Diese Fraktion wird mit 1 M Ammoniumsulfat und 20% Glycerin versetzt und auf eine Phenyl sepharose FF (66 ml) geladen. Das Enzym wird mit einem linearen auf 0 M Ammoniumsulfat abfallenden Gradienten von 50 mM Tris-HCl, pH 8 mit 20% Glycerin (Gesamtvolumen 1000 ml) eluiert. Die aktivsten Fraktionen, zwischen 0,4 M und 0,1 M Ammoniumsulfatkonzentration wurden vereinigt, nach Ultra filtration umgepuffert (50 mM Tris-HCl, pH 8, 150 mM KCl) und abschließend in einer Gelfiltrationsäule (Superdex G-75) chromatographiert (siehe im folgenden Tabelle 4).

Die rekombinante GDP-Mannose-Pyrophosphorylase wurde aus E.coli 6,3fach angereichert. Bei einer Ausbeute von 13,5% konnte eine spezifische Aktivität von 2,34 U/mg erreicht werden. Ausgehend von 0,37 U/mg konnte über die Q-Sepharose ein Reinigungsfaktor von 2 bei einer Ausbeute von 85% erreicht werden. Die nachfolgende hydrophobe Interactionschromato graphie an Phenylsepharose führte durch das Vereinigen nur der aktivsten Fraktionen zu einem relativ hohen Verlust von 40%, bei einer Steigerung der spezifischen Aktivität auf 2,27 U/mg.

Das Molekulargewicht der GDP-Mannose-Pyrophosphorylase beträgt unter denaturierenden Bedingungen (SDS-Polyacrylamid-Gelelek trophorese) 54 kD. Zur Molekulargewichtsbestimmung im nativen Zustand wurde, mit 2 ml (7,54 mg/ml) Enzymprobe aus der Aufreinigung siehe oben, eine Gelfiltration an Sephadex G-200 (115,5 ml) durchgeführt. Die Aktivitätsbestimmung wurde mit dem nachfolgend beschriebenen erfindungsgemäßen Enzymtest für Pyrophosphorylasen durchgeführt. 2 Aktivitätsmaxima konnten bestimmt werden, die den Molekulargewichten 208700 Dalton und 107800 Dalton entsprechen. Im nativen Zustand liegt das Enzym daher als Dimer bzw. Tetramer vor.

Tabelle 4

Reinigung der GDP-Mannose-Pyrophosphorylase; Ergebnisse der einzelnen Reinigungsschritte

Folgende Untersuchungen zur Wirkungsweise und Anwendung der GDP-alpha-D-Mannose-Pyrophosphorylase wurden durchgeführt:

1) Untersuchungen zur Stabilität

Das Enzym wurde bei 4°C auf seine Lagerstabilität untersucht. Dazu wurde eine Enzympräparation mit 1,15 U/mg ohne Stabilisator sowie mit 0,1 mg/ml BSA, bzw. 3 M Ammoniumsulfat, bzw. 25% Glycerin versetzt und über 47 Tage bei 4°C inkubiert. Nach 47 Tagen konnte in den Ansätzen ohne Stabilisator und mit BSA eine Restaktivität von ca. 5% gefunden werden, während die Ansätze mit Glycerin und Ammoniumsulfat noch Aktivitäten von 75% bzw. 65% aufwiesen. In dem Ansatz mit Ammoniumsulfat konnte noch nach 4 Monaten eine Aktivität von 50% der Ausgangsaktivität festgestellt werden (Fig. 6).

Weiter wurde die Stabilität bei 30°C untersucht, indem eine definierte Stammlösung an Enzym mit 79,3 mU/mg bei 30°C in 50 mM Tris-HCl, pH 8, 5 mM MgCl₂ inkubiert und nach verschiedenen Zeiten (0 h, 2 h, 6 h und 30 h) eine Aktivitätsbestimmung durchgeführt wurde.

Tabelle 4a

Temperaturstabilität der GDP-Man-Pyrophosphorylase bei 30°C

2) Bestimmung der k_m- und v_max-Werte für die Substrate GTP und Mannose-1-Phosphat (M-1-P)

Bedingungen: 2.27 µg/ml GDP-Mannose-Pyrophosphorylase- Präparation nach der Gelfiltration, Aktivitäts bestimmung per NUSSA.

a) Bestimmung des k_m-Wertes und des v_max-Wertes für GTP- Mannose-1-Phosphat wurde mit konstant 0,08 mM eingesetzt. GTP wurde zwischen 0,01 mM und 10 mM eingesetzt (Fig. 7).
b) Bestimmung des k_m-Wertes und des v_max-Wertes für M-1-P GDP wurde mit konstant 2 mM eingesetzt.
Mannose-1-Phosphat wurde zwischen 0,002 mM und 0,6 mM variiert (Fig. 8).

Tabelle 5

Kinetische Konstanten für die Substrate GTP und M-1-P der GDP-Mannose-Pyrophosphorylase

3) Einfluß von GDP-Mannose auf die Synthese

Bedingungen: 2,27 µg/ml [in a)] und 5,67 µg/ml [in b)] GDP- Mannose-Pyrophosphorylase-Präparation nach Gelfiltration, Aktivitätsbestimmung per NUSSA.

a) Mannose-1-Phosphat wurde mit 0,08 mM konstant eingesetzt. GTP wurde variiert zwischen 0.08 mM und 6 mM. GDP-Mannose wurde mit 0 µM, 50 µM und 100 µM im Test eingesetzt.
Die Auswertung der gemessenen Aktivitäten zeigt eine kompetitive Hemmung von GDP-Mannose bezogen auf GTP (Fig. 9). Der K_i-Wert wurde berechnet zu 14,9 µM.
b) GTP wurde konstant mit 2 mM im Test eingesetzt. Mannose-1-Phosphat wurde variiert zwischen 0,003 mM und 0,3 mM.
Die Auswertung der gemessenen Aktivitäten zeigt eine un kompetitive Haltung von GDP-Mannose bezogen auf M-1-P. (Fig. 10) der K_i-Wert wurde berechnet zu 118 µM.

4) Substratspektrum der GDP-Mannose-Pyrophosphorylase

Bedingungen: Die GDP-Mannose-Pyrophosphorylase wurde mit 7,3 mU/mg im Enzymtest NUSSA eingesetzt.

a) Nucleosidtriphosphate: ATP, CTP, GTP, UTP, dTTP je 1 mM
Zucker-1-Phosphate: Mannose-1-Phosphat mit 2,5 mM
b) Nucleosidtriphosphat: GTP
Zucker-1-Phosphate: Glucose-1-P, N-Acetylglucosamin-1-P, Glucosamin-1-P, Galactose-1-P, Galactosamin-1-P, N- Acetylgalactosamin-1-P, Glucuronsäure-1-P, Galact uronsäure-1-P, Xylose-1-P, Mannose-1-P

Sowohl in a) als auch in b) konnte außer mit den natürlichen Substraten GTP und Mannose-1-Phosphat kein Umsatz festgestellt werden.

5) Anwendung der GDP-Mannose-Pyrophosphorylase zur Synthese von GDP-Mannose

Die Synthese sollte ausgehend von Mannose nach Reaktionsschema 1 durchgeführt werden.

Zunächst wurde die Synthese von GDP-Mannose ausgehend von Mannose-1-Phosphat und GTP untersucht. Hierzu wurde die GDP- Mannose-Pyrophosphorylase gekoppelt mit der Pyrophosphatase eingesetzt (1 U/ml).

Die Synthese wurde bei verschiedenen pH-Werten (7, 8, 9) in 50 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl₂ mit 2 mM GTP und 2 mM Mannose-1- Phosphat in einem Gesamtvolumen von 2 ml bei Raumtemperatur durchgeführt. Die GDP-Mannose-Pyrophosphorylase wurde mit 0,04 U/ml eingesetzt, die Pyrophosphatase mit 1 U/ml. Nach verschiedenen Zeiten wurden dem Ansatz 200 µl entnommen und 5 min bei 95°C erhitzt, abzentrifugiert (Eppendorf-Zentrifuge, 10 000 rpm, 2 min, Raumtemperatur) und über die Kapillarelektro phorese analysiert.

Über Eichkurven und den Vergleich der Flächen konnte der Gehalt an GTP und GDP-Mannose bestimmt werden. Die Umsetzungen zeigen eine höhere Ausbeute an GDP-Mannose bei alkalischen pH- Werten (Fig. 11). Da die anderen Hilfsenzyme (Reaktionsschema 1: Hexokinase und Pyruvat-Kinase) pH-Optima zwischen pH 7 und pH 9 aufweisen (Boehringer-Mannheim, 1987 in Biochemica- Information) wurde für die weiteren Synthesen ein pH-Wert von 8 gewählt.

Untersucht wurde im folgenden die Abhängigkeit der Synthese von GDP-Mannose von der Enzymkonzentration an GDP-Mannose- Pyrophosphorylase, die mit 0,04 U/ml, 0,06 U/ml, 0,08 U/ml, 0,1 U/ml und 0,2 U/ml eingesetzt wurde. Die Umsetzungen zeigen eine erhöhte Ausbeute an GDP-Mannose bei gleichbleibender Inkubationszeit und Erhöhung der Enzymkonzentration (Fig. 12). Die Multiplikation der Enzymkonzentration mit der Inkubationszeit führt zu einer Reaktionskonstanten (E _* t). Bei Variation der Enzymkonzentration bzw. der Inkubationszeit können unter Konstanthaltung des E _* t-Produktes konstante Ausbeuten erzielt werden. Bei einem E _* t von 20 (U _* min/ml) ist das Reaktionsgleichgewicht unter den gewählten Bedingungen eingestellt und eine Ausbeute von GDP-Mannose von ca. 90% erreicht (Fig. 13).

Beispiel II

Nucleotidyltransferase substrate screening assay (NUSSA)

Reaktionsschema

O'Brien, Bowien und Wood beschrieben 1975 in J. Biol. Chem. 250 (22), 8690-8695 einen gekoppelten photometrischen Enzym test zur Messung von einer pyrophospat-abhängigen Phospho fructokinase (PP_iPFK), wie sie erstmalig von Reeves et al., 1974 in J. Biol. Chem. 249, 7737-7741, in Etamoeba hiestolytica entdeckt wurden. Hierbei wurde die PP_iPFK gekoppelt mit der Reaktion der Aldolase (Reaktion 3), der Triose phosphatisomerase (Reaktion 4) und der Glycerin-3-Phosphat- Dehydrogenase (Reaktion 5). Die Reaktion wurde photometrisch bei 340 nm verfolgt.

Der folgende Enzymtest (NUSSA) koppelt erfindungsgemäß die Reaktion der Nucleotidyltransferase mit diesem Testsystem und ermöglicht somit die Messung einer beliebigen Pyrophospho rylase bzw. eines beliebigen Pyrophosphat-freisetzenden Enzyms. Der Test NUSSA wurde optimiert auf die Messung in Microtiterplatten in 200 µl Gesamtvolumen.

Tabelle 6

Zusammensetzung des Enzymtests NUSSA

Das Gesamtvolumen betrug 200 µl. Die Ansätze wurden in einem Titertek-Photometer (Molecular Devices, München) photometrisch vermessen. Im Falle des PP_iPFK-Tests wurde mit PP_i gestartet, im Falle der Pyrophosporylasen wahlweise mit dem Zucker- 1-Phosphat oder dem Nucleosidtriphosphat.

Zur Berechnung der Aktivität wurde folgende Formel angewendet:

Anwendung des Enzymtests NUSSA

1) Beispiel siehe oben: Aktivitätsmessungen der GDP-Mannose- Pyrophosphorylase.

2) Beispiel: Anwendung des NUSSA zum Screening auf Pyrophos phorylasen in zwei verschiedenen Enzymquellen:

a) Escherichia coli BL21 (DE3) pLysSpERJ-1
b) Reis (Oryza sativa L.)

Zur Anwendung des Tests muß die PP_iPFK aufgereinigt werden. Als einfache und gut verfügbare Enzymquelle wurde die Kartoffel (Solanum tuberosum L.) gewählt. Die Aufreinigung wurde nach der von van Schaftingen et al., 1982 in Eur. J. Biochem. 129, 191-195 beschriebenen Methode durchgeführt. Das Enzym (PP_iPFK) wurde in 25% Gylcerin bei -20°C aufbewahrt.

Escherichia coli BL21(DE3)pLysSpERJ-1 wurde wie oben beschrieben aufgezogen und aufgeschlossen. Das erhaltene Rohhomogenat wurde bei 10 000 rpm, 2 min, 20°C abzentrifugiert und im Enzymtest eingesetzt (21,02 mg/ml).

Der Reis wurde nach Elling, 1993 in Patent DE 42 21 595 C1, aufgeschlossen, bei 10 000 rpm, 10 min, 20°C abzentrifugiert und als Rohextrakt (4,26 mg/ml) im Enzymscreening eingesetzt. Als Substrate wurden getestet:

a) Nucleosidtriphosphate: ATP, CTP, GTP, UTP, dTTP je 1 mM im Test mit Glucose-1-Phosphat (2,5 mM)
b) Nucleosidtriphosphat UTP (1 mM)
Zucker-1-Phosphate je 2,5 mM im Test

Die Tabelle 7 zeigt die spezifischen Aktivitäten von Pyrophos phorylasen in einer mikrobiellen und einer eukaryotischen Enzymquelle.

Tabelle 7

Spezifische Aktivitäten von Pyrophosphorylasen in E.coli und Reis

20 µg/ml E.coli BL21(DE3)pLysS-pJER-1-Rohextrakt im Testansatz, 1,06 µg/ml bis 0,14 mg/ml Oryza sativa-Rohextrakt im Testansatz. Aktivitätsbestimmung per NUSSA

Zur Analytik der Synthese der GDP-Mannose wurde eine Kapillar elektrophorese (Gerät: Firma Beckman) angewendet. Als Methode wurde die Kapillarzonenelektrophorese mit einem Boratpuffer- System eingesetzt. Hierzu wurden 40 ml 0,4 mM Borsäure und 20 ml 0,2 mM Natriumborat gemischt und mit 140 ml H₂O aufgefüllt. In diesem Verhältnis gemischt stellt sich ein pH-Wert von ca. 8,3 ein. Die Stromspannung wurde mit 25 kV vorgewählt. Die Stromstärke stellt sich ein auf ca. 35,7 µA.

Um die Konzentration aus den Elektropherogrammen bestimmen zu können, wurden von GDP-Mannose und GTP verschiedene Konzentrationen zwischen 0,02 mM und 0,4 mM in 50 mM Tris- HCl, pH 8 mit 5 mM MgCl₂ angesetzt und über die Kapillar elektrophorese analysiert. Aus der Auftragung der Fläche gegen die theoretisch eingesetzte Konzentration (mM) resultiert eine Gerade, so daß eine lineare Regression durchgeführt werden konnte:

Isolierung der Phosphomannomutase aus E. coli BL21(DE3)

Anzucht von E. coli BL21 und Aufschluß der Zellen: bei 37°C in einem Schüttler bei 120 rpm wie bei der GDP- Mannose-Pyrophosphorylase.

Der gewonnene Rohextrakt wurde auf einen Anionenaustauscher gegeben:
Q-Sepharose FF:
77 ml Q-Sepharose FF wurden mit 122 ml Rohextrakt (mit 14 mg/ml Proteingehalt) beladen. Es wurde ein linear ansteigender Gradient (50 mM Tris-HCl, pH 8, 0-600 mM KCl) angelegt und das Protein zwischen 280 und 460 mM KCl eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt und das Protein mit 3 M (NH₄)₂SO₄ präzipitiert. Nach Zentrifugation (15 min, 10 000 rpm, 4°C) wurde das Pellet in 5 ml Tris-HCl, pH 8 aufgenommen. Das Enzym konnte mit einem Reinigungsfaktor von 2,4 und einer Ausbeute von 78% gewonnen werden.

Tabelle 8

Partielle Reinigung der Phosphomannomutase

Enzymatische Synthese von GDP-α-D-Mannose ausgehend von Mannose

Die enzymatische Synthese von GDP-Mannose (Fig. 14) verläuft ausgehend von Mannose über die Hexokinase-katalysierte Phosphorylierung an C6, die Isomerisierung von Mannose-6-Phosphat zu Mannose-1-Phosphat durch die Phospho-mannomutase und die Umsetzung von Mannose-1-Phosphat mit GTP zu GDP-Mannose durch die GDP-Mannose-Pyrophosphorylase.

Das eingesetzte ATP wird rezykliert, indem das bei der Hexokinasereaktion entstehende ADP mit Phosphoenolpyruvat unter der Katalyse durch die Pyruvat-Kinase zu ATP und Pyruvat umgewandelt wird (Wong et al., 1995 in Angew. Chem. 107, 569-593) (Fig. 15).

Die Synthese in größerem Maßstab wurde im 'repetitive batch'- Verfahren durchgeführt. Das Gesamtvolumen des Syntheseansatzes betrug 80 ml. Die folgende Tabelle zeigt die Zusammensetzung des Syntheseansatzes:

Nach 24 Stunden wurde der Ansatz über ein Ultrafiltrationsmodul mit einer YM 10-Membran (cut off von 10 kD) der Firma Amicon (Witten) auf 5 ml eingeengt und mit 50 mM Tris-HCl, pH 8, 10 mM KCl, 10 mM MgCl₂ auf 50 ml aufgefüllt, wieder eingeengt und erneut aufgefüllt und auf 5 ml eingeengt. Das proteinhaltige Retentat wurde für einen erneuten Syntheseansatz mit Substratlösung (75 ml) versetzt und erneut 24 Stunden inkubiert. Diese Vorgehensweise wurde noch ein weiteres Mal wiederholt.

Die Filtrate wurden mit alkalischer Phosphatase (1 U/ml) versetzt und 24 Stunden inkubiert, um Nucleosidmono-, di- und triphosphate bzw. Zucker-Phosphate wie Mannose-6- oder -1-Phospat zu dephosphorylieren.

Der aktivierte Zucker wird von der Phosphatase nicht angegriffen.

Insgesamt wurden dreimal 253 mg (0,4 mmol) GTP mit 216,3 mg Mannose umgesetzt. Die Überprüfung der Ausbeuten nach je 24 Stunden ergab:

Dies entspricht 581 mg GDP-Mannose, bezogen auf die freie Säure (605.3 g/mol).

Nach der Inkubation mit alkalischer Phosphatase wurden die Ansätze ultrafiltriert und vereinigt und auf einen Anionenaustauscher (Dowex^R 1×2 Cl^-, Serva) gegeben.

Die GDP-Mannose wurde nach einem linearen Gradienten zwischen 0 und 0,5 M LiCl (500 ml) mit 1 M LiCl eluiert. Die GDP-Mannose enthaltende Lösung (900 ml mit 0,92 mM GDP-Mannose) wurde über Sephadex G-10 gelfiltriert und anschließend die GDP-Mannose enthaltenden Fraktionen lyophilisiert. Das Lyophilisat wurde in wenig Wasser gelöst und mit eiskaltem Aceton versetzt. Die ausfallende GDP-Mannose wurde abfiltriert in Wasser aufgenommen, lyophilisiert und über die Kapillarelektrophorese durch Vergleich der Fläche mit einer Eichkurve analysiert. Fig. 16 zeigt das Elektropherogramm der unverdünnten Probe (1 mg des Lyophilisats/ml Wasser).

Insgesamt konnten 199 mg GDP-Mannose in 500 mg Lyophilsat erhalten werden.

Claims

1. Mannose- bzw. mannosederivat-spezifische, aus Mikroorganismen isolierbare GDP-Mannose-Pyrophosphorylase (GDP-Man-PP) mit einer spezifischen Aktivität 2 U/mg.

2. GDP-Mannose-Pyrophosphorylase nach Anspruch 1, bakteriellen Ursprungs.

3. Verfahren zur Gewinnung von GDP-Man-PP, dadurch gekennzeichnet, daß man einen im Hinblick auf die Bildung von GDP-Man-PP rekombinanten Stamm von auf Enzymproduktion ausgelegten Mikroorganismen in angepaßtem Medium kultiviert; die geernteten Zellen aufschließt und den durch Zentri fugieren erhaltenen Rohextrakt auf einen Anionenaustauscher gibt, der einer Stufen-Gradienten-Elution unterworfen wird, aus deren enzym-angereicherter Fraktion die GDP-Man-PP durch "Hydrophobe Interaktions-Chromatographie" (HIC) mit linear abfallendem (NH₄)₂SO₄-Gradienten gewonnen wird.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man einen durch Inserierung des für die GDP-Man-PP kodierenden Gens rfbM in ein Plasmid und Einschleusung desselben in einen geeigneten Produzenten-Stamm erhaltenen rekombinanten Stamm verwendet.

5. Verfahren zur Herstellung von GDP-Mannose, dadurch gekennzeichnet, daß man Mannose-1-phosphat enzymatisch in Gegenwart von GDP-Man-PP nach Anspruch 1 mit GTP umsetzt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Mannose-1-phosphat durch Umwandlung von Mannose-6- phosphat mit Hilfe von Phosphomannomutase gebildet wird.

7. Zur Umwandlung von Mannose-6-phosphat in Mannose-1- phosphat befähigte Phosphomannomutase mikrobiellen Ursprungs.

8. Phosphomannomutase nach Anspruch 7. erhalten aus einem durch Inserierung des für die Phospho mannomutase kodierenden Gens rfbK in ein Plasmid und Ein schleusung desselben in einen geeigneten Produzenten-Stamm erhaltenen rekombinanten Stamm, insbes. Bakterienstamm.

9. Photometrischer Nucleotidyltransferase-Test NUSSA mit fünfstufiger Umsetzung gemäß Reaktionsschema 2 von Seite 8, bei dem NADH photometrisch ermittelt und gemäß der Beziehung 2 Mol NADH Verbrauch entsprechend 1 Mol umgesetztes NTP umgerechnet wird.