MXPA02000240A - Metodo para producir oligosacaridos. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a la produccion mediante procedimiento microbiologico de oligosacaridos de interes biologico; mas particularmente, la invencion se refiere a un metodo para la sintesis in vivo de oligosacaridos mediante la internalizacion de un precursor exogeno en celulas bacterianas en crecimiento que expresan genes de modificacion y glucosilacion adecuados.

Description

MÉTODO PARA PRODUCIR OLIGOSACARIDOS MEMORIA DESCRIPTIVA La presente invención se refiere a la producción microbiológica de oligosacáridos de interés biológico. Actualmente está bien establecido que los oligosacáridos desempeñan un papel biológico importante especialmente con respecto a la actividad y función de proteínas; por lo tanto, éstos sirven para modular la vida media de las proteínas, y ocasionalmente éstos están implicados en la estructura de la proteína. Los oligosacáridos desempeñan un papel esencial en la variabilidad del antígeno (por ejemplo grupos sanguíneos), y en ciertas infecciones bacterianas tales como las causadas por Neisseria meningitis. Puesto que los oligosacáridos se obtienen usualmente en un rendimiento bajo mediante la purificación iniciando a partir de fuentes __ -- „ .i-naturales, la síntesis de oligosacáridos se ha vuelto un reto mayor para la química de carbohidratos para abastecer cantidades suficientes de oligosacáridos bien caracterizados, requeridos para la investigación básica o para cualesquiera otras aplicaciones potenciales (Boons et al., 1996). La síntesis de oligosacáridos complejos de interés biológico puede llevarse a cabo químicamente, enzimáticamente o microbiológicamente.

A pesar del desarrollo de nuevos métodos químicos para sintetizar oligosacáridos en el transcurso de los últimos 20 años, la síntesis qliímica de oligosacáridos permanece muy difícil debido a las numerosas protecciones selectivas y pasos de desprotección, la inestabilidad de las uniones glucosídicas, las dificultades para obtener acoplamientos de regiones específicas, y los bajos rendimientos de producción. Conforme el número de pasos se incrementa con el tamaño del oligosacárido, la preparación de grandes cantidades de oligosacáridos más grandes que trisacáridos no es un asunto fácil. Contrario a la experiencia de síntesis de péptidos o síntesis de ácidos nucleicos, la química orgánica sintética tradicional no puede en la actualidad proveer una síntesis de alta calidad y en gran cantidad de oligosacáridos, incluso de fórmula simple. Consecuentemente, los métodos enzimáticos se han vuelto más populares puesto que éstos permiten una síntesis selectiva de la región bajo condiciones moderadas y sin un paso para protección de los grupos hidroxilo. El desarrollo del método enzimático se hizo posible mediante la clonación e identificación funcional de numerosos genes que codifican las enzimas implicadas en la ruta sintética de oligosacáridos. Por lo tanto, varios tipos de enzimas pueden utilizarse para la síntesis de oligosacáridos in vitro. La función fisiológica de las glucosil-hidrolasas y las glucosil-fosforilasas es depolimerizar los olígosacáridos, pero éstas también pueden utilizarse para in vitro en la síntesis de oligosacáridos al controlar el equilibrio de la reacción y la cinética. Los substratos de las enzimas para estas reacciones están fácilmente disponibles, pero estas reacciones enzimáticas no son muy versátiles. Otro método enzimático desarrollado utiliza las glucosiltransferasas o la ruta bioquímica de Leloir, la cual muestra fuerte especificidad de región para el precursor y también para el substrato donante; estas glucosil-transferasas no son tan fácilmente disponibles como las glucosil-hidrolasas. La técnica de ADN recombinante ha hecho posible recientemente clonar y producir un cierto número de éstas. Sin embargo, la limitación principal de este método enzimático yace en los costos muy elevados de los azúcar-nucleótidos que son los donantes de azúcares utilizados por estas enzimas. La ruta microbiana para producir oligosacáridos recombinantes in vivo es la más atrayente de las rutas sintéticas puesto que la bacteria es simultáneamente responsable de la biosíntesis de las enzimas, la regeneración de los azúcar-nucleótidos y, finalmente, la producción del oligosacárido. Las primeras descripciones de la síntesis microbiológica de oligosacáridos utilizando bacterias recombinantes pueden considerarse hasta cierto grado como los estudios que llevaron a la elucidación de las rutas para la biosíntesis de los factores de nodulación; estos factores son moléculas señal secretadas por rhizobia para permitir el reconocimiento por plantas leguminosas en el procedimiento de nodulación. Los factores de nodulación consisten de una estructura base de quito-oligosacárido que contiene varias sustituciones. La identificación funcional de los genes nod implicados en la biosíntesis de los factores de nodulación fue llevada a cabo parcialmente mediante la identificación de los oligosacáridos formados in vivo en cepas de Escherichia coli que expresan estos diversos genes nod (Gérémia et al., 1994; Kamst et al., 1995; Spaink et al., 1994; Mergaert et al., 1995). Sin embargo, la producción de los oligosacáridos per se no fue el objetivo de estos estudios; estos productos se sintetizaron únicamente en cantidades traza y se identificaron solamente mediante el uso de precursores radioactivos. Por otra parte, se demostró recientemente en el laboratorio de los inventores (Samain et al., 1997) que el cultivo a alta densidad celular de cepas de Escherichia coli que contienen el gen nodC (quito-oligosacárido sintasa) hizo posible producir grandes cantidades, mayores de 2 g/l, de quito-oligosacáridos "recombinantes". Sin embargo, esta técnica de síntesis microbiológica de oligosacáridos permanece limitada a la producción de solamente quito-oligosacáridos, debido a la propiedad única de nodC (quito-oligosacárido sintasa) de funcionar sin un precursor; específicamente, las otras enzimas glucolizan un precursor específico y su actividad depende por lo tanto de este precursor en la célula. El problema del precursor es por lo tanto el obstáculo principal de bloqueo del desarrollo del método y su extensión a la producción de otros tipos de oligosacáridos. Un objetivo de la presente invención es por lo tanto un método para producir un oligosacárido de interés mediante una célula genéticamente modificada iniciando con al menos un precursor exógeno internalizado por dicha célula, dicho precursor estando implicado en la ruta biosintética de dicho oligosacárido, dicho método comprendiendo los pasos de (i) obtener una célula que comprende al menos un gen recombinante que codifica una enzima capaz de modificar dicho precursor exógeno o uno de los intermediarios en la ruta biosintética de dicho oligosacárido a partir de dicho precursor exógeno necesario para la síntesis de dicho oligosacárido a partir de dicho precursor, y también los componentes para expresar dicho gen en dicha célula, y dicha célula que carece de cualquier actividad enzimática responsable de degradar dicho oligosacárido, dicho precursor y dichos intermediarios; (ii) cultivar dicha célula en la presencia de al menos un precursor exógeno, bajo condiciones que capacitan la intemalización conforme a con un mecanismo de transporte pasivo y/o activo de dicho precursor exógeno por dicha célula y la producción de dicho oligosacárido por dicha célula. De conformidad con una modalidad particular, la presente invención se refiere a un método como se describió anteriormente, caracterizado porque dicha célula también comprende al menos un gen que codifica una enzima capaz de modificar un precursor endógeno implicado en la ruta biosintética de dicho oligosacárido, dicha enzima siendo idéntica a o diferente a la enzima utilizada en el método descrito anteriormente, y también a los componentes para expresar dicho gen en dicha célula y caracterizada porque dicha célula carece de cualquier actividad enzimática responsable de degradar dicho precursor.

El término "oligosacáridos" se pretende que denote polímeros lineares o ramificados con un número variable de residuos, uniones y subunidades; el número de residuos siendo mayor que 1. Los oligosacáridos son carbohidratos que se convierten mediante hidrólisis a varias moléculas monosacáridas; los monosacáridos siendo azúcares que no pueden convertirse en una substancia más sencilla por hidrólisis. Los monosacáridos se subdividen en triosas, tetrosas, pentosas, hexosas y heptosas dependiendo del número de átomos de carbono en sus cadenas basadas en hidrocarburos, y también en aldosas y cetosas dependiendo de la presencia de una función aldehido o una función cetona en su molécula. Entre los monosacáridos que se encuentran más frecuentemente, se debe hacer mención de mañosa, glucosa, galactosa, N-acetilglucosamina y N-acetilgalactosamina. El número de cadenas de oligosacáridos estereoisoméricos es extremadamente grande, debido al gran número de carbonos asimétricos en la cadena basada en hidrocarburo. La expresión "precursor exógeno" se pretende que denote un compuesto implicado en la ruta biosintética del oligosacárido de conformidad con la invención que se internaliza por dicha célula. La expresión "precursor endógeno" se pretende que denote un compuesto implicado en la ruta biosintética del oligosacárido de conformidad con la invención que está naturalmente presente en dicha célula. La expresión "célula genéticamente modificada" se pretende que denote un microorganismo en el cual se ha introducido en su genoma al menos una alteración de la secuencia de ADN con el objeto de dar a dicha célula un fenotipo particular. Dichas alteraciones pueden por así, por ejemplo, dar a la célula la capacidad para no degradar o no modificar un compuesto de conformidad con la invención, o no reducir la frecuencia del rearreglo del ADN. El método de conformidad con la invención se caracteriza porque dicha célula es una célula elegida de bacterias y levaduras. De conformidad con una modalidad preferida de la invención, la bacteria se elige a partir del grupo compuesto de Escherichia coli, Bacillus subtilis, Campylobacter pylori, Helicobacter pylori, Agrobacterium tumefaciens, Staphylococcus aureus, Thermophilus aquaticus, Azorhizobium caulinodans, Rhizobium leguminosarum, Neisseria gonorrhoeae y Neisseria meningitis. De conformidad con una modalidad preferida de la invención, la bacteria es Escherichia coli. De conformidad con otra modalidad de la invención, la célula es una levadura que preferiblemente es Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pombe o Candida albicans. La célula de conformidad con la invención carece de cualquier actividad enzimática responsable de degradar dicho oligosacárido, dicho precursor o dicho intermediario metabólico. La secuencia de ácido nucleico que codifica la enzima de conformidad con la invención está ya sea naturalmente presente en dicha célula o se introduce dentro de dicha célula mediante las técnica de ADN recombinante conocidas por los expertos en la técnica. En la presente descripción, el término "ácido nucleico" se pretenderá que denote un fragmento de ADN, el cual es ya sea de doble hebra o de una sola hebra, o productos de transcripción de dichos ADN, y/o un fragmento de ARN. De conformidad con una modalidad preferida, la secuencia de ácido nucleico que se introduce dentro de dicha célula mediante las técnicas de ADN recombinante y que codifica una enzima implicada en la ruta biosintética del oligosacárido de interés es heteróloga. La expresión "secuencia de ácido nucleico heteróloga" se pretende que denote una secuencia de ácido nucleico que no está naturalmente presente en la célula de conformidad con la invención. La secuencia de ácido nucleico heteróloga de conformidad con la invención puede originarse a partir de cualquier animal o planta, tipo de célula eucarionte o procarionte y se puede originar a partir de virus. Entre las células procariontes a partir de las cuales se origina la secuencia de ácido nucleico heteróloga, se debe hacer mención de bacterias y en particular de Escherichia coli, Bacillus subtilis, Campylobacter pylori, Helicobacter pylori, Agrobacterium tumefaciens, Staphylococcus aureus, Thermophilus aquaticus, Azorhizobium caulinodans, Rhizobium leguminosarum, Neisseria gonorrhoeae y Neisseria meningitis. Entre las células eucariontes unicelulares a partir de las cuales se origina la secuencia de ácido nucleico heteróloga, se debe hacer mención de levaduras y en particular de Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pombe o Candida albicans. De conformidad con una modalidad preferida de la invención, la secuencia de ácido nucleico heteróloga se origina a partir de células eucariontes de plantas o animales. De conformidad con una modalidad aún más preferida de la invención, la secuencia de ácido nucleico heteróloga se origina a partir de células de mamífero y preferiblemente a partir de células de humano. De conformidad con una modalidad preferida de la invención, la célula de conformidad con la invención es la bacteria Escherichia coli y la secuencia de ácido nucleico introducida dentro de la bacteria y que codifica la enzima de conformidad con la invención preferiblemente se origina a partir de una bacteria elegida de entre el grupo mencionado anteriormente. De conformidad con una modalidad preferida de la invención, la secuencia de ácido nucleico que codifica la enzima de conformidad con la invención se introduce dentro de dicha célula en la forma de un vector de expresión. El vector debe comprender un promotor, señales de inicio y paro de la traducción, y también regiones adecuadas para regular la transcripción. El vector debe ser capaz de mantenerse establemente en la célula por generaciones sucesivas y puede contener opcionalmente señales particulares que especifican la secreción de la enzima traducida. Estas diversas señales de control se eligen como una función de la célula hospedera a ser utilizada. Para este fin, la secuencias de ácidos nucleicos pueden insertarse dentro de vectores de replicación autónoma dentro del hospedero elegido o dentro de vectores integrativos los cuales se integran dentro del genoma del hospedero elegido. Dichos vectores se preparan de conformidad con los métodos comúnmente utilizados por los expertos en la técnica, y las clonas que resultan de éstos pueden introducirse dentro de una célula hospedera adecuada mediante métodos estándares tales como, por ejemplo, choque térmico o electroporación. La invención también se dirige hacia las células anteriormente mencionadas, caracterizadas porque éstas se transforman por al menos un ácido nucleico recombinante aislado que codifica la enzima de conformidad con la invención o mediante al menos un vector recombinante como se definió anteriormente. El método de conformidad con la invención se caracteriza porque dicha modificación hecha por dicha enzima se elige a partir de glucosilación, sulfatación, acetilación, fosforilación, succinilación, metilación y adición de un grupo enolpiruvato, sialilación y fucosilación. Más particularmente, El método de conformidad con la invención se caracteriza porque dicha enzima es una enzima capaz de llevar a cabo una glucosilación, la cual se elige a partir de gluscosil-transferasas, glucosil-hidrolasas y glucosil-fosforilasas. De conformidad con una modalidad preferida, la enzima capaz de llevar a cabo la glucosilación es una glucosil-transferasa. De conformidad con una modalidad preferida, la glucosil-transferasa de conformidad con la invención se elige a partir de ß-1 ,3-N-acetil-glucosaminil-transferasa, ß-1 ,3-galactosil-transferasa, -1 ,3-N- acetil-glucosaminil-transferasa, ß-1 ,3-glucuronosil-transferasa, ß-1 ,3-N-acetil-galactosaminil-transferasa, ß-1 ,4-N- acetil-galactosaminil-transferasa, ß-1 ,4- galactosil-transferasa, a-1 ,3-galactosil-transferasa, a-1 ,4-galactosil-transferasa, a-2,3-sialil-transferasa, a-2,6-sialil-transferasa, a-2,8-sialil-transferasa, a-1 ,3-fucosil-transferasa, a-1 ,4-fucosil-transferasa y a-1 ,2-fucosil- transferasa. Las galactosil-transferasas utilizadas en la presente invención son capaces de llevar a cabo conjugación estereoespecífica de unidades de sacáridos activados específicamente en una molécula aceptora específica. Los sacáridos activados generalmente consisten de derivados sacáridos de difosfato de uridina, difosfato de guanosina y difosfato de citidina. Por lo tanto los sacáridos activados pueden ser un sacárido-UDP, un sacárido-GDP o un sacárido-CMP. Ciertos genes que codifican glucosil-transferasas utilizados en el método de conformidad con la invención se han descrito previamente; por lo tanto, la solicitud de patente internacional WO 96/10086 describe la síntesis estándar de oligosacárido: en un primer paso, diversas glucosil-transferasas se producen en bacterias recombinantes que contienen los genes IgtA, IgtB y IgtC de Neisseria gonorrhoeae, y, después de purificar las enzimas recombinantes así producidas, los oligosacáridos se sintetizan in vitro en la presencia de los precursores y azúcar-nucleótidos requeridos. De conformidad con ciertas modalidades de la invención, la enzima capaz de llevar a cabo una acetilación se codifica por el gen NodL de la bacteria Azorhizobium caulinodans. De conformidad con otra modalidad, la enzima capaz de llevar a cabo una sulfatación se codifica por el gen NodH de la bacteria Rhizobium meliloti. El método de conformidad con la invención se caracteriza porque el cultivo de dicha célula preferiblemente se lleva a cabo sobre un substrato basado en carbono; de conformidad con una modalidad particular de la invención, dicho substrato basado en carbono se elige a partir de glicerol y glucosa. También pueden utilizarse otros substratos basados en carbono; se debe hacer mención de maltosa, almidón, celulosa, pectina y quitina. De conformidad con otra modalidad, el cultivo de la célula se lleva a cabo sobre un substrato compuesto de aminoácidos y/o proteína y/o lípidos. El método de conformidad con la invención se caracteriza porque dicho paso de cultivo se lleva a cabo bajo condiciones que permiten la producción de un cultivo con una alta densidad celular; este paso de cultivo comprende una primera fase de crecimiento celular exponencial garantizada por dicho substrato basado en carbono, una segunda fase de crecimiento celular limitado por dicho substrato basado en carbono el cual se añade continuamente, y finalmente una tercera fase de crecimiento celular lento obtenida por la adición continuamente al cultivo de una cantidad de dicho sustrato que menor que la cantidad de sustrato añadida en el paso b) de manera que incrementa el contenido de oligosacáridos producidos en el cultivo de alta densidad celular. El método de conformidad con la invención se caracteriza porque la cantidad de substrato añadida continuamente al cultivo celular durante dicha fase c) es al menos 30% menor, preferiblemente 50% y preferiblemente 60% menor que la cantidad de substrato añadida continuamente durante dicha fase b). El método de conformidad con la invención también se caracteriza porque dicho precursor exógeno se añade durante la fase b).

De conformidad con una modalidad de la invención, el método se caracteriza porque dicho precursor exógeno es de naturaleza de carbohidrato, preferiblemente de naturaleza de oligosacárido. La novedad y posibilidad del método de conformidad con la invención se basa en el uso de dos modos de intemalización del precursor exógeno de manera que no destruye la integridad de la célula o se atacan sus funciones vitales. Esto especialmente excluye a las técnicas estándares de permeabilización de membrana con solventes orgánicos los cuales bloquean el crecimiento y el metabolismo energético. Los dos modos posibles para internalizar el precursor exógeno utilizan un mecanismo de transporte pasivo o activo. La invención se refiere principalmente a un método que se caracteriza porque dicho precursor exógeno se internaliza de conformidad con un mecanismo de transporte pasivo. La expresión "intemalización mediante transporte pasivo" se pretende que denote la difusión pasiva de cualesquiera de los precursores exógenos a través de la membrana plasmática, el flujo molecular estando orientado a partir de las zonas de mayor concentración a las zonas de menor concentración de manera que se tiende finalmente hacia un estado de equilibrio. La intemalización mediante transporte pasivo consiste en el uso de un precursor exógeno que es lo suficientemente pequeño y suficientemente hidrófobo para difundir pasivamente a través de la membrana. Un precursor monosacárido cuya posición anomérica se bloquea con un substituto de alquilo constituye un ejemplo de un precursor que puede ser internalizado de esta manera. La presente invención por lo tanto se refiere a un método que se caracteriza porque dicho precursor exógeno es un monosacárido cuyo carbono anomérico está unido a un grupo alquilo; preferiblemente dicho grupo alquilo es un grupo alilo. Uno de los objetivos de la invención es por lo tanto proveer un método para producir oligosacáridos que contienen un grupo funcionalizable tal como el grupo alilo y que consecuentemente pueden ser utilizados como precursores para la síntesis química de glucoconjugados (neoglucoproteína o neoglucolípidos) o glucopolímeros. La razón para esto es que el doble enlace del grupo alilo es capaz de abrirse mediante ozonolisis para formar un aldehido y para permitir que el oligosacárido se conjugue dentro de una proteína mediante aminación reductiva (Roy et al., 1997). Otra ruta es la adición de cisteamina (Lee y Lee, 1974, Roy et al., 1997) al doble enlace alílico para formar para formar un grupo terminal amina el cual puede reaccionar, por ejemplo, con los grupos carboxílicos de las proteínas. De conformidad con una modalidad particular, El método de conformidad con la invención se refiere a la producción de (ß-D-Gal-[1 ^ 4]-ß-D-GlcNac-1 - O-alilo); el método se caracteriza porque dicha célula es una bacteria de genotipo LacZ, dicha enzima es ß-1 ,4-galactosil-transferasa, dicho substrato es glicerol y dicho precursor es alil-N-acetil-ß-D-glucosaminida (ß-D-GlcNac-t O-al¡lo). Finalmente, de conformidad con otra modalidad particular, el método de conformidad con la invención se caracteriza porque el doble enlace del grupo alilo de dicho (ß-D-Gal-[1- 4]-ß-D-GlcNac-1- > O-alilo) está químicamente modificado por las reacciones de adición, oxidación u ozonolisis. La presente invención también se refiere a un método que se caracteriza porque dicho precursor se internaliza de conformidad con un mecanismo de transporte activo. La expresión "intemalización mediante transporte activo", se pretende que denote la capacidad de las células y preferiblemente de las bacterias para admitir selectivamente y concentrar ciertas sustancias o precursores exógenos dentro de su citoplasma. Este transporte se lleva a cabo mediante transportadores de naturaleza proteica conocidos como permeasas, las cuales actúan como enzimas; las permeasas son catalizadores inducibles, es decir catalizadores que se sintetizan en la presencia del substrato o precursor. De conformidad con una modalidad particular de la invención, la lactosa y los ß-galactósidos constituyen precursores que se transportan activamente dentro del citoplasma de la bacteria Escherichia coll mediante la lactosa permeasa, también conocida como galactósido permeasa. La invención se refiere así a un método de conformidad con la invención que se caracteriza porque dicho transporte activo de dicho precursor se lleva a cabo mediante lactosa permeasa. La lactosa permeasa tiene una especificidad relativamente amplia, la cual permite transportar moléculas diferentes a lactosa. La razón para esto es que ésta es capaz de transportar varios ß-galactósidos, a-galactósidos y sucrosa naturales o sintéticos. Uno de los objetivos de la invención es por lo tanto proveer, de conformidad con una modalidad preferida, de un método que se caracteriza porque dicho precursor es lactosa, la cual constituye la porción base para una gran mayoría de oligosacáridos biológicamente activos. También está dentro el alcance de la presente invención el proveer un método que se caracteriza porque dicho precursor se elige a partir del grupo que compuesto de: 4-O-ß-D-galactopiranosil-D-fructofuranosa (lactulosa), 3-O-ß-D-galactopiranosil-D-arabinosa y allil-ß-D-galactopiranósido, (ii) a-galactósidos, preferiblemente melibiosa y rafinosa, y allil-a-D-galactopiranósido, (iii) sucrosa. La especificidad de la lactosa permeasa puede modificarse incluso mediante mutación y permite el transporte de otros compuestos tales como maltosa y celobiosa. Todos estos compuestos pueden utilizarse entonces como precursores par la síntesis de oligosacáridos. También dentro del alcance de la invención está el uso de análogos de precursores de lactosa que contienen un grupo químicamente reactivo para una funcionalización subsecuente del producto; preferiblemente, uno de estos análogos es allil-ß-D-galactopiranósido. También está dentro del alcance de esta invención el utilizar otras permeasas posiblemente modificadas por técnicas de ADN recombinante para permitir la intemalización de diferentes tipos de precursores. Los ß-galactósidos normalmente se hidrolizan en el citoplasma de la bacteria mediante la ß-galactosidasa codificada por el gen LacZ. Con el objeto de superar este problema, una mutante bacteriana LacZ que carece de actividad ß-galactosidasa se utiliza cuando el precursor utilizado es lactosa y/o un ß-galactósido. Uno de los objetivos de la invención es proveer también por lo tanto el método de conformidad con la invención que se caracteriza porque dicha célula carece de actividad enzimática responsable de la degradación de dicho precursor o dichos intermediarios metabólicos. De conformidad con una modalidad particular, la invención se refiere a un método descrito anteriormente que se caracteriza porque dicho precursor es ácido siálico. En este caso, dicho transporte activo de dicho precursor se lleva a cabo por NanT permeasa. De conformidad con otra modalidad particular, la invención se refiere a un método descrito anteriormente que se caracteriza porque dicho ' precursor es ácido siálico. En este caso, dicho transporte activo de dicho precursor se lleva a cabo por lactosa permeasa y NanT permeasa. En el método de conformidad con la invención, dicha célula puede estar carente en actividad enzimática responsable de degradar dicho precursor(es). De conformidad con una modalidad preferida, el método se caracteriza porque ducha célula tiene un genotipo elegido de LacZ y/o NanA'. De conformidad con otro aspecto de la invención, el método se caracteriza porque este también comprende la adición de un inductor a dicho medio de cultivo para inducir la expresión en dicha célula de dicha enzima y/o de una proteína implicada en dicho transporte activo; de conformidad con una modalidad preferida, el método de conformidad con la invención se caracteriza porque dicho inductor es isopropil ß-D-tiogalactósido (IPTG) y dicha proteína es lactosa permeasa. La invención hace posible por primera vez producir oligosacáridos complejos en rendimientos del orden de un gramo por litro. Dependiendo de su tamaño, el oligosacárido ya sea se acumula en el citoplasma bacteriano o se secreta hacia el medio de cultivo. Por lo tanto, de conformidad con una modalidad preferida, el método de conformidad con la invención se utiliza para la producción del trisacárido 4-O-[3-0-(2-acetamido-2-desoxi-ß-D-glucopiranosil)-ß-D-galactopiranosil]-D-glucopiranosa; (ß-D-GlcNac-[1 ->- 3]-ß-D-Gal-[1 - 4]-D-Glc); éste se caracteriza porque dicha célula es una bacteria de genotipo LacZ, LacY*, dicha enzima es ß-1 ,3-N-acetil-glucosaminil-transferasa, dicho substrato es glicerol, dicho inductor es isopropil ß-D-tiogalactósido (IPTG) y dicho precursor es lactosa. De conformidad con una segunda modalidad preferida, el método de conformidad con la invención se utiliza para la producción de lacto-N-neo-tetraosa y palilactosamina; éste se caracteriza porque dicha célula es una bacteria de genotipo LacZ, LacY*, dichas enzimas son ß-1 ,3-N-acetil-glucosaminil-transferasa y ß-1 ,4-gaiactosil-transferasa, dicho substrato es glucosa, dicho inductor es isopropil ß-D-tiogalactósido (IPTG) y dicho precursor es lactosa. De conformidad con una tercera modalidad preferida, el método de conformidad con la invención se utiliza para la producción de alil 3-0-(2-acetamido-2-desoxi-ß-D-glucopiranosil)-ß- D-galactopiranósido, (ß-D- GIcNAc [1- -3]-ß-D-Gal-[1- >O]-alilo); éste se caracteriza porque dicha célula es una bacteria de genotipo LacZ, LacY*, dicha enzima es ß-1 ,3-N- acetil-glucosaminil-transferasa, dicho substrato es glicerol, dicho inductor es isopropil ß-D-tiogalactósido (IPTG) y dicho precursor es alil-ß-D-galactopiranósido. De conformidad con una cuarta modalidad preferida, el método de conformidad con la invención se utiliza para la producción de análogos de lacto-N-neo-tetrosa y de polilactosaminas en las que el residuo de glucosa se reemplaza con un grupo alilo; éste se caracteriza porque dicha célula es una bacteria de genotipo LacZ, LacY*, dichas enzimas son ß-1 ,3-N-acetil-glucosaminil-transferasa y ß-1 ,4-galactosil-transferasa, dicho substrato es glucosa, dicho inductor es isopropil ß-D-tiogalactósido (IPTG) y dicho precursor es alil-ß-D-galactopiranósido. De conformidad con una quinta modalidad preferida, el método de conformidad con la invención se utiliza para la producción de alil-ß-D-lactosamina, (ß-D-Gal- [1 ~ ~ 4]-ß-GlcNac-1 ~ ' O-alilo); éste se caracteriza porque dicha célula es una bacteria de genotipo LacZ, LacY*, dicha enzima es ß-1 ,4- galactosil-transferasa, dicho substrato es glicerol y dicho precursor es alil-N-acetil ß-D-glucosamina (-D-GlcNac-[1 "^ O-alilo]). La invención también se refiere a un método que hace posible abarcar la producción de un gran número de oligosacáridos diferentes obtenidos mediante la glucosilación de lactosa. Específicamente, aparte de los genes IgtA y IgtB los cuales codifican respectivamente ß-1 ,3-N-acetil- glucosaminil-transferasa y ß-1 ,4-galactosil-transferasa, varios genes de glucosil-transferasas bacterianas que utilizan lactosa como precursor han sido clonadas recientemente. Estos son IgtC (ß-1 ,4-galactosil-transferasa) y Lst (a-2, 3-sialil-transferasa) (Gilbert et al., 1997). Utilizando estos genes en un método de conformidad con la invención se hace posible producir moléculas tales como globotriosa (antígeno sanguíneo Pk) y sialil-lactosa. Además la coexpresión de los genes IgtA y IgtB con el gen para a-1 , 3-fucosil-transferasa a partir de Helicobacter pylori (Martin et al., 1997) de conformidad con un método de conformidad con la invención hace posible obtener pentasacárido de Lewisx. La adición del gen Lst (a-2, 3-sialil-transferasa) da acceso al sialil hexasacárido de Lewisx. El método de conformidad con la invención también hace posible obtener un gran número de oligosacáridos diferentes obtenidos mediante la glucosilación de precursores exógenos diferentes a la lactosa y transportados por lactosa permeasa o por otras permeasas. El método de conformidad con la invención hace posible obtener un gran número de oiigosacáridos diferentes obtenidos mediante modificación in vivo (sulfatación, acetilación, fosforilación, succinilación, metilación, adición de un grupo enolpiruvato) de precursores. La síntesis de ciertos oligosacárídos puede necesitar la modificación de precursores endógenos, además de la modificación de precursores exógenos. Por lo tanto, se puede contemplar el introducir dentro de la bacteria Escherichia coli K12 el gen para la enzima implicada en el metabolismo de un precursor endógeno para permitir la producción de ciertos azúcar-nucleótidos tales como, por ejemplo, ácido CMP-siálico, UDP-GalNAc o GDP-fucosa, las cuales no se producen normalmente por esta cepa bacteriana, de manera que se logra la síntesis de un oligosacárido de interés. Por ejemplo, UDP-GalNAc puede producirse a partir de UDP-GIcNac si el gen de epimerasa se introduce dentro de una célula de conformidad con la invención. Contrariamente al método enzimático para la síntesis in vitro de oligosacáridos, el cual requiere el uso de moléculas muy costosas tales como ATP, Acetil-CoA, PAPS (adenosina 3'-fosfato 5'-fosfosulfato) o fosfo-enolpiruvato, una de las ventajas de la presente invención yace en el hecho de que estas moléculas se reciclan naturalmente dentro de la célula, haciendo así posible reducir los costos de producción de los oligosacáridos. Otro objetivo de la invención se refiere a un método descrito anteriormente para la producción de 3'-sialillactosa ( a-NeuAc-[2- 3]- ß-Gal- [1 - ]-ßD-Glc) o 6'-sialiIactosa (a-NeuAc-[-_- 6]-ß-Gal-[1 - ]-ßD-Glc), caracterizado porque: • dicha célula es una bacteria de genotipo: LacZ, LacY*, NanA' o Nan~T; • dichas enzimas son CMP-NeuAc-sintasa y a-2, 3-sialil- transferasa o a-2, 6-sialil-transferasa; • dicho substrato es glicerol; • dicho inductor es isopropil-ß-D-tiogalactósido (IPTG); • dichos precursores son lactosa y ácido siálico.

De conformidad con una sexta modalidad preferida que completa la segunda modalidad descrita anteriormente, el método de conformidad con la invención se utiliza para la producción de derivados de sialilo de lacto-N-neo-tetraosa y de polilactosamina (lacto-N-neo-hexaosa, lacto-N-neo-octaosa, lacto-N-neo-decaosa), caracterizado además porque también comprende dicha enzima elegida de entre a-2, 3-sialil-transferasa y a-2, 6-sialil-transferasa, y porque dicha célula también tiene un genotipo NanA', NanT* y expresa el gen de CMP-NeuAc-sintasa, dichos aceptores son lactosa y ácido siálico. Otro objetivo de la invención se refiere a un método descrito anteriormente para la producción de lacto-N-neo'-tetraosa, ß-D-Galfr ' 4]-ß-D-GIcNAc- [1 _>3]-ß-D-Gal-[1-^ 4]-(a-L-Fuc[l 3])-ß-D-Glc, ß-D-Gal[l 4]-(a-L-Fuc[1-^ 3])-ß-D-GlcNAc- [1 - 3]-ß-D-Gal-[1- 4]-(a-L-Fuc[1-^ 3])-ß-D-Glc, ß-D-Gal[1 -* 4]-(a-L-Fuc[1-^ 3])-ß-D-GlcNAc- [1- 3]-ß-D-Gal-[1 -^ 4]-ß-D-GIcNAc- [1 - 3]-ß-D-Gal-[1- 4]-(a-L-Fuc[1 - 3])-ß-D-Glc, caracterizado además porque • dicha célula es una bacteria de genotipo LacZ, LacY*, WcaJ y que sobreexpresa rcsA; • dichas enzimas son ß-1,3-N-acetil-glucosaminil-transferasa, ß- 1 ,4- galactosil-transferasa y a-1 ,3-fucosil-transferasa; • dicho substrato es glucosa; • dicho inductor es isopropil-ß-D-tiogalactósido (IPTG); • dicho precursor es lactosa.

De conformidad con una séptima modalidad preferida, el método de conformidad con la invención se utiliza para la producción de 3'-fucosillactosa (ß-D-Gal[1 _ 4]-(a-L-Fuc[1 _^3])-D-Glc) o 2'-fucosillactosa (ß-D-Gal[1 - . 4j-(a-L-Fuc[1 - - 3])-D-Glc), caracterizado además porque una de dichas enzimas elegidas de entre a-1 , 3-fucosil-transferasa y a-1 , 2-fucosil-transferasa, y porque la célula tiene un genotipo NanA", NanV y sobreexpresa el gen rcsA y dicho precursor es lactosa. De conformidad con una octava modalidad preferida, el método de conformidad con la invención se utiliza para la producción de derivados de fucosilo de lacto-N-neo-tetraosa y de polilactosamina (lacto-N-neo-hexaosa, lacto-N-neo-octaosa, lacto-N-neo-decaosa), caracterizado además porque también comprende dicha enzima elegida de a-1 , 2-fucosil-transferasa y a-1 , 3-fucosil-transferasa, y porque dicha célula también tiene un genotipo WcaS y sobreexpresa el gen RcsA, dicho aceptores siendo lactosa. De conformidad con una novena modalidad preferida, el método de conformidad con la invención se utiliza para la producción de derivados de fucosilo de lacto-N-neo-tetraosa y de polilactosamina (lacto-N-neo-hexaosa, lacto-N-neo-octaosa, lacto-N-neo-decaosa), caracterizado además porque también comprende dicha enzima elegida de a-1 , 2-fucosil-transferasa y a-1 , 3-fucosil-transferasa, y porque dicha célula también tiene un genotipo WcaJ y sobreexpresa el gen RcsA y el gen para CMP-NeuAc-sintasa, dichos aceptores son lactosa y ácido siálico. Los métodos de las modalidades 1 a 9 mencionadas anteriormente pueden llevarse a cabo para la producción de análogos de oligosacárido en los que el residuo de glucosa se reemplaza con un grupo alilo, dicho precursor ahora siendo alil-ß-D-galactósido más que lactosa. Otro objetivo de la invención es proveer un método para producir oligosacáridos a que están marcados o enriquecidos en radioisótopos; dichos oligosacáridos son extremadamente valiosos para estudios de análisis de biología básica o conformacional. La invención por lo tanto se refiere a un método para producir a un oligosacárido que está marcado con al menos un radioisótopo, caracterizado porque dichas células se cultivan sobre dicho sustrato basado en carbono con radioisótopo y/o en la presencia de dicho precursor marcado con dicho radioisótopo. Lo radioisótopos preferiblemente se eligen a partir del grupo compuesto de:14C, 13C, 3H, 35S, 32P, 33P. La invención también se refiere a un oligosacárido que puede obtenerse mediante un método de conformidad con invención. De conformidad con una modalidad particular, la invención se refiere a un oligosacárido activado que puede utilizarse para la síntesis química de glucoconjugados o glucopolímeros que puede obtenerse mediante un método como se describió anteriormente, dichos oligosacáridos siendo caracterizados porque el doble enlace del grupo alilo esta químicamente modificado mediante las reacciones de adición, oxidación u ozonolisis. El oligosacárido de conformidad con la invención es útil en uno amplio intervalo de aplicaciones terapéuticas y diagnósticas; este puede ser útil, por ejemplo como un agente para bloquear receptores de superficie celular en el tratamiento de un hospedero de enfermedades que implican a adhesión celular, o puede ser utilizado como suplementos nutricionales, agentes antibacterianos, agentes antimetastásicos y agentes antiinflamatorios. La invención por lo tanto se refiere a un oligosacárido que conformidad con la invención como producto medicinal, y especialmente como producto medicinal que se pretende para prevenir selectivamente la adhesión de moléculas biológicas. El oligosacárido de conformidad con invención también se utiliza como un producto medicinal que se pretende para tratar cáncer, inflamación, enfermedades cardiacas, diabetes, infecciones bacterianas, infecciones virales y enfermedades neurológicas y como producto medicinal que se pretende para injertos. La invención también se refiere a una composición farmacéutica, caracterizada porque ésta comprende un oligosacárido de conformidad con la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Finalmente, la invención también se refiere al uso agricultural y agronómico de un oligosacárido de conformidad con la invención, especialmente para el crecimiento y defensa de plantas. Específicamente, los oligosacáridos desempeñan un papel predominante en la simbiosis de Rhizobium/plantas leguminosas. De hecho, ciertos oligosacáridos se originan a partir de la hidrólisis de glucoproteínas fúngales o vegetales o las paredes pueden actuar como hormonas vegetales o como efectores de reacciones de defensa en plantas. La ventaja industrial del método de conformidad con la invención es obvia puesto que ésta hace posible por primera vez lograr una producción del orden de un kilogramo de oligosacáridos complejos de interés biológico. Todos los oligosacáridos de interés biológico que se abarcan se sintetizan a escala industrial y están actualmente disponibles solamente en la escala de mg y a costos extremadamente altos (arriba de un millón de FFr por gramo); el precio de los costos de estos compuestos producidos por la presente ruta microbiológica son infinitamente menores. Las características y ventajas de la presente invención se mostrarán más claramente al leer los ejemplos y figuras a continuación, las claves de las cuales se presentan a continuación.

FIGURAS Figura 1 : Principio del método para producir el trisacárido 4-O-[3-O-(2-acetamido-2-deoxi-ß-D-gluco-piranosil)-ß-D-galactopiranosil]-D-glucopiranosa, (ß-D-GlcNAc-[1-^ 3]-ß-D-Gal-[1- 4]-D-Glc) La lactosa (ß-D-Gal-[1-4]-ß-D-Glc) se transporta dentro de la células mediante lactosa permeasa (Lac permeasa). La lactosa no puede hidrolizarse en la célula puesto que la cepa es una mutante LacZ-. La expresión del gen IgtA permite la producción de la enzima LgtA la cual transfiere un GIcNAc de UDP-GIcNAc hacia una molécula de lactosa. Ei trisacárido formado (ß-D-GlcNAc-[1 -3]-ß-D-Gal-[1 -4]-D-Glc) se excreta hacia el medio. Figura 2: cultivo de alta densidad celular de la cepa control JM 109 y de la cepa JM 109 (pCWIgtA) que contiene el gen de glucosil transferasa LgtA. La lactosa se añade continuamente y la lactosa residual se determina enzimáticamente. La concentración de GIcNAc hidrolizable en el medio de cultivo se mide colorimétricamente después de la hidrólisis acida. La lactosa añadida representa la cantidad acumulativa total de la lactosa que se ha añadido continuamente. Figura 3: espectro de masas en el modo FAB+ del trisacárido 4-O-[3-O-(2-acetamido-2-deoxi-ß-D-gluco-p¡ranosil)-ß-D-gaIactopiranosil]-D-glucopiranosa, (ß-D-GlcNAc-[1 "" 3]-ß-D-Gal-[1 "^ 4]-D-Glc) purificado a partir del sobrenadante de cultivo de la cepa JM 109 (IgtA) Los dos iones cuasi-moleculares [M+H]+ y [M+Na]+ se observan a m/z 546 y 568. Un ¡ón [M+H]+ a m/z 442 también se observó, lo cual es debido la presencia de ß-D-GlcNAc-[1-3]-IPTG. Esto indica que el IPTG (¡sopropil ß-D-tiogalactósido) utilizado para inducir Lac permeasa y LgtA también esta glucosilado. Figura 4: espectro de RMN del protón del trisacárido trisacárido 4-0-[3-O-(2-acetamido-2-deoxi-ß-D-glucopiranosil)-ß-D-galactopiranosil]-D-glucopiranosa, (ß-D-GlcNAc-[ 3]-ß-D-Gal-[1-^ 4]-D-Glc) a 596°C La señal a 1.4 ppm se debe a los protones del grupo isopropilo del derivado de IPTG a glucosilado. Figura 5: espectro de 3C RMN del trisacárido 4-O-[3-O-(2-acetamido-2-deoxi-ß-D-glucopiranosil)-ß-D-galactopiranosil]-D-glucopiranosa, (ß-D-GlcNAc-[1 -^3]-ß-D-Gal-[1 - 4]-D-Glc) Figura 6: a principio del método para producir lacto-N-neotetraosa 4-O-[3-0-(2-acetamido-2-deoxi-ß-D-glucopiranos¡I)-ß-D-galactopiranosiI]-D-glucopiranosa, (ß-D-GlcNAc-[1-^ 3]-ß-D-Gal-[1-^ 4]-D-Glc) La lactosa (ß-D-Gal-[1-4]-ß-D-Glc) se transporta dentro de la célula mediante Lac permeasa. La lactosa no puede hidrolizarse en la célula puesto que la cepa es una mutante LacZ-. La expresión del gen IgtA permite la producción de la enzima LgtA la cual transfiere un GIcNAc de UDP-GIcNAc hacia una molécula de lactosa. El trisacárido formado entonces se utiliza como un precursor para LgtB el cual transfiere una molécula de galactosa a partir de UDP-Gal para formar lacto-N-neo-tetraosa (ß-D-Gai-[1-4]-ß-D-GlcNAc-[1 -3]-ß-D-Gal-[1 -4]-ß-D-Glc). Figura 7: cultivo de alta densidad celular de la cepa JM 109 (pCWIgtA, pBBIgtB) Cultivo en la presencia de lactosa a alta concentración (5 g.l" )y a baja concentración (1 g.l"1). Figura 8: separación en Biogel P4 de los oligosacáridos producidos por la cepa JM 109 (pCWIgtA, pBBIgtB) en la presencia de lactosa a una concentración inicial de 5 g.l"1 (A) o de 1 g.l"1 (B) Los picos 1 , 2, 3 o 4 corresponden, respectivamente, a lacto-N-neo-tetraosa, lacto-N-neo-hexaosa, lacto-N-neo-octaosa y lacto-N-neo-decaosa. Figura 9: principio de los métodos para producir sialilactosa La lactosa y el ácido siálico (NeuAc) se internalizan en la célula por lactosa permeasa (lacY) y ácido siálico permeasa (nanT). Estos dos compuestos no se degradan en la célula puesto que la cepa es una mutante LacZ- y nanA-. La expresión de la CMP-NeuA sintasa y de la a-2, 3-sialil-transferasa permite la activación del ácido siálico internalizado hacia CMP-NeuAc y su transferencia hacia la lactosa intercelular.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Materiales y métodos 1.1. Origen de los plásmidos y cepas bacterianas Las cepas JM 107 y JM 109 de Escherichia coli K12 (Yannisch- Perron et al., 1984) se utilizaron como células hospederas para todos los ejemplos descritos de producción de oligosacárido. Las cepas se obtuvieron a partir de DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen). El genotipo de la cepa JM 109 es el siguiente:F traD36 laclq ? (lacZ) M15 proA+B+/e14-(McrA-) ?(lac-proAB) supE44 recA1 endA1 gyrA96 (Nalr) thi hsdR17 relA1. El genotipo de la cepa JM 107 es idéntico al de la cepa JM 109 excepto por el hecho de que el gen recA1 no está inactivado. Los genes IgtA y IgtB de Neisseria meningitis MC58 se abastecieron por el Dr. W. Wakarchuk (Institute for Biological Sciences, National Research Council of Canadá, 100 Sussex Drive, Ottawa, Ontario, K1A OR6, Canadá) a en la forma de dos plásmidos pCW, uno que contiene el gen IgtA (referido en la presente como pCWIgtA) y el otro que contiene el gen IgtB (referido en la presente como pCWIgtB). Las secuencias de estos dos genes están disponibles a partir del banco de datos GenBank bajo el número U25839. El plásmido pLitmus28 se obtuvo partir de la compañía New Englands Biolabs. El plásmido pBBRI MCS se abasteció por el Dr. M. Kovach (Department of Microbiology and Immunology, Louisiana State University, Shreveport, LA 71130-3932, E.U.A.). Los genes para la CMP-ácido siálico sintasa y a-2, 3-silil-transferasa de Neisseria meningitis MC58 se abastecieron por el Dr. M. Gilbert (Institute for Biological Sciences, National Research Council of Canadá, 100 Sussex Drive, Ottawa, Ontario, K1A OR6, Canadá) en la forma de dos plásmidos NSY-01 y NST-01. El plásmido NSY-01 es un derivado del plásmido pT7-7 el cual contiene el gen (GenBank U60146) para CMP-ácido siálico sintasa (Gilbert et al., 1997). El plásmido NST-01 es un derivado del plásmido pBluescript Sk- el cual contiene el gen (GenBank U60660) para a-2, 3-sialii-transferasa (Gilbert et al., 1996). El gen fucT para a-1 , 3-fucosil-transferasa de Helicobacter pylori se abasteció por el Dr. S. Martin (Glaxo Wellcome Research and Development, Gunnels Wood Road, Stevenage, Hertfordshire, SG1 2NY, RU) en la forma de un plásmido pHP0651 derivado a partir de pET-21 a. La secuencia está disponible a partir de GenBank (AE000578, gen HP0651 ). 1.2. Subclonación Los inventores utilizaron las técnicas estándar de biología molecular descritas por Sambrook et al. (1989).

Construcción del plásmido pBBIgtB: El fragmento de ADN de 0.835 kb que contenía el gen IgtB se obtuvo mediante digestión del plásmido pCWIgtB con BamHl e Hindlll. Este fragmento se subclonó dentro del vector pLitmus28 predigerido con BamHl e Hindlll para formar el plásmido pLitlgtB. El fragmento de 0.9 kb que contenía el gen IgtB se escindió a partir del plásmido pLitlgtB mediante digestión con Xhol e Hlndlll y se subclonó dentro del plásmido pBBRI MCS predigerido con Xhol e Hindlll para formar el plásmido pBBIgtB.

Construcción del plásmido pBBnsv: El fragmento que contenía el gen para CMP-ácido siálico sintasa se escindió a partir del plásmido NSY-01 mediante la digestión con Xbal y se subclonó dentro del plásmido pBBRI MCS predigerido con Xbal para formar el plásmido pBBnsy.

Construcción del plásmido pBBLnt: El gen IgtA presente en la construcción pCWIgtA (Gilbert et al.) se amplificó mediante PCR al mismo tiempo que el promotor UV5 tactac del plásmido utilizando los iniciadores CTTTAAGCTTCCGGCTCGTATAA (sentido, promotor hacia el extremo 5') y GACAGCTTATCATCGATAAGCTT (antisentido, extremo IgtA) ambos conteniendo in sitio Hindlll. El fragmento amplificado de 1.3 kb entonces se subclonó dentro del sitio Hindlll del vector pBBIgtB.

Construcción del plásmido pBBLntRcsA: El gen rcsA (Stout et al., 1991 ) se amplificó inicialmente por PCR iniciando con ADN genómico a partir de JM 109 con los iniciadores AGGGTACCCATGTTGTTCCGTTTAG (sitio kpn, rcsA izquierdo) y AATCTAGAGTAATCTTATTCAGCCTG (sitio Xbal, rcsA derecho), y luego se clonó dentro de los sitios kpanl-Xbal del vector pBBR1-MCS. El vector pBBR1-MCS-rcsA se abrió entonces hacia el extremo 5' de gen mediante la digestión con kpnl, sus extremos se hicieron romos (equipo Amersham), se liberó con Xbal e insertó dentro de los sitios Smal-Xbal de la construcción pBBLnt, permitiendo una clonación hacia el extremo 3' del ensamblaje IgtB-UV5tactac-lgtA, colocando al rcsA bajo el control del promotor UV5 tactac. 1.3. Condiciones de cultivo Los cultivos de rutina y las preparaciones de los ¡nóculos se llevaron a cabo en medio LB (Sambrook et al., 1989). Los cultivos de alta densidad celular se prepararon en un fermentador de dos litros que contenía un volumen inicial de un litro de medio que tiene la siguiente composición: glicerol (17. 5 g.r1) o glucosa (15 g.r1), NH4H2PO4 (7 g.r1), KH2PO4 (7g.r1), MgSO4.7H2O (1 g.l"1), tiamina HCl (4.5 mg.l"1), solución de elementos traza (7.5 ml.r1), ácido cítrico (0.5 g.l"1), KOH (2 g.r ). El MgS04 se somete autoclave separadamente y la tiamina se esteriliza mediante filtración. La solución de elementos traza contiene: triacetato de nitrilo (70 mM, pH 6.5), citrato férrico (7.5 g.r1), MnCI2.4H2O (1.3 g.r1), CoCI.6H2O (0.21 g.r1), CuCI2.4H20 (0.13 g.l"1), H3B03 (0.25 g.r1), ZnSO4.7H2O (1.2 g.r1), Na2MoO-j.H20 (0.15 g.l"1). Los antibióticos ampicilina (50 mg.l"1) y cloramfenicol (25 mg.l"1) se añadieron para asegurar la presencia de diversos plásmidos. La solución alimentadora contiene glicerol (500 g.l'1) o glucosa (400 g.l"1), MgSO4.7H20 (12 g.l"1) y la solución de elementos traza (25 ml.r1). Los cultivos de alta densidad celular se inoculan al 2%. A través del cultivo, el contenido de oxígeno disuelto se mantiene al 20% de saturación al controlar manualmente la velocidad de flujo de aire y al ajustar automáticamente la velocidad de agitación. El pH se mantiene automáticamente a 6.8 mediante la visión de amoniaco acuoso (15% p/v). La temperatura se mantiene a 34°C para la cepa JM 109 (pCWIgtA) que 28°C para la cepa JM 109 (pCWIgtA, pBBIgtB). La estrategia de cultivo a alta densidad generalmente comprende tres fases: una primera fase de crecimiento exponencial la cual se asegura mediante el sustrato basado en carbono (glicerol o glucosa) inicialmente presente del medio; una segunda fase la cual inicia cuando el crecimiento se vuelve limitado por la fuente de carbono, que cual entonces añade continuamente a una velocidad de 4. 5 g.h-1.I"1 de glicerol o 3.6 g.h-1.1"1 de glucosa. En una tercera fase, esta velocidad se reduce al 60% para disminuir el crecimiento, de manera que se incremente el contenido de oligosacárido. 1.4. Ensayo de los oliqosacáridos Las muestras (1 ml) se toman durante la circulación y se centrifugan inmediatamente en microtubos. El sobrenadante se retiene para ensayar los oligosacáridos extracelulares. El concentrado bacteriano se resuspende en 1 ml de agua y entonces se incuba en un baño con agua a 100°C por 30 minutos para romper las células. Después de una segunda centrifugación, el sobrenadante se retiene para ensayar los oligosacáridos extracelulares. La concentración de lactosa se mide utilizando un equipo de determinación enzimática (diagnóstico Roche). Los residuos N-acetil-glucosamina presentes en los oligosacáridos se liberan mediante hidrólisis acida como se describió previamente (Samain et al., 1997) y luego se cuantifica colorimétricamente mediante el método de Reissig et al., (1955); en la descripción, el término "GIcNAc hidrolizable" significa la cantidad de GIcNAc ensayado de esta manera. Ensayando la lactosa con y sin tratamiento con una neuraminidasa se hace posible estimar la concentración de sialil-lactosa. La fucosa total se mide colorimétricamente mediante el método de hidrocloruro de cisteína de Diseñe y Shettles (1948). 1.5. Purificación de los oligosacáridos Al término del cultivo, las células bacterianas se cosechan mediante centrifugación a. El sobrenadante se retiene para purificación de los oligosacáridos extracelulares. Las células bacterianas se resuspende en 1 litro de agua a y entonces se permeabilizan a mediante un tratamiento con calor (a 30 minutos a 100°C) para liberar los oligosacáridos extracelulares. Después de una segunda centrifugación, estos oligosacáridos se recuperan en el sobrenadante. El primer y segundo sobrenadante que contienen los oligosacáridos extracelulares intracelulares, respectivamente, se adsorben sobre carbón activado (100 g por litro de sobrenadante). Después de enjuagar con agua destilada, los oligosacáridos se diluyen con etanol al 50% (v/v), se concentran mediante evaporación y se secan mediante congelamiento. Los oligosacáridos entonces se separan a mediante cromatografía de exclusión estérica sobre una columna (4. 5 cm x 95 cm) de Biogel P4, permitiendo la inyección de aproximadamente 300 mg de mezcla de oligosacáridos. La elución se llevó a cabo con agua destilada, a una velocidad de flujo de 40 ml.h"1. Los oligosacáridos no fucosilo se separan mediante cromatografía de exclusión estérica sobre una columna (4.5 cm x 95 cm) de Biogel P4, permitiendo la inyección de aproximadamente 300 mg de muestra de oligosacáridos. La elución se llevó a cabo con agua destilada a una velocidad de flujo de 40 ml.h"1.

Los oligosacáridos de fucosilo se separan mediante cromatografía de exclusión estérica sobre una columna (1. 5 cm x 200 cm) de Biogel P2 termostática mente mantenida a 60°C, permitiendo la inyección de aproximadamente 30 mg de mezcla de oligosacáridos. La elución se llevó a cabo con agua destilada, a una velocidad de flujo de 30 ml.h"1. La sialillactosa se separó a partir de los oligosacáridos neutrales a mediante la unión en una resina Dowex 1X4-400 (en forma HCO3"), y eluyendo con un gradiente de NaHCO3 (0 a 100 mM). El bicarbonato entonces se remueve al tratar el eluído con una resina Dowex 50X4 en la forma H+. 1.6. Preparación de los alil ß-D-glucósidos El alil ß-D-galactopiranósido y alil-N-acetil-ß-D-glucosamina se sintetizaron de conformidad con el protocolo descrito por Lee y Lee (1974). 1.7. Identificación y caracterización estructural de los oliqosacáridos El espectro de masas se adquirió utilizando un espectrómetro de masas (Nermag R-1010C). Para cada experimento, el volumen de matriz inicial es 4 µl. Los productos se analizaron en el modo FAB+. Los espectros de RMN se obtuvieron utilizando un espectrómetro Brucker AC300. 1.8. Construcción de la cepa JM 107-nanA" Una cepa JM 107 incapaz de metabolizar ácido siálico se preparó mediante inactivación insercional del gen nanA (operón Nan) que codifica la NeuAc aldolasa (Plumbridge et al., 1999). Dos reacciones de amplificación de PCR se llevaron a cabo en cada lado del centro del gen nanA para insertar en estos un sitio de restricción BamHl. Un primer fragmento BamHI-Xbal de 1.6 kb que comprende la porción a mano derecha del nanA se amplificó a partir del ADN genómico de JM 109 utilizando los iniciadores AAAGGATCCAAGATCAGGATGTTCACG y GCTCTAGAATGGTAATGATGAGGCAG y clonando entre los sitios BamHl y Xbal del vector pUC19, formando el vector pUC-nan1.6. Un segundo fragmento Kpnl-BamHI de 2.1 kb que comprende la porción a mano izquierda del nanA se amplificó utilizando los iniciadores AAAGGATCCGCGTAGGTGCGCTGAAAC y AAAGGTACCTCAGGCCACCGTTAGCAG y clonando entre los sitios Kpnl y BamHl del vector pUC-nan1.6, formando el vector pUC-nan3.7. El gen de resistencia a canamicina (pUC-4K, cassette Pharmacia) entonces se clonó dentro del sitio BamHl de pUC-nan3.7. El fragmento Sacl-Xbal de 4.9 kb que contiene nanA::kan se insertó dentro de los mismos sitios del vector suicida (Donnenberg y Kaper, 1991 ). Este plásmido se utilizó para obtener mediante recombinación homologa mutantes JM 107 nanA::kan, seleccionados por su resistencia a canamicina y su capacidad para metabolizar ácido siálico (cepa JM 107-nanA"). 1.9. Construcción de la cepa JM 107col-DE3 La supresión de la capacidad para sintetizar ácido colánico se logró mediante la inactivación insercional de gen wcaJ que codifica una glucosil-transferasa (Stevenson et al., 1996). Un fragmento de ADN de 1.8 kb que contiene el gen wcaJ y ADN adyacente se amplificaron mediante PCR iniciando con ADN genómico a partir de JM 109, insertándolo dentro de un vector pTOPO2.1 (equipo de clonación Invitrogen PCR), con la ayuda de los iniciadores CCACGATCCACGTCTCTCC (wcaJ derecho) y AAGCTCATATCAATATGCCGCT (wcaJ izquierdo). Este entonces se transfirió dentro de un vector pUC19 dentro del sitio EcoRL El vector así obtenido se sometió a un tratamiento con una EcoR1 metilasa, permitiendo la subsecuente adición del gen de resistencia a canamicina en el sitio Apol presente en el centro de wcaJ. El ADN recombinante wcaJ::kan se transfirió finalmente dentro del vector suicida pCVD442 permitiendo, mediante recombinación homologa, la producción de mutantes genómicos JM 107 que contienen el gen inactivado, seleccionados para PCR con la ayuda de los iniciadores los cuales se utilizaron para la clonación (cepa JM 107-col-). La cepa JM 107-col- se hizo lisogénica a partir del fago lambdaDE3 utilizando el equipo de lisogenización a partir de Novagen.

Eiemplo 2 Producción de trisacárido 4-O-f3-O-(2-acetamido-2-deoxi-ß-D- glucopiranosil.-ß-D-qalactopiranosip-D-glucopiranosa, (ß-D-GIcNAc- El principio se ilustra mediante la figura 1. Los inventores utilizaron la cepa JM 109 de Escherichia coli K12, dentro de la cual los inventores introdujeron el plásmido pCWIgtA con el gen IgtA. La cepa JM 109 es lacZ", es decir que esta es incapaz de hidrolizar lactosa. Por otra parte, ésta es lacY+, lo cual significa que esta puede sintetizar lactosa permeasa. El gen IgtA codifica una ß-1 , 3-N-acetil-glucosaminil-transferasa (LgtA), la cual transfiere una unidad de N-acetil-glucosamina hacia la galactosa de la lactosa. La cepa JM 109 (pCWIgtA) y también la cepa control JM 109 se cultivaron a alta densidad celular (Samain et al., 1997) en glicerol como la fuente de carbono y de energía. Después de la primera fase de crecimiento exponencial provisto por el glicerol inicialmente presente en el medio (17.5 g/l), el crecimiento se volvió limitado por el glicerol, que cual entonces se añade continuamente a una velocidad de 4. 5 g.h"1.1"1. Durante esta segunda fase de cultivo, se introducen lactosa continuamente a 90 mg.h"1.!"1. El IPTG (isopropil-ß-D-tiogalactósido) (0.5 mM) también se inyecta al inicio de esta fase para inducir la expresión de la lactosa permeasa y de la ß-1 , 3-N-acetil-glucosaminil-transferasa. Como se describió en la figura 2, la lactosa añadida claramente no se acumula en el medio, indicando que la lactosa se internaliza de hecho por las células bacterianas. Una gran acumulación en el medio de cultivo de un compuesto que contiene N-acetilglucosamina (GIcNAc hidrolizable) se observó dentro de la cepa JM 109 (pCWIgtA). La cantidad de GIcNAc hidrolizable (3.8 mmoles/l), producida corresponde casi estequiométricamente a la cantidad de lactosa consumida (3.5 mmoles/l), sugiriendo que toda la lactosa internalizada ha sido glucosilada por LgtA. Al término del cultivo, las células se remueven por centrifugación y los oligosacáridos presentes en el sobrenadante se purifica mediante adsorción sobre carbón activado y elución con etanol. A los oligosacáridos presentes entonces se separan de conformidad con su peso molecular, en una columna Biogel P4. Se encontró un solo compuesto predominante. Los datos de espectrometría de masas y de RMN indican que este compuesto es de hecho el trisacárido (ß-D-GlcNAc-[t 3]-ß-D-Gal-[1 -^4]-ß-D-Glc formado mediante la adición de un residuo GIcNac a la molécula de lactosa. De hecho, el espectro de masas en modo FAB+ muestra la presencia de un ¡ón de cuasi-molecular [M+H]+ a m/z 546 (figura 3). El espectro de H RMN confirma en la estructura de trisacárido, la presencia de un grupo acetilo y la configuración beta de las dos uniones O-glucósido (figura 4). El espectro de 13C RMN también especifica que la unión entre GIcNAc y la galactosa es de hecho del tipo 1 , 3 (figura 5).

EJEMPLO 3 Producción de lacto-N-neo-tetraosa y de polilactosamina El principio se describe la figura 6. La cepa de E. coli JM 109 se cotransformó con los dos plásmidos pCWIgtA y pBBIgtB que contiene, respectivamente, los genes IgtA (utilizado previamente) y IgtB (que codifica una ß-1 , 4-galactosil-transferasa conocida como LgtB). La cepa JM 109 (pCWIgtA, pBBIgtB) se cultivo a alta densidad celular utilizando glucosa como el substrato de crecimiento. Al inicio de la segunda fase, la lactosa se añade a alta concentración (5 g.l"1) o a baja concentración (1 g.l"1) y se añaden 0.1 mM de IPTG. Contrario a lo que se observó con la cepa JM 109 (PCWIgtA), solamente una liberación de una semana de GIcNAc hidrolizable dentro del medio se detecta durante el cultivo de esta cepa. Por otra parte, GIcNAc hidrolizable se encontró en gran cantidad en la bacteria (figura 7). Cuando el abastecimiento de lactosa es de 1 g.l"1, la intemalización completa de la lactosa (2.9 mmoles. I"1) y una producción total de GIcNAc unido de 1.45 g.l"1 (6.5 mmoles. I"1), es decir, la incorporación de más de dos moléculas de GIcNAc por molécula aceptora de lactosa, se observó. Cuando la lactosa se añade a alta concentración, la internalización es incompleta (3 g.l"1, es decir, 8.7 mmoles.l"1) con una producción de GIcNAc también de aproximadamente 6.5 mmoles.l"1. En este caso, la relación molar GIcNAc/lactosa es cercana a 1 , lo cual es coherente con la síntesis de lacto-N-neo-tetraosa. La purificación de la fracción oligosacárido intracelular hace posible obtener varios compuestos principales que se separan bien mediante cromatografía en Biogel P4. Los datos de espectrometría de masas y de RMN indican que estos compuestos corresponden a las siguientes estructuras: lacto-N-neo-tetraosa [M+H]+ = 708; lacto-N-neo-hexaosa [M+H]+ = 708; lacto-N-neo-octaosa [M+Na]+ = 1460 y probablemente lacto-N-neo-decaosa. Las proporciones respectivas de estos diversos compuestos dependen de la cantidad de lactosa añadida. Por lo tanto, con 5 g.l-1 de lactosa, el producto principal es lacto-N-neo-tetraosa (figura 8A). Por otra parte, un bajo abastecimiento de lactosa (1 g.l-1 ) promueve la formación de compuestos por un alto grado de polimerización, la lacto-N-neo-octaosa se vuelve el producto principal (figura 8B). La formación de homólogos superiores de polilactosamina de lacto-N-neo-tetraosa se explica por el hecho de que LgtA es capaz de utilizar lacto-N-neo-tetraosa para formar un intermediario pentasacárido que es glucosilado por LgtB para dar lacto-N-neo-hezaosa, y así hasta lacto-N-neo-decaosa. No se observó formación significativa de oligosacáridos con un número non de residuos y que contiene una galactosa en una posición del extremo no reductor. Esto indica que la elongación de las moléculas de esta limitada por la incorporación de GIcNAc por LgtA más que por la galactosilación catalizada por LgtB.

EJEMPLO 4 Producción de alil 4-O-r3-O-(2-acetamido-2-deoxi-ß-P-glucopiranos¡0-ß-D-galactopiranosM-D-glucopiranosa. (ß-P-GIcNAc-IT 3,-ß-D-Gal-M "^4,-P- Glc) La cepa JM 109 (pCWIgtA) se cultivó a alta densidad celular sobre glicerol. Al inicio de la segunda fase de cultivo, se añadieron 0.75 g.l-1 de alil-ß-D-galactopiranósido y 0.1 mM de IPTG. Una intemalización tota! del alil-ß-D-galactopiranósido se observó después de nueve horas, con una apariencia estequiométrica de GIcNAc hidrolizable en el medio extracelular. Los oligosacáridos presentes en el medio extracelular se purificaron como en el ejemplo 2. El espectro de masas en el modo FAB+ del producto principal obtenido muestra la presencia de un ion cuasi-molecular [M+H]+ a m/z 424 que corresponde a la estructura ß-D-GlcNAc-[1 3]-ß-D-Gal-A O-alilo.

EJEMPLO 5 Producción de ß-D-Gal-p 41-ß-D-GlcNAc-1 O-alilo La cepa JM 109 (pBBIgtB) se cultivó a alta densidad celular sobre glicerol. Al inicio de la segunda fase de cultivo, se añadieron 0.5 g.l-1 de alil-N-acetil-ß-D-glucosaminida (ß-D-GlcNAc-1-^ O-alilo). Una reducción de aproximadamente 30% en la cantidad de GIcNAc hidrolizable extracelular se observó en las primeras cinco horas, lo cual demuestra una intemalización parcial de alil-N-acetil-ß-D-glucosaminida. En paralelo, una producción intracelular casi estequiométrica de GIcNAc hidrolizable y de residuos de galactosa ß-enlazados (hidrolizable con ß-galactosidas) se observó. Estos resultados demuestran que el 30% de la alil-N-acetil-ß-D-glucosaminida ihicialmente añadida ha sido galactosilada mediante la actividad codificada por el gen IgtB. Después de la purificación, la estructura del compuesto esperado (ß-D-Gal-[1- 4]-ß-D-ß-1 ~ O-alilo) se confirmó mediante espectrometría de masas y RMN.

EJEMPLO 6 Producción de análogos de lacto-N-neo-tetraosa y de polilactosaminas en las gue el residuo de glucosa está reemplazado con un grupo alilo.

La cepa JM 109 (pCWIgtA y pBBIgtB) se cultivo como en el ejemplo 3, excepto que el abastecimiento de lactosa se remplazó con la adición de 0.65 g-l-1 de alil-ß-D-galactopiranósido. Después de la purificación de conformidad con el protocolo del ejemplo 3, tres compuestos principales se obtuvieron. Los datos de espectrometría de masas indican que estos tres compuestos corresponden a los tri-, penta- y heptasacáridos a continuación: ß-D-Gal-[1-^4]-ß-D-GlcNAc-[1"^ 3]-ß-D-Gal-1"^ O-alilo, [M+H]+ = 586; ß-D-Gal-[1 - ]-ß-D-GlcNAc-[t 3]-ß-D-GaI-[T 4]-ß-D-GlcNAc-[1- 3]-ß-D-Gai-1" O-alilo, [M+H]+ = 951 ; ß-D-Gal-[1 - 4]-ß-D-GlcNAc-[1-* 3]-ß-D-Gal-r -^ ^-ß-D-GIcNAc-ÍT** Sj-ß-D-GaKT 4]-ß-D-GlcNAc-[T 3]-ß-D-Gal-1 O-alilo, [M+H]+ = 1316.

EJEMPLO 7 Producción de 3'-siaiillactosa (a-NeuAc-r2-»-3.-ß-P-Gal-ri->4?-ß-P-Glc.

El principio se ilustra por la figura 9. Los genes para la biosíntesis de ácido siálico y CMP-NeuAc no están presentes en E. coli K12. Sin embargo, E. coli K12 es capaz de degradar ácido siálico (Plumbridge y Vimr, 1999) y contiene una permeasa (NanT) que capacita al ácido siálico exógeno a entrar dentro de la célula. Este ácido siálico entonces se cataboliza normalmente por una aldolasa (NanA). Los inventores utilizaron la cepa de E. coli K12 JM 109-nanA-(ejemplo 1 ) y una cepa control JM 107 dentro de la cual introdujeron los dos plásmidos compatibles NST-01 y pBBnsy que contiene, respectivamente, los genes para alfa-2, 3-sialil-transferasa y para CMP-NeuAc sintasa. Está cepa carece de actividad nanA y por lo tanto no es capaz de degradar ácido siálico ¡ntracelular. Sin embargo, esta contiene los genes de la lactosa permeasa (lacY) y de la sialil permeasa (nanT) y por lo tanto es capaz de internalizar ácido siálico exógeno y lactosa. El ácido siálico internalizado puede entonces activase a CMP-NeuAc mediante la acción de CMP-NeuAc sintasa y transferirse hacia la lactosa ¡ntracelular mediante la acción de alfa-2, 3-sialil-transferasa. La cepa JM 107-nanA- (Nst-01 , pBBnsy) y la cepa control JM 107 (Nst-01 , pBBnsy) que tiene la actividad NanA se cultivaron a alta densidad celular sobre glicerol. La lactosa (1.5 g.l-1 ), IPTG (0.1 mM) y ácido siálico (0.6 g.l-1) se añadieron al inicio de la segunda fase de cultivo por un periodo de cinco horas. A lo largo de la duración (17 horas) de la tercera fase de cultivo, se introdujeron continuamente 100 mg.h-1 L-1 de ácido siálico y 200 mg.h-1 L-1 de lactosa. Al término del cultivo de la cepa JM 107-nanA- (Nst-01 , pBBnsy), que el ensayo enzimático de la lactosa con y sin tratamiento con una neuraminidasa que hace posible estimar la producción total de sialillactosa como 2.6 g.l-1. Este producto se encuentra parcialmente en las células bacterianas (1.5 g.l-1 ) y en el medio de cultivo extracelular (1.1 g.l-1 ). En el caso de la cepa control JM 107 (Nst-01 , pBBnsy), la producción de sialillactosa es mucho menor (150 mg.l-1), indicando que virtualmente todo el ácido siálico ha sido degradado por la bacteria. Los oligosacáridos intracelulares y extracelulares se purifican mediante adsorción sobre carbón activado y elución con etanol. Después de la purificación en una resina de intercambio aniónico, solamente un producto se detecta mediante HPLC. Que el espectro de masas en modo FAB+ puesta la presencia de dos iones cuasimoleculares [M+H]+ a m/z 656 y [M+Na] a m/z 678 que corresponde a la sal de sodio de sialillactosa.

EJEMPLO 8 Producción de derivados de fucosil de lacto-N-neo-tetraosa En E. coli K12, los genes para la biosíntesis de GDP-fucosa forman parte del operón responsable para la biosíntesis de un polisacárido extracelular, ácido colánico (.Stevenson et al., 1996). La expresión de este operón se controla a mediante una red de regulación compleja en la que la proteína RcsA esté implicada (Stout et al., 1991 ). La sobreexpresión del gen rcsA se refleja así mediante una sobreproducción de ácido colánico (Russo y Singh, 1993) y consecuentemente de los genes para la biosíntesis de GDP fucosa. Para incrementar la disponibilidad de GDP fucosa, la estrategia de los inventores consistió en utilizar una cepa de E. coli en la que el gen rcsA se sobreexpresó (de manera que se sobreproducen los genes para la biosíntesis de GDP-fucosa) y en la cual uno de los genes que es esencial para la biosíntesis de ácido colánico ha sido inactivado (de manera que se suprime totalmente la producción de ácido colánico y se evita una competencia para el uso de GDP-fucosa). Los inventores utilizaron la cepa JM 107-col-DE3 en la que el gen wcaJ, el cual es responsable para la transferencia del primer residuo de glucosa de la unidad repetida, ha sido inactivado de conformidad con el ejemplo 1 y dentro del cual los inventores introdujeron ya sea los dos plásmidos pHP0651 y pBBLnt, o los dos plásmidos pHP0651 y pBBLntRcsA.

El plásmido pHP0651 contiene el gen fucT para alfa-1 , 3-fucosil-transferasa de Helicobacter pylori. Esta fucosil-transferasa utiliza un aceptor N-acetillactosamina y lacto-N-neo-tetraosa, pero no lactosa (Martin et al., 1997). El plásmido pBBLnt contiene los genes IgtA y IgtB. El plásmido pBBLntRcsA contiene los genes IgtA, IgtB y rcsA. Las dos cepas JM 107-col"DE3 (pHP0651 , pBBLnt) y JM 107-col"DE3 (pHP0651 , pBBLntRcsA) se cultivaron como en el ejemplo 3 en la presencia de 5 g.l"1 de lactosa. Al término de la tercera fase de cultivo, la cantidad de GIcNAc hidrolizable producido por las dos cepas (1.7 g.l"1) fue comparable a la obtenida con la cepa JM 109 (pCWIgtA, pBBIgtB) en el ejemplo 3. El ensayo colorimétrico de la fucosa al término del cultivo muestra una gran diferencia entre las dos cepas, con una producción de fucosa de 1 g.l"1 para la cepa JM 107-col"DE3 (pHP=651 , pBBLntRcsA) y solamente 0.25 g.l"1 para la cepa JM 107-col"DE3 (pHP0651 , pBBInt). Los fucosil oligosacáridos se encuentran en más del 70% en la fracción intracelular. La purificación de la fracción intracelular mediante la adsorción sobre carbón activo y cromatografía de exclusión estérica en Biogel P2 hace posible separar cuatro compuestos principales. El compuesto 1 corresponde, por su volumen de elución en Biogel P2 y su migración en capa fina, a lacto-N-neo-tetraosa. El espectro de masas del compuesto 2 muestra la presencia de un ion cuasimolecular [M+H]+ a m/z 854 que corresponde a la masa molar de lacto-N-fucopentosa. La presencia de un ion secundario a 327 indica que la molécula se fucosila en el residuo de glucosa y que tiene la siguiente estructura ß-D-Gal-[1- 4]-ß-D-GlcNAc-[1 ? 3]-ß-D-Gal-[1- 4]-(a-L-Fuc-[1 -+- 3]-ß-D-Glc. El espectro de masas del compuesto principal 3 a muestra la presencia de 3 iones cuasimoleculares a m/z 1000, 1022 y 1038 que corresponden a las tres formas [M+H]+, [M+Na]+ y [M+K]+ de la molécula de lacto-N-difucohexaosa que tiene la siguiente estructura ß-D-Gal-[1 4]-(ß-L-Fuc-[1 3])-ß-D-GlcNAc-[1 3]-ß-D-Gal-[1 4]-(a-L-Fuc-[1 3])-ß-D-Glc. El espectro de masas del compuesto 4 hace posible identificar dos iones cuasimoleculares a m/z 1365 y 1388 que corresponden a las formas [M+H]+ y [M+Na]+ de una molécula de lacto-N-difucooctaosa. La presencia de un ¡ón secundario a m/z 512 indica que el residuo GIcNAc del extremo no reductor contiene una fucosa. Los datos de RMN muestran que el protón H+ de un residuo de fucosa es sensible al anomerismo y que este residuo de fucosa se une así a la glucosa. Estos resultados hacen posible proponer la siguiente estructura para el compuesto 4: ß-D-Gal-[1-^ 4]-(a-L-Fuc-[1 - 3])-ß-D-GlcNAc-[1 - 3]-ß-D-Gal-[1 4]-ß-D-GlcNAc-[1-> 3]-ß-D-Gal-[1- 4]-(a-L-Fuc-[1- 3])-ß-D-Glc.

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Claims (1)

1. NOVEDAP PE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- Un método para producir un oligosacárido de interés mediante una célula genéticamente modificada iniciando con al menos un precursor exógeno internalizado, dicho precursor estando implicado en la ruta biosintética de dicho oligosacárido, caracterizado porque comprende los pasos de: (i) obtener una célula que comprende al menos un gen recombinante que codifica una enzima capaz de modificar dicho precursor exógeno o uno de los intermediarios en la ruta biosintética de dicho oligosacárido a partir de dicho precursor exógeno necesario para la síntesis de dicho oligosacárido a partir de dicho precursor, y también los componentes para expresar dicho gen en dicha célula, que carece de cualquier actividad enzimática responsable de degradar dicho oligosacárido, dicho precursor y dichos intermediarios; (¡i) cultivar dicha célula en la presencia de al menos un precursor exógeno, bajo condiciones que capacitan la internalización conforme a con un mecanismo de transporte pasivo y/o activo de dicho precursor exógeno por dicha célula y la producción de dicho oligosacárido por dicha célula. 2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha célula también comprende al menos un gen que codifica una enzima capaz de modificar un precursor endógeno implicado en la ruta biosintética de dicho oligosacárido, dicha enzima siendo idéntica a o diferente a la enzima utilizada en el método descrito anteriormente, y también a los componentes para expresar dicho gen en dicha célula y caracterizada porque dicha célula carece de cualquier actividad enzimática responsable de degradar dicho precursor. 3.- El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado además porque dicha célula es una célula elegida de bacterias y levaduras. 4.- El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque dicha célula es una bacteria, preferiblemente del tipo Escherichia col!. 5.- El método de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado además porque dicha modificación se elige de glucosilación, sulfatación, acetilación, fosforilación, succinilación, metilación y adición de un grupo enolpiruvato. 6.- El método de conformidad con una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado además porque dicha enzima es una enzima capaz de llevar a cabo una glucosilación, elegida de glucosil-transferasas. 7.- El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque dicha enzima es una glucosil-transferasa elegida de ß-1 , 3-N-acetil-glucosaminil-transferasa, ß-1 , 3-galactosil-transferasa, a-1 , 3-N- acetil-glucosaminil-transferasa, ß-1 , 3-glucuronosil-transferasa, ß-1, 3-N-acetil-galactosaminil-transferasa, ß-1 , 4-N- acetil- galactosaminil-transferasa, ß-1, 4- galactosil-transferasa, a-1 , 3-galactosil-transferasa, a-1 , 4-galactosil-transferasa, a-2, 3-sialil-transferasa, a-2, 6-sialil-transferasa, a-2, 8-síalil-transferasa, a-1 , 2-fucosil-transferasa, a-1 , 3-fucosil-transferasa y a-1 , 4-fucosil-transferasa. 8.- El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado además porque dicho cultivo celular se lleva a cabo sobre un substrato basado en carbono. 9.- El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque dicho substrato basado en carbono se elige de glicerol y glucosa. 10.- El método de conformidad con una de las reivindicaciones 8 y 9, caracterizado además porque dicho cultivo se lleva a cabo bajo condiciones que permiten la producción de un cultivo con una alta densidad celular. 11.- El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque dicho paso de cultivo comprende: a) - una primera fase de crecimiento celular exponencial garantizada por dicho substrato basado en carbono, b) - una segunda fase de crecimiento celular limitado por dicho substrato basado en carbono el cual se añade continuamente, c) - una tercera fase de crecimiento celular lento obtenida por la adición continuamente al cultivo de una cantidad de dicho sustrato que menor que la cantidad de sustrato añadida en el paso b) de manera que incrementa el contenido de oligosacáridos producidos en el cultivo de alta densidad celular. 12.- El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque la cantidad de substrato añadida continuamente al cultivo celular durante dicha fase c) es al menos 30% menor, preferiblemente 50% y preferiblemente 60% menor que la cantidad de substrato añadida continuamente durante dicha fase b). 13.- El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 11 y 12, caracterizado además porque dicho precursor se añade durante la fase b). 14.- Ei método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado además porque dicho precursor es de naturaleza de carbohidrato, preferiblemente de naturaleza de oligosacárido. 15.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho precursor es un monosacárido cuyo carbono anomérico está unido a un grupo alquilo de manera que permite su internalización mediante un mecanismo de transporte pasivo. 16.- El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque dicho grupo alquilo es un alilo. 17.- El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 15 y 16, caracterizado además porque es para la producción de (ß-D-Gal-[1->4]-ß-D-GlcNAc-1- O-alilo) caracterizado porque dicha célula es una bacteria de genotipo: LacZ, dicha enzima es ß-1 , 4-galactosiI- transferasa; dicho substrato es glicerol; dicho precursor es (ß-D-GlcNAc-1 O-alilo). 18.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho precursor es lactosa. 19.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho precursor se elige del grupo compuesto de 4-O-ß-D-galactopiranosil-D-fructofuranosa (lactulosa), 3-O-ß-D-galactopiranosil-D-arabinosa y allil-ß-D-galactopiranósido, a-galactósidos, preferiblemente melibiosa y rafinosa, y allil-a-D-galactopiranósido, de sucrosa. 20.- El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 18 y 19, caracterizado además porque dicho transporte activo de dicho precursor se lleva a cabo mediante lactosa permeasa. 21.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho precursor es ácido siálico. 22.- El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque dicho transporte activo de dicho precursor se lleva a cabo mediante NanT permeasa. 23- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicho precursor es ácido siálico y lactosa. 24.- El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque dicho transporte activo de dicho precursor se lleva a cabo mediante lactosa permeasa y NanT permeasa. 25.- El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 24, caracterizado además porque dicha célula carece de cualquier actividad enzimática responsable de degradar dicho precursor(es). 26.- El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque dicha célula tiene un genotipo elegido de LacZ y/o NanA'. 27.- El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 26, caracterizado además porque también comprende la adición de un inductor a dicho medio de cultivo para inducir la expresión en dicha célula de dicha enzima y/o de una proteína implicada en dicho transporte activo. 28.- El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque dicho inductor es isopropil ß-D-tiogalactósido (IPTG) y dicha proteína es lactosa permeasa. 29.- El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 28, caracterizado además porque es para la producción del trisacárido 4-0-[3-0-(2-acetamido-2-deoxi-ß-D-gluco-piranosil)-ß-D-galactopiranosil]-D-glucopiranosa, (ß-D-GlcNAc-[t 3]-ß-D-Gal-[1-^ 4]-D-Glc), caracterizado porque: dicha célula es una bacteria de genotipo LacZ, LacY*, dicha enzima es ß-1 ,3-N-acetil-gIucosaminil-transferasa, dicho substrato es glicerol, dicho inductor es ¡sopropil ß-D-tiogalactósido (IPTG); dicho precursor es lactosa. 30.- El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 28, caracterizado además porque es para la producción de lacto-N-neo-tetraosa y polilactosamina (lacto-N-neo-hexaosa, lacto-N-neo-octaosa, lacto-N-neo-decaosa); éste se caracteriza porque: dicha célula es una bacteria de genotipo LacZ, Lac , dichas enzimas son ß-1 ,3-N-acetil-glucosaminil-transferasa y ß-1 ,4-galactosil-transferasa, dicho substrato es glucosa, dicho inductor es ¡sopropil ß-D-tiogalactósido (IPTG); dicho precursor es lactosa. 31.- El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque es para la producción de derivados de sialilo de lacto-N-neo-tetraosa y de polilactosamina (lacto-N-neo-hexaosa, lacto-N-neo-octaosa, lacto-N-neo-decaosa), caracterizado porque también comprende a dicha enzima elegida de a-2, 3-sialil-transferasa y a-2, 6-sialil-transferasa, y porque dicha célula también tiene un genotipo NanA", Nan y expresa el gen de CMP-NeuAc-sintasa. 32.- El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque es para la producción de derivados de fucosilo de lacto-N-neo-tetraosa y de polilactosamina (lacto-N-neo-hexaosa, lacto-N-neo-octaosa, lacto-N-neo-decaosa), caracterizado además porque también comprende a dicha enzima elegida de a-1 , 2-fucosil-transferasa y a-1 , 3-fucosil-transferasa, y porque dicha célula también tiene un genotipo WcaJ y sobreexpresa el gen RcsA. 33.- El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque es para la producción de un sialilo y derivados de fucosilo de lacto-N-neo-tetraosa, lacto-N-neo-decaosa, caracterizado porque también comprende dicha enzima elegida de a-2, 3-sialil-transferasa y 5 a-2, 6-sialil-transferasa, y también a dicha enzima elegida de a-1 , 2-fucosil- transferasa y a-1 , 3-fucosil-transferasa, y también porque dicha célula también tiene un genotipo NanA", NanT, WcaJ y sobreexpresa el gen RcsA y el gen para CMP-NeuAc-sintasa. 34.- El método de conformidad con cualesquiera de las 10 reivindicaciones 1 a 28, caracterizado además porque es para la producción de 3'-sialillactosa (a-NeuAc-[2-^3]-ß-Gal-[f-^ 4]-ß-D-Glc) o 6'-sialilactosa (a- NeuAc-t-T" * 63-ß-Gal-fl-^ 4]-ß-D-Glc), caracterizado porque: dicha célula es una bacteria de genotipo: LacZ, LacY*, NanA' o NanT; dichas enzimas son CMP-NeuAc-sintasa y a-2, 3-sialil-transferasa o a-2, 6-sialil-transferasa; 15 dicho substrato es glicerol; dicho inductor es isopropil-ß-D-tiogalactósido (IPTG); dichos precursores son lactosa y ácido siálico. 35.- El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 28, caracterizado además porque es para la producción •# de 3'-fucos¡IIactosa (ß-D-Gal[1 -*- 4]-(a-L-Fuc[1-^ 3]-D-Glc) o 2'-fucosillactosa, 20 (a-L-Fuc[1 - 2])-ß-D-Gal-[1->* 4]-D-Glc, caracterizado además porque comprende dicha enzimas elegidas de a-1 , 3-fucosil-transferasa y a-1 , 2- fucosil-transferasa, y porque la célula tiene un genotipo wcaf lacZ y sobreexpresa el gen rcsA y porque dicho precursor es lactosa. 36.- El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 28, caracterizado además porque es para la producción de alil 3-O-(2-acetam¡do-2-desoxi-ß-D-glucopíranosil)-ß-D-galactop¡ranósido, (ß-D-GIcNac- [1- 3]-ß-D-Gal-[1-^0]-alilo); caracterizado porque: dicha célula es una bacteria de genotipo LacZ, LacY*, dicha enzima es ß-1 ,3-N-acetil-glucosaminil-transferasa, dicho substrato es glicerol, dicho inductor es isopropil ß-D-tiogalactósido (IPTG); dicho precursor es alil-ß-D-galactopiranósido. 37.- El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 28, caracterizado además porque es para la producción de análogos de lacto-N-neo-tetrosa y de polilactosaminas en las que el residuo de glucosa se reemplaza con un grupo alilo, caracterizado porque dicha célula es una bacteria de genotipo LacZ, LacY*, dichas enzimas son ß-1 ,3-N-acetil-glucosamlnil-transferasa y ß-1 ,4-galactosiI-transferasa, dicho substrato es glucosa, dicho inductor es isopropil ß-D-tiogalactósido (IPTG); dicho precursor es alil-ß-D-galactopiranósido. 38.- El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 31 a 35, caracterizado además porque es para la producción de análogos de oligosacárido en los que el residuo de glucosa se reemplaza con un grupo alilo, caracterizado porque dicho precursor es alil-ß-D-galactósido. 39.- El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 38, caracterizado además porque es para producir oligosacárido marcado con al menos un isótopo, caracterizado porque dicha célula se cultivan sobre dicho sustrato basado en carbono con dicho isótopo y/o en la presencia de dicho precursor marcado con dicho isótopo. 40.- El oligosacárido que puede obtenerse mediante el método que se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 39. 41.- El oligosacárido que puede obtenerse mediante el método que se reclama en con cualesquiera de las reivindicaciones 17, 19, 36 y 37, caracterizado además porque el doble enlace del grupo alilo de dicho oligosacárido esta químicamente modificado mediante las reacciones de adición, oxidación u ozonolisis para formar oligosacáridos activados que pueden utilizarse para la síntesis química de glucoconjugados o glucoproteínas. 42.- El oligosacárido de conformidad con la reivindicación 40 o 41 , caracterizado además porque se utiliza como un producto medicinal 43.- El oligosacárido de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado además porque se utiliza como un producto medicinal pretendido para prevenir selectivamente la adhesión de moléculas biológicas. 44.- El oligosacárido de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado además por que se utiliza como un producto pretendido para tratar cáncer, inflamación, enfermedades cardiacas, diabetes, infecciones bacterianas, infecciones virales y enfermedades neurológicas e injertos. 45.-Una composición farmacéutica, caracterizada por que comprende un oligosacárido como se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 42 a 44 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 46.- El uso agricultural o agronómico de un oligosacárido como se reclama en la reivindicación 40 o 41 , caracterizado además porque es especialmente para el crecimiento y defensa de plantas.