DE60026142T2

DE60026142T2 - Verfahren zur herstellung von oligosaccharide

Info

Publication number: DE60026142T2
Application number: DE60026142T
Authority: DE
Inventors: Eric Samain; Bernard Priem
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 1999-07-07
Filing date: 2000-07-07
Publication date: 2006-11-23
Anticipated expiration: 2020-07-08
Also published as: WO2001004341A1; JP2003504072A; FR2796082B1; AU6296100A; US20090082307A1; MXPA02000240A; EP1194584B1; FR2796082A1; CA2378562C; EP1637611B1; JP5058420B2; EP1637611A1; AU780290B2; DE60044310D1; ATE466094T1; ATE318324T1; US7521212B1; CA2378562A1; US8586332B2; EP1194584A1

Description

Die Erfindung hat die Herstellung von Oligosacchariden von biologischem Interesse auf mikrobiologischem Wege zum Gegenstand.
Es ist jetzt wohl etabliert, dass die Oligosaccharide eine wichtige biologische Rolle insbesondere im Bereich der Aktivität und der Funktion der Proteine spielen; sie dienen beispielsweise dazu, die Dauer der Halbwertszeit der Proteine zu modulieren, manchmal sind sie an der Struktur des Proteins beteiligt. Die Oligosaccharide spielen eine kritische Rolle bei der Antigen-Variabilität (beispielsweise Blutgruppe) und bei bestimmten bakteriellen Infektionen, wie jenen, die durch Neisseria meningitidis hervorgerufen werden.
Da die Oligosaccharide durch Reinigung ausgehend von natürlichen Quellen üblicherweise mit einer geringen Ausbeute erhalten werden, ist die Synthese von Oligosacchariden zu einer bedeutenden Herausforderung der Chemie der Kohlenhydrate geworden, um ausreichende Mengen von gut charakterisierten Oligosacchariden, welche für die grundlegende Untersuchung oder für alle anderen potentiellen Anwendungen erforderlich sind (Boons et al., 1996), bereitzustellen.
Die Synthese von komplexen Oligosacchariden von biologischem Interesse kann auf chemischem, enzymatischem oder mikrobiologischem Wege erfolgen.
Trotz der Entwicklung von neuen chemischen Methoden zur Synthese von Oligosacchariden während der letzten 20 Jahre, bleibt die chemische Synthese von Oligosacchariden aufgrund der zahlreichen selektiven Schutz- und Schutzgruppenentfernungsschritte, der Labilität der glycosidischen Bindungen, Schwierigkeiten, regiospezifische Kopplungen zu erhalten, und von geringen Herstellungsausbeuten sehr schwierig. Da die Anzahl der Schritte mit der Größe des Oligosaccharids zunimmt, ist die Herstellung von großen Mengen von Oligosacchariden, die länger als die Trisaccharide sind, nicht leicht. Im Gegensatz zu den Erfahrungen bei der Peptidsynthese oder der Nukleinsäuresynthese kann die traditionelle synthetische organische Chemie folglich heutzutage keine qualitätsvolle und in Mengen erfolgende Synthese von Oligosacchariden sogar von einfacher Formel bereitstellen.
Folglich sind die enzymatischen Methoden populärer geworden, denn sie erlauben eine regioselektive Synthese unter milden Bedingungen und ohne einen Schritt eines Schützens der Hydroxylgruppen. Die Entwicklung des enzymatischen Ansatzes wurde ermöglicht durch die Klonierung und die funktionale Identifizierung von zahlreichen Genen, welche die Enzyme kodieren, welche an dem Syntheseweg der Oligosaccharide beteiligt sind. So können verschiedene Arten von Enzymen für die in vitro-Synthese von Oligosacchariden eingesetzt werden. Die physiologische Funktion der Glycosylhydroxylasen und der Glycosylphosphorylasen besteht darin, die Oligosaccharide zu depolymerisieren, aber sie können gleichfalls in vitro bei der Synthese der Oligosaccharide eingesetzt werden, indem man das Gleichgewicht und die Kinetik der Reaktion kontrolliert. Die Substrate der Enzyme dieser Reaktionen sind leicht verfügbar, aber diese enzymatischen Reaktionen sind nicht sehr vielseitig. Eine andere enzymatische Methode, die entwickelt worden ist, setzt die Glycosyltransferasen des biochemischen Leloir-Weges ein, die eine starke Regiospezifität für die Vorstufe wie auch für das Donor-Substrat zeigen; diese Glycosyltransferasen sind nicht so leicht verfügbar wie die Glycosylhydrolasen. Die in vitro-DNA-Rekombinationstechnik hat unlängst erlaubt, eine bestimmte Anzahl von diesen zu klonieren und zu produzieren. Indessen besteht die Haupteinschränkung dieser enzymatischen Methode in den sehr hohen Kosten der Nukleotid-Zucker-Moleküle, die die Donoren des Zuckers, der durch diese Enzyme verwendet wird, sind.
Der mikrobiologische Weg zur Herstellung von rekombinanten Oligosacchariden in vivo ist der verführerischste der Synthesewege, denn das Bakterium übernimmt gleichzeitig die Biosynthese der Enzyme, die Regeneration der Nukleotid-Zucker-Moleküle und schließlich die Produktion des Oligosaccharids.
Die ersten Beschreibungen der Synthese von Oligosacchariden auf mikrobiologischem Wege unter Verwendung von rekombinanten Bakterien können in einem bestimmten Maße als die Arbeiten angesehen werden, die zu der Erhellung der Biosynthesewege der Knötchenbildungsfaktoren geführt haben; diese Faktoren sind Signalmoleküle, die durch die Rhizobien sekretiert werden, um die Erkennung durch die Leguminosen in dem Knötchenbildungsprozess zu ermöglichen. Die Knötchenbildungsfaktoren werden aus einem Chitooligosaccharid-Grundgerüst, welches unterschiedliche Substitutionen trägt, gebildet. Die funktionale Identifizierung der nod-Gene, die an der Biosynthese der Knötchenbildungsfaktoren beteiligt sind, ist teilweise erreicht worden, indem die Oligosaccharide, die in vivo in Stämmen von Escherichia coli, die diese unterschiedlichen nod-Gene exprimieren, gebildet werden, identifiziert wurden (Gérémia et al., 1994; Kamst et al., 1995; Spaink et al., 1994; Mergaert et al., 1995). DE 197 35 994 beschreibt Mikroorganismen, die eine Glycosyltransferase exprimieren; Bettler et al. (1999-03) Glycoconjugate Journal, Band 16, 205–212, beschreiben, dass ein geringer Teil der Oligosaccharide, die durch E. coli produziert werden, durch Glycerol substituiert sind; Sarmain et al. (1999-06) Journal of Biotechnology, Band 72, 33–47, beschreiben die Herstellung von acetylierten Chitooligosacchariden bei E. coli und WO 98/44145 beschreibt Stämme von E. coli für die Produktion von Oligosacchariden. Indessen war die Produktion von Oligosacchariden an sich nicht das Ziel dieser Untersuchungen; diese Produkte wurden lediglich in Form von Spuren synthetisiert und lediglich dank der Verwendung von radioaktiven Vorstufen identifiziert.
Im Gegensatz dazu ist unlängst in unserem Labor gezeigt worden (Samain et al., 1997), dass die bei hoher Zelldichte erfolgende Kultivierung von Stämmen von Escherichia coli, welche das Gen nodC (Chitooligosaccharidsynthase) aufweisen, es erlaubte, bedeutende Mengen über 2 g/l von sogenannten rekombinanten Chitooligosacchariden zu produzieren.
Diese Technik der mikrobiologischen Synthese von Oligosacchariden bleibt indessen auf die Produktion von Chitooligosacchariden allein beschränkt aufgrund der Tatsache der einzigartigen Eigenschaft von nodC (Chitooligosaccharidsynthase), ohne Vorstufe zu funktionieren; die anderen Enzyme glycosylieren tatsächlich eine spezifische Vorstufe und deren Aktivität ist folglich von dem Vorhandensein dieser Vorstufe in der Zelle abhängig. Das Problem der Vorstufe ist folglich der hauptsächliche Hinderungsgrund, der die Entwicklung der Methode und deren Erweiterung auf die Produktion von anderen Arten von Oligosacchariden blockiert.
Die Erfindung hat folglich ein Verfahren zur Herstellung eines Oligosaccharids von Interesse durch eine genetisch modifizierte Zelle ausgehend von wenigstens einer durch die Zelle internalisierten exogenen Vorstufe, ausgewählt aus Lactose, einem β-Galactosid und Sialinsäure, zum Gegenstand, wobei die Vorstufe an dem Biosyntheseweg des Oligosaccharids beteiligt ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (i) Gewinnung einer Zelle, welche wenigstens ein rekombinantes Gen, welches ein Enzym kodiert, welches in der Lage ist, eine Modifizierung der exogenen Vorstufe oder einer der Zwischenstufen des Biosynthesewegs des Oligosaccharids ausgehend von der exogenen Vorstufe, welche für die Synthese des Oligosaccharids ausgehend von der Vorstufe erforderlich ist, auszuführen, wie auch die Elemente, welche die Expression des Gens in der Zelle erlauben, umfasst, wobei die Zelle keine enzymatische Tätigkeit aufweist, welche in der Lage wäre, das Oligosaccharid, die Vorstufe und die Zwischenstufen abzubauen; (ii) Kultivierung der Zelle in Gegenwart von wenigstens einer solchen exogenen Vorstufe unter Bedingungen, welche die Internalisierung der exogenen Vorstufe durch die Zelle gemäß einem passiven und/oder aktiven Transportmechanismus und die Produktion des Oligosaccharids durch die Zelle erlauben.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren, wie oben beschrieben, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass die Zelle außerdem wenigstens ein Gen, welches ein Enzym kodiert, welches in der Lage ist, eine Modifizierung einer endogenen Vorstufe, welche an dem Biosyntheseweg des Oligosaccharids beteiligt ist, auszuführen, wobei das Enzym identisch mit oder verschieden ist von dem Enzym, das in dem oben beschriebenen Verfahren eingesetzt wird, wie auch die Elemente, welche die Expression des Gens in der Zelle erlauben, umfasst, und dadurch gekennzeichnet ist, dass die Zelle keine enzymatische Tätigkeit aufweist, welche in der Lage wäre, die Vorstufe abzubauen.
Mit Oligosacchariden sollen lineare oder verzweigte Polymere mit variabler Anzahl von Resten, Bindungen und Untereinheiten bezeichnet werden, wobei die Anzahl von Resten größer als 1 ist. Die Oligosaccharide sind Glucide, die sich bei der Hydrolyse in mehrere Monosaccharid-Moleküle umwandeln, wobei die Monosaccharide die Zucker sind, die man durch Hydrolyse nicht in eine einfachere Substanz umwandeln kann. Man unterteilt die Monosaccharide nach der Anzahl von Kohlenstoffatomen von deren Kohlenwasserstoffkette in Triosen, Tetrosen, Pentosen, Hexosen, Heptosen und nach dem Vorhandensein einer Aldehydfunktion oder einer Ketonfunktion in ihrem Molekül auch in Aldosen und Ketosen. Unter den häufigsten Monosacchariden kann man die Mannose, die Glucose, die Galactose, N-Acetylglucosamin, N-Acetylgalactosamin aufführen. Die Anzahl von stereoisomeren Oligosaccharidketten ist extrem groß aufgrund der bedeutenden Anzahl von asymmetrischen Kohlenstoffatomen in der Kohlenwasserstoffkette.
Mit exogener Vorstufe soll eine Verbindung, die an dem Biosyntheseweg des Oligosaccharids gemäß der Erfindung beteiligt ist, welche durch die Zelle internalisiert wird, bezeichnet werden. Mit endogener Vorstufe soll eine Verbindung, welche an dem Biosyntheseweg des Oligosaccharids gemäß der Erfindung beteiligt ist, die von Natur aus in der Zelle vorhanden ist, bezeichnet werden.
Mit genetisch modifizierter Zelle soll ein Mikroorganismus bezeichnet werden, in welchem wenigstens eine Veränderung der DNA-Sequenz in dessen Genom eingeführt worden ist, um der Zelle einen bestimmten Phänotyp zu verleihen. Solche Veränderungen können so beispielsweise die Fähigkeit der Zelle, eine Verbindung gemäß der Erfindung nicht abzubauen oder nicht zu modifizieren oder die Häufigkeit einer DNA-Umlagerung nicht zu verringern, verleihen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle eine Zelle ist, die unter den Bakterien und den Hefen ausgewählt wird. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsweise der Erfindung wird das Bakterium ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Escherichia coli, Bacillus subtilis, Campylobacter pylori, Helicobacter pylori, Agrobacterium tumefaciens, Staphylococcus aureus, Thermophilus aquaticus, Azorhizobium caulinodans, Rhizobium leguminosarum, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitis. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsweise der Erfindung ist das Bakterium Escherichia coli. Gemäß einer anderen Ausführungsweise der Erfindung ist die Zelle eine Hefe, die vorzugsweise Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pombe, Candida albicans ist. Die erfindungsgemäße Zelle weist keine enzymatische Aktivität auf, welche in der Lage wäre, das Oligosaccharid, die Vorstufe oder die Stoffwechselzwischenstufen abzubauen.
Die Nukleinsäuresequenz, welche das Enzym gemäß der Erfindung kodiert, ist entweder in der Zelle von Natur aus vorhanden oder wird in die Zelle durch die in vitro-DNA-Rekombinationstechniken, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind, eingeführt. Im Rahmen der vorliegenden Beschreibung soll mit Nukleinsäure ein DNA-Fragment, ebenso doppelsträngig wie einzelsträngig, wie Transkriptionsprodukte der DNAs und/oder ein RNA-Fragment bezeichnet werden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsweise ist die Nukleinsäuresequenz, die in die Zelle durch die in vitro-DNA-Rekombinationstechniken eingeführt wird und die ein Enzym kodiert, welches an dem Biosyntheseweg des Oligosaccharids von Interesse beteiligt ist, heterolog. Mit heterologer Nukleinsäuresequenz soll eine Nukleinsäuresequenz bezeichnet werden, die nicht von Natur aus in der Zelle gemäß der Erfindung vorhanden ist. Die heterologe Nukleinsäuresequenz kann gemäß der Erfindung von einem jeglichen tierischen oder pflanzlichen, eukaryotischen oder prokaryotischen Zelltyp stammen und kann von einem Virus stammen.
Unter den prokaryotischen Zellen, aus welchen die heterologe Nukleinsäuresequenz stammt, kann man die Bakterien und insbesondere Escherichia coli, Bacillus subtilis, Campylobacter pylori, Helicobacter pylori, Agrobacterium tumefaciens, Staphylococcus aureus, Thermophilus aquaticus, Azorhizobium caulinodans, Rhizobium leguminosarum, Rhizobium meliloti, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitis aufführen.
Unter den einzelligen eukaryotischen Zellen, aus welchen die heterologe Nukleinsäuresequenz stammt, kann man die Hefen und insbesondere Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pombe, Candida albicans aufführen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsweise stammt die heterologe Nukleinsäuresequenz aus pflanzlichen oder tierischen eukaryotischen Zellen. Gemäß einer noch bevorzugteren Weise stammt die heterologe Nukleinsäuresequenz aus Säugetierzellen und vorzugsweise aus menschlichen Zellen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsweise der Erfindung ist die Zelle gemäß der Erfindung das Bakterium Escherichia coli und die Nukleinsäuresequenz, die in das Bakterium eingeführt wird und das Enzym gemäß der Erfindung kodiert, stammt vorzugsweise aus einem Bakterium, welches in der vorstehend aufgeführten Gruppe ausgewählt wird.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsweise der Erfindung wird die Nukleinsäuresequenz, welche das Enzym gemäß der Erfindung kodiert, in die Zelle in Form eines Expressionsvektors eingeführt. Der Vektor muss einen Promotor, Translationsinitiations- und -terminationssignale wie auch geeignete Transkriptionsregulationsregionen umfassen. Der Vektor muss in der Zelle während aufeinanderfolgender Generationen stabil gehalten werden können und kann gegebenenfalls spezielle Signale, die die Sekretion des translatierten Enzyms spezifizieren, aufweisen. Diese unterschiedlichen Kontrollsignale werden abhängig von dem eingesetzten zellulären Wirt ausgewählt. Zu diesem Zweck können die Nukleinsäuresequenzen in Vektoren mit autonomer Replikation innerhalb des gewählten Wirts oder in Integrationsvektoren, die sich in das Genom des gewählten Wirts integrieren, inseriert werden. Solche Vektoren werden gemäß den Methoden, die von dem Fachmann auf diesem Gebiet üblicherweise eingesetzt werden, hergestellt und die daraus resultierenden Klone können in einen geeigneten zellulären Wirt durch Standardmethoden, wie beispielsweise den Thermoschock oder die Elektroporation, eingeführt werden.
Die Erfindung zielt außerdem auf die obigen Zellen ab, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie durch wenigstens eine isolierte rekombinante Nukleinsäure, welche das Enzym gemäß der Erfindung kodiert, oder durch wenigstens einen rekombinanten Vektor, wie oben definiert, transformiert sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass die durch das Enzym ausgeführte Modifikation ausgewählt wird unter der Glycosylierung, der Sulfatierung, der Acetylierung, der Phosphorylierung, der Succinylierung, der Methylierung und der Hinzufügung einer Enolpyruvat-Gruppe, der Sialylierung, der Fucosylierung. Insbesondere ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym ein Enzym ist, welches in der Lage ist, eine Glycosylierung auszuführen, ausgewählt unter den Glycosyltransferasen, den Glycosylhydrolasen, den Glycosylphosphorylasen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsweise ist das Enzym, welches in der Lage ist, die Glycosylierung auszuführen, eine Glycosyltransferase. Gemäß einer bevorzugen Ausführungsweise wird die Glycosyltransferase gemäß der Erfindung unter der β-1,3-N-Acetylglucosaminyltransferase, der β-1,3-Galactosyltransferase, der α-1,3-N-Acetylgalactosaminyltransferase, der β-1,3-Glucuronosyltransferase, der β-1,3-N-Acetylgalactosaminyltransferase, der β-1,4-N-Acetylgalactosaminyl transferase, der β-1,4-Galactosyltransferase, der α-1,3-Galactosyltransferase, der α-1,4-Galactosyltransferase, der α-2,3-Sialyltransferase, der α-2,6-Sialyltransferase, der α-2,8-Sialyltransferase, der α-1,3-Fucosyltransferase, der α-1,4-Fucosyltransferase, der α-1,2-Fucosyltransferase ausgewählt. Die im Rahmen der Erfindung eingesetzten Glycosyltransferasen sind zu der stereospezifischen Konjugation einer Einheit von speziellen aktivierten Sacchariden mit einem speziellen Akzeptormolekül in der Lage. Die aktivierten Saccharide bestehen im Allgemeinen aus Saccharidderivaten von Uridin-, Guanosin- und Cytidindiphosphat. So können die aktivierten Saccharide ein UDP-Saccharid, ein GDP-Saccharid, ein CMP-Saccharid sein.
Bestimmte Gene, die Glycosyltransferasen kodieren, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden, sind zuvor beschrieben worden; beispielsweise beschreibt die internationale Patentanmeldung WO 96 10086 die klassische Oligosaccharidsynthese: während eines ersten Schritts werden die unterschiedlichen Glycosyltransferasen in rekombinanten Bakterien, die die Gene lgtA, lgtB und lgtC von Neisseria gonorrhoeae aufweisen, produziert, dann werden nach Reinigung der so hergestellten rekombinanten Enzyme die Oligosaccharide in vitro in Gegenwart der erforderlichen Vorstufen und Nukleotid-Zucker-Moleküle synthetisiert.
Gemäß bestimmten Ausführungsweisen der Erfindung wird das Enzym, welches in der Lage ist, eine Acetylierung auszuführen, durch das Gen NodL des Bakteriums Azorhizobium caulinodans kodiert. Gemäß einer anderen Ausführungsweise wird das Enzym, welches in der Lage ist, eine Sulfatierung auszuführen, durch das Gen NodH des Bakteriums Rhizobium meliloti kodiert.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass die Zellkultivierung vorzugsweise auf einem kohlenstoffhaltigen Substrat ausgeführt wird; gemäß einer besonderen Ausführungsweise der Erfindung wird das kohlenstoffhaltige Substrat unter Glycerol und Glucose ausgewählt. Andere kohlenstoffhaltige Substrate können gleichfalls eingesetzt werden; man kann Maltose, Stärke, Cellulose, Pectin, Chitin aufführen. Gemäß einer anderen Ausführungsweise erfolgt die Zellkultivierung auf einem Substrat, welches aus Aminosäuren und/oder Proteinen und/oder Lipiden gebildet wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt der Kultivierung unter Bedingungen ausgeführt wird, welche erlauben, eine Kultur mit hoher Zelldichte zu erhalten; dieser Kultivierungsschritt umfasst eine erste Phase einer exponentiellen Zellvermehrung, welche durch das kohlenstoffhaltige Substrat sichergestellt wird, eine zweite Phase einer Zellvermehrung, welche durch das kohlenstoffhaltige Substrat, welches kontinuierlich zugesetzt wird, begrenzt wird, und schließlich eine dritte Phase einer verlangsamten Zellvermehrung, welche erhalten wird, indem in die Kultur kontinuierlich eine bezogen auf die in Schritt b) zugesetzte Substratmenge verringerte Menge des Substrats hinzugegeben wird derart, dass der Gehalt an in der Kultur mit hoher Zelldichte produzierten Oligosacchariden erhöht wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass die in die Zellkultur während der Phase c) kontinuierlich hinzugegebene Substratmenge bezogen auf die während der Phase b) kontinuierlich zugesetzte Substratmenge um wenigstens 30%, vorzugsweise 50%, bevorzugt 60% verringert ist. Das erfindungsgemäße Verfahren ist gleichfalls dadurch gekennzeichnet, dass die exogene Vorstufe während der Phase b) zugesetzt wird.
Gemäß einer Ausführungsweise der Erfindung ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die exogene Vorstufe von Glucid-Natur, vorzugsweise von Oligosaccharid-Natur ist.
Die Eigentümlichkeit und die Durchführbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens beruhen auf der Verwendung von zwei Weisen der Internalisierung der exogenen Vorstufe, die weder die Integrität der Zelle zerstören noch deren Lebensvorgänge oder -funktionen schädigen. Dies schließt insbesondere die klassischen Techniken zur Permeabilisierung der Membran durch organische Lösemittel, die die Vermehrung und den Energiestoffwechsel blockieren werden, aus. Die beiden möglichen Weisen der Internalisierung der exogenen Vorstufe setzen einen passiven oder aktiven Transportmechanismus ein.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass die Vorstufe gemäß einem aktiven Transportmechanismus internalisiert wird. Mit Internalisierung durch aktiven Transport soll die Fähigkeit der Zellen und bevorzugt der Bakterien bezeichnet werden, selektiv bestimmte(n) Substanzen oder exogene(n) Vorstufen in deren Zytoplasma Eingang zu verschaffen und zu konzentrieren. Dieser Transport erfolgt durch Transportmoleküle von Protein-Natur, welche als Permeasen bezeichnet werden, die wie Enzyme wirken; die Permeasen sind induzierbare Katalysatoren, d.h. sie werden in Gegenwart von Substrat oder der Vorstufe synthetisiert. Gemäß einer besonderen Ausführungsweise der Erfindung bilden Lactose und die β-Galactoside Vorstufen, die aktiv in das Zytoplasma des Bakteriums Escherichia coli durch die Lactosepermease, welche auch als Galactosidpermease bezeichnet wird, transportiert werden. Die Erfindung betrifft folglich ein erfindungsgemäßes Verfahren, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass der aktive Transport der Vorstufe durch die Lactosepermease erfolgt. Die Lactosepermease weist eine ziemlich breite Spezifität auf, die es dieser erlaubt, außer Lactose andere Moleküle zu transportieren. Sie ist tatsächlich in der Lage, verschiedene natürliche oder synthetische β-Galactoside, α-Galactoside und Saccharose zu transportieren. Es ist folglich einer der Gegenstände der Erfindung, gemäß einer bevorzugten Ausführungsweise ein Verfahren bereitzustellen, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass die Vorstufe Lactose ist, welche das Grundmotiv von sehr zahlreichen biologisch aktiven Oligosacchariden bildet. Es liegt gleichfalls im Umfang der Erfindung, ein Verfahren bereitzustellen, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass die Vorstufe ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus: (i) natürlichen oder synthetischen β-Galactosiden, vorzugsweise unter 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-fructofuranose (Lactulose), 3-O-β-D-Galactopyranosyl-D-arabinose und Allyl-β-D-galactopyranosid, (ii) α-Galactosiden, vorzugsweise Melibiose und Raffinose, Allyl-α-D-galactopyranosid, (iii) Saccharose.
Die Spezifität der Lactosepermease kann auch durch Mutation modifiziert werden und den Transport von anderen Verbindungen, wie Maltose und Cellobiose, erlauben. Alle diese Verbindungen können folglich als Vorstufen für die Synthese von Oligosacchariden eingesetzt werden. Es liegt gleichfalls im Umfang dieser Erfindung, als Vorstufen Analoga der Lactose, welche eine chemisch reaktive Gruppe für eine spätere Funktionalisierung des Produkts aufweisen, einzusetzen; eines dieser Analoga ist vorzugsweise Allyl-β-D-galactopyranosid. Es liegt gleichfalls im Umfang dieser Erfindung, andere Permeasen, die durch die in vitro-DNA-Rekombinationstechniken modifiziert oder nicht modifiziert worden sind, einzusetzen, um die Internalisierung von unterschiedlichen Arten von Vorstufen zu ermöglichen.
Die β-Galactoside werden im Zytoplasma des Bakteriums normalerweise durch die β-Galactosidase, die durch das Gen LacZ kodiert wird, hydrolysiert. Um sich von diesem Problem zu befreien, wird eine lacZ-Bakterienmutante, welche keine β-Galactosidaseaktivität mehr aufweist, eingesetzt, wenn die eingesetzte Vorstufe Lactose und/oder ein β-Galactosid ist. Der Gegenstand der Erfindung besteht darin, ein Verfahren bereitzustellen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Zelle keine enzymatische Aktivität aufweist, welche in der Lage wäre, die Vorstufe wie auch die Stoffwechselzwischenstufen abzubauen.
Gemäß einer besonderen Weise bezieht sich die Erfindung auf ein oben beschriebenes Verfahren, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass die Vorstufe Sialinsäure ist. In diesem Falle wird der aktive Transport der Vorstufe durch die Permease NanT realisiert.
Gemäß einer anderen besonderen Weise erstreckt sich die Erfindung auf ein oben beschriebenes Verfahren, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass die Vorstufe Sialinsäure und Lactose ist. In diesem Falle wird der aktive Transport der Vorstufe durch die Lactosepermease und die Permease NanT realisiert.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren weist die Zelle keine enzymatische Aktivität auf, welche in der Lage wäre, die Vorstufe oder die Vorstufen abzubauen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsweise ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle einen unter LacZ- und/oder NanA- ausgewählten Genotyp hat.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass es außerdem die Zugabe eines Induktors in das Kulturmedium, um die Expression des Enzyms und/oder eines an dem aktiven Transport beteiligten Proteins in der Zelle zu induzieren, umfasst; gemäß einer bevorzugten Ausführungsweise ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass der Induktor Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) ist und das Protein die Lactosepermease ist.
Die Erfindung erlaubt erstmals, komplexe Oligosaccharide mit Ausbeuten in der Größenordnung von Gramm pro Liter herzustellen. Je nach seiner Größe häuft sich das Oligosaccharid entweder im bakteriellen Zytoplasma an oder wird in das Kulturmedium sekretiert. So wird gemäß einer bevorzugten Ausführungsweise das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt für die Herstellung des Trisaccharids 4-O-[3-O-(2-Acetamido-2-desoxy-β-D-glucopyranosyl)-β-D-galactopyranosyl]-D-glucopyranose, (β-D-GlcNac-[1→3]-β-D-Gal-[1→4]-D-Glc); es ist dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle ein Bakterium von LacZ^–,LacY⁺-Genotyp ist, das Enzym die β-1,3-N-Acetylglucosaminyltransferase ist, das Substrat Glycerol ist, der Induktor Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) ist und die Vorstufe Lactose ist.
Gemäß einer zweiten bevorzugten Ausführungsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt für die Herstellung von Lacto-N-neo-tetraose und von Polylactosamin; es ist dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle ein Bakterium von LacZ^–,LacY⁺-Genotyp ist, die Enzyme die β-1,3-N-Acetylglucosaminyltransferase und die β-1,4-Galactosyltransferase sind, das Substrat Glucose ist, der Induktor Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) ist, die Vorstufe Lactose ist.
Gemäß einer dritten bevorzugten Ausführungsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt für die Herstellung von Allyl-3-O-(2-acetamido-2-desoxy-β-D-glucopyranosyl)-β-D-galactopyranosid (β-D-GlcNac-[1→3]-β-D-Gal-1→O-allyl); es ist dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle ein Bakterium von LacZ^–,LacY⁺-Genotyp ist, das Enzym die β-1,3-N-Acetyl glucosaminyltransferase ist, das Substrat Glycerol ist, der Induktor Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) ist, die Vorstufe Allyl-β-D-galactopyranosid ist.
Gemäß einer vierten bevorzugten Ausführungsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt für die Herstellung von Analoga von Lacto-N-neo-tetraose und von Polylactosaminen, in welchen der Glucoserest durch eine Allylgruppe ersetzt ist; es ist dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle ein Bakterium von LacZ^–,Lac⁺-Genotyp ist, die Enzyme die β-1,3-N-Acetylglucosaminyltransferase und die β-1,4-Galactosyltransferase sind, das Substrat Glucose ist, der Induktor Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) ist und die Vorstufe Allyl-β-D-galactopyranosid ist.
Gemäß einer fünften bevorzugten Ausführungsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt für die Herstellung von Allyl-β-D-lactosamin (β-D-Gal-[1→4]-β-D-GlcNac-1→O-allyl); es ist dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle ein Bakterium von LacZ^–,LacY⁺-Genotyp ist, das Enzym die β-1,4-Galactosyltransferase ist, das Substrat Glycerol ist, die Vorstufe Allyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid (β-D-GlcNac-[1→O-allyl)) ist.
Die Erfindung betrifft gleichfalls ein Verfahren, welches erlaubt, die Herstellung einer großen Anzahl von unterschiedlichen Oligosacchariden, welche durch Glycosylierung von Lactose erhalten werden, ins Auge zu fassen. Tatsächlich sind unlängst außer den Genen lgtA und lgtB, die die β-1,3-N-Acetylglucosaminyltransferase bzw. die β-1,4-Galactosyltransferase kodieren, mehrere Gene von bakteriellen Glycosyltransferasen, welche Lactose als Vorstufe verwenden, kloniert worden. Es handelt sich um lgtC (β-1,4-Galactosyltransferase) und um Lst (α-2,3-Sialyltransferase) (Gilbert et al., 1997). Die Verwendung dieser Gene in einem erfindungsgemäßen Verfahren erlaubt, Moleküle, wie Globotriose (P^k-Blut-Antigen) und Sialyllactose, herzustellen. Außerdem erlaubt die Coexpression der Gene LgtA und LgtB mit dem Gen der α-1,3-Fucosyltransferase von Helicobacter pylori (Martin et al., 1997) gemäß einem erfindungsgemäßen Verfahren die Herstellung des Lewis^x-Pentasaccharids. Das Hinzufügen des Gens Lst (α-2,3-Sialyltransferase) ermöglicht den Zugang zu Sialyl-Lewis^x-hexasaccharid.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt gleichfalls, eine große Anzahl von unterschiedlichen Oligosacchariden zu erhalten, die durch Glycosylierung von anderen exogenen Vorstufen als Lactose erhalten und durch die Lactosepermease oder durch andere Permeasen transportiert werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt gleichfalls, eine große Anzahl von unterschiedlichen Oligosacchariden, die durch Modifizierung (Sulfatierung, Acetylierung, Phosphorylierung, Succinylierung, Methylierung, Hinzufügung einer Enolpyruvat-Gruppe) von Vorstufen in vivo erhalten werden, herzustellen. Die Synthese von bestimmten Oligosacchariden kann außer der Modifizierung von exogenen Vorstufen die Modifizierung von endogenen Vorstufen erfordern. So ist es vorstellbar, in ein Escherichia coli-K12-Bakterium das Gen eines Enzyms, das an dem Stoffwechsel einer endogenen Vorstufe beteiligt ist, einzuführen, um die Produktion von bestimmten Nukleotid-Zucker-Verbindungen, wie beispielsweise CMP-Sialinsäure, UDP-GalNAc oder GDP-Fucose, die durch diesen Bakterienstamm normalerweise nicht produziert werden, zu erlauben, um die Synthese eines Oligosaccharids von Interesse zu realisieren. Beispielsweise kann UDP-GalNAc ausgehend von UDP-GlcNAc hergestellt werden, wenn das Gen der Epimerase in eine Zelle gemäß der Erfindung eingeführt wird.
Im Gegensatz zu der enzymatischen Methode der in vitro-Synthese von Oligosacchariden, welche die Verwendung von sehr kostspieligen Molekülen, wie ATP, Acetyl-CoA, PAPS (Adenosin-3'-phosphat-5'-phosphosulfat) oder Phosphoenolpyruvat erfordert, besteht einer der Vorteile der Erfindung in der Tatsache, dass diese Moleküle von Natur aus in der Zelle rezykliert werden, was so ermöglicht, die Produktionskosten der Oligosaccharide zu senken.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung betrifft ein vorstehend beschriebenes Verfahren für die Herstellung von 3-Sialyllactose (α-NeuAc-[2→3]-β-D-Gal-[1→4]-β-D-Glc) oder 6-Sialyllactose (α-NeuAc-[2→6]-β-D-Gal-[1→4]-β-D-Glc), welches dadurch gekennzeichnet ist, dass:

– die Zelle ein Bakterium von LacZ^–,LacY⁺-,NanA^–,NanT⁺-Genotyp ist;
– die Enzyme die CMP-NeuAc-Synthase und die α-2,3-Sialyltransferase oder die α-2,6-Sialyltransferase sind;
– das Substrat Glycerol ist;
– der Induktor Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) ist;
– die Vorstufen Lactose und Sialinsäure sind.

Gemäß einer sechsten bevorzugten Ausführungsweise, die die zweite vorstehend beschriebene Weise komplettiert, wird das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt für die Herstellung eines sialylierten Derivats von Lacto-N-neo-tetraose und von Polylactosamin (beispielsweise Lacto-N-neo-hexaose, Lacto-N-neo-octaose, Lacto-N-neo-decaose), welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es außerdem ein solches Enzym, ausgewählt unter der α-2,3-Sialyltransferase, der α-2,6-Sialyltransferase, umfasst und dass die Zelle außerdem einen NanA^–,NanT⁺-Genotyp aufweist und das Gen der CMP-NeuAc-Synthase exprimiert, die Akzeptoren Lactose und Sialinsäure sind.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung betrifft ein vorstehend beschriebenes Verfahren für die Herstellung von Lacto-N-neotetraose, β-D-Gal-[1→4]-β-D-GlcNac[1→3]-β-D-Gal[1→4]-(α-L-Fuc-[1→3])-β-D-Glc, β-D-Gal-[1→4]-(α-L-Fuc-[1→3])-β-D-GlcNac-[1→3]-β-D-Gal-[1→4]-(α-L-Fuc-[1→3])-β-D-Glc, β-D-Gal-[1→4]-(α-L-Fuc-[1→3])-β-D-GlcNac-[1→3]-β-D-Gal-[1→4]-β, D-GlcNAc-[1→3]-β-D-Gal-[1→4]-(α-L-Fuc-[1→3]-β-D-Glc,
welches dadurch gekennzeichnet ist, dass

– die Zelle ein Bakterium von LacZ^–,LacY⁺,WcaJ^–-Genotyp ist und RcsA überexprimiert;
– die Enzyme die β-1,3-N-Acetylglucosaminyltransferase, die β-1,4-Galactosyltransferase, die α-1,3-Fucosyltransferase sind;
– das Substrat Glucose ist;
– der Induktor Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) ist;
– die Vorstufe Lactose ist.

Gemäß einer siebten bevorzugten Ausführungsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt für die Herstellung von 3-Fucosyllactose (β-D-Gal-[1→4]-(α-L-Fuc-[1→3])-D-Glc) oder von 2-Fucosyllactose (β-D-Gal-[1→2]-(α-L-Fuc-[1→3]-D-Glc), welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es ein solches Enzym, ausgewählt unter der α-1,3-Fucosyltransferase oder der α-1,2-Fucosyltransferase, umfasst und dass die Zelle einen wcaj^–lacZ^–-Genotyp aufweist und das Gen rcsA überexprimiert und dass die Vorstufe Lactose ist.
Gemäß einer achten bevorzugten Ausführungsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt für die Herstellung eines fucosylierten Derivats von Lacto-N-neo-tetraose und von Polylactosamin (Lacto-N-neo-hexaose, Lacto-N-neo-octaose, Lacto-N-neo-decaose), welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es außerdem ein solches Enzym, ausgewählt unter der α-1,2-Fucosyltransferase, der α-1,3-Fucosyltransferase, umfasst und dass die Zelle außerdem einen WcaJ^–-Genotyp aufweist und das Gen RcsA überexprimiert, wobei der Akzeptor die Lactose ist.
Gemäß einer neunten bevorzugten Ausführungsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt für die Herstellung eines sialylierten und fucosylierten Derivats von Lacto-N-neo-tetraose, Lacto-N-neo-decaose), welches dadurch gekennzeichnet ist, dass es außerdem ein solches Enzym, ausgewählt unter der α-2,3-Sialyltransferase, der α-2,6-Sialyltransferase, und außerdem ein solches Enzym, ausgewählt unter der α-1,2-Fucosyltransferase, der α-1,3-Fucosyltransferase, umfasst und dass die Zelle außerdem einen NanA^–,NanT⁺,WcaJ^–-Genotyp aufweist und das Gen RcsA und das Gen der CMP-NeuAc-Synthase überexprimiert, die Akzeptoren Lactose und Sialinsäure sind.
Die Verfahren der Weisen 1 bis 9, die zuvor aufgeführt worden sind, können für die Herstellung von Analoga von Oligosacchariden, in welchen der Glucoserest durch eine Allylgruppe ersetzt ist, eingesetzt werden, wobei die Vorstufe Allyl-β-D-galactosid und nicht mehr Lactose ist.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung besteht darin, ein Verfahren bereitzustellen, um Oligosaccharide, die mit Radioisotopen markiert oder angereichert sind, herzustellen; solche Oligosaccharide sind extrem wertvoll für grundlegende Untersuchungen im Bereich der Biologie oder der Konformationsanalyse. Die Erfindung betrifft folglich ein Verfahren zur Herstellung eines Oligosaccharids, welches durch wenigstens ein Radioisotop markiert ist, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass die Zelle auf dem kohlenstoffhaltigen Substrat, welches durch das Radioisotop markiert ist, und/oder in Gegenwart einer durch das Radioisotop markierten Vorstufe kultiviert wird. Die Radioisotope werden vorzugsweise ausgewählt in der Gruppe bestehend aus: ¹⁴C, ¹³C, ³H, ³⁵S, ³²P, ³³P.
Der industrielle Nutzen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist evident, denn es erlaubt erstmals, eine Produktion von komplexen Oligosacchariden von biologischem Interesse in der Größenordnung von Kilogramm zu erreichen. Alle Oligosaccharide von biologischem Interesse, deren Synthese in industriellem Maßstab wir ins Auge fassen, sind gegenwärtig lediglich im mg-Maßstab und zu extrem hohen Preisen (bis zu 1 Million Franc pro Gramm) verfügbar; der Selbstkostenpreis dieser Verbindungen, die durch den vorliegenden mikrobiologischen Weg hergestellt werden, ist exorbitant niedriger.
Merkmale und Vorteile der Erfindung werden besser aufgezeigt beim Lesen der folgenden Beispiele und Figuren, deren Legenden nachfolgend aufgeführt werden.
FIGUREN:
1: Prinzip des Verfahrens zur Herstellung des Trisaccharids 4-O-[3-O-(2-Acetamido-2-desoxy-β-D-glucopyranosyl)-β-D-galactopyranosyl]-D-glucopyranose, (β-D-GlcNac-[1→3]-β-D-Gal-[1→4]-D-Glc)
Die Lactose (β-D-Gal-[1-4]-β-D-Glc) wird durch die Lactosepermease (Lac-Permease) in die Zelle transportiert. Die Lactose kann in der Zelle nicht hydrolysiert werden, denn der Stamm ist eine LacZ^–-Mutante. Die Expression des Gens lgtA erlaubt die Produktion des Enzyms LgtA, welches ein GlcNAc von UDP-GlcNAc auf ein Lactose-Molekül transferiert. Das gebildete Trisaccharid (β-D-GlcNAc-[1→3]-β-D-Gal-[1→4]-D-Glc) wird in das Medium sekretiert.
2: Kultivierung des Vergleichsstamms JM109 und des Stamms JM109 (pCWlgtA), welcher das Gen der Glycosyltransferase LgtA aufweist, bei hoher Zelldichte.
Die Lactose wird kontinuierlich zugesetzt und die restliche Lactose wird enzymatisch bestimmt. Die Konzentration von hydrolysierbarem GlcNAc im Kulturmedium wird kolorimetrisch nach saurer Hydrolyse gemessen. Die zugesetzte Lactose repräsentiert die gesamte kumulierte Menge von Lactose, die kontinuierlich zugesetzt worden ist.
3: Massenspektrum im FAB⁺-Modus des Trisaccharids 4-O-[3-O-(2-Acetamido-2-desoxy-β-D-glucopyranosyl)-β-D-galactopyranosyl]-D-glucopyranose, (β-D-GlcNac-[1→3]-β-D-Gal-[1→4]-D-Glc), welches aus dem Kulturüberstand des Stamms JM109 (lgtA) gereinigt worden ist.
Man beobachtet die beiden Quasi-Molekülionen [M + H]⁺ und [M + Na]⁺ bei m/z 546 und 568. Man beobachtet gleichfalls ein Ion [M + H]⁺ bei m/z 442, welches auf das Vorhandensein von β-D-GlcNAc-[1-3]-IPTG zurückzuführen ist. Dies zeigt an, dass IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactose), welches eingesetzt wird, um die Lac-Permease und LgtA zu induzieren, gleichfalls glycosyliert ist.
4: Protonen-NMR-Spektrum des Trisaccharids 4-O-[3-O-(2-Acetamido-2-desoxy-β-D-glucopyranosyl)-β-D-galactopyranosyl]-D-glucopyranose, (β-D-GlcNac-[1→3]-β-D-Gal-[1→4]-D-Glc), bei 323°K.
Das Signal bei 1,4 ppm ist auf die Protonen der Isopropylgruppe des glycosylierten Derivats von IPTG zurückzuführen.
5: ¹³C-NMR-Spektrum des Trisaccharids 4-O-[3-O-(2-Acetamido-2-desoxy-β-D-glucopyranosyl)-β-D-galactopyranosyl]-D-glucopyranose, (β-D-GlcNac-[1→3]-β-D-Gal-[1→4]-D-Glc).
6: Prinzip des Verfahrens zur Herstellung von Lacto-N-neo-tetraose (β-D-Gal-[1→4]-β-D-GlcNAc[1→3]-β-D-Gal-[1→4]-β-D-Glc).
Die Lactose (β-D-Gal-[1-4]-β-D-Glc) wird durch die Lac-Permease in die Zelle transportiert. Die Lactose kann in der Zelle nicht hydrolysiert werden, denn der Stamm ist eine LacZ^–-Mutante. Die Expression des Gens lgtA erlaubt die Produktion des Enzyms LgtA, welches ein GlcNAc von UDP-GlcNAc auf ein Lactose-Molekül transferiert. Das gebildete Trisaccha rid wird dann als Vorstufe verwendet durch LgtB, welches ein Galactose-Molekül von UDP-Gal unter Bildung von Lacto-N-neo-tetraose (β-D-Gal-[1-4]-β-D-GlcNAc-[1-3]-β-D-Gal-[1-4]-β-D-Glc) transferiert.
7: Kultivierung des Stamms JM109 (pCWlgtA, pBBlgtB) bei hoher Zelldichte.
Kultivierung in Gegenwart von Lactose in hoher (5 g·l^–1) und niedriger Konzentration (1 g·l^–1).
8: Auftrennung der durch den Stamm JM109 (pCWlgtA, pBBlgtB) in Gegenwart von Lactose in einer Anfangskonzentration von 5 g·l^–1 (A) oder 1 g·l^–1 (B) produzierten Oligosaccharide an Biogel P4
Die Peaks 1, 2, 3, 4 entsprechen Lacto-N-neo-tetraose, Lacto-N-neo-hexaose, Lacto-N-neo-octaose bzw. Lacto-N-neo-decaose.
9: Prinzip des Verfahrens zur Herstellung von Sialyllactose
Die Lactose und die Sialinsäure (NeuAc) werden durch die Lactosepermease (lacY) und die Sialinsäure-Permease (nanT) in die Zelle internalisiert. Diese beiden Verbindungen werden in der Zelle nicht abgebaut, denn der Stamm ist eine lacZ^–- und nanA^–-Mutante. Die Expression der CMP-NeuA-Synthase und der α-2,3-Sialyltransferase erlaubt die Aktivierung der internalisierten Sialinsäure zu CMP-NeuAc und dessen Transfer auf intrazelluläre Lactose.
BEISPIELE
Beispiel 1: Materialien und Methoden
1.1. Herkunft der Plasmide und Bakterienstämme
Die Stämme JM107 und JM109 von Escherichia coli K12 (Yannisch-Perron et al., 1984) wurden als Wirtszellen für alle beschriebenen Beispiele der Herstellung von Oligosacchariden eingesetzt. Die Stämme wurden von der DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen) erhalten. Der Genotyp des Stamms JM109 ist der Folgende: F^– traD36lacI^q Δ(lacZ)M15 proA⁺B⁺/e14^–(McrA^–) Δ(lac-proAB) supE44 recA1 endA1 gyrA96 (Nal^–) thi hsdR17 relA1. Der Genotyp des Stamms JM107 ist identisch mit jenem des Stamms JM109 mit Ausnahme dessen, dass das Gen recA1 nicht inaktiviert ist.
Die Gene lgtA und lgtB von Neisseria meningitis MC58 wurden von Dr. W. Wakarchuk (Institute for Biological Sciences, National Research council of Canada, 100 Sussex Drive, Ottawa, Ontario, K1A OR6, Kanada) in Form von zwei pCW-Plasmiden bereitgestellt, wobei das eine das Gen ltgA enthält (hier bezeichnet als pCWlgtA) und das andere das Gen lgtB enthält (hier bezeichnet als pCWlgtB). Die Sequenzen von diesen beiden Genen sind in der Datenbank GenBank unter der Nr. U25839 verfügbar. Das Plasmid pLitmus28 wurde von der Firma New Englands Biolabs erworben. Das Plasmid pBBR1MCS wurde von Dr. M. Kovach (Department of Microbiology and Immunology, Louisiana State University, Shreveport, LA 71130–3932, USA) bereitgestellt.
Die Gene der CMP-Sialinsäure-Synthase und der α-2,3-Sialyltransferase von Neisseria meningitis MC58 wurden von Dr. M. Gilbert (Institute for Biological Sciences, National Research council of Canada, 100 Sussex Drive, Ottawa, Ontario, K1A OR6, Kanada) in Form von zwei Plasmid NSY-01 und NST-01 bereitgestellt. Das Plasmid NSY-01 ist ein Derivat des Plasmids pT7-7, welches das Gen (GenBank U60146) der CMP-Sialinsäure-Synthase (Gilbert et al., 1997) enthält. Das Plasmid NST-01 ist ein Derivat des Plasmids pBluescript Sk-, welches das Gen (GenBank Nr. U60660) der α-2,3-Sialyltransferase (Gilbert et al., 1996) enthält.
Das Gen fucT der α-1,3-Fucosyltransferase von Helicobacter pylori wurde von Dr. S. Martin (Glaxo Wellcome Research and Development, Gunnels Wood Road, Stevenage, Hertfordshire, SG1 2NY, Vereinigtes Königreich) in Form eines Plasmids pHP0651, welches von pET-21a abgeleitet ist, bereitgestellt. Die Sequenz ist bei der GenBank verfügbar (AE000578, Gen HP0651).
1.2. Subklonierungen
Wir haben die Standardtechniken der Molekularbiologie, die von Sambrook et al. (1989) beschrieben worden sind, eingesetzt.
Konstruktion des Plasmids pBBlgtB: Das DNA-Fragment von 0,835 kb, welches das lgtB-Gen enthält, wurde durch Verdau des Plasmids pCWlgtB durch BamHI und HindIII erhalten. Dieses Fragment wurde in den Vektor pLitmus28, der zuvor durch BamHI und HindIII verdaut worden ist, subkloniert, wodurch das Plasmid pLitlgtB gebildet wurde. Das Fragment von 0,9 kb, welches das lgtB-Gen enthält, wurde aus dem Plasmid pLitlgtB durch einen Verdau mit XhoI und HindIII herausgeschnitten und in das zuvor durch XhoI und HindIII verdaute Plasmid pBBR1MCS subkloniert, wodurch das Plasmid pBBlgtB gebildet wurde.
Konstruktion des Plasmids pBBnsy: Das Fragment, welches das Gen der CMP-Sialinsäure-Synthase enthält, wurde aus dem Plasmid NSY-01 durch einen Verdau mit XbaI herausgeschnitten und in das zuvor durch XbaI verdaute Plasmid pBBR1MCS subkloniert, wodurch das Plasmid pBBnsy gebildet wurde.
Konstruktion des Plasmids pBBLnt. Das in dem Konstrukt pCWlgtA (Gilbert et al.) vorhandene lgtA-Gen wurde durch PCR zugleich wie der Promotor UV5tactac des Plasmids mit Hilfe der Primer CTTTAAGCTTCCGGCTCGTATAA (Sinn, strangaufwärts von dem Promotor) und GACAGCTTATCATCGATAAGCTT (Antisinn, Ende lgtA), welche beide eine HindIII-Stelle enthalten, amplifiziert. Das amplifizierte Fragment von 1,3 kb wurde dann in die HindIII-Stelle des Vektors pBBlgtB subkloniert.
Konstruktion des Plasmids pBBLntRcsA: Das rcsA-Gen (Stout et al., 1991) wurde zuallererst durch PCR ausgehend von genomischer DNA von JM109 mit den Primern AGGGTACCCATGTTGTTCCGTTTAG (KpnI-Stelle, linke Seite von rcsA) und AATCTAGAGTAATCTTATTCAGCCTG (XbaI-Stelle, rechte Seite von rcsA) amplifiziert, dann in die KpnI-XbaI-Stellen des Vektors pBBR1-MCS kloniert. Der Vektor pBBR1-MCSrcsA wurde dann strangaufwärts von dem Gen durch Verdau mit KpnI geöffnet, mit stumpfen Enden versehen (Kit Amersham), durch XbaI vollständig herausgeschnitten und in die SmaI-XbaI-Stellen des Konstrukts pBBLnt inseriert, was eine strangabwärts erfolgende Klonierung der Gesamtheit lgtB-UV5tactac-lgtA, welche rcsA unter die Kontrolle des UV5tactac-Promotors stellt, erlaubt.
1.3. Kulturbedingungen
Die Routinekultivierungen und die Herstellung der Inokula wurden auf LB-Medium (Sambrook et al., 1989) ausgeführt. Die Kulturen mit hoher Zelldichte wurden in einem 2 l-Fermenter realisiert, welcher ein Anfangsvolumen von 1 l Medium mit der folgenden Zusammensetzung enthielt: Glycerol (17,5 g/l) oder Glucose (15 g/l), NH₄H₂PO₄ (7 g/l), KH₂PO₄ (7 g/l), MgSO₄·7H₂O (1 g/l), Thiamin·HCl (4,5 mg/l), Spurenelemente-Lösung (7,5 ml/l), Citronensäure (0,5 g/l), KOH (2 g/l). Das MgSO₄ wird getrennt autoklaviert und das Thiamin wird durch Filtration sterilisiert. Die Spurenelemente-Lösung enthält: Nitrilotriacetat (70 mM, pH 6,5), Eisen(III)-nitrat (7,5 g/l), MnCl₂·4H₂O (1,3 g/l), CoCl₂·6H₂O (0,21 g/l), CuCl₂·2H₂O (0,13 g/l); H₃BO₃ (0,25 g/l), ZnSO₄·7H₂O (1,2 g/l), Na₂MoO₄·2H₂O (0,15 g/l). Die Antibiotika, Ampicillin (50 mg/l) und Chloramphenicol (25 mg/l), werden zugesetzt, um das Vorhandensein der verschiedenen Plasmide sicherzustellen. Die Zuspeisungslösung enthält Glycerol (500 g/l) oder Glucose (400 g/l), MgSO₄·7H₂O (12 g/l) und Spurenelemente-Lösung (25 ml/l).
Die Kulturen mit hoher Zelldichte werden mit 2% angeimpft. Während der gesamten Kultivierung wird der Gehalt an gelöstem Sauerstoff bei 20% Sättigung gehalten, indem die Luftzufuhr manuell geregelt und indem die Bewegungsgeschwindigkeit automatisch angepasst wurde. Der pH wird durch Zugabe von wässriger Ammoniaklösung (15% (Gew./Vol.)) automatisch auf 6,8 eingestellt. Die Temperatur wird für den Stamm JM109 (pCWlgtA) bei 34°C und für den Stamm JM109 (pCWlgtA, pBBlgtB) bei 28°C gehalten. Die Strategie der Kultivierung mit hoher Dichte umfasst im Allgemeinen 3 Phasen: eine erste Phase exponentieller Vermehrung, die durch das kohlenstoffhaltige Substrat (Glycerol oder Glucose), welches zu Beginn in dem Medium vorhanden ist, sichergestellt wird; eine zweite Phase, die beginnt, wenn die Vermehrung durch die Kohlenstoffquelle, die dann kontinuierlich in einer Menge von 4,5 g·h^–1·l^–1 Glycerol oder 3,6 g·h^–1·l^–1 Glucose zugesetzt wird, begrenzt wird. In einer dritten Phase wird diese Menge um 60% verringert, um die Vermehrung derart zu verlangsamen, dass der Gehalt an Oligosacchariden erhöht wird.
1.4. Quantitative Bestimmung der Oligosaccharide
Die Proben (1 ml) werden während der Kultur entnommen und unverzüglich in Mikroröhrchen zentrifugiert. Der Überstand wird für die quantative Bestimmung der extrazellulären Oligosaccharide aufbewahrt. Der bakterielle Bodensatz wird in 1 ml Wasser resuspendiert, dann in einem Wasserbad bei 100°C 30 min inkubiert, um die Zellen platzen zu lassen. Nach einer zweiten Zentrifugation wird der Überstand für die quantitative Bestimmung der intrazellulären Oligosaccharide aufbewahrt.
Die Lactose-Konzentration wird gemessen, indem ein enzymatischer Bestimmungskit (Roche diagnostic) eingesetzt wird. Die in den Oligosacchariden vorhandenen N-Acetylglucosamin-Reste werden durch saure Hydrolyse freigesetzt, wie zuvor beschrieben (Samain et al., 1997) und dann kolorimetrisch durch die Methode von Reissig et al. (1955) quantifiziert; im Rahmen der Beschreibung versteht man unter hydrolysierbarem GlcNAc die auf diese Weise quantitativ bestimmte GlcNAc-Menge.
Die quantitative Bestimmung der Lactose mit und ohne Behandlung durch eine Neuraminidase erlaubt es, die Konzentration an Sialyl-Lactose abzuschätzen.
Die gesamte Fucose wird kolorimetrisch durch die Cysteinhydrochlorid-Methode von Dische und Shettles (1948) gemessen.
1.5. Reinigung der Oligosaccharide
Am Ende der Kultivierung werden die Bakterienzellen durch Zentrifugation gesammelt. Der Überstand wird für die Reinigung der extrazellulären Oligosaccharide aufbewahrt. Die Bakterienzellen werden in 1 l Wasser resuspendiert, dann werden sie durch eine Wärmebehandlung (30 min bei 100°C) permeabilisiert, um die intrazellulären Oligosaccharide freizusetzen. Nach einer zweiten Zentrifugation werden diese Oligosaccharide im Überstand gewonnen.
Der erste und der zweite Überstand, welcher die extra- bzw. intrazellulären Oligosaccharide enthält, wird an Aktivkohle (100 g pro Liter Überstand) adsorbiert. Nach Spülen mit destillier tem Wasser werden die Oligosaccharide mit 50%-igem (Vol./Vol.) Ethanol eluiert, durch Eindampfen aufkonzentriert und lyophilisiert.
Die Oligosaccharide werden durch sterische Ausschlusschromatographie an einer Säule (4,5 cm × 95 cm) von Biogel P4, welche das Einspritzen von ungefähr 300 mg Oligosaccharid-Mischung erlaubt, aufgetrennt. Die Elution erfolgt mit destilliertem Wasser mit einer Fördermenge von 40 ml·h^–1.
Die nicht-fucosylierten Oligosaccharide werden durch sterische Ausschlusschromatographie an einer Säule (4,5 cm × 95 cm) von Biogel P4, welche das Einspritzen von ungefähr 300 mg Oligosaccharid-Mischung erlaubt, aufgetrennt. Die Elution erfolgt mit destilliertem Wasser mit einer Fördermenge von 40 ml·h^–1.
Die fucosylierten Oligosaccharide werden durch sterische Ausschlusschromatographie an einer Säule (1,5 cm × 200 cm) von Biogel P2, welche auf 60°C thermostatisiert ist, welche das Einspritzen von ungefähr 30 mg Oligosaccharid-Mischung erlaubt, aufgetrennt. Die Elution erfolgt mit destilliertem Wasser mit einer Fördermenge von 30 ml·h^–1.
Die Sialyllactose wird von den neutralen Oligosacchariden durch Bindung an ein Harz in Form von Dowex 1X4-400 (in HCO₃ ^–-Form) abgetrennt und mit einem NaHCO₃-Gradienten (0 bis 100 mM) eluiert. Das Bicarbonat wird dann entfernt, indem das Eluat mit einem Dowex 50X4-400-Harz in H⁺-Form behandelt wird.
1.6. Herstellung der Allyl-β-D-glucoside
Allyl-β-D-galactopyranosid und Allyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid wurden gemäß dem von Lee und Lee (1974) beschriebenen Protokoll synthetisiert.
1.7. Identifizierung und strukturelle Charakterisierung der Oligosaccharide
Die Massenspektren wurden mit einem Massenspektrometer (Nermag R-1010C) erstellt. Für jedes Experiment beträgt das Matrix-Ausgangsvolumen 4 μl. Die Produkte wurden im FAB⁺-Modus analysiert.
Die NMR-Spektren wurden mit einem Brucker AC300-Spektrometer erhalten.
1.8. Konstruktion des Stamms JM107-nanA^–
Ein JM107-Stamm, der nicht in der Lage ist, Sialinsäure zu metabolisieren, wurde durch Insertionsinaktivierung des Gens nanA (Nan-Operon), welches die NeuAc-Aldolase kodiert (Plumbridge et al., 1999), hergestellt. Es wurden zwei Amplifizierungsreaktionen durch PCR auf beiden Seiten des Zentrums des nanA-Gens derart, dass eine BamHI-Restriktionsstelle eingeführt wurde, ausgeführt.
Ein erstes BamHI-XbaI-Fragment von 1,6 kb, welches den rechten Abschnitt von nanA umfasst, wurde ausgehend von genomischer DNA von JM109 amplifiziert, indem die Primer AAAGGATCCAAGATCAGGATGTTCACG und GCTCTAGAATGGTAATGATGAGGCAC eingesetzt wurden, und zwischen die BamHI- und XbaI-Stellen des Vektors pUC19 kloniert, wodurch der Vektor pUC-nan1,6 gebildet wurde. Ein zweites KpnI-BamHI-Fragment von 2,1 kb, welches den linken Abschnitt von nanA umfasst, wurde unter Verwendung der Primer AAAGGATCCGCGTAGGTGCGCTGAAAC und AAAGGTACCTCAGGCCACCGTTAGCAG amplifiziert und zwischen die KpnI- und BamHI-Stellen des Vektors pUC-nan1,6 kloniert, wodurch der Vektor pUC-nan-3,7 gebildet wurde. Das Kanamycinresistenzgen (pUC-4K, Kassette von Pharmacia) wurde dann in die BamHI-Stelle von pUC-nan-3,7 kloniert. Das 4,9 kb-SacI-XbaI-Fragment, welches nanA::kan enthält, wurde in die gleichen Stellen des Suizid-Vektors pCVD442 (Donnenberg und Kaper, 1991) inseriert. Dieses Plasmid wurde eingesetzt, um durch homologe Rekombination JM107-nanA::kan-Mutanten zu erhalten, die aufgrund ihrer Resistenz gegen Kanamycin und ihres Unvermögens, Sialinsäure zu metabolisieren (Stamm JM107-nanA^–), selektiert wurden.
1.9 Konstruktion des Stamms JM107col^–DE3
Die Suppression der Fähigkeit, Colansäure zu synthetisieren, wurde durch Insertionsinaktivierung des Gens wcaJ, welches eine Glucosyltransferase kodiert (Stevenson et al., 1996), realisiert. Ein DNA-Fragment von 1,8 kb, welches das Gen wcaJ und angrenzende DNA enthält, wurden durch PCR ausgehend von genomischer DNA von JM109 amplifiziert und in einen Vektor pTOPO2.1 inseriert (PCR-Klonierungskit von Invitrogen) mit Hilfe der Primer CCACGATCCACGTCTCTCC (rechter Abschnitt von wcaJ) und AAGCTCATATCAATATGCCGCT (linker Abschnitt von wcaJ). Es wurde dann in einen pUC19-Vektor auf der Höhe der EcoRI-Stelle transferiert. Der so erhaltene Vektor wurde einer Behandlung durch eine EcoRI-Methylase, welche die nachfolgende Hinzufügung des Kanamycinresistenzgens an der im Zentrum von wcaJ vorhandenen ApoI-Stelle erlaubt, unterzogen. Die rekombinante DNA wcaJ::kan wurde schließlich in den Suizid-Vektor pCVD442 transferiert, welcher durch homologe Rekombination die Gewinnung von genomischen JM107-Mutanten, welche das inaktivierte Gen enthalten, welche durch PCR mit Hilfe der Primer, die zur Klonierung gedient haben, selektiert werden (Stamm JM107-col^–), erlaubt.
Der Stamm JM107-col^– wurde für den Phagen λDE3 lysogen gemacht, indem der Lysogenisierungskit von Novagen verwendet wurde.
Beispiel 2: Herstellung des Trisaccharids 4-O-[3-O-(2-Acetamido-2-desoxy-β-D-glucopyranosyl)-β-D-galactopyranosyl]-D-glucopyranose, (β-D-GlcNac-[1→3]-β-D-Gal-[1→4]-D-Glc).
Das Prinzip wird durch die 1 veranschaulicht. Wir haben den Stamm JM109 von Escherichia coli K12, in welchen wir das Plasmid pCWlgtA Gen lgtA eingeführt haben, eingesetzt. Der Stamm JM109 ist lacZ^–, d.h. dass er nicht in der Lage ist, Lactose zu hydrolysieren. Im Gegensatz dazu ist er lacY⁺, was bedeutet, dass er die Lactosepermease synthetisieren kann. Das Gen lgtA kodiert eine β-1,3-N-Acetylglucosaminyltransferase (LgtA), welche eine N-Acetylglucosamin-Einheit auf die Galactose von Lactose transferiert.
Der Stamm JM109 (pCWlgtA) wie auch der Vergleichsstamm JM109 wurden bei hoher Zelldichte (Samain et al., 1997) auf Glycerol als Kohlenstoff- und Energiequelle kultiviert. Nach einer ersten Phase exponentieller Vermehrung, welche durch das anfänglich in dem Medium vorhandene Glycerol (17,5 g/l) sichergestellt wird, wird die Vermehrung durch das Glycerol, welches dann kontinuierlich in einer Menge von 4,5 g·h^–1·l^–1 hinzugefügt wird, begrenzt. Während dieser zweiten Kultivierungsphase speist man kontinuierlich 90 mg·h^–1·l^–1 Lactose ein. Man injiziert gleichfalls zu Beginn dieser Phase IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactosid) (0,5 mM), um die Expression der Lactosepermease und der β-1,3-N-Acetylglucosaminyltransferase zu induzieren. Wie in der 2 beschrieben, häuft sich die zugesetzte Lactose in dem Medium praktisch nicht an, was anzeigt, dass die Lactose durch die Bakterienzellen gut internalisiert wird. Man beobachtet bei dem Stamm JM109 (pCWlgtA) eine bedeutende Anhäufung einer N-Acetylglucosamin (hydrolysierbares GlcNAc) enthaltenden Verbindung in dem Kulturmedium. Die produzierte Menge von hydrolysierbarem GlcNAc (3,8 mmol/l) entspricht nahezu stöchiometrisch der verbrauchten Lactosemenge (3,5 mmol/l), was nahe legt, dass die Gesamtheit der internalisierten Lactose durch LgtA glycosyliert worden ist.
Am Ende der Kultur werden die Zellen durch Zentrifugation entfernt und die in dem Überstand vorhandenen Oligosaccharide werden durch Adsorption an Aktivkohle und Elution mit Ethanol gereinigt. Die vorhandenen Oligosaccharide werden dann nach ihrem Molekulargewicht an einer Biogel P4-Säule aufgetrennt. Es wird eine einzige Hauptverbindung gefunden. Die Massen- und NMR-Spektrometrie-Daten zeigen, dass diese Verbindung wohl das Trisaccharid (β-D-GlcNac-[1→3]-β-D-Gal-[1→4]-β-D-Glc), welches durch Addition eines GlcNAc-Rests an ein Lactose-Molekül gebildet wird, ist. Das Massenspektrum im FAB⁺-Modus zeigt tatsächlich das Vorhandensein eines Quasi-Molekülions [M + H]⁺ bei m/z 546 (3). Das ¹H-NMR-Spektrum bestätigt die Trisaccharid-Struktur, das Vorhandensein einer Acetylgruppe und die β-Konfiguration der beiden O-glycosidischen Bindungen (4). Das ¹³C-NMR-Spektrum präzisiert gleichfalls, dass die Bindung zwischen dem GlcNAc und der Galactose sehr wohl vom 1,3-Typ ist (5).
Beispiel 3: Herstellung von Lacto-N-neo-tetraose und von Polylactosamin
Das Prinzip wird in der 6 beschrieben. Der E. coli-Stamm JM109 wurde mit den beiden Plasmiden pCWlgtA und pBBlgtB, welche die Gene lgtA (zuvor eingesetzt) bzw. lgtB (welches eine β-1,4-Galactosyltransferase, welche als LgtB bezeichnet wird, kodiert) tragen, cotransformiert. Der Stamm JM109 (pCWlgtA, pBBlgtb) wurde bei hoher Zelldichte unter Verwendung von Glucose als Vermehrungssubstrat kultiviert. Zu Beginn der zweiten Phase setzt man Lactose in hoher (5 g·l^–1) oder niedriger Konzentration (1 g·l^–1) und IPTG in einer Konzentration von 0,1 mM zu. Im Gegensatz dazu, was bei dem Stamm JM109 (pCWlgtA) beobachtet worden war, detektiert man während der Kultivierung dieses Stamms lediglich eine geringfügige Freisetzung von hydrolysierbarem GlcNAc in das Medium. Im Gegenzug findet man hydrolysierbares GlcNAc in bedeutender Menge im Bakterium (7). Wenn die Zufuhr von Lactose 1 g·l^–1 beträgt, beobachtet man eine vollständige Internalisierung der Lactose (2,9 mmol·l^–1) und eine Gesamtproduktion von gebundenem GlcNAc von 1,45 g/l^–1 (6,5 mmol·l^–1), was einem Einbau von mehr als zwei GlcNAc-Molekülen pro Lactose-Akzeptormolekül entspricht. Wenn die Lactose in hoher Konzentration zugesetzt wird, ist die Internalisierung unvollständig (3 g·l^–1, was 8,7 mmol·l^–1 entspricht) mit einer Produktion von GlcNAc gleichfalls von ungefähr 6,5 mmol·l^–1. In diesem Falle ist das Molverhältnis GlcNAc/Lactose nahe 1, was mit der Synthese von Lacto-N-neo-tetraose übereinstimmt.
Die Reinigung der intrazellulären Oligosaccharid-Fraktion hat erlaubt, mehrere Hauptverbindungen, die durch Chromatographie an Biogel P4 gut aufgetrennt werden, zu erhalten. Die Massen- und NMR-Spektrometrie-Daten zeigen, dass diese Verbindungen den folgenden Strukturen entsprechen: Lacto-N-neo-tetraose [M + H]⁺ = 708; Lacto-N-neo-hexaose [M + H]⁺ = 708; Lacto-N-neo-octaose, [M + Na]⁺ = 1460 und wahrscheinlich Lacto-N-neo-decaose. Die jeweiligen Anteile dieser unterschiedlichen Verbindungen hängen von der zugesetzten Lactosemenge ab. So ist bei 5 g·l^–1 Lactose das Hauptprodukt die Lacto-N-neo-tetraose (8A). Im Gegensatz dazu begünstigt eine geringere Lactose-Zufuhr (1 g·l^–1) die Bildung von Verbindungen von höherem Polymerisationsgrad, wobei Lacto-N-neo-octaose zum Hauptprodukt wird (8B).
Die Bildung von höheren homologen Polylactosaminen der Lacto-N-neo-tetraose erklärt sich durch die Tatsache, dass LgtA in der Lage ist, Lacto-N-neo-tetraose zu verwenden, um ein intermediäres Pentasaccharid zu bilden, welches durch LgtB glycosyliert wird, wodurch Lacto-N-neo-hexaose erhalten wird. Diese Letztere ist ihrerseits eine Vorstufe für einen neuen Glycosylierungszyklus, der zu der Bildung von Lacto-N-neo-octaose führt, und so fort bis zu Lacto-N-neo-decaose.
Man beobachtet keine signifikante Bildung von Oligosacchariden mit ungerader Anzahl von Resten und welche eine Galactose an der nicht-reduzierenden terminalen Position tragen. Dies zeigt an, dass die Verlängerung der Moleküle durch den Einbau des GlcNAc durch LgtA und nicht durch die durch LgtB katalysierte Galactosylierung begrenzt wird.
Beispiel 4: Herstellung von Allyl-3-O-(2-acetamido-2-desoxy-β-D-glucopyranosyl)-β-D-galactopyranosid (β-D-GlcNAc-[1→3]-β-D-Gal-1→O-allyl)
Der Stamm JM109 (pCWlgtA) wurde mit hoher Zelldichte auf Glycerol kultiviert. Zu Beginn der zweiten Kultivierungsphase setzt man 0,75 g·l^–1 Allyl-β-D-galactopyranosid und 0,1 mM IPTG zu. Man beobachtet eine vollständige Internalisierung des Allyl-β-D-galactopyranosids am Ende von 9 h mit einem stöchiometrischen Auftreten von hydrolysierbarem GlcNAc im extrazellulären Medium. Die in dem extrazellulären Medium vorhandenen Oligosaccharide werden wie in Beispiel 2 gereinigt. Das Massenspektrum des erhaltenen Hauptprodukts im FAB⁺-Modus zeigt das Vorhandensein eines Quasi-Molekülions [M + H]⁺ bei m/z 424, was der Struktur β-D-GlcNAc-[1→3]-β-D-Gal-A→O-allyl entspricht.
Beispiel 5: Herstellung von β-D-Gal-[1→4]-β-D-GlcNAc-1→O-allyl
Der Stamm JM109 (pBBlgtB) wurde bei hoher Zelldichte auf Glycerol kultiviert. Zu Beginn der zweiten Kultivierungsphase setzt man 0,5 g·l^–1 Allyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid (β-D-GlcNAc-1→O-allyl) zu. Man beobachtet während der 5 ersten Stunden eine Verringerung der Menge von extrazellulärem hydrolysierbarem GlcNAc von ungefähr 30%, was eine partielle Internalisierung von Allyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid zeigt. Parallel dazu beobachtet man eine nahezu stöchiometrische intrazelluläre Produktion von hydrolysierbarem GlcNAc und von β-gebundenen Galactoseresten (durch β-Galactosidase hydrolysierbar). Diese Ergebnisse zeigen, dass 30% des anfänglich zugesetzten Allyl-N-acetyl-β-D-glucosaminids durch die durch das Gen lgtB kodierte Aktivität galactosyliert worden ist. Nach Reinigung wurde die Struktur der erwarteten Verbindung (β-D-Gal-[1→4]-β-D-GlcNAc-1→O-allyl) durch Massen- und NMR-Spektrometrie bestätigt.
Beispiel 6: Herstellung von Analoga von Lactose-N-neo-tetraose und von Polylactosaminen, in welchen der Glucose-Rest durch eine Allylgruppe ersetzt ist
Der Stamm JM109 (pCWlgtA und pBBlgtB) wurde wie in Beispiel 3 kultiviert mit der Ausnahme, dass die Zugabe von Lactose durch die Zugabe von 0,65 g·l^–1 Allyl-β-D-galactopyranosid ersetzt wurde. Nach Reinigung gemäß dem Protokoll von Beispiel 3 erhält man 3 Hauptverbindungen. Die Massenspektrometrie-Daten zeigen, dass diese drei Verbindungen den folgenden Tri-, Penta- und Heptasacchariden entsprechen:
β-D-Gal-[1→4]-β-D-GlcNAc-[1→3]-β-D-Gal-1→O-allyl, [M + H] = 586;
β-D-Gal-[1→4]-β-D-GlcNAc-[1→3]-β-D-Gal-[1→4]-β-D-GlcNAc-[1→3]-β-D-Gal-1→O-allyl, [M + H] = 951;
β-D-Gal-[1→4]-β-D-GlcNAc-[1→3]-β-D-Gal-[1→4]-β-D-GlcNAc-[1→3]-β-D-Gal-[1→4]-β-D-GlcNAc-[1→3]-β-D-Gal-1→O-allyl, [M + H] = 1316.
Beispiel 7: Herstellung von 3'-Sialyllactose (α-NeuAc-[2→3]-β-D-Gal-[1→4]-β-D-Glc)
Das Prinzip wird durch die 9 veranschaulicht. Die Gene der Biosynthese der Sialinsäure und von CMP-NeuAc sind in E. coli K12 nicht vorhanden. Im Gegensatz dazu ist E. coli K12 in der Lage, Sialinsäure abzubauen (Plumbridge und Vimr, 1999) und weist eine Permease (NanT) auf, welche erlaubt, exogene Sialinsäure in die Zelle eindringen zu lassen. Diese Sialinsäure wird dann normalerweise durch eine Aldolase (NanA) katabolisiert.
Wir haben den Escherichia coli K12-Stamm JM107-nanA^– (Beispiel 1) und einen JM107-Vergleichsstamm, in welchen wir die beiden kompatiblen Plasmide NST-01 und pBBnsy, welche das Gen der α-2,3-Sialyltransferase bzw. der CMP-NeuAc-Synthase enthalten, eingeführt haben, eingesetzt. Dieser Stamm ist frei von NanA-Aktivität und ist folglich nicht in der Lage, intrazelluläre Sialinsäure abzubauen. Im Gegensatz dazu weist er die Gene der Lactosepermease (lacY) und der Sialylpermease (nanT) auf und ist folglich in der Lage, Lactose und exogene Sialinsäure zu internalisieren. Die internalisierte Sialinsäure kann so unter der Einwirkung der CMP-NeuAc-Synthase zu CMP-NeuAc aktiviert und unter der Einwirkung der α-2,3-Sialyltransferase auf intrazelluläre Lactose transferiert werden.
Der Stamm JM107-nanA^–(Nst-01, pBBnsy) und der Vergleichsstamm JM107 (Nst-01, pBBnsy), welcher NanA-Aktivität aufweist, wurden bei hoher Zelldichte auf Glycerol kultiviert. Lactose (1,5 g·l^–1), IPTG (0,1 mM) und Sialinsäure (0,6 g·l^–1) werden zu Beginn der zweiten Kultivierungsphase mit einer Dauer von 5 h zugesetzt. Während der gesamten Dauer (17 h) der dritten Kultivierungsphase speist man kontinuierlich 100 mg·h^–1·l^–1 Sialinsäure und 200 mg·h^–1·l^–1 Lactose ein.
Am Ende der Kultivierung des Stamms JM107-nanA^–(Nst-01, pBBnsy) erlaubt die enzymatische Bestimmung der Lactose mit und ohne Behandlung durch eine Neuraminidase, die Gesamtproduktion von Sialyllactose zu 2,6 g·l^–1 abzuschätzen. Diese Produktion findet sich teilweise in den Bakterienzellen (1,5 g·l^–1) und in dem extrazellulären Kulturmedium (1,1 g·l^–1) wieder. In dem Falle des Vergleichsstamms JM107 (Nst-01, pBBnsy) ist die Produktion von Sialyllactose viel geringer (150 mg·l^–1), was anzeigt, dass praktisch die Gesamtheit der Sialinsäure durch das Bakterium abgebaut worden ist.
Die intrazellulären und extrazellulären Oligosaccharide werden durch Adsorption an Aktivkohle und Elution mit Ethanol gereinigt. Nach Reinigung an Anionenaustauscherharz wird mittels HPLC ein einziges Produkt detektiert. Dass Massenspektrum im FAB⁺-Modus zeigt das Vorhandensein von zwei Quasi-Molekülionen [M + H]⁺ bei m/z 656 und [M + Na] bei m/z 678, welches dem Natriumsalz von Sialyllactose entspricht.
Beispiel 8: Herstellung von fucosylierten Derivaten von Lacto-N-neo-tetraose
Bei E. coli K12 bilden die Gene der Biosynthese von GDP-Fucose einen Teil des Operons, welches für die Biosynthese eines extrazellulären Polysaccharids, der Colansäure, verantwortlich ist (Stevenson et al., 1996). Die Expression dieses Operons wird durch ein komplexes Regulationsnetzwerk, an welchem das Protein RcsA beteiligt ist, kontrolliert (Stout et al., 1991). Die Überexpression des rcsA-Gens kommt so in einer Überproduktion von Colansäure (Russo und Singh, 1993) und folglich der Gene für die Biosynthese von GDP-Fucose zum Ausdruck.
Um die Verfügbarkeit von GDP-Fucose zu erhöhen, bestand unsere Strategie darin, einen E. coli-Stamm einzusetzen, in welchem das rcsA-Gen überexprimiert wurde (derart, dass die Gene der Biosynthese von GDP-Fucose überproduziert werden) und in welchem eines der für die Biosynthese der Colansäure essentiellen Gene inaktiviert worden ist (derart, dass die Produktion von Colansäure vollständig unterdrückt wird und ein Wettbewerb um die Verwendung von GDP-Fucose vermieden wird).
Wir haben den Stamm JM107-col^–DE3 eingesetzt, in dem das Gen wcaJ, das für den Transfer des ersten Glucose-Rests der Grundeinheit verantwortlich ist, gemäß Beispiel 1 inaktiviert worden ist und in welchen wir entweder die beiden Plasmide pHP0651 und pBBLnt oder die beiden Plasmide pHP0651 und pBBLntRcsA eingeführt haben. Das Plasmid pHP0651 enthält das Gen fucT der α-1,3-Fucosyltransferase von Helicobacter pylori. Diese Fucosyltransferase verwendet als Akzeptor N-Acetyllactosamin und Lacto-N-neo-tetraose, aber nicht Lac tose (Martin et al., 1997). Das Plasmid pBBLnt enthält die Gene lgtA und lgtB. Das Plasmid pBBLntRcsA enthält die Gene lgtA, lgtB und rcsA.
Die beiden Stämme JM107-col^–DE3 (pHP0651, pBBLnt) und JM107-col^–DE3 (pHP0651, pBBLntRcsA) wurden wie in Beispiel 3 in Gegenwart von 5 g·l^–1 Lactose kultiviert. Am Ende der dritten Kultivierungsphase war die durch die beiden Stämme produzierte Menge von hydrolysierbarem GlcNAc (1,7 g·l^–1) vergleichbar mit jener, die durch den Stamm JM109 (pCWlgtA, pBBlgtb) in Beispiel 3 erhalten wurde. Die kolorimetrische Bestimmung der Fucose am Ende der Kultivierung zeigt einen bedeutenden Unterschied zwischen den beiden Stämmen mit einer Fucose-Produktion von 1 g·l^–1 für den Stamm JM107-col^–DE3 (pHP0651, pBBLntRcsA) und nur 0,25 g·l^–1 für den Stamm JM107-col^–DE3 (pHP0651, pBBLnt). Die fucosylierten Oligosaccharide finden sich zu mehr als 70% in der intrazellulären Fraktion.
Die Reinigung der intrazellulären Fraktion durch Adsorption an Aktivkohle und sterische Ausschlusschromatographie an Biogel P2 erlaubt, vier Hauptverbindungen aufzutrennen.
Die Verbindung 1 entspricht durch ihr Elutionsvolumen an Biogel P2 und ihre Wanderung in der Dünnschicht Lacto-N-neo-tetraose.
Das Massenspektrum der Verbindung 2 zeigt das Vorhandensein eines Quasi-Molekülions [M + H]⁺ bei m/z bei 854, was der Molmasse von Lacto-N-fucopentaose entspricht. Das Vorhandensein eines sekundären Ions bei 327 zeigt an, dass das Molekül an dem Glucoserest fucosyliert ist und die folgende Struktur aufweist:
β-D-Gal-[1→4]-β-D-GlcNAc-[1→3]-β-D-Gal-[1→4]-(α-L-Fuc-[1→3])-β-D-Glc
Das Massenspektrum der Verbindung 3 zeigt das Vorhandensein von 3 Quasi-Molekülionen bei m/z 1000, 1022 und 1038, entsprechend den drei Formen [M + H]⁺ [M + Na]⁺ und [M + K]⁺ des Moleküls von Lacto-N-difucohexaose mit der folgenden Struktur:
β-D-Gal-[1→4]-(β-L-Fuc-[1→3])-β-D-GlcNAc-[1→3]-β-D-Gal-[1→4]-(α-L-Fuc-[1→3])-β-D-Glc
Das Massenspektrum der Verbindung 4 erlaubt, zwei Quasi-Molekülionen bei m/z 1365 und 1388 zu identifizieren, welche den Formen [M + H]⁺ und [M + Na]⁺ eines Lacto-N-difucooctaose-Moleküls entsprechen. Das Vorhandensein eines sekundären Ions bei m/z 512 zeigt an, dass der GlcNAc-Rest des nicht-reduzierenden Endes eine Fucose trägt. Die NMR-Daten zeigen, dass das ¹H-Proton eines Fucoserests hinsichtlich Anomerie sensibel ist und dass dieser Fucoserest folglich an die Glucose gebunden ist. Diese Ergebnisse erlauben, für die Verbindung 4 die folgende Struktur vorzuschlagen:
β-D-Gal-[1→4]-(α-L-Fuc-[1→3])-β-D-GlcNAc-[1→3]-β-D-Gal-[1→4]-β-D-GlcNAc-[1→3]-β-D-Gal-[1→4]-(α-L-Fuc-[1→3])-β-D-Glc.
REFERENZEN

1. Boons (1996) Tetrahedron 52, 1095–1121.
2. Dische Z. Shettles L. B. (1948) J. Biol. Chem., 175, 160–167.
3. Donnenberg M. S., Kaper J. B. (1991) Infect. Immun., 59: 4310–4317.
4. Geremia R. A., Mergaert P., Geelen D., Van Montagu M., Holsters M. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2669–2673.
5. Gilbert M., Watson D. C., Cunningham A. M., Jennings M. P., Young N. M., Martin A., Wakarchuk W. W. (1996) J. Biol. Chem., 271: 28271–28276.
6. Gilbert M, Watson D. C., Warachuk W. W (1997), Biotechnology Letters, 19: 417–420. J.
7. Gilbert M., Cunningham A. M., Watson D. C., Martin, A., Richards, J. C., Wakarchuk, W. W. (1997) Eur. J. Biochem. 249, 187–194.
8. Kamst E., van der Drift K. M. G., Thomas-Oates J. E., Lugtenberg B. J. J., Spaink H. P. (1995) Escherichia coli. J. Bacteriol. 177, 6282–6285.
9. Kovach, M. E., Elzre, P. H., Hill, D. S., Robertson, G. T., Rarris, M. A., Roop II, R. M., Peterson, K. M., (1995). Gene 166, 175–176.
10. Lee R. T., Lee Y. C. (1974). Carbohyd. Res. 37, 193–203.
11. Martin, S. L., Edbrooke, M. R., Hodgman, T. C., van den Eijnden, D.H, Bird, M. I., (1997) J. Biol. Chem., 34, 21349–21356.
12. Mergaert P., D'Haeze W., Geelen D., Prome D. Van Montagu M., Geremia R., Prome J. C., Holsters M. (1995) J. Biol. Chem. 270, 29217–29223.
13. Plumbridge J., Vimr E. (1999) J. Bacteriol., 181: 47–54.
14. Reissig, J. L., Strominger, J. L., Leloir, L. F., (1955). J. Biol. Chem. 217, 959–966.
15. Roy R (1997) Recent developements in the rational design of multivalent glycoconjugates, in Topics curr chem., (Hrsg. J. Thiem and H. Driguez), Springer, Heidelberg, S. 241–274.
16. Russo T. A., Singh G. (1993) J. Bacteriol. 175, 7617–7623.
17. Samain, E., Drouillard, S., Heyraud, A., Driguez, H., Geremia, R. A. (1997). Carbohydr. Res. 30, 235–242.
18. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor laboratory Press. N. Y.
19. Spaink H. P., Wijfjes A. H. M., van der Drift K. M. G., Haverkamp J., Thomas-Oates J. E., Lugtenberg B. J. J. (1994) Mol. Microbiol. 13, 821–831.
20. Stevenson G., Andrianopoulos K., Hobbs M., P. R. Reeves P. R. (1996) J. Bacteriol., 178: 4885–4893.
21. Stout V., Torres-Cabassa A., Maurizi M. R., Gutnick D., Gottesman S. (1991) J. Bacteriol., 173: 1738–1747.
22. Yannisch-Perron C., Viera J., Messing J. (1985). Gene, 33, 103–119.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Oligosaccharids von Interesse durch eine genetisch modifizierte Zelle ausgehend von wenigstens einer internalisierten exogenen Vorstufe, ausgewählt aus Lactose, einem β-Galactosid und Sialinsäure, wobei die Vorstufe an dem Biosyntheseweg des Oligosaccharids beteiligt ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: i) Gewinnung einer Zelle, welche: – wenigstens ein rekombinantes Gen, welches ein Enzym kodiert, welches in der Lage ist, eine Modifizierung der exogenen Vorstufe, welche für die Synthese des Oligosaccharids ausgehend von der Vorstufe erforderlich ist, auszuführen, wie auch die Elemente, welche die Expression des Gens in der Zelle erlauben, umfasst, – keine enzymatische Tätigkeit aufweist, welche in der Lage wäre, die Vorstufe abzubauen; ii) Kultivierung der Zelle in Gegenwart von wenigstens einer solchen exogenen Vorstufe unter Bedingungen, welche die Internalisierung der exogenen Vorstufe durch die Zelle gemäß einem aktiven Transportmechanismus und die Produktion des Oligosaccharids durch die Zelle erlauben, wobei die Zellkultivierung auf einem kohlenstoffhaltigen Substrat ausgeführt wird unter Bedingungen, welche erlauben, eine Kultur mit hoher Zelldichte zu erhalten, umfassend: a) eine erste Phase einer exponentiellen Zellvermehrung, welche durch das kohlenstoffhaltige Substrat sichergestellt wird; b) eine zweite Phase einer Zellvermehrung, welche durch das kohlenstoffhaltige Substrat, welches kontinuierlich zugesetzt wird, begrenzt wird; c) eine dritte Phase einer verlangsamten Zellvermehrung, welche erhalten wird, indem in die Kultur kontinuierlich eine bezogen auf die in Schritt b) zugesetzte Substratmenge verringerte Menge des Substrats hinzugegeben wird derart, dass der Gehalt an in der Kultur mit hoher Zelldichte produzierten Oligosacchariden erhöht wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle außerdem wenigstens ein Gen, welches ein Enzym kodiert, welches in der Lage ist, eine Modifizierung einer endogenen Vorstufe, welche an dem Biosyntheseweg des Oligosaccharids beteiligt ist, auszuführen, wobei das Enzym identisch mit oder verschieden ist von dem Enzym nach Anspruch 1, wie auch die Elemente, welche die Expression des Gens in der Zelle erlauben, umfasst, und dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle keine enzymatische Aktivität aufweist, welche in der Lage wäre, die Vorstufe abzubauen.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle eine Zelle, welche unter den Bakterien und den Hefen ausgewählt wird, ist.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle ein Bakterium, vorzugsweise vom Typ Escherichia coli, ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Modifizierung unter der Glycosylierung, der Sulfatierung, der Acetylierung, der Phosphorylierung, der Succinylierung, der Methylierung, der Hinzufügung einer Enolpyruvat-Gruppe ausgewählt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym ein Enzym, welches in der Lage ist, eine Glycosylierung auszuführen, welches unter den Glycosyltransferasen ausgewählt wird, ist.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym eine Glycosyltransferase ist, welche unter der β-1,3-N-Acetylglucosaminyltransferase, der β-1,3-Galactosyltransferase, der α-1,3-N-Acetylgalactosaminyltransferase, der β-1,3-Glucuronosyltransferase, der β-1,3-N-Acetylgalactosaminyltransferase, der β-1,4-N-Acetylgalactosaminyltransferase, der β-1,4-Galactosyltransferase, der α-1,3-Galactosyltransferase, der α-1,4-Galactosyltransferase, der α-2,3-Sialyltransferase, der α-2,6-Sialyltransferase, der α-2,8-Sialyltransferase, der α-1,2-Fucosyltransferase, der α-1,3-Fucosyltransferase, der α-1,4-Fucosyltransferase ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das kohlenstoffhaltige Substrat unter Glycerol und Glucose ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die in die Zellkultur während der Phase c) kontinuierlich hinzugegebene Substratmenge bezogen auf die während der Phase b) kontinuierlich zugesetzte Substratmenge um wenigstens 30%, vorzugsweise 50%, bevorzugt 60% verringert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorstufe während der Phase b) zugesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorstufe Lactose ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorstufe ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus: – natürlichen oder synthetischen β-Galactosiden, vorzugsweise unter 4-O-β-D-Galactopyranosyl-D-fructofuranose (Lactulose), 3-O-β-D-Galactopyranosyl-D-arabinose, Allyl-β-D-galactopyranosid.
Verfahren nach den Ansprüchen 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass der aktive Transport der Vorstufe durch die Lactosepermease realisiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorstufe Sialinsäure ist.
Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der aktive Transport der Vorstufe durch die Permease NanT realisiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorstufe Sialinsäure und Lactose ist.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der aktive Transport der Vorstufe durch die Lactosepermease und die Permease NanT realisiert wird.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle einen unter LacZ- und/oder NanA- ausgewählten Genotyp hat.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass es außerdem die Zugabe eines Induktors in das Kulturmedium, um die Expression des Enzyms und/oder eines an dem aktiven Transport beteiligten Proteins in der Zelle zu induzieren, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Induktor Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) ist und das Protein die Lactosepermease ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20 für die Herstellung des Trisaccharids 4-O-[3-O-(2-Acetamido-2-desoxy-β-D-glucopyranosyl)-β-D-galactopyranosyl]-D-glucopyranose, (β-D-GlcNac-[1→3]-β-D-Gal-[1→4]-D-Glc), dadurch gekennzeichnet, dass: – die Zelle ein Bakterium von LacZ^–,LacY⁺-Genotyp ist; – das Enzym die β-1,3-N-Acetylglucosaminyltransferase ist; – das Substrat Glycerol ist; – der Induktor Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) ist; – die Vorstufe Lactose ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21 für die Herstellung von Lacto-N-neo-tetraose und von Polylactosamin (beispielsweise Lacto-N-neo-hexaose, Lacto-N-neo-octaose, Lacto-N-neo-decaose), dadurch gekennzeichnet, dass: – die Zelle ein Bakterium von LacZ^–,LacY⁺-Genotyp ist; – die Enzyme die β-1,3-N-Acetylglucosaminyltransferase und die β-1,4-Galactosyltransferase sind; – das Substrat Glucose ist; – der Induktor Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) ist; – die Vorstufe Lactose ist.
Verfahren nach Anspruch 22 für die Herstellung eines sialylierten Derivats von Lacto-N-neo-tetraose und von Polylactosamin (beispielsweise Lacto-N-neo-hexaose, Lacto-N-neo-octaose, Lacto-N-neo-decaose), dadurch gekennzeichnet, dass es außerdem ein solches Enzym, ausgewählt unter der α-2,3-Sialyltransferase, der α-2,6-Sialyltransferase, umfasst und dass die Zelle außerdem einen NanA^–,NanT⁺-Genotyp aufweist und das Gen der CMP-NeuAc-Synthase exprimiert.
Verfahren nach Anspruch 22 für die Herstellung eines fucosylierten Derivats von Lacto-N-neo-tetraose und von Polylactosamin (beispielsweise Lacto-N-neo-hexaose, Lacto-N-neo-octaose, Lacto-N-neo-decaose), dadurch gekennzeichnet, dass es außerdem ein solches Enzym, ausgewählt unter der α-1,2-Fucosyltransferase, der α-1,3-Fucosyltransferase, umfasst und dass die Zelle außerdem einen WcaJ^–-Genotyp aufweist und das Gen RcsA überexprimiert.
Verfahren nach Anspruch 22 für die Herstellung eines sialylierten und fucosylierten Derivats von Lacto-N-neo-hexaose, Lacto-N-neo-decaose, dadurch gekennzeichnet, dass es außerdem ein solches Enzym, ausgewählt unter der α-2,3-Sialyltransferase, der α-2,6-Sialyltransferase, und außerdem ein solches Enzym, ausgewählt unter der α-1,2- Fucosyltransferase, der α-1,3-Fucosyltransferase, umfasst und dass die Zelle außerdem einen NanA^–,NanT⁺,WcaJ^–-Genotyp aufweist und das Gen RcsA und das Gen der CMP-NeuAc-Synthase überexprimiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20 für die Herstellung von 3-Sialyllactose (α-NeuAc-[2→3]-β-D-Gal-[1→4]-β-D-Glc) oder 6-Sialyllactose (α-NeuAc-[2→6]-β-D-Gal-[1→4]-β-D-Glc), dadurch gekennzeichnet, dass: – die Zelle ein Bakterium von LacZ^–,LacY⁺-,NanA^–,NanT⁺-Genotyp ist; – die Enzyme die CMP-NeuAc-Synthase und die α-2,3-Sialyltransferase oder die α-2,6-Sialyltransferase sind; – das Substrat Glycerol ist; – der Induktor Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) ist; – die Vorstufen Lactose und Sialinsäure sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20 für die Herstellung von 3-Fucosyllactose (β-D-Gal-[1→4]-(α-L-Fuc-[1→3])-D-Glc) oder 2-Fucosyllactose (α-L-Fuc-[1→2]-β-D-Gal-[1→4]-D-Glc), dadurch gekennzeichnet, dass es ein solches Enzym, ausgewählt unter der α-1,3-Fucosyltransferase oder der α-1,2-Fucosyltransferase, umfasst und dass die Zelle einen wcaj^–lacZ^–-Genotyp aufweist und das Gen rcsA überexprimiert und dass die Vorstufe Lactose ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20 für die Herstellung von Allyl-3-O-(2-acetamido-2-desoxy-β-D-glucopyranosyl)-β-D-galactopyranosid (β-D-GlcNac-[1→3]-β-D-Gal-1→O-allyl), dadurch gekennzeichnet, dass: – die Zelle ein Bakterium von LacZ^–,LacY⁺-Genotyp ist; – das Enzym die β-1,3-N-Acetylglucosaminyltransferase ist; – das Substrat Glycerol ist; – der Induktor Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) ist; – die Vorstufe Allyl-β-D-galactopyranosid ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20 für die Herstellung von Analoga von Lacto-N-neo-tetraose und von Polylactosaminen, in welchen der Glucoserest durch eine Allylgruppe ersetzt ist, dadurch gekennzeichnet, dass: – die Zelle ein Bakterium von LacZ^–,LacY⁺-Genotyp ist; – die Enzyme die β-1,3-N-Acetylglucosaminyltransferase und die β-1,4-Galactosyltransferase sind; – das Substrat Glucose ist; – der Induktor Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) ist; – die Vorstufe Allyl-β-D-galactopyranosid ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 27 für die Herstellung von Analoga von Oligosacchariden, in welchen der Glucoserest durch eine Allylgruppe ersetzt ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorstufe Allyl-β-D-galactosid ist.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 30 zur Herstellung eines Oligosaccharids, welches durch wenigstens ein Isotop markiert ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle auf dem kohlenstoffhaltigen Substrat, welches durch das Isotop markiert ist, und/oder in Gegenwart einer durch das Isotop markierten Vorstufe kultiviert wird.