CN107108677B - Hmo的混合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种人乳低聚糖的混合物，该组合物基本上由以下组成：a)组分A，其为3‑FL或DFL；组分B，其为LNT、LNnT、LNFP‑I或2’‑FL；组分C，其当组分B为LNT时为LNFP‑II，或当组分B为LNnT时为LNFP‑III，或当组分B为LNFP‑I时为LNDFH‑I，或当组分B为2’‑FL时为DFL；以及组分D，其当组分A为3‑FL时为乳糖，或当组分A为DFL时为2’‑FL；其条件是如果组分B为2’‑FL，则组分A为3‑FL；或者该组合物基本上由以下组成：b)3‑FL；组分E，其为LNT、LNnT或LNFP‑I；以及组分F，其当组分E为LNT时为LNFP‑II，或当组分E为LNnT时为LNFP‑III，或当组分E为LNFP‑I时为LNDFH‑I；并且本发明涉及制备它们的方法及它们的用途。

Description

HMO的混合物
技术领域
本发明涉及人乳低聚糖(“HMO”)的混合物、制备该混合物的方法以及该混合物在人健康中的应用。
背景技术
HMO已经成为近年来极为关注的课题，因为其在人有机体中发生的许多生物学过程中发挥作用。哺乳动物乳汁包含这些复合低聚糖中的至少130种(Urashima等人，MilkOligosaccharides，Nova Biomedical Books，New York，2011，ISBN：978-1-61122-831-1)。
此前，HMO的唯一来源是主要包含水、以及55-70g/l乳糖、24-59g/l脂质、约13g/l蛋白质、5-15g/l HMO和约1.5g/l矿物质的哺乳动物乳汁。
然而，在过去十年中，开发用于合成这些低聚糖的方法的努力显著增加，因为其在许多人生物学过程中发挥作用。在这方面，已经开发出通过微生物发酵、酶法、化学合成或这些技术的组合来制备HMO的方法。例如，通过化学方法，可如WO 2011/100980和WO 2013/044928中所述制备LNnT，可如WO 2012/155916和WO 2013/044928中所述合成LNT，可如WO2013/091660中所述制备LNT和LNnT的混合物，可如WO 2010/115934和WO 2010/115935中所述制备2’-FL，可如WO 2013/139344中所述制备3-FL，且可如WO 2010/100979中所述制备6’-SL及其盐。作为生物技术方法的实例，WO 01/04341和WO 2007/101862描述了如何使用基因改造的大肠杆菌(E.coli)制备任选由岩藻糖或唾液酸取代的核心人乳低聚糖。WO2012/158517和WO 2013/154725描述了包含3-FL、2’-FL和DFL的益生元组合物并且WO2012/112777的描述了在基因改造的大肠杆菌中制备的3-FL、2’-FL、DFL和乳糖的混合物。作为酶法的一个实例，可如EP-A-577580中所述制备唾液酸化低聚糖。
还已经致力于开发用于酶合成HMO低聚糖的混合物，而不必如WO 2012/156897和WO 2012/156898中所述合成混合物的所有低聚糖组分的方法。这些方法已经提供了包含多种不同低聚糖的反应混合物。
然而，仍在寻求更好的用于合成HMO的混合物的方法。
有证据表明，人消化道中称为微生物组(microbiome)的微生物的定居群落在健康和疾病中起着重要作用。当微生物组的正常组成失去平衡时，人宿主可能会遭受后果。最近的研究涉及到例如癌症、肥胖、炎性肠病、银屑病、哮喘、以及甚至可能是自闭症的多种疾病中的微生物组的失衡。据信HMO积极地调节微生物组，并且将它们用于此目的越来越感兴趣。然而，HMO的显著多样性，加上缺乏可得性，已经阻碍对各个HMO的特定功能的研究。明确需要特定的HMO或HMO的组合从而以期望的方式调节微生物组，以便解决特定的人健康问题。
发明内容
本发明的第一方面涉及一种HMO的混合物，其基本上由以下组成：
-组分A，其为3-FL或DFL，
-组分B，其为LNT、LNnT、LNFP-I或2’-FL，
-组分C，其：
当组分B为LNT时为LNFP-II，或
当组分B为LNnT时为LNFP-III，或
当组分B为LNFP-I时为LNDFH-I，或
当组分B为2’-FL时为DFL，以及
-组分D，其：
当组分A为3-FL时为乳糖，或
当组分A为DFL时为2’-FL，
其条件是如果组分B为2’-FL，则组分A为3-FL。优选地，在第一方面的HMO混合物中，组分A为DFL。
本发明的第二方面涉及一种HMO的混合物，其基本上由以下组成：
-3-FL，
-组分E，其为LNT、LNnT或LNFP-I，以及
-组分F，其
当组分E为LNT时为LNFP-II，或
当组分E为LNnT时为LNFP-III，或
当组分E为LNFP-I时为LNDFH-I。
本发明的第三方面涉及一种用于制备根据第一方面的HMO的混合物的方法，其通过在α1-3/4岩藻糖苷转移酶的存在下，使组分A和组分B进行反应以制备包含组分A、B、C和D的反应混合物，然后从反应混合物中除去α1-3/4岩藻糖苷转移酶。
本发明的第四方面涉及一种用于获得HMO的混合物的方法，该HMO的混合物基本上由以下组成：
-3-FL，
-组分B，其为LNT、LNnT、LNFP-I或2’-FL，以及
-组分C，其
当组分C为LNT时为LNFP-II，或
当组分C为LNnT时为LNFP-III，或
当组分C为LNFP-I时为LNDFH-I，或
当组分C为2’-FL时为DFL，
优选第二方面的混合物，该方法包括以下步骤：在α1-3/4岩藻糖苷转移酶的存在下，使3-FL和组分B进行反应，以制备包含3-FL、乳糖和组分B和C的反应混合物，然后从反应混合物中除去乳糖和α1-3/4岩藻糖苷转移酶。
本发明的第五方面涉及一种用于治疗细菌感染的抗感染组合物。该组合物包括，优选基本上由以下组成：
-DFL
-组分E，其为LNT、LNnT或LNFP-I，
-组分F，其：
当组分E为LNT时为LNFP-II，或
当组分E为LNnT时为LNFP-III，或
当组分E为LNFP-I时为LNDFH-I，以及
-2’-FL，
或者
-3-FL，
-组分B，其为LNT、LNnT、LNFP-I或2’-FL，以及
-组分C，其：
当组分B为LNT时为LNFP-II，或
当组分B为LNnT时为LNFP-III，或
当组分B为LNFP-I时为LNDFH-I，或
当组分B为2’-FL时为DFL；
或者该组合物基本上由以下组成：
-3-FL，
-组分B，其为LNT、LNnT、LNFP-I或2’-FL，
-组分C，其：
当组分B为LNT时为LNFP-II，或
当组分B为LNnT时为LNFP-III，或
当组分B为LNFP-I时为LNDFH-I，或
当组分B为2’-FL时为DFL，以及
-乳糖。
这些抗感染组合物中的每一种都包含多种具有新的性质和生物活性组合的不同HMO。具体来说，各种组合物可以增加人微生物组中的双歧杆菌(Bifidobacterium)丰度(abundance)和Barnesiella丰度。优选地，各种组合物可以减少人微生物组中的厚壁菌(Firmicutes)丰度，特别是梭状芽孢杆菌(Clostridia)。各种组合物也可用于治疗和/或降低人广泛范围的细菌感染的风险。
本发明的第六方面涉及一种调节人微生物组以增加双歧杆菌丰度和Barnesiella丰度的方法，优选通过减少厚壁菌丰度，特别是梭状芽孢杆菌。
本发明的第七方面涉及一种预防或治疗人细菌感染的方法，特别是抗生素耐药性细菌感染。
第六和第七方面的方法各自包括向人施用：
i)一种组合物，其包括，优选基本上由以下组成：
-3-FL，
-组分B，其为LNT、LNnT、LNFP-I或2’-FL，以及
-组分C，其：
当组分B为LNT时为LNFP-II，或
当组分B为LNnT时为LNFP-III，或
当组分B为LNFP-I时为LNDFH-I，或
当组分B为2’-FL时为DFL；
或者
ii)一种组合物，其基本上由以下组成：
-3-FL，
-组分B，其为LNT、LNnT、LNFP-I或2’-FL，以及
-组分C，其：
当组分B为LNT时为LNFP-II，或
当组分B为LNnT时为LNFP-III，或
当组分B为LNFP-I时为LNDFH-I，或
当组分B为2’-FL时为DFL；以及
-乳糖；
或者iii)一种组合物，其包括，优选基本上由以下组成：
-DFL
-组分E，其为LNT、LNnT或LNFP-I，
-岩藻糖基化组分F，其：
当组分E为LNT时为LNFP-II，或
当组分E为LNnT时为LNFP-III，或
当组分E为LNFP-I时为LNDFH-I，以及
-2’-FL。
具体实施方式
根据本发明，已经令人意外地发现，HMO的混合物可以提供用于通过微生物组的特定调节来治疗细菌感染的抗感染组合物。该混合物增加微生物组的双歧杆菌丰度和Barnesiella丰度。该混合物还减少微生物组的厚壁菌丰度；特别是梭状芽孢杆菌。在其微生物组中具有增加的双歧杆菌和Barnesiella丰度的人对广泛范围的感染具有更强的抵抗力，并且从这些感染(包括抗生素耐药性感染)中恢复得更快。据信这种改善的抵抗力是由于微生物组的变化。归因于这种混合物的微生物中厚壁菌尤其是梭状芽孢杆菌的减少提供了额外的健康益处。
本发明的第一方面
第一方面为一种HMO的混合物，其基本上由以下组成：
-组分A，其为3-FL或DFL，
-组分B，其为LNT、LNnT、LNFP-I或2’-FL，
-组分C，其：
当组分B为LNT时为LNFP-II，或
当组分B为LNnT时为LNFP-III，或
当组分B为LNFP-I时为LNDFH-I，或
当组分B为2’-FL时为DFL，以及
-组分D，其：
当组分A为3-FL时为乳糖，或
当组分A为DFL时为2’-FL，
其条件是如果组分B为2’-FL，则组分A为3-FL。
在该第一方面的混合物的优选实施方式中，组分A为3-FL。更优选(3-FL+组分B)相对于组分C的摩尔比为0.8-9.50，并且乳糖与组分C的摩尔比为约1。甚至更优选的是，3-FL与组分B的摩尔比为0.07-7.7。特别是在基本上由3-FL、2’-FL、DFL和乳糖组成的混合物中，3-FL与2’-FL的摩尔比为0.05-7.7。
在该第一方面的混合物的另一优选实施方式中，组分A为3-FL，并且组分B为LNT或LNnT。优选地，3-FL与组分C的摩尔比和组分B与组分C的摩尔比中之一不大于2。
根据该第一方面，特别优选的是：
i)基本上由3-FL、LNT、LNFP-II和乳糖组成的HMO的混合物，并且其中：
-(3-FL+LNT)相对于LNFP-II的摩尔比为0.8-9.5，并且
-乳糖相对于LNFP-II的摩尔比为约1，
其条件是3-FL与LNFP-II的摩尔比和LNT与LNFP-II的摩尔比中之一不大于2；和
ii)基本上由3-FL、LNnT、LNFP-III和乳糖组成的HMO的混合物，并且其中：
-(3-FL+LNnT)相对于LNFP-III的摩尔比为0.8-9.5，并且
-乳糖相对于LNFP-III的摩尔比为约1，
其条件是3-FL与LNFP-III的摩尔比和LNnT与LNFP-III的摩尔比中之一不大于2。
在第一方面的混合物的另一个优选实施方式中，组分A为3-FL，并且组分B为LNFP-I或2’-FL。优选地，3-FL与组分C的摩尔比和组分B与组分C的摩尔比中之一不大于2，且/或3-FL与组分B的摩尔比为0.07-7.7。
特别优选的是基本上由3-FL、LNFP-I、LNDFH-I和乳糖组成的HMO的混合物。优选地，在该HMO混合物中：
-(3-FL+LNFP-I)相对于LNDFH-I的摩尔比为0.8-9.5，并且
-乳糖相对于LNDFH-I的摩尔比为约1；
并且更优选在该混合物中：
-3-FL与LNDFH-I的摩尔比和LNFP-I与LNDFH-I的摩尔比中之一不大于2。
同样根据该第一方面，特别优选的是基本上由3-FL、2’-FL、DFL和乳糖组成的HMO的混合物。优选地，在该混合物中：
-(3-FL+2’-FL)相对于DFL的摩尔比为0.8-9.5，并且
-乳糖相对于DFL的摩尔比为约1。
更优选地，该混合物中3-FL与2’-FL的摩尔比为0.05-7.7或0.07-7.7。还更优选地，3-FL与DFL的摩尔比或2’-FL与DFL的摩尔比不大于2。
在第一方面的混合物的另一优选实施方式中，组分A为DFL。优选地，组分C相对于(DFL+组分B)的摩尔比为至少1：10，优选为至少1：7，更优选为至少1：5，甚至更优选为至少1：3。还优选地，DFL相对于组分B的摩尔比为0.17-6，优选为0.25-4，更优选为约1。
该第一方面的混合物可以基本上由2’-FL、DFL、LNT和LNFP-II组成。优选该HMO混合物中LNFP-II相对于(DFL+LNT)的摩尔比为至少1：10，更优选为至少1：7，甚至更优选为至少1：5，特别是1：3。还优选该HMO混合物中DFL相对于LNT的摩尔比为0.17-6，优选为0.25-4，更优选为约1。还优选地，该混合物中2’-FL相对于LNFP-II的摩尔比为约1。
第一方面的混合物也可以基本上由2’-FL、DFL、LNnT和LNFP-III组成。优选该HMO混合物中LNFP-III相对于(DFL+LNnT)的摩尔比为至少1：10，更优选为至少1：7，甚至更优选为至少1：5，特别是1：3。还优选该HMO混合物中DFL相对于LNnT的摩尔比为0.17-6，优选为0.25-4，更优选为约1。还优选地，该混合物中2’-FL相对于LNFP-III的摩尔比为约1。
第一方面的混合物也可以基本上由2’-FL、DFL、LNFP-I和LNDFH-I组成。优选该HMO混合物中LNDFH-I相对于(DFL+LNFP-I)的摩尔比为至少1：10，更优选为至少1：7，甚至更优选为至少1：5，特别是1：3。还优选该HMO混合物中DFL相对于LNFP-I的摩尔比为0.17-6，优选为0.25-4，更优选为约1。还优选地，该混合物中2’-FL相对于LNDFH-I的摩尔比为约1。
本发明的第二方面
第二方面为一种HMO的混合物，其基本上由以下组成：
-3-FL，
-组分E，其为LNT、LNnT或LNFP-I，以及
-组分F，其
当组分E为LNT时为LNFP-II，或
当组分E为LNnT时为LNFP-III，或
当组分E为LNFP-I时为LNDFH-I。
优选地，组分F相对于(3-FL+组分E)的摩尔比为至少1：10，优选为至少1：7，更优选为至少1：5，甚至更优选为至少1：3，且/或3-FL相对于组分E的摩尔比为0.05-21，优选为0.13-7.7，更优选为约1。
第二方面的混合物可以基本上由3-FL、LNT和LNFP-II组成。优选该HMO混合物中LNFP-II相对于(3-FL+LNT)的摩尔比为至少1：10，更优选为至少1：7，甚至更优选为至少1：5，特别是1：3。还优选该HMO混合物中3-FL相对于LNT的摩尔比为0.05-21，优选为0.13-7.7，更优选为约1。
第二方面的混合物也可以基本上由3-FL、LNnT和LNFP-III组成。优选该HMO混合物中LNFP-III相对于(3-FL+LNnT)的摩尔比为至少1：10，更优选为至少1：7，甚至更优选为至少1：5，特别是1：3。还优选该HMO混合物中3-FL相对于LNnT的摩尔比为0.05-21，优选为0.13-7.7，更优选为约1。
第二方面的混合物也可以基本上由3-FL、LNFP-I和LNDFH-I组成。优选该HMO混合物中LNDFH-I相对于(3-FL+LNFP-I)的摩尔比为至少1：10，更优选为至少1：7，甚至更优选为至少1：5，特别是1：3。还优选该HMO混合物中3-FL相对于LNFP-I的摩尔比为0.05-21，优选为0.13-7.7，更优选为约1。
本发明的第三方面
第三方面为用于获得包括其优选的和更优选的实施方式的本发明的第一方面的混合物的方法，包括以下步骤：在α1-3/4岩藻糖苷转移酶的存在下，使组分A和组分B进行反应，以制备包含组分A、B、C和D的反应混合物，然后从反应混合物中除去α1-3/4岩藻糖苷转移酶。可以以常规方式除去α1-3/4岩藻糖苷转移酶，例如通过使反应混合物变性，然后离心或超滤。
在进行本发明第三方面的方法中，组分A供体、组分B受体、α1-3/4岩藻糖苷转移酶、水性溶剂和孵育缓冲液(例如50mM Na3PO4或100mM KHPO4)的具体相对浓度不是关键的。在这方面，该方法可以适当地在室温(例如15-50℃、优选20-37℃)下在pH为6-8、优选6.5-7下进行15分钟至24小时。
以DFL为组分A进行的第三方面的方法
该方法包括：在α1-3/4岩藻糖苷转移酶的存在下，使作为供体的DFL和作为受体的组分B以1：5至5：1、优选为1：3至3：1、更优选为1：2至2：1、甚至更优选为1：1的摩尔比进行反应，所述α1-3/4岩藻糖苷转移酶对于DFL和组分B的反应的转化率为至少10％至多约60％、优选为至少20％、更优选为至少30％。
本发明的HMO混合物可以通过这种方法通过用α1-3/4岩藻糖苷转移酶处理DFL和LNT以制备反应混合物，然后从反应混合物中除去α1-3/4岩藻糖苷转移酶来容易地获得。该方法优选包括以下步骤：使DFL和LNT以优选为1：5至5：1、更优选为1：3至3：1、甚至更优选为1：2至2：1、再甚至更优选为1：1的摩尔比与α1-3/4岩藻糖苷转移酶接触，所述α1-3/4岩藻糖苷转移酶对于DFL与LNT的反应的转化率为至少10％至多约60％、优选为至少15％、更优选为至少20％、甚至更优选为至少25％、还更优选为至少30％。然后将所制备的包含LNFP-II、2’-FL、未反应的DFL、LNT和α1-3/4岩藻糖苷转移酶的反应混合物进行常规纯化步骤以除去α1-3/4岩藻糖苷转移酶。例如可以通过变性然后离心或超滤来除去α1-3/4岩藻糖苷转移酶，以制备基本上由DFL、LNT、LNFP-II和2’-FL组成的混合物。
在以“当…进行[...]方法时”开始的以下语句中，表述“可以制备”等同于表述“获得”。
当以DFL与LNT的摩尔比为2：1至1：2并且转化率为20～50％进行本发明的方法时，可以制备(DFL+LNT)与LNFP-II的摩尔比为2-13并且DFL与LNT的摩尔比为0.33-6的HMO混合物。
当以DFL与LNT的摩尔比为1：1并且转化率为20-50％进行该方法时，可以制备(DFL+LNT)与LNFP-II的摩尔比为2-8并且DFL与LNT的摩尔比为1的HMO混合物。
当以DFL与LNT的摩尔比为3：1至1：3并且转化率为30-50％进行该方法时，可以制备(DFL+LNT)与LNFP-II的摩尔比为2-12并且DFL与LNT的摩尔比为0.2-5的HMO混合物。
当以DFL与LNT的摩尔比为2：1至1：2并且转化率为30-50％进行该方法时，可以制备(DFL+LNT)与LNFP-II的摩尔比为2-8并且DFL与LNT的摩尔比为0.33-3的HMO混合物。
当以DFL与LNT的摩尔比为1：1并且转化率为30-50％进行该方法时，可以制备(DFL+LNT)与LNFP-II的摩尔比为2-4.67并且DFL与LNT的摩尔比为1的HMO混合物。
当以DFL与LNT的摩尔比为3：1至1：3并且转化率为20-40％进行该方法时，可以制备(DFL+LNT)与LNFP-II的摩尔比为3-18并且DFL与LNT的摩尔比为0.23-4.33的HMO混合物。
当以DFL与LNT的摩尔比为2：1至1：2并且转化率为20-40％进行该方法时，可以制备(DFL+LNT)与LNFP-II的摩尔比为3-13并且DFL与LNT的摩尔比为0.38-2.67的HMO混合物。
当以DFL与LNT的摩尔比为1：1并且转化率为20-40％进行该方法时，可以制备(DFL+LNT)与LNFP-II的摩尔比为3-8并且DFL与LNT的摩尔比为1的HMO混合物。
当以DFL与LNT的摩尔比为3：1至2：1并且转化率为30-50％进行该方法时，可以制备(DFL+LNT)与LNFP-II的摩尔比为4-11.3并且DFL与LNT的摩尔比为2.5-5的HMO混合物。
当以DFL与LNT的摩尔比为2：1至1：1并且转化率为20-40％进行该方法时，可以制备(DFL+LNT)与LNFP-II的摩尔比为3-13并且DFL与LNT的摩尔比为1-2.67的HMO混合物。
当以DFL与LNT的摩尔比为1：1至1：2并且转化率为20-40％进行该方法时，可以制备(DFL+LNT)与LNFP-II的摩尔比为3-13并且DFL与LNT的摩尔比为0.38-1的HMO混合物。
当以DFL与LNT的摩尔比为1：2至1：3并且转化率为30-50％进行该方法时，可以制备(DFL+LNT)与LNFP-II的摩尔比为4-11.3并且DFL与LNT的摩尔比为0.2-0.41的HMO混合物。
本发明的HMO混合物也可以通过这种方法通过用α1-3/4岩藻糖苷转移酶处理DFL供体和LNnT以制备反应混合物，然后从反应混合物中除去α1-3/4岩藻糖苷转移酶来容易地获得。该方法优选包括以下步骤：使DFL和LNnT以优选为1：5至5：1、更优选为1：3至3：1、甚至更优选为1：2至2：1、再甚至更优选为1：1的摩尔比与α1-3/4岩藻糖苷转移酶接触，所述α1-3/4岩藻糖苷转移酶对于DFL与LNnT的反应的转化率为至少10％至多约60％、优选为至少15％、更优选为至少20％、甚至更优选为至少25％、还更优选为至少30％。然后将所制备的包含LNFP-III、2’-FL、未反应的DFL、LNnT和α1-3/4岩藻糖苷转移酶的反应混合物进行常规纯化步骤以除去α1-3/4岩藻糖苷转移酶。例如可以通过变性，然后离心或超滤来除去α1-3/4岩藻糖苷转移酶，以制备基本上由DFL、LNnT、LNFP-III和2’-FL组成的混合物。
在以“当…进行[...]方法时”开始的以下语句中，表述“可以制备”等同于表述“获得”。
当以DFL与LNnT的摩尔比为2：1至1：2并且转化率为20-50％进行本发明的方法时，可以制备(DFL+LNnT)与LNFP-III的摩尔比为2-13并且DFL与LNnT的摩尔比为0.33-6的HMO混合物。
当以DFL与LNnT的摩尔比为1：1并且转化率为20-50％进行该方法时，可以制备(DFL+LNnT)与LNFP-III的摩尔比为2-8并且DFL与LNnT的摩尔比为1的HMO混合物。
当以DFL与LNnT的摩尔比为3：1至1：3并且转化率为30-50％进行该方法时，可以制备(DFL+LNnT)与LNFP-III的摩尔比为2-12并且DFL与LNnT的摩尔比为0.2-5的HMO混合物。
当以DFL与LNnT的摩尔比为2：1至1：2并且转化率为30-50％进行该方法时，可以制备(DFL+LNnT)与LNFP-III摩尔比为2-8并且DFL与LNnT的摩尔比为0.33-3的HMO混合物。
当以DFL与LNnT的摩尔比为1：1并且转化率为30-50％进行该方法时，可以制备(DFL+LNnT)与LNFP-III的摩尔比为2-4.67并且DFL与LNnT的摩尔比为1的HMO混合物。
当以DFL与LNnT的摩尔比为3：1至1：3并且转化率为20-40％进行该方法时，可以制备(DFL+LNnT)与LNFP-III的摩尔比为3-18并且DFL与LNnT的摩尔比为0.23-4.33的HMO混合物。
当以DFL与LNnT的摩尔比为2：1至1：2并且转化率为20-40％进行该方法时，可以制备(DFL+LNnT)与LNFP-III的摩尔比为3-13并且DFL与LNnT的摩尔比为0.38-2.67的HMO混合物。
当以DFL与LNnT的摩尔比为1：1并且转化率为20-40％进行该方法时，可以制备(DFL+LNnT)与LNFP-III的摩尔比为3-8并且DFL与LNnT的摩尔比为1的HMO混合物。
当以DFL与LNnT的摩尔比为3：1至2：1并且转化率为30-50％进行该方法时，可以制备(DFL+LNnT)与LNFP-III的摩尔比为4-11.3并且DFL与LNnT的摩尔比为2.5-5的HMO混合物。
当以DFL与LNnT的摩尔比为2：1至1：1并且转化率为20-40％进行该方法时，可以制备(DFL+LNnT)与LNFP-III的摩尔比为3-13并且DFL与LNnT的摩尔比为1-2.67的HMO混合物。
当以DFL与LNnT的摩尔比为1：1至1：2并且转化率为20-40％进行该方法时，可以制备(DFL+LNnT)与LNFP-III的摩尔比为3-13并且DFL与LNnT的摩尔比为0.38-1的HMO混合物。
当以DFL与LNnT的摩尔比为1：2至1：3并且转化率为30-50％进行该方法时，可以制备(DFL+LNnT)与LNFP-III的摩尔比为4-11.3并且DFL与LNnT的摩尔比为0.2-0.41的HMO混合物。
本发明的HMO混合物也可以通过这种方法通过用α1-3/4岩藻糖苷转移酶处理DFL和LNFP-I以制备反应混合物，然后从反应混合物中除去α1-3/4岩藻糖苷转移酶来容易地获得。该方法优选包括以下步骤：使DFL和LNFP-I以优选为1：5至5：1、更优选为1：3至3：1、甚至更优选为1：2至2：1、甚至更优选为1：1的摩尔比与α1-3/4岩藻糖苷转移酶接触，所述α1-3/4岩藻糖苷转移酶对于DFL与LNFP-I的反应的转化率为至少10％至多约60％、优选为至少15％、更优选为至少20％、甚至更优选为至少25％、还更优选为至少30％。然后将所制备的包含LNDFH-I、2’-FL、未反应的DFL、LNFP-I和α1-3/4岩藻糖苷转移酶的反应混合物进行常规纯化步骤以除去α1-3/4岩藻糖苷转移酶。例如可以通过变性，然后离心或超滤来除去α1-3/4岩藻糖苷转移酶，以制备基本上由DFL、LNFP-I、LNDFH-I和2’-FL组成的混合物。
在以“当…进行[...]方法时”开始的以下语句中，表述“可以制备”等同于表述“获得”。
当以DFL与LNFP-I的摩尔比为2：1至1：2并且转化率为20-50％进行本发明的方法时，可以制备(DFL+LNFP-I)与LNDFH-I的摩尔比为2-13并且DFL与LNFP-I的摩尔比为0.33-6的HMO混合物。
当以DFL与LNFP-I的摩尔比为1：1并且转化率为20-50％进行该方法时，可以制备(DFL+LNFP-I)与LNDFH-I的摩尔比为2-8并且DFL与LNFP-I的摩尔比为1的HMO混合物。
当以DFL与LNFP-I的摩尔比为3：1至1：3并且转化率为30-50％进行该方法时，可以制备(DFL+LNFP-I)与LNDFH-I的摩尔比为2-12并且DFL与LNFP-I的摩尔比为0.2-5的HMO混合物。
当以DFL与LNFP-I的摩尔比为2：1至1：2并且转化率为30-50％进行该方法时，可以制备(DFL+LNFP-I)与LNDFH-I的摩尔比为2-8并且DFL与LNFP-I的摩尔比为0.33-3的HMO混合物。
当以DFL与LNFP-I的摩尔比为1：1并且转化率为30-50％进行该方法时，可以制备(DFL+LNFP-I)与LNDFH-I的摩尔比为2-4.67并且DFL与LNFP-I的摩尔比为1的HMO混合物。
当以DFL与LNFP-I的摩尔比为3：1至1：3并且转化率为20-40％进行该方法时，可以制备(DFL+LNFP-I)与LNDFH-I的摩尔比为3-18并且DFL与LNFP-I的摩尔比为0.23-4.33的HMO混合物。
当以DFL与LNFP-I的摩尔比为2：1至1：2并且转化率为20-40％进行该方法时，可以制备(DFL+LNFP-I)与LNDFH-I的摩尔比为3-13并且DFL与LNFP-I的摩尔比为0.38-2.67的HMO混合物。
当以DFL与LNFP-I的摩尔比为1：1并且转化率为20-40％进行该方法时，可以制备(DFL+LNFP-I)与LNDFH-I的摩尔比为3-8并且DFL与LNFP-I的摩尔比为1的HMO混合物。
当以DFL与LNFP-I的摩尔比为3：1至2：1并且转化率为30-50％进行该方法时，可以制备(DFL+LNFP-I)与LNDFH-I的摩尔比为4-11.3并且DFL与LNFP-I的摩尔比为2.5-5的HMO混合物。
当以DFL与LNFP-I的摩尔比为2：1至1：1并且转化率为20-40％进行该方法时，可以制备(DFL+LNFP-I)与LNDFH-I的摩尔比为3-13并且DFL与LNFP-I的摩尔比为1-2.67的HMO混合物。
当以DFL与LNFP-I的摩尔比为1：1至1：2并且转化率为20-40％进行该方法时，可以制备(DFL+LNFP-I)与LNDFH-I的摩尔比为3-13并且DFL与LNFP-I的摩尔比为0.38-1的HMO混合物。
当以DFL与LNFP-I的摩尔比为1：2至1：3并且转化率为30-50％进行该方法时，可以制备(DFL+LNFP-I)与LNDFH-I的摩尔比为4-11.3并且DFL与LNFP-I的摩尔比为0.2-0.41的HMO混合物。
以3-FL作为组分A进行的第三方面的方法
另外可选地，第三方面的方法可以在α1-3/4岩藻糖苷转移酶的存在下，以3-FL作为供体且组分B作为受体以1：5至5：1、优选为1：3至3：1、更优选为1：2至2：1、甚至更优选为1：1的摩尔比来进行，所述α1-3/4岩藻糖苷转移酶对于3-FL和组分B的反应的转化率为至少35％至多约80％、优选为至少40％、更优选为至少50％。然后将所制备的反应混合物进行常规纯化步骤以除去α1-3/4岩藻糖苷转移酶。例如可以通过变性，然后离心或超滤来除去α1-3/4岩藻糖苷转移酶。
在第三方面的另外可选方法的优选实施方式中，本发明的HMO混合物可以通过用α1-3/4岩藻糖苷转移酶处理3-FL和LNFP-I或2’-FL以制备反应混合物，然后从反应混合物中除去α1-3/4岩藻糖苷转移酶来容易地获得。该方法优选包括以下步骤：使3-FL和LNFP-I或2’-FL以1：3至3：1、优选为1：2至2：1、更优选为1：1的摩尔比与α1-3/4岩藻糖苷转移酶接触，所述α1-3/4岩藻糖苷转移酶对于3-FL与LNFP-I或2’-FL的反应的转化率为至少35％至多约70％、优选为至少40％、更优选为至少50％。
在更优选的实施方式中，基本上由3-FL、LNFP-I、LNDFH-I和乳糖组成的HMO混合物可以通过用α1-3/4岩藻糖苷转移酶，处理摩尔比优选为1：5至5：1、更优选为1：3至3：1、甚至更优选为1：2至2：1、还甚至更优选为1：1的3-FL和LNFP-I来容易地获得，所述α1-3/4岩藻糖苷转移酶对于3-FL与LNFP-I的反应的转化率为至少35％至多约70％、优选为至少40％、更优选为至少50％。
在另一个更优选的实施方式中，基本上由3-FL、2’-FL、DFL和乳糖组成的HMO混合物可以通过用α1-3/4岩藻糖苷转移酶，处理摩尔比优选为1：5至5：1、更优选为1：3至3：1、甚至更优选为1：2至2：1、还甚至更优选为1：1的3-FL和2’-FL来容易地获得，所述α1-3/4岩藻糖苷转移酶对于3-FL与2’-FL的反应的转化率为至少10％至多约70％、优选为至少20％、更优选为至少35％、甚至更优选为至少40％、还更优选为至少50％。
在第三方面的另外可选方法的另一个优选实施方式中，本发明的HMO混合物可以通过用α1-3/4岩藻糖苷转移酶处理3-FL和LNT或LNnT以制备反应混合物，然后从反应混合物中除去α1-3/4岩藻糖苷转移酶来容易地获得。该方法优选包括：在α1-3/4岩藻糖苷转移酶的存在下，使3-FL和LNT或LNnT以1：3至3：1、优选为1：2至2：1、更优选为1：1的摩尔比进行反应，所述α1-3/4岩藻糖苷转移酶对于3-FL与LNT或LNnT的反应的转化率为至少35％至多约70％、优选为至少40％、更优选为至少50％。
在更优选的实施方式中，HMO混合物可以通过用α1-3/4岩藻糖苷转移酶，处理摩尔比优选为1：5至5：1、更优选为1：3至3：1、甚至更优选为1：2至2：1、甚至更优选为1：1的3-FL和LNT来容易地获得，所述α1-3/4岩藻糖苷转移酶对于3-FL与LNT的反应的转化率为至少35％至多约70％、优选为至少40％、更优选为至少50％，该HMO混合物基本上由3-FL、LNT、LNFP-II和乳糖组成的HMO混合物，并且其中：
-(3-FL+LNT)相对于LNFP-II的摩尔比为0.8-9.5，并且
-乳糖相对于LNFP-II的摩尔比为约1，
其条件是3-FL与LNFP-II的摩尔比和LNT与LNFP-II的摩尔比中之一不大于2。
在另一个更优选的实施方式中，HMO混合物可以通过用α1-3/4岩藻糖苷转移酶，处理摩尔比优选为1：5至5：1、更优选为1：3至3：1、甚至更优选为1：2至2：1、甚至更优选为1：1的3-FL和LNnT来获得，所述α1-3/4岩藻糖苷转移酶对于3-FL与LNnT的反应的转化率为至少35％至多约70％、优选为至少40％、更优选为至少50％，该HMO混合物基本上由3-FL、LNnT、LNFP-III和乳糖组成，并且其中：
-(3-FL+LNnT)相对于LNFP-III的摩尔比为0.8-9.5，并且
-乳糖相对于LNFP-III的摩尔比为约1，
其条件是3-FL与LNFP-III的摩尔比和LNnT与LNFP-III的摩尔比中之一不大于2。
本发明的第四方面
第四方面为一种用于获得HMO的混合物的方法，所述HMO的混合物基本上由以下组成：
-3-FL，
-组分B，其为LNT、LNnT、LNFP-I或2’-FL，以及
-组分C，其
当组分B为LNT时为LNFP-II，或
当组分B为LNnT时为LNFP-III，或
当组分B为LNFP-I时为LNDFH-I，或
当组分B为2’-FL时为DFL，
优选为第二方面的混合物，包括其优选的和更优选的实施方式，所述方法包括以下步骤：在α1-3/4岩藻糖苷转移酶的存在下，使作为供体的3-FL和作为受体的组分B进行反应以制备反应混合物，然后从反应混合物中除去乳糖和α1-3/4岩藻糖苷转移酶。例如可以通过变性，然后离心或超滤来除去α1-3/4岩藻糖苷转移酶。例如可以通过级联超滤和/或纳滤将乳糖从3-FL、组分B和组分C中分离，或可以首先用乳糖酶处理乳糖以将其降解成葡萄糖和半乳糖，然后可以将它们通过超滤和/或纳滤从3-FL、组分B和组分C中分离。
在进行本发明第四方面的方法中，3-FL供体、组分B受体、α1-3/4岩藻糖苷转移酶、水性溶剂和孵育缓冲液(例如50mM Na3PO4或100mM KHPO4)的具体相对浓度并不是关键的。在这方面，该方法可以适当地在室温(例如15-50℃、优选20-37℃)下在pH为6-8、优选6.5-7下进行15分钟至24小时。
该方法优选包括以下步骤：在α1-3/4岩藻糖苷转移酶的存在下，使3-FL和组分B以1：5至5：1、优选为1：3至3：1、更优选为1：2至2：1、甚至更优选为1：1的摩尔比进行反应，所述α1-3/4岩藻糖苷转移酶对于3-FL和组分B的反应的转化率为至少35％至多约80％、优选为至少40％、更优选为至少50％。
在第四方面的方法的优选实施方式中，基本上由3-FL、LNT和LNFP-II组成的HMO混合物可以通过用α1-3/4岩藻糖苷转移酶处理3-FL和LNT以制备反应混合物，然后如上所述从反应混合物中除去乳糖和α1-3/4岩藻糖苷转移酶来容易地获得。该方法优选包括以下步骤：使3-FL和LNT以优选为1：5至5：1、更优选为1：3至3：1、甚至更优选为1：2至2：1、还甚至更优选为1：1的摩尔比与α1-3/4岩藻糖苷转移酶接触，所述α1-3/4岩藻糖苷转移酶对于3-FL和LNT的反应的转化率为至少10％至多约70％、优选为至少20％、更优选为至少35％、甚至更优选为至少40％、还更优选为至少50％。然后可以如上所述从所制备的包含LNFP-II、乳糖、未反应的3-FL、LNT和α1-3/4岩藻糖苷转移酶的反应混合物中除去α1-3/4岩藻糖苷转移酶和乳糖。
在第四方面的方法的另一个优选实施方式中，基本上由3-FL、LNnT和LNFP-III组成的HMO混合物可以通过用α1-3/4岩藻糖苷转移酶处理3-FL和LNnT以制备反应混合物，然后如上所述从反应混合物中除去乳糖和α1-3/4岩藻糖苷转移酶来容易地获得。该方法优选包括以下步骤：使3-FL和LNnT以1：5至5：1、更优选为1：3至3：1、甚至更优选为1：2至2：1、还甚至更优选为1：1的摩尔比与α1-3/4岩藻糖苷转移酶接触，所述α1-3/4岩藻糖苷转移酶对于3-FL和LNnT的反应的转化率为至少10％至多约70％、优选为至少20％、更优选为至少35％、甚至更优选为至少40％、还更优选为至少50％。然后如上所述可以从所制备的包含LNFP-III、乳糖、未反应的3-FL、LNnT和α1-3/4岩藻糖苷转移酶的反应混合物中除去α1-3/4岩藻糖苷转移酶和乳糖。
在第四方面的方法的另一个优选实施方式中，基本上由3-FL、LNFP-I、LNDFH-I组成的HMO混合物可以通过用α1-3/4岩藻糖苷转移酶处理3-FL和LNFP-I以制备反应混合物，然后如上所述从反应混合物中除去乳糖和α1-3/4岩藻糖苷转移酶来容易地获得。该方法优选包括以下步骤：使3-FL和LNFP-I以优选为1：5至5：1、更优选为1：3至3：1、甚至更优选为1：2至2：1、还甚至更优选为1：1的摩尔比与α1-3/4岩藻糖苷转移酶接触，所述α1-3/4岩藻糖苷转移酶对于3-FL和LNFP-I的反应的转化率为至少10％至多约70％、优选为至少20％、更优选为至少35％、甚至更优选为至少40％、还更优选为至少50％。然后如上所述可以从所制备的包含LNDFH-I、乳糖、未反应的3-FL、LNFP-I和α1-3/4岩藻糖苷转移酶的反应混合物中除去α1-3/4岩藻糖苷转移酶和乳糖。
在第四方面的方法的又一个优选实施方式中，基本上由3-FL、2’-FL和DFL组成的HMO混合物可以通过用α1-3/4岩藻糖苷转移酶处理3-FL和2’-FL受体以制备包含DFL、乳糖、未反应的3-FL、2’-FL和α1-3/4岩藻糖苷转移酶的反应混合物来容易地获得。然后如上所述将混合物进行常规纯化步骤以除去乳糖和α1-3/4岩藻糖苷转移酶。所获得的该HMO混合物中DFL相对于(3-FL+2’-FL)的摩尔比优选为至少1：10、更优选为至少1：7、甚至更优选为至少1：5、特别是1：3。该HMO混合物中3-FL相对于2’-FL的摩尔比优选为0.05-21，更优选为0.13-7.7，甚至更优选为约1。
本发明特别优选的第三和第四方面
在以“当…进行[...]方法时”开始的以下语句中，表述“可以制备”等同于表述“获得”。
当以3-FL与LNT的摩尔比为2：1至1：2并且转化率为35-70％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNT、LNFP-II和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNT和LNFP-II组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNT)与LNFP-II的摩尔比为0.8-6.6并且3-FL与LNT的摩尔比为0.2-4.5。
当以3-FL与LNT的摩尔比为1：1并且转化率为35-70％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNT、LNFP-II和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNT和LNFP-II组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNT)与LNFP-II的摩尔比为0.8-3.8并且3-FL与LNT的摩尔比为1。
当以3-FL与LNT的摩尔比为3：1至1：3并且转化率为40-70％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNT、LNFP-II和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNT和LNFP-II组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNT)与LNFP-II的摩尔比为0.8-8并且3-FL与LNT的摩尔比为0.13-7.7。
当以3-FL与LNT的摩尔比为2：1至1：2并且转化率为40-70％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNT、LNFP-II和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNT和LNFP-II组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNT)与LNFP-II的摩尔比为0.8-5.5并且3-FL与LNT的摩尔比为0.2-4.5。
当以3-FL与LNT的摩尔比为1：1并且转化率为40-70％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNT、LNFP-II和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNT和LNFP-II组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNT)与LNFP-II的摩尔比为0.8-3并且3-FL与LNT的摩尔比为1。
当以3-FL与LNT的摩尔比为3：1至1：3并且转化率为50-70％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNT、LNFP-II和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNT和LNFP-II组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNT)与LNFP-II的摩尔比为0.8-6并且3-FL与LNT的摩尔比为0.13-7.7。
当以3-FL与LNT的摩尔比为2：1至1：2并且转化率为50-70％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNT、LNFP-II和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNT和LNFP-II组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNT)与LNFP-II的摩尔比为0.8-4并且3-FL与LNT的摩尔比为0.2-4.5。
当以3-FL与LNT的摩尔比为1：1并且转化率为50-70％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNT、LNFP-II和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNT和LNFP-II组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNT)与LNFP-II的摩尔比为0.8-2并且3-FL与LNT的摩尔比为1。
当以3-FL与LNT的摩尔比为3：1至1：3并且转化率为40-60％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNT、LNFP-II和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNT和LNFP-II组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNT)与LNFP-II的摩尔比为1.3-8并且3-FL与LNT的摩尔比为0.17-6。
当以3-FL与LNT的摩尔比为2：1至1：2并且转化率为40-60％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNT、LNFP-II和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNT和LNFP-II组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNT)与LNFP-II的摩尔比为2-6.6并且3-FL与LNT的摩尔比为0.25-3.5。
当以3-FL与LNT的摩尔比为1：1并且转化率为40-60％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNT、LNFP-II和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNT和LNFP-II组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNT)与LNFP-II的摩尔比为1.3-3并且3-FL与LNT的摩尔比为1。
当以3-FL与LNT的摩尔比为5：1至3：1并且转化率为50-80％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNT、LNFP-II和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNT和LNFP-II组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNT)与LNFP-II的摩尔比为3-10并且3-FL与LNT的摩尔比为5-21。
当以3-FL与LNT的摩尔比为3：1至2：1并且转化率为40-70％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNT、LNFP-II和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNT和LNFP-II组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNT)与LNFP-II的摩尔比为2-8并且3-FL与LNT的摩尔比为2.5-7.7。
当以3-FL与LNT的摩尔比为2：1至1：1并且转化率为35-55％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNT、LNFP-II和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNT和LNFP-II组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNT)与LNFP-II的摩尔比为1.6-6.6并且3-FL与LNT的摩尔比为1-3.3。
当以3-FL与LNT的摩尔比为1：1至1：2并且转化率为35-55％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNT、LNFP-II和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNT和LNFP-II组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNT)与LNFP-II的摩尔比为1.6-6.6并且3-FL与LNT的摩尔比为0.3-1。
当以3-FL与LNT的摩尔比为1：2至1：3并且转化率为40-70％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNT、LNFP-II和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNT和LNFP-II组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNT)与LNFP-II的摩尔比为2-8并且3-FL与LNT的摩尔比为0.13-0.4。
当以3-FL与LNT的摩尔比为1：3至1：5并且转化率为50-80％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNT、LNFP-II和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNT和LNFP-II组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNT)与LNFP-II的摩尔比为3-10并且3-FL与LNT的摩尔比为0.05-0.2。
当以3-FL与LNnT的摩尔比为2：1至1：2并且转化率为35-70％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNnT、LNFP-III和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNnT和LNFP-III组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNnT)与LNFP-III的摩尔比为0.8-6.6并且3-FL与LNnT的摩尔比为0.2-4.5。
当以3-FL与LNnT的摩尔比为1：1并且转化率为35-70％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNnT、LNFP-III和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNnT和LNFP-III组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNnT)与LNFP-III的摩尔比为0.8-3.8并且3-FL与LNnT的摩尔比为1。
当以3-FL与LNnT的摩尔比为3：1至1：3并且转化率为40-70％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNnT、LNFP-III和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNnT和LNFP-III组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNnT)与LNFP-III的摩尔比为0.8-8并且3-FL与LNnT的摩尔比为0.13-7.7。
当以3-FL与LNnT的摩尔比为2：1至1：2并且转化率为40-70％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNnT、LNFP-III和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNnT和LNFP-III组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNnT)与LNFP-III的摩尔比为0.8-5.5并且3-FL与LNnT的摩尔比为0.2-4.5。
当以3-FL与LNnT的摩尔比为1：1并且转化率为40-70％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNnT、LNFP-III和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNnT和LNFP-III组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNnT)与LNFP-III的摩尔比为0.8-3并且3-FL与LNnT的摩尔比为1。
当以3-FL与LNnT的摩尔比为3：1至1：3并且转化率为50-70％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNnT、LNFP-III和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNnT和LNFP-III组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNnT)与LNFP-III的摩尔比为0.8-6并且3-FL与LNnT的摩尔比为0.13-7.7。
当以3-FL与LNnT的摩尔比为2：1至1：2并且转化率为50-70％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNnT、LNFP-III和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNnT和LNFP-III组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNnT)与LNFP-III的摩尔比为0.8-4并且3-FL与LNnT的摩尔比为0.2-4.5。
当以3-FL与LNnT的摩尔比为1：1并且转化率为50-70％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNnT、LNFP-III和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNnT和LNFP-III组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNnT)与LNFP-III的摩尔比为0.8-2并且3-FL与LNnT的摩尔比为1。
当以3-FL与LNnT的摩尔比为3：1至1：3并且转化率为40-60％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNnT、LNFP-III和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNnT和LNFP-III组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNnT)与LNFP-III的摩尔比为1.3-8并且3-FL与LNnT的摩尔比为0.17-6。
当以3-FL与LNnT的摩尔比为2：1至1：2并且转化率为40-60％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNnT、LNFP-III和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNnT和LNFP-III组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNnT)与LNFP-III的摩尔比为2-6.6并且3-FL与LNnT的摩尔比为0.25-3.5。
当以3-FL与LNnT的摩尔比为1：1并且转化率为40-60％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNnT、LNFP-III和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNnT和LNFP-III组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNnT)与LNFP-III的摩尔比为1.3-3并且3-FL与LNnT的摩尔比为1。
当以3-FL与LNnT的摩尔比为5：1至3：1并且转化率为50-80％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNnT、LNFP-III和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNnT和LNFP-III组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNnT)与LNFP-III的摩尔比为3-10并且3-FL与LNnT的摩尔比为5-21。
当以3-FL与LNnT的摩尔比为3：1至2：1并且转化率为40-70％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNnT、LNFP-III和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNnT和LNFP-III组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNnT)与LNFP-III的摩尔比为2-8并且3-FL与LNnT的摩尔比为2.5-7.7。
当以3-FL与LNnT的摩尔比为2：1至1：1并且转化率为35-55％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNnT、LNFP-III和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNnT和LNFP-III组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNnT)与LNFP-III的摩尔比为1.6-6.6并且3-FL与LNnT的摩尔比为1-3.3。
当以3-FL与LNnT的摩尔比为1：1至1：2并且转化率为35-55％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNnT、LNFP-III和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNnT和LNFP-III组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNnT)与LNFP-III的摩尔比为1.6-6.6并且3-FL与LNnT的摩尔比为0.3-1。
当以3-FL与LNnT的摩尔比为1：2至1：3并且转化率为40-70％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNnT、LNFP-III和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNnT和LNFP-III组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNnT)与LNFP-III的摩尔比为2-8并且3-FL与LNnT的摩尔比为0.13-0.4。
当以3-FL与LNnT的摩尔比为1：3至1：5并且转化率为50-80％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNnT、LNFP-III和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNnT和LNFP-III组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNnT)与LNFP-III的摩尔比为3-10并且3-FL与LNnT的摩尔比为0.05-0.2。
当以3-FL与LNFP-I的摩尔比为2：1至1：2并且转化率为35-70％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNFP-I、LNDFH-I和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNFP-I和LNDFH-I组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNFP-I)与LNDFH-I的摩尔比为0.8-6.6并且3-FL与LNFP-I的摩尔比为0.2-4.5。
当以3-FL与LNFP-I的摩尔比为1：1并且转化率为35-70％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNFP-I、LNDFH-I和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNFP-I和LNDFH-I组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNFP-I)与LNDFH-I的摩尔比为0.8-3.8并且3-FL与LNFP-I的摩尔比为1。
当以3-FL与LNFP-I的摩尔比为3：1至1：3并且转化率为40-70％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNFP-I、LNDFH-I和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNFP-I和LNDFH-I组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNFP-I)与LNDFH-I的摩尔比为0.8-8并且3-FL与LNFP-I的摩尔比为0.13-7.7。
当以3-FL与LNFP-I的摩尔比为2：1至1：2并且转化率为40-70％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNFP-I、LNDFH-I和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNFP-I和LNDFH-I组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNFP-I)与LNDFH-I的摩尔比为0.8-5.5并且3-FL与LNFP-I的摩尔比为0.2-4.5。
当以3-FL与LNFP-I的摩尔比为1：1并且转化率为40-70％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNFP-I、LNDFH-I和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNFP-I和LNDFH-I组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNFP-I)与LNDFH-I的摩尔比为0.8-3并且3-FL与LNFP-I的摩尔比为1。
当以3-FL与LNFP-I的摩尔比为3：1至1：3并且转化率为50-70％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNFP-I、LNDFH-I和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNFP-I和LNDFH-I组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNFP-I)与LNDFH-I的摩尔比为0.8-6并且3-FL与LNFP-I的摩尔比为0.13-7.7。
当以3-FL与LNFP-I的摩尔比为2：1至1：2并且转化率为50-70％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNFP-I、LNDFH-I和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNFP-I和LNDFH-I组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNFP-I)与LNDFH-I的摩尔比为0.8-4并且3-FL与LNFP-I的摩尔比为0.2-4.5。
当以3-FL与LNFP-I的摩尔比为1：1并且转化率为50-70％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNFP-I、LNDFH-I和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNFP-I和LNDFH-I组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNFP-I)与LNDFH-I的摩尔比为0.8-2并且3-FL与LNFP-I的摩尔比为1。
当以3-FL与LNFP-I的摩尔比为3：1至1：3并且转化率为40-60％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNFP-I、LNDFH-I和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNFP-I和LNDFH-I组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNFP-I)与LNDFH-I的摩尔比为1.3-8并且3-FL与LNFP-I的摩尔比为0.17-6。
当以3-FL与LNFP-I的摩尔比为2：1至1：2并且转化率为40-60％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNFP-I、LNDFH-I和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNFP-I和LNDFH-I组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNFP-I)与LNDFH-I的摩尔比为2-6.6并且3-FL与LNFP-I的摩尔比为0.25-3.5。
当以3-FL与LNFP-I的摩尔比为1：1并且转化率为40-60％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNFP-I、LNDFH-I和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNFP-I和LNDFH-I组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNFP-I)与LNDFH-I的摩尔比为1.3-3并且3-FL与LNFP-I的摩尔比为1。
当以3-FL与LNFP-I的摩尔比为5：1至3：1并且转化率为50-80％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNFP-I、LNDFH-I和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNFP-I和LNDFH-I组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNFP-I)与LNDFH-I的摩尔比为3-10并且3-FL与LNFP-I的摩尔比为5-21。
当以3-FL与LNFP-I的摩尔比为3：1至2：1并且转化率为40-70％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNFP-I、LNDFH-I和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNFP-I和LNDFH-I组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNFP-I)与LNDFH-I的摩尔比为2-8并且3-FL与LNFP-I的摩尔比为2.5-7.7。
当以3-FL与LNFP-I的摩尔比为2：1至1：1并且转化率为35-55％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNFP-I、LNDFH-I和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNFP-I和LNDFH-I组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNFP-I)与LNDFH-I的摩尔比为1.6-6.6并且3-FL与LNFP-I的摩尔比为1-3.3。
当以3-FL与LNFP-I的摩尔比为1：1至1：2并且转化率为35-55％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNFP-I、LNDFH-I和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNFP-I和LNDFH-I组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNFP-I)与LNDFH-I的摩尔比为1.6-6.6并且3-FL与LNFP-I的摩尔比为0.3-1。
当以3-FL与LNFP-I的摩尔比为1：2至1：3并且转化率为40-70％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNFP-I、LNDFH-I和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNFP-I和LNDFH-I组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNFP-I)与LNDFH-I的摩尔比为2-8并且3-FL与LNFP-I的摩尔比为0.13-0.4。
当以3-FL与LNFP-I的摩尔比为1：3至1：5并且转化率为50-80％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、LNFP-I、LNDFH-I和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、LNFP-I和LNDFH-I组成的HMO混合物，其中(3-FL+LNFP-I)与LNDFH-I的摩尔比为3-10并且3-FL与LNFP-I的摩尔比为0.05-0.2。
基本上由3-FL、2’-FL、DFL和乳糖组成或基本上由3-FL、2’-FL和DFL组成的HMO混合物可以通过分别进行第三或第四方面的方法来获得，3-FL和2’-FL的摩尔比优选为1：5至5：1、更优选为1：3至3：1、甚至更优选为1：2至2：1、还更优选为1：1，并且α1-3/4岩藻糖苷转移酶的转化率为至少35％至多约70％、优选为至少40％、更优选为至少50％。
当以3-FL与2’-FL的摩尔比为2：1至1：2并且转化率为35-70％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、2’-FL、DFL和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、2’-FL和DFL组成的HMO混合物，其中(3-FL+2’-FL)与DFL的摩尔比为0.8-6.6并且3-FL与2’-FL的摩尔比为0.2-4.5。
当以3-FL与2’-FL的摩尔比为1：1并且转化率为35-70％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、2’-FL、DFL和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、2’-FL和DFL组成的HMO混合物，其中(3-FL+2’-FL)与DFL的摩尔比为0.8-3.8并且3-FL与2’-FL的摩尔比为1。
当以3-FL与2’-FL的摩尔比为3：1至1：3并且转化率为40-70％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、2’-FL、DFL和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、2’-FL和DFL组成的HMO混合物，其中(3-FL+2’-FL)与DFL的摩尔比为0.8-8并且3-FL与2’-FL的摩尔比为0.13-7.7。
当以3-FL与2’-FL的摩尔比为2：1至1：2并且转化率为40-70％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、2’-FL、DFL和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、2’-FL和DFL组成的HMO混合物，其中(3-FL+2’-FL)与DFL的摩尔比为0.8-5.5并且3-FL与2’-FL的摩尔比为0.2-4.5。
当以3-FL与2’-FL的摩尔比为1：1并且转化率为40-70％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、2’-FL、DFL和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、2’-FL和DFL组成的HMO混合物，其中(3-FL+2’-FL)与DFL的摩尔比为0.8-3并且3-FL与2’-FL的摩尔比为1。
当以3-FL与2’-FL的摩尔比为3：1至1：3并且转化率为50-70％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、2’-FL、DFL和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、2’-FL和DFL组成的HMO混合物，其中(3-FL+2’-FL)与DFL的摩尔比为0.8-6并且3-FL与2’-FL的摩尔比为0.13-7.7。
当以3-FL与2’-FL的摩尔比为2：1至1：2并且转化率为50-70％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、2’-FL、DFL和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、2’-FL和DFL组成的HMO混合物，其中(3-FL+2’-FL)与DFL的摩尔比为0.8-4并且3-FL与2’-FL的摩尔比为0.2-4.5。
当以3-FL与2’-FL的摩尔比为1：1并且转化率为50-70％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、2’-FL、DFL和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、2’-FL和DFL组成的HMO混合物，其中(3-FL+2’-FL)与DFL的摩尔比为0.8-2并且3-FL与2’-FL的摩尔比为1。
当以3-FL与2’-FL的摩尔比为3：1至1：3并且转化率为40-60％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、2’-FL、DFL和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、2’-FL和DFL组成的HMO混合物，其中(3-FL+2’-FL)与DFL的摩尔比为1.3-8并且3-FL与2’-FL的摩尔比为0.17-6。
当以3-FL与2’-FL的摩尔比为2：1至1：2并且转化率为40-60％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、2’-FL、DFL和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、2’-FL和DFL组成的HMO混合物，其中(3-FL+2’-FL)与DFL的摩尔比为2-6.6并且3-FL与2’-FL的摩尔比为0.25-3.5。
当以3-FL与2’-FL的摩尔比为1：1并且转化率为40-60％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、2’-FL、DFL和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、2’-FL和DFL组成的HMO混合物，其中(3-FL+2’-FL)与DFL的摩尔比为1.3-3并且3-FL与2’-FL的摩尔比为1。
当以3-FL与2’-FL的摩尔比为5：1至3：1并且转化率为50-80％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、2’-FL、DFL和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、2’-FL和DFL组成的HMO混合物，其中(3-FL+2’-FL)与DFL的摩尔比为3-10并且3-FL与2’-FL的摩尔比为5-21。
当以3-FL与2’-FL的摩尔比为3：1至2：1并且转化率为40-70％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、2’-FL、DFL和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、2’-FL和DFL组成的HMO混合物，其中(3-FL+2’-FL)与DFL的摩尔比为2-8，并且3-FL与2’-FL的摩尔比为2.5-7.7。
当以3-FL与2’-FL的摩尔比为2：1至1：1并且转化率为35-55％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、2’-FL、DFL和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、2’-FL和DFL组成的HMO混合物，其中(3-FL+2’-FL)与DFL的摩尔比为1.6-6.6并且3-FL与2’-FL的摩尔比为1-3.3。
当以3-FL与2’-FL的摩尔比为1：1至1：2并且转化率为35-55％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、2’-FL、DFL和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、2’-FL和DFL组成的HMO混合物，其中(3-FL+2’-FL)与DFL的摩尔比为1.6-6.6并且3-FL与2’-FL的摩尔比为0.3-1。
当以3-FL与2’-FL的摩尔比为1：2至1：3并且转化率为40-70％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、2’-FL、DFL和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、2’-FL和DFL组成的HMO混合物，其中(3-FL+2’-FL)与DFL的摩尔比为2-8并且3-FL与2’-FL的摩尔比为0.13-0.4。
当以3-FL与2’-FL的摩尔比为1：3至1：5并且转化率为50-80％进行第三或第四方面的方法时，可以分别制备基本上由3-FL、2’-FL、DFL和乳糖组成的HMO混合物或基本上由3-FL、2’-FL和DFL组成的HMO混合物，其中(3-FL+2’-FL)与DFL的摩尔比为3-10并且3-FL与2’-FL的摩尔比为0.05-0.2。
适用于进行本发明的第三和第四方面的α1-3/4岩藻糖苷转移酶
在下面的段落中，表述“可携带”与表述“任选携带”等同，并且表述“可以被取代”与表述“任选被取代”等同。
根据本发明，术语“α1-3/4岩藻糖苷转移酶”优选是指任何野生型或工程化的岩藻糖苷酶，其能够将岩藻糖残基转移至式2的受体中的葡萄糖的3-位，转移至式1、1a或1b的受体中的N-乙酰基-乳糖胺基中、优选末端N-乙酰基-乳糖胺基中的N-乙酰基-葡糖胺的3-位，或者转移至式1、1a或1b的受体中乳-N-二糖基中、优选末端乳-N-二糖基中的N-乙酰基-葡糖胺的4-位，其中式1和式2的化合物如下：
Figure BDA0001277311460000301
其中R1为岩藻糖基或H，
R2选自N-乙酰基-乳糖胺基和乳-N-二糖基，其中N-乙酰基-乳糖胺基可携带包括一个或多个N-乙酰基-乳糖胺基和/或一个或多个乳-N-二糖基的糖残基；任意N-乙酰基-乳糖胺基和乳-N-二糖基可以被一个或多个唾液酸残基和/或岩藻糖残基取代，
R3为H或N-乙酰基-乳糖胺基，其任选被包括一个或多个N-乙酰基-乳糖胺基和/或一个或多个乳-N-二糖基的糖残基取代；任意N-乙酰基-乳糖胺基和乳-N-二糖基可以被一个或多个唾液酸残基和/或岩藻糖残基取代，且
每个R4独立地为唾液酸基或H，
其条件是R1或R4中的至少一个不为H；
并且式1a和1b的化合物如下：
Figure BDA0001277311460000311
其中R1如上所定义，
R2a为N-乙酰基-乳糖胺基，其任选被包括一个N-乙酰基-乳糖胺基和/或一个乳-N-二糖基的糖残基取代；任意N-乙酰基-乳糖胺基和乳-N-二糖基可以被一个或多个唾液酸残基和/或岩藻糖残基取代，但优选不含唾液酸残基和/或岩藻糖残基，
R3a为H或N-乙酰基-乳糖胺基，其任选被乳-N-二糖基取代；任意N-乙酰基-乳糖胺基和乳-N-二糖基可以被一个或多个唾液酸残基和/或岩藻糖残基取代，但优选不含唾液酸残基和/或岩藻糖残基，
R2b为乳-N-二糖基，其任选被唾液酸残基和/或岩藻糖残基取代，但优选不含唾液酸残基和/或岩藻糖残基，且
R3b为H或N-乙酰基-乳糖胺基，其任选被一个或两个N-乙酰基-乳糖胺基和/或一个乳-N-二糖基取代；任意N-乙酰基-乳糖胺基和乳-N-二糖基可以被一个或多个唾液酸残基和/或岩藻糖残基取代，但优选不含唾液酸残基和/或岩藻糖残基。
优选地，式1a和1b的化合物具有以下连接键和修饰中的一个或多个：
-式1a中R2a的糖残基中的N-乙酰基-乳糖胺基通过1-3糖苷间键连接到另一个N-乙酰基-乳糖胺基，
-式1a中R2a的糖残基中的乳-N-二糖基通过1-3糖苷间键连接到N-乙酰基-乳糖胺基，
-式1a中R3a的糖残基中的乳-N-二糖基通过1-3糖苷间键连接到N-乙酰基-乳糖胺基，
-式1b中R3b的糖残基中的N-乙酰基-乳糖胺基通过1-3或1-6糖苷间键连接到另一个N-乙酰基-乳糖胺基，以及
-式1b中R3b的糖残基中的乳-N-二糖基通过1-3糖苷间键连接到N-乙酰基-乳糖胺基。
α1-3/4岩藻糖苷转移酶优选选自根据EC 3.2.1.111所分类的具有岩藻糖苷转移酶活性的α-L-岩藻糖苷酶，比如来自长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longumsubsp.infantis)ATCC 15697的α1-3/4岩藻糖苷酶，如美国专利8361756中SEQ ID No.18(本申请的SEQ ID No.1)的蛋白质所示，和其它与来自长双歧杆菌婴儿亚种ATCC 15697的α1-3/4岩藻糖苷酶的56至345位氨基酸的同一性为至少60％、优选为至少70％、更优选为至少80％、特别是至少90％的岩藻糖苷酶。这些其它岩藻糖苷酶的实例列于下表1。
Figure BDA0001277311460000331
Figure BDA0001277311460000341
Figure BDA0001277311460000351
重要的是，α1-3/4岩藻糖苷转移酶的岩藻糖苷转移酶活性大于其水解活性。在
Figure BDA0001277311460000352
或
Figure BDA0001277311460000353
Figure BDA0001277311460000354
反应的过程中，组分C或组分F的水解可在某一时间点变得显著，因为组分C或组分F的浓度增加，然后分别降解成组分B或组分E，以及岩藻糖。为了制备本发明的HMO混合物，应该在产生显著的产物水解之前停止反应。这个时间点可以通过公知的酶动力学测量来容易地测定。
用于制备本发明的HMO混合物的特别优选的α1-3/4岩藻糖苷转移酶是没有水解活性或至少具有显著降低的水解活性的α1-3/4岩藻糖苷转移酶。这样的酶可以通过在一个或多个氨基酸位置改变主要是野生型α1-3/4岩藻糖苷酶的氨基酸序列来制备，使得突变的氨基酸序列产生改善的岩藻糖苷转移酶活性和/或降低的水解活性。根据本发明，α1-3/4岩藻糖苷转移酶优选：
i)至少在US 8361756的SEQ ID No.18的以下一个或多个氨基酸位置具有突变：134、135、168、170、174、216、221、236、237、244、245、282和413，优选在至少一个或多个以下氨基酸位置具有突变：134、135、174、216、221、282和413；从而
ii)对于以下反应提供至少10％至多70％、优选为至少20％、更优选为至少35％、甚至更优选为40-50％的转化率：
-3-FL供体与LNT受体，或
-3-FL供体与LNnT受体，或
-3-FL供体与LNFP-I受体，或
-3-FL供体与2’-FL受体，或
-DFL供体与LNT受体，或
-DFL供体与LNnT受体，或
-DFL供体与LNFP-I受体。
本发明的第五方面
本发明的第五方面为一种用于治疗细菌感染的抗感染组合物。该组合物包括，优选基本上由以下组成：
-DFL，
-组分E，其为LNT、LNnT或LNFP-I，
-组分F，其
当组分E为LNT时为LNFP-II，或
当组分E为LNnT时为LNFP-III，或
当组分E为LNFP-I时为LNDFH-I，以及
-2’-FL；
或包括，优选基本上由以下组成：
-3-FL，
-组分B，其为LNT、LNnT、LNFP-I或2’-FL，以及
-岩藻糖基化组分C，其：
当组分B为LNT时为LNFP-II，或
当组分B为LNnT时为LNFP-III，或
当组分B为LNFP-I时为LNDFH-I，或
当组分B为2’-FL时为DFL；
或者该组合物基本上由以下组成：
-3-FL，
-组分B，其为LNT、LNnT、LNFP-I或2’-FL，
-岩藻糖基化组分C，其：
当组分B为LNT时为LNFP-II，或
当组分B为LNnT时为LNFP-III，或
当组分B为LNFP-I时为LNDFH-I，或
当组分B为2’-FL时为DFL，以及
-乳糖。
优选地，抗感染组合物基本上由以下组成：
-3-FL，
-组分B，其为LNT、LNnT、LNFP-I或2’-FL，以及
-组分C，其：
当组分B为LNT时为LNFP-II，或
当组分B为LNnT时为LNFP-III，或
当组分B为LNFP-I时为LNDFH-I，或
当组分B为2’-FL时为DFL，
或抗感染组合物基本上由以下组成：
-DFL，
-组分E，其为LNT、LNnT或LNFP-I，
-组分F，其
当组分E为LNT时为LNFP-II，或
当组分E为LNnT时为LNFP-III，或
当组分E为LNFP-I时为LNDFH-I，以及
-2’-FL。
特别优选的抗感染组合物选自：
-基本上由3-FL、LNT和LNFP-II或由3-FL、LNT、LNFP-II和乳糖组成的HMO的混合物，优选其中：
-(3-FL+LNT)相对于LNFP-II的摩尔比为0.8-9.5，并且
-乳糖相对于LNFP-II的摩尔比为约1，
其条件是3-FL与LNFP-II的摩尔比和LNT与LNFP-II的摩尔比中之一不大于2，特别是基本上由3-FL、LNT和LNFP-II组成的HMO的混合物；或者
-基本上由3-FL、LNnT和LNFP-III或由3-FL、LNnT、LNFP-III和乳糖组成的HMO的混合物，优选其中：
-(3-FL+LNnT)相对于LNFP-III的摩尔比为0.8-9.5，并且
-乳糖相对于LNFP-III的摩尔比为约1，
其条件是3-FL与LNFP-III的摩尔比和LNnT与LNFP-III的摩尔比中之一不大于2，特别是基本上由3-FL、LNnT和LNFP-III组成的HMO的混合物；或者
-基本上由3-FL、LNFP-I和LNDFH-I或由3-FL、LNFP-I、LNDFH-I和乳糖组成的HMO的混合物，优选其中：
-(3-FL+LNFP-I)相对于LNDFH-I的摩尔比为0.8-9.5，并且
-乳糖相对于LNDFH-I的摩尔比为约1，
特别是基本上由3-FL、LNFP-I和LNDFH-I组成的HMO的混合物；或者
-基本上由3-FL、2’-FL和DFL或由3-FL、2’-FL、DFL和乳糖组成的HMO的混合物，优选其中：
-(3-FL+2’-FL)相对于DFL的摩尔比为0.8-9.5，并且
-乳糖相对于DFL的摩尔比为约1；或者
-基本上由3-FL、2’-FL和DFL组成的HMO的混合物，优选其中：
-DFL相对于(3-FL+2’-FL)的摩尔比为至少1：10、优选为至少1：7、更优选为至少1：5、特别是1：3；且/或
-3-FL相对于2’-FL的摩尔比为0.05-21、优选为0.13-7.7、更优选为约1；或者
-包括2’-FL、DFL、LNT和LNFP-II的HMO的混合物，优选基本上由2’-FL、DFL、LNT和LNFP-II组成的HMO的混合物；或者
-包括2’-FL、DFL、LNnT和LNFP-III的HMO的混合物，优选基本上由2’-FL、DFL、LNnT和LNFP-III组成的HMO的混合物；或者
-包括2’-FL、DFL、LNFP-I和LNDFH-I的HMO的混合物，优选基本上由2’-FL、DFL、LNFP-I和LNDFH-I组成的HMO的混合物。
本发明的抗感染组合物可以是药物组合物。药物组合物可以包含药学上可接受的载体，例如磷酸缓冲盐溶液、乙醇在水中的混合物、水和乳液如油/水或水/油乳液，以及各种润湿剂或赋形剂。药物组合物还可以包含其他材料，当将其施用于患者时不产生不良反应、过敏反应或其他不希望的反应。载体和其它材料可以包括溶剂、分散剂、涂层、吸收促进剂、控释剂、和一种或多种惰性赋形剂，比如淀粉、多元醇、成粒剂、微晶纤维素、稀释剂、润滑剂、粘合剂和崩解剂。如果需要，抗感染组合物的片剂剂量可以通过标准的水性或非水性技术进行包衣。
本发明的抗感染组合物可以口服给药，例如，作为包含预定量的第一混合物的片剂、胶囊或小丸剂，或作为包含预定浓度的第一混合物的粉末剂或颗粒剂，或包含预定浓度的第一混合物的在水性或非水性液体中的凝胶、糊剂、溶液、混悬液、乳剂、糖浆、大丸剂、药糖剂或膏剂。口服给药的组合物可以包括粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、调味剂和保湿剂。口服给药的组合物如片剂可以任选地进行包衣，并且可以配制成对其中的第一混合物提供持续、延迟或控制释放。
本发明的抗感染组合物还可以通过直肠栓剂、气溶胶管、鼻胃管或直接输注到胃肠道或胃中施用。
本发明的抗感染药物组合物还可以包括治疗剂如抗病毒剂、抗生素、益生菌、止痛剂和抗炎剂。对于患者这些组合物的合适剂量可以基于如患者的免疫状态、体重和年龄等因素以常规方式来确定。在一些情况下，剂量的浓度将与人母乳中组合物发现的HMO的浓度相似。所需量通常在每天约200mg至约20g的范围内，在某些实施方式中为每天约300mg至约15g、每天约400mg至约10g，在某些实施方式中为每天约500mg至约10g，在某些实施方式中为每天约1g至约10g。合适的剂量方案可以通过本领域技术人员已知的方法来确定。
本发明的抗感染组合物也可添加到营养组合物中。例如，它们可以添加到婴儿配方、营养组合物、补液溶液、或老年人或免疫受损个体的膳食维持或补充。大量营养素如可食用脂肪、碳水化合物和蛋白质也可以包括在这种抗感染组合物中。可食用脂肪包括例如椰子油、大豆油和单甘油酯和甘油二酯。碳水化合物包括例如葡萄糖、可食用乳糖和水解玉米淀粉。蛋白质包括例如大豆蛋白、乳清和脱脂乳。维生素和矿物质(例如钙、磷、钾、钠、氯、镁、锰、铁、铜、锌、硒、碘和维生素A、E、D、C和B复合物)也可以包括在这种抗感染组合物中。
本发明的第六方面
本发明的第六方面为一种调节人微生物组以增加双歧杆菌丰度和Barnesiella丰度的方法。优选地，该方法减少厚壁菌丰度，特别是梭状芽孢杆菌。该方法包括向人施用：
i)一种组合物，其包括，优选基本上由以下组成：
-3-FL，
-组分B，其为LNT、LNnT、LNFP-I或2’-FL，以及
-组分C，其：
当组分B为LNT时为LNFP-II，或
当组分B为LNnT时为LNFP-III，或
当组分B为LNFP-I时为LNDFH-I，或
当组分B为2’-FL时为DFL；
或者
ii)一种组合物，其基本上由以下组成：
-3-FL，
-组分B，其为LNT、LNnT、LNFP-I或2’-FL，以及
-组分C，其：
当组分B为LNT时为LNFP-II，或
当组分B为LNnT时为LNFP-III，或
当组分B为LNFP-I时为LNDFH-I，或
当组分B为2’-FL时为DFL；以及
-乳糖；
或者
iii)一种组合物，其包括，优选基本上由以下组成：
-DFL
-组分E，其为LNT、LNnT或LNFP-I，
-组分F，其：
当组分E为LNT时为LNFP-II，或
当组分E为LNnT时为LNFP-III，或
当组分E为LNFP-I时为LNDFH-I，以及
-2’-FL。
优选基本上由以下组成的组合物：
-3-FL，
-组分B，其为LNT、LNnT、LNFP-I或2’-FL，以及
-组分C，其：
当组分B为LNT时为LNFP-II，或
当组分B为LNnT时为LNFP-III，或
当组分B为LNFP-I时为LNDFH-I，或
当组分B为2’-FL时为DFL；
或者基本上由以下组成的组合物：
-DFL
-组分E，其为LNT、LNnT或LNFP-I，
-组分F，其：
当组分E为LNT时为LNFP-II，或
当组分E为LNnT时为LNFP-III，或
当组分E为LNFP-I时为LNDFH-I，以及
-2’-FL。
用于调节人微生物组的特别优选的方法包括向人施用：
-3-FL、LNT和LNFP-II，优选基本上由3-FL、LNT和LNFP-II或由3-FL、LNT、LNFP-II和乳糖组成的HMO的混合物，更优选其中：
-(3-FL+LNT)相对于LNFP-II的摩尔比为0.8-9.5，并且
-乳糖相对于LNFP-II的摩尔比为约1，
其条件是3-FL与LNFP-II的摩尔比和LNT与LNFP-II的摩尔比中之一不大于2，特别是基本上由3-FL、LNT和LNFP-II组成的HMO的混合物；或者
-3-FL、LNnT和LNFP-III，优选基本上由3-FL、LNnT和LNFP-III或由3-FL、LNnT、LNFP-III和乳糖组成的HMO的混合物，更优选其中：
-(3-FL+LNnT)相对于LNFP-III的摩尔比为0.8-9.5，并且
-乳糖相对于LNFP-III的摩尔比为约1，
其条件是3-FL与LNFP-III的摩尔比和LNnT与LNFP-III的摩尔比中之一不大于2，特别是基本上由3-FL、LNnT和LNFP-III组成的HMO的混合物；或者
-3-FL、LNFP-I和LNDFH-I，优选基本上由3-FL、LNFP-I和LNDFH-I或由3-FL、LNFP-I、LNDFH-I和乳糖组成的HMO的混合物，更优选其中：
-(3-FL+LNFP-I)相对于LNDFH-I的摩尔比为0.8-9.5，并且
-乳糖相对于LNDFH-I的摩尔比为约1，
特别是基本上由3-FL、LNFP-I和LNDFH-I组成的HMO的混合物；或者
-3-FL、2’-FL和DFL，优选基本上由3-FL、2’-FL和DFL或由3-FL、2’-FL、DFL和乳糖组成的HMO的混合物，更优选其中：
-(3-FL+2’-FL)相对于DFL的摩尔比为0.8-9.5，并且
-乳糖相对于DFL的摩尔比为约1，
特别是基本上由3-FL、2’-FL和DFL组成的HMO的混合物；或者
-2’-FL、DFL、LNT和LNFP-II，优选包括2’-FL、DFL、LNT和LNFP-II的HMO的混合物，更优选基本上由2’-FL、DFL、LNT和LNFP-II组成的HMO的混合物；或者
-2’-FL、DFL、LNnT和LNFP-III，优选包括2’-FL、DFL、LNnT和LNFP-III的HMO的混合物，更优选基本上由2’-FL、DFL、LNnT和LNFP-III组成的HMO的混合物；或者
-2’-FL、DFL、LNFP-I和LNDFH-I，优选包括2’-FL、DFL、LNFP-I和LNDFH-I的HMO的混合物，更优选基本上由2’-FL、DFL、LNFP-I和LNDFH-I组成的HMO的混合物。
本发明的第七方面
本发明的七个方面为一种预防或治疗人细菌感染、特别是抗生素耐药性细菌感染的方法。该方法包括向人施用，
i)一种组合物，其包括，优选基本上由以下组成：
-3-FL，
-组分B，其为LNT、LNnT、LNFP-I或2’-FL，以及
-岩藻糖基化组分C，其：
当组分B为LNT时为LNFP-II，或
当组分B为LNnT时为LNFP-III，或
当组分B为LNFP-I时为LNDFH-I，或
当组分B为2’-FL时为DFL；
或者
ii)一种组合物，其基本上由以下组成：
-3-FL，
-组分B，其为LNT、LNnT、LNFP-I或2’-FL，以及-组分C，其：
当组分B为LNT时为LNFP-II，或
当组分B为LNnT时为LNFP-III，或
当组分B为LNFP-I时为LNDFH-I，或
当组分B为2’-FL时为DFL；以及
-乳糖；
或者
iii)一种组合物，其包括，优选基本上由以下组成：
-DFL
-组分E，其为LNT、LNnT或LNFP-I，
-组分F，其：
当组分E为LNT时为LNFP-II，或
当组分E为LNnT时为LNFP-III，或
当组分E为LNFP-I时为LNDFH-I，以及
-2’-FL。
优选基本上由以下组成的组合物：
-3-FL，
-组分B，其为LNT、LNnT、LNFP-I或2’-FL，以及
-组分C，其：
当组分B为LNT时为LNFP-II，或
当组分B为LNnT时为LNFP-III，或
当组分B为LNFP-I时为LNDFH-I，或
当组分B为2’-FL时为DFL；
或者基本上由以下组成的组合物：
-DFL
-组分E，其为LNT、LNnT或LNFP-I，
-组分F，其：
当组分E为LNT时为LNFP-II，或
当组分E为LNnT时为LNFP-III，或
当组分E为LNFP-I时为LNDFH-I，以及
-2’-FL。
用于预防或治疗人细菌感染的特别优选的方法包括向人施用：
-3-FL、LNT和LNFP-II，优选基本上由3-FL、LNT和LNFP-II或由3-FL、LNT、LNFP-II和乳糖组成的HMO的混合物，更优选其中：
-(3-FL+LNT)相对于LNFP-II的摩尔比为0.8-9.5，并且
-乳糖相对于LNFP-II的摩尔比为约1，
其条件是3-FL与LNFP-II的摩尔比和LNT与LNFP-II的摩尔比中之一不大于2，特别是基本上由3-FL、LNT和LNFP-II组成的HMO的混合物；或者
-3-FL、LNnT和LNFP-III，优选基本上由3-FL、LNnT和LNFP-III或由3-FL、LNnT、LNFP-III和乳糖组成的HMO的混合物，更优选其中：
-(3-FL+LNnT)相对于LNFP-III的摩尔比为0.8-9.5，并且
-乳糖相对于LNFP-III的摩尔比为约1，
其条件是3-FL与LNFP-III的摩尔比和LNnT与LNFP-III的摩尔比中之一不大于2，特别是基本上由3-FL、LNnT和LNFP-III组成的HMO的混合物；或者
-3-FL、LNFP-I和LNDFH-I，优选基本上由3-FL、LNFP-I和LNDFH-I或由3-FL、LNFP-I、LNDFH-I和乳糖组成的HMO的混合物，更优选其中：
-(3-FL+LNFP-I)相对于LNDFH-I的摩尔比为0.8-9.5，并且
-乳糖相对于LNDFH-I的摩尔比为约1，
特别是基本上由3-FL、LNFP-I和LNDFH-I组成的HMO的混合物；或者
-3-FL、2’-FL和DFL，优选基本上由3-FL、2’-FL和DFL或由3-FL、2’-FL、DFL和乳糖组成的HMO的混合物，更优选其中：
-(3-FL+2’-FL)相对于DFL的摩尔比为0.8-9.5，并且
-乳糖相对于DFL的摩尔比为约1，
特别是基本上由3-FL、2’-FL和DFL组成的HMO的混合物；或者
-2’-FL、DFL、LNT和LNFP-II，优选包括2’-FL、DFL、LNT和LNFP-II的HMO的混合物，更优选基本上由2’-FL、DFL、LNT和LNFP-II组成的HMO的混合物；或者
-2’-FL、DFL、LNnT和LNFP-III，优选包括2’-FL、DFL、LNnT和LNFP-III的HMO的混合物，更优选基本上由2’-FL、DFL、LNnT和LNFP-III组成的HMO的混合物；或者
-2’-FL、DFL、LNFP-I和LNDFH-I，优选包括2’-FL、DFL、LNFP-I和LNDFH-I的HMO的混合物，更优选基本上由2’-FL、DFL、LNFP-I和LNDFH-I组成的HMO的混合物。
虽然已经参照优选实施方式描述了本发明，但是应当理解，在本发明的范围内可以进行各种修改。
在本说明书中，除非有明确的相反说明，当符合所述条件的两者中任一个或两个时，从操作者的意义上使用“或者/或(or)”一词以还原真实意义，而不是操作者的仅需要符合条件中的一个的“异或(exclusive or)”。“包括(comprising)”一词用于“包含(including)”的意义，而不是意指“由…组成”。以上承认的所有在先的教导并入本文以供参考。不应将本文承认的任何在先公开的文件视为认可或表示其教导在澳大利亚或其他地方在其公开日期为公知常识。
实施例
在下面的实施例中，长双歧杆菌婴儿亚种ATCC 15697的突变体用于制备本发明的混合物；突变的位置参考本申请的SEQ ID No.1，其与US 8361756的SEQ ID No.18相同。
实施例1
Figure BDA0001277311460000451
在磷酸钠缓冲液(50mM，pH＝6.5，37℃，200μl)中进行测试，[3-FL]＝200mM，[LNT]＝200mM，酶提取物＝0.5mg/ml。HPLC条件：使用56％乙腈和44％水，使用TSK Gel Amide 80(Tosoh，3μm，150×4.6mm)，流速为1ml/min。通过CAD和/或UV检测在195nm处检测底物和产物的洗脱。
下表示出了所得到的混合物的组成。乳糖与LNFP-II等摩尔。
Figure BDA0001277311460000461
实施例2
使用W135F-A174N-N274A-E413突变体进行与实施例1相同的测试，不同之处在于3-FL：LNT比率从3：1至1：3变化，并且酶提取物为0.05mg/ml。下表示出了所得到的混合物的组成。乳糖与LNFP-II等摩尔。没有检测到岩藻糖。
Figure BDA0001277311460000471
实施例3
Figure BDA0001277311460000472
在磷酸钠缓冲液(50mM，pH＝6.5，37℃，200μl)中进行测试，[3-FL]＝200mM，[LNnT]＝200mM。HPLC条件：使用56％乙腈和44％水，使用TSK Gel Amide 80(Tosoh，3μm，150×4.6mm)，流速为1ml/min。通过CAD和/或UV检测在195nm处检测底物和产物的洗脱。
下表示出了对于2mg/ml的酶提取物所得到的混合物的组成。乳糖与LNFP-III等摩尔。
Figure BDA0001277311460000481
下表示出了对于0.5mg/ml的酶提取物所得到的混合物的组成。乳糖与LNFP-III等摩尔。
Figure BDA0001277311460000482
实施例4
使用多点突变体进行与实施例3相同的测试。下表示出了对于0.5mg/ml的酶提取物所得到的混合物的组成。乳糖与LNFP-III等摩尔。
Figure BDA0001277311460000491
实施例5
Figure BDA0001277311460000492
在磷酸钠缓冲液(50mM，pH＝6.5，37℃，200μl)中进行测试，[3-FL]＝200mM，[LNFP-I]＝200mM，酶提取物＝0.5mg/ml。HPLC条件：使用56％乙腈和44％水，使用TSK GelAmide 80(Tosoh，3μm，150×4.6mm)，流速为1ml/min。通过CAD和/或UV检测在195nm处检测底物和产物的洗脱。
下表示出了所得到的混合物的组成。乳糖与LNDFH-I等摩尔。
Figure BDA0001277311460000493
在磷酸钠缓冲液(50mM，pH＝6.5，30℃，140μl)中进行另一个测试，[3-FL]＝50mM，[LNFP-I]＝50mM，酶提取物＝10μl。
下表示出了所得到的混合物的组成。乳糖与LNDFH-I等摩尔。
Figure BDA0001277311460000501
实施例6
在磷酸钠缓冲液(50mM，pH＝6.5，37℃，150μl)中进行与实施例5相同的测试，[3-FL]＝100mM，[LNFP-I]＝50mM，酶提取物＝10μl粗提物。HPLC如实施例5。
下表示出了220分钟后所得到的混合物的组成。乳糖与LNDFH-I等摩尔。
Figure BDA0001277311460000502
实施例7
Figure BDA0001277311460000503
在磷酸钠缓冲液(50mM，pH＝6.5，37℃，200μl)中进行测试，[3-FL]＝200mM，[2’-FL]＝200mM，酶提取物＝0.5mg/ml。HPLC条件：使用56％乙腈和44％水，使用TSK GelAmide80(Tosoh，3μm，150×4.6mm)，流速为1ml/min。通过CAD和/或UV检测在195nm处检测底物和产物的洗脱。
下表示出了所得到的混合物的组成。乳糖与DFL等摩尔。
Figure BDA0001277311460000511
实施例8
Figure BDA0001277311460000512
在磷酸钠缓冲液(50mM，pH＝6.5，37℃，200μl)中进行测试，使用W135F-A174N-N274A-E413R突变体，[DFL]＝200mM，[LNT]＝200mM，酶提取物＝0.1mg/ml或0.25mg/ml。HPLC条件：使用66％乙腈和34％水，使用TSK Gel Amide 80(Tosoh，3μm，150×4.6mm)，流速为1.1ml/min。通过CAD和/或UV检测在195nm处检测底物和产物的洗脱。
下表示出了所得到的混合物的组成。
酶提取物：0.1mg/ml
时间(h) LNFP-II转化率 DFL(mol％) LNT(mol％) LNFP-II(mol％) 2’-FL(mol％)
1 10％ 45％ 45％ 5％ 5％
2 15％ 42.5％ 42.5％ 7.5％ 7.5％
5 24％ 38％ 38％ 12％ 12％
8 27％ 36.5％ 36.5％ 13.5％ 13.5％
酶提取物：0.25mg/ml
时间(h) LNFP-II转化率 DFL(mol％) LNT(mol％) LNFP-II(mol％) 2’-FL(mol％)
0.5 10％ 45％ 45％ 5％ 5％
1 16％ 42％ 42％ 8％ 8％
2 20％ 40％ 40％ 10％ 10％
5 28％ 36％ 36％ 14％ 14％
8 28％ 36％ 36％ 14％ 14％
实施例9
Figure BDA0001277311460000521
在磷酸钠缓冲液(50mM，pH＝6.5，37℃，200μl)中进行测试，使用W135F-A174N-N274A-E413R突变体，[DFL]＝200mM，[LNnT]＝200mM，酶提取物＝0.1mg/ml或0.25mg/ml。HPLC条件：使用66％乙腈和34％水，使用TSK Gel Amide 80(Tosoh，3μm，150×4.6mm)，流速为1.1ml/min。通过CAD和/或UV检测在195nm处检测底物和产物的洗脱
下表示出了所得到的混合物的组成。
酶提取物：0.1mg/ml
时间(h) LNFP-III转化率 DFL(mol％) LNnT(mol％) LNFP-III(mol％) 2’-FL(mol％)
1 7％ 46.5％ 46.5％ 3.5％ 3.5％
2 11％ 44.5％ 44.5％ 5.5％ 5.5％
5 19％ 40.5％ 40.5％ 9.5％ 9.5％
8 21％ 39.5％ 39.5％ 10.5％ 10.5％
酶提取物：0.25mg/ml
时间(h) LNFP-III转化率 DFL(mol％) LNnT(mol％) LNFP-III(mol％) 2’-FL(mol％)
0.5 8％ 46％ 46％ 4％ 4％
1 12％ 44％ 44％ 6％ 6％
2 17％ 41.5％ 41.5％ 8.5％ 8.5％
5 24％ 38％ 38％ 12％ 12％
8 25％ 37.5％ 37.5％ 12.5％ 12.5％
实施例10
Figure BDA0001277311460000522
在磷酸钠缓冲液(50mM，pH＝6.5，37℃，200μl)中进行测试，使用W135F-A174N-N274A-E413R突变体，[DFL]＝200mM，[LNFP-I]＝200mM，酶提取物＝0.1mg/ml或0.25mg/ml。HPLC条件：使用66％乙腈和34％水，使用TSK Gel Amide 80(Tosoh，3μm，150×4.6mm)，流速为1.1ml/min。通过CAD和/或UV检测在195nm处检测底物和产物的洗脱。
下表示出了所得到的混合物的组成。
酶提取物：0.1mg/ml
Figure BDA0001277311460000531
酶提取物：0.25mg/ml
Figure BDA0001277311460000532
实施例11
在该研究中招募总共80名男性和女性患者参加。经筛查访问和测试(run-in)期1-2周后，选择患者并随机分为8组，每组10名患者。将7组每组施用包含5克的以下组合物之一的治疗产品：
i)LNT、3-FL和LNFP-II，
ii)LNnT、3-FL和LNFP-III，
iii)LNFP-I、3-FL和LNDFH-I，
iv)3-FL、2’-FL和DFL，
v)2’-FL、DFL、LNT和LNFP-II，
vi)2’-FL、DFL、LNnT和LNFP-III，或
vii)2’-FL、DFL、LNFP-I和LNDFH-I，
且将1组施用安慰剂产品(2克葡萄糖)，均施用8周。治疗产品和安慰剂在单位剂量容器中呈粉末形式。
如果患者年满18周岁，则有资格参加。所有招募的患者都能够并愿意了解并遵守研究程序。如果有以下情况，则将患者排除：患者在筛查访问前一个月内已经参加了临床研究；患者在筛查测试中具有临床上与参加研究有关的异常结果；患者正患有严重的疾病，如恶性肿瘤、糖尿病、严重冠心病、肾脏疾病、神经系统疾病或严重的精神疾病或任何可能混淆研究结果的病症；在研究前使用高剂量的益生菌补充剂(允许使用酸奶)3个月；在研究前服用抗生素药物3个月；在研究前2周内定期服用任何可能干扰症状评估的药物；和怀孕或泌乳。
在筛查访问时，登记病史和伴随药物，并收集血液样本用于安全性分析。分发粪便样本试剂盒。要求患者将样本保存在冰箱中，直到下一次访问。
在第二次访问时，检查资格标准，并且将合格的受试者随机分配到试验中的三组(arms)。收集粪便样本并分发用于新样本的装置。使患者熟悉互动互联网启用系统(interactive internet enabled system)，每天记录数据，并提供给治疗或对照产品。提醒受试者在研究过程中不要改变他们惯常的饮食。收集血液样本用于生物标志物研究。将粪便样本储存在-80℃直到分析。将粪便样本进行16S RNA测序分析。
该研究进行8周，患者每天服用安慰剂或治疗产品。患者被指示在早晨与早餐一起服用产品。通过互动互联网启用系统监控顺应性(compliance)。患者还使用系统记录：
-Bristol粪便形态分类(Bristol Stool Form Scale)(BSF)信息，
-症状信息如腹痛、腹部不适、腹部绞痛、腹胀和腹部饱胀感，
-额外的胃肠症状评定量表(Gastrointestinal Symptom Rating Scale)(GSRS)信息。
该调查问卷包括覆盖五个方面(腹痛、消化不良、反流、腹泻、便秘)的15项，并使用七级李克特量表(seven-graded Likert scale)。
在研究结束时，每个病人都有医疗团队的退出访问。如前所述收集和分析粪便样本和血液样本。
粪便分析表明，治疗患者的双歧杆菌和Barnesiella的丰度增加，厚壁菌、特别是梭状芽孢杆菌的丰度减少。
实施例12
各自单独地安置80只7周龄的C57BL/6J雌性小鼠以避免小鼠之间的污染并提供给经辐照的食物和水。将小鼠分为8组，每组10只小鼠，7组治疗组和1组安慰剂组。
在饮用水中用氨苄青霉素(0.5g/l)处理小鼠，每3天更换一次。1周后，停止将氨苄青霉素加入到饮用水中。此后，将以下组合物中的一种以40mg/ml的总浓度加入到7个治疗组中的每一组的饮用水中：
i)LNT、3-FL和LNFP-II，
ii)LNnT、3-FL和LNFP-III，
iii)LNFP-I、3-FL和LNDFH-I，
iv)3-FL、2’-FL和DFL，
v)2’-FL、DFL、LNT和LNFP-II，
vi)2’-FL、DFL、LNnT和LNFP-III，或
vii)2’-FL、DFL、LNFP-I和LNDFH-I。
对照组给予纯水。每天给予新鲜的水，并且所有小鼠都可以自由接近饮用水。以啮齿动物食物喂养小鼠，并每天给予新鲜的食物。
在氨苄青霉素处理结束两天后，各组小鼠用万古霉素耐药性屎肠球菌(Enterococcus faecium)菌株(VRE)通过口服强饲法进行感染。通过在具有万古霉素的Enterococcosel琼脂平板上铺种系列稀释的粪便丸粒，而在不同的时间点测定VRE水平。通过外观识别VRE菌落，并通过革兰氏染色确认。对赋予万古霉素耐药性的vanA基因进行PCR，用于确认感染小鼠中VRE的存在。
监测小鼠2周，然后将其安乐死。在将小鼠安乐死之前获得新鲜的粪便丸粒。将样本立即冷冻并储存在-80℃。使用96孔PowerSoil DNA分离试剂盒(MO-BIO)提取DNA。在PCR期间每个板最少一个样本-孔保持为空，以用作阴性对照。使用附带的Illumina适配器用正向引物S-D-Bact-0341-b-S-17和反向引物S-D-Bact-0785-a-A-21(Klindworth等人，Nucleic Acids Res.41,e1(2013))进行PCR。这些是靶向V3-V4区域的通用的细菌16S rDNA引物。使用以下PCR程序：98℃进行30秒，25×(98℃进行10秒，55℃进行20秒，72℃进行20秒)，72℃进行5分钟。通过将产物在1％琼脂糖凝胶上跑胶来验证扩增。在使用NexteraIndex Kit V2(Illumina)的套式PCR中加入条形码，使用以下PCR程序：98℃进行30秒，8×(98℃进行10秒，55℃进行20秒，72℃进行20秒)，72℃进行5分钟。通过将产物在1％琼脂糖凝胶上跑胶来验证引物的附着。
使用SequalPrep Normalization Plate Kit对来自套式PCR的产物进行归一化和合并。通过蒸发浓缩合并的文库，并使用Qubit High Sensitivity Assay Kit(ThermoFisher Scientific)在Qubit荧光计上测量合并的文库的DNA浓度。使用用于2×300bp配对末端测序的MiSeq Reagent Kit V3(Illumina)在MiSeq桌面测序仪上进行测序。使用64位版本的USEARCH(Edgar，2013)用于序列数据的生物信息学分析。
在HMO处理的小鼠中，VRE定植在14天内降至不可检测的水平。VRE的密度在5天内降低。未治疗的小鼠在结肠中继续存在大量的VRE。小鼠的治疗组也显示出紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)、特别是Barnesiella的丰度。
序列表
<110> 格礼卡姆股份公司
<120> HMO的混合物
<130> P19428WO
<150> EP15163044.9
<151> 2015-04-09
<150> EP15163045.6
<151> 2015-04-09
<150> EP15163047.2
<151> 2015-04-09
<150> EP15155450.8
<151> 2015-02-17
<150> EP15155454.0
<151> 2015-02-17
<150> EP15155457.3
<151> 2015-02-17
<150> EP15155460.7
<151> 2015-02-17
<150> EP14190374.0
<151> 2014-10-24
<160> 1
<170> BiSSAP 1.3.2
<210> 1
<211> 478
<212> PRT
<213> 长双歧杆菌婴儿亚种（Bifidobacterium longum subsp. infantis）
<400> 1
Met Asn Asn Pro Ala Asp Ala Gly Ile Asn Leu Asn Tyr Leu Ala Asn
1 5 10 15
Val Arg Pro Ser Ser Arg Gln Leu Ala Trp Gln Arg Met Glu Met Tyr
20 25 30
Ala Phe Leu His Phe Gly Met Asn Thr Met Thr Asp Arg Glu Trp Gly
35 40 45
Leu Gly His Glu Asp Pro Ala Leu Phe Asn Pro Arg Asn Val Asp Val
50 55 60
Asp Gln Trp Met Asp Ala Leu Val Ala Gly Gly Met Ala Gly Val Ile
65 70 75 80
Leu Thr Cys Lys His His Asp Gly Phe Cys Leu Trp Pro Ser Arg Leu
85 90 95
Thr Arg His Thr Val Ala Ser Ser Pro Trp Arg Glu Gly Lys Gly Asp
100 105 110
Leu Val Arg Glu Val Ser Glu Ser Ala Arg Arg His Gly Leu Lys Phe
115 120 125
Gly Val Tyr Leu Ser Pro Trp Asp Arg Thr Glu Glu Ser Tyr Gly Lys
130 135 140
Gly Lys Ala Tyr Asp Asp Phe Tyr Val Gly Gln Leu Thr Glu Leu Leu
145 150 155 160
Thr Gln Tyr Gly Pro Ile Phe Ser Val Trp Leu Asp Gly Ala Asn Gly
165 170 175
Glu Gly Lys Asn Gly Lys Thr Gln Tyr Tyr Asp Trp Asp Arg Tyr Tyr
180 185 190
Asn Val Ile Arg Ser Leu Gln Pro Asp Ala Val Ile Ser Val Cys Gly
195 200 205
Pro Asp Val Arg Trp Ala Gly Asn Glu Ala Gly His Val Arg Asp Asn
210 215 220
Glu Trp Ser Val Val Pro Arg Arg Leu Arg Ser Ala Glu Leu Thr Met
225 230 235 240
Glu Lys Ser Gln Gln Glu Asp Asp Ala Ser Phe Ala Thr Thr Val Ser
245 250 255
Ser Gln Asp Asp Asp Leu Gly Ser Arg Glu Ala Val Ala Gly Tyr Gly
260 265 270
Asp Asn Val Cys Trp Tyr Pro Ala Glu Val Asp Thr Ser Ile Arg Pro
275 280 285
Gly Trp Phe Tyr His Gln Ser Glu Asp Asp Lys Val Met Ser Ala Asp
290 295 300
Gln Leu Phe Asp Leu Trp Leu Ser Ala Val Gly Gly Asn Ser Ser Leu
305 310 315 320
Leu Leu Asn Ile Pro Pro Ser Pro Glu Gly Leu Leu Ala Glu Pro Asp
325 330 335
Val Gln Ser Leu Lys Gly Leu Gly Arg Arg Val Ser Glu Phe Arg Glu
340 345 350
Ala Leu Ala Ser Val Arg Cys Glu Ala Arg Thr Ser Ser Ala Ser Ala
355 360 365
Ala Ala Ala His Leu Val Asp Gly Asn Arg Asp Thr Phe Trp Arg Pro
370 375 380
Asp Ala Asp Asp Ala Ala Pro Ala Ile Thr Leu Thr Leu Pro Gln Pro
385 390 395 400
Thr Thr Ile Asn Ala Ile Val Ile Glu Glu Ala Ile Glu His Gly Gln
405 410 415
Arg Ile Glu His Leu Arg Val Thr Gly Ala Leu Pro Asp Gly Thr Glu
420 425 430
Arg Val Leu Gly Gln Ala Gly Thr Val Gly Tyr Arg Arg Ile Leu Arg
435 440 445
Phe Asp Asp Val Glu Val Ser Ser Val Thr Leu His Val Asp Gly Ser
450 455 460
Arg Leu Ala Pro Met Ile Ser Arg Ala Ala Ala Val Arg Ile
465 470 475

Claims (64)

1.一种HMO的混合物，其由以下组成：
-组分A，其为3-FL或DFL，
-组分B，其为LNT、LNnT、LNFP-I或2’-FL，
-组分C，其：
当组分B为LNT时为LNFP-II，或
当组分B为LNnT时为LNFP-III，或
当组分B为LNFP-I时为LNDFH-I，或
当组分B为2’-FL时为DFL，以及
-组分D，其：
当组分A为3-FL时为乳糖，或
当组分A为DFL时为2’-FL，
其条件是如果组分B为2’-FL，则组分A为3-FL。
2.根据权利要求1所述的混合物，其中：
-组分A为3-FL，
-(3-FL+组分B)相对于组分C的摩尔比为0.8-9.50，并且
-乳糖与组分C的摩尔比为1。
3.根据权利要求2所述的混合物，其中组分B为LNT或LNnT，并且3-FL与组分D的摩尔比和组分B与组分C的摩尔比中之一不大于2。
4.根据权利要求2或3所述的混合物，其中3-FL与组分B的摩尔比为0.07-7.7。
5.根据权利要求1或2所述的混合物，其中组分A为3-FL，并且组分B为LNFP-I或2’-FL，并且3-FL与组分C的摩尔比或组分B与组分C的摩尔比不大于2。
6.根据权利要求1所述的混合物，其中组分A为DFL。
7.根据权利要求6所述的混合物，其中组分C相对于(DFL+组分B)的摩尔比为至少1：10。
8.根据权利要求7所述的混合物，其中组分C相对于(DFL+组分B)的摩尔比为至少1：7。
9.根据权利要求7所述的混合物，其中组分C相对于(DFL+组分B)的摩尔比为至少1：5。
10.根据权利要求7所述的混合物，其中组分C相对于(DFL+组分B)的摩尔比为至少1：3。
11.根据权利要求6至10中任一项所述的混合物，其中DFL相对于组分B的摩尔比为0.17-6。
12.根据权利要求11所述的混合物，其中DFL相对于组分B的摩尔比为0.25-4。
13.根据权利要求11所述的混合物，其中DFL相对于组分B的摩尔比为1。
14.一种HMO的混合物，其由以下组成
-3-FL，
-组分E，其为LNT、LNnT或LNFP-I，以及
-组分F，其
当组分E为LNT时为LNFP-II，或
当组分E为LNnT时为LNFP-III，或
当组分E为LNFP-I时为LNDFH-I。
15.根据权利要求14所述的混合物，其中组分F相对于(3-FL+组分E)的摩尔比为至少1：10。
16.根据权利要求15所述的混合物，其中组分F相对于(3-FL+组分E)的摩尔比为至少1：7。
17.根据权利要求15所述的混合物，其中组分F相对于(3-FL+组分E)的摩尔比为至少1：5。
18.根据权利要求15所述的混合物，其中组分F相对于(3-FL+组分E)的摩尔比为至少1：3。
19.根据权利要求14至18中任一项所述的混合物，其中3-FL相对于组分E的摩尔比为0.05-21。
20.根据权利要求19所述的混合物，其中3-FL相对于组分E的摩尔比为0.13-7.7。
21.根据权利要求19所述的混合物，其中3-FL相对于组分E的摩尔比为1。
22.一种用于获得根据权利要求1至13中任一项所述的HMO的混合物的方法，其包括以下步骤：在α1-3/4岩藻糖苷转移酶的存在下，使组分A和组分B进行反应以制备反应混合物，然后从所述反应混合物中除去所述α1-3/4岩藻糖苷转移酶。
23.根据权利要求22所述的用于获得HMO的混合物的方法，所述方法包括以下步骤：在α1-3/4岩藻糖苷转移酶的存在下，使DFL和组分B以1：5至5：1的摩尔比进行反应，所述α1-3/4岩藻糖苷转移酶对于DFL和组分B的反应的转化率为至少10％至多60％。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述HMO的混合物为根据权利要求6所述的HMO的混合物。
25.根据权利要求23所述的方法，其中使DFL和组分B以1：3至3：1的摩尔比进行反应。
26.根据权利要求23所述的方法，其中使DFL和组分B以1：2至2：1的摩尔比进行反应。
27.根据权利要求23所述的方法，其中使DFL和组分B以1：1的摩尔比进行反应。
28.根据权利要求23所述的方法，其中所述α1-3/4岩藻糖苷转移酶对于DFL和组分B的反应的转化率为至少20％。
29.根据权利要求23所述的方法，其中所述α1-3/4岩藻糖苷转移酶对于DFL和组分B的反应的转化率为至少30％。
30.根据权利要求22所述的用于获得HMO的混合物的方法，在所述HMO的混合物中化合物A为3-FL，所述方法包括以下步骤：在α1-3/4岩藻糖苷转移酶的存在下，使3-FL和组分B以1：5至5：1的摩尔比进行反应，所述α1-3/4岩藻糖苷转移酶对于3-FL和组分B的反应的转化率为至少35％至多80％。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述HMO的混合物为根据权利要求2至5中任一项所述的HMO的混合物。
32.根据权利要求30所述的方法，其中使3-FL和组分B以1：3至3：1的摩尔比进行反应。
33.根据权利要求30所述的方法，其中使3-FL和组分B以1：2至2：1的摩尔比进行反应。
34.根据权利要求30所述的方法，其中使3-FL和组分B以1：1的摩尔比进行反应。
35.根据权利要求30所述的方法，其中所述α1-3/4岩藻糖苷转移酶对于3-FL和组分B的反应的转化率为至少40％。
36.根据权利要求30所述的方法，其中所述α1-3/4岩藻糖苷转移酶对于3-FL和组分B的反应的转化率为至少50％。
37.根据权利要求30至36中任一项所述的方法，其用于获得根据权利要求3所述的HMO的混合物。
38.根据权利要求30至32中任一项所述的方法，其包括以下步骤：在α1-3/4岩藻糖苷转移酶的存在下，使3-FL和组分B以1：3至3：1的摩尔比进行反应，所述α1-3/4岩藻糖苷转移酶对于3-FL和组分B的反应的转化率为至少35％至多70％。
39.根据权利要求38所述的方法，其中使3-FL和组分B以1：2至2：1的摩尔比进行反应。
40.根据权利要求38所述的方法，其中使3-FL和组分B以1：1的摩尔比进行反应。
41.根据权利要求38所述的方法，其中所述α1-3/4岩藻糖苷转移酶对于3-FL和组分B的反应的转化率为至少40％。
42.根据权利要求38所述的方法，其中所述α1-3/4岩藻糖苷转移酶对于3-FL和组分B的反应的转化率为至少50％。
43.一种用于获得HMO的混合物的方法，所述HMO的混合物由以下组成：
-3-FL，
-组分B，其为LNT、LNnT、LNFP-I或2’-FL，以及
-组分C，其
当组分B为LNT时为LNFP-II，或
当组分B为LNnT时为LNFP-III，或
当组分B为LNFP-I时为LNDFH-I，或
当组分B为2’-FL时为DFL，
所述方法包括以下步骤：在α1-3/4岩藻糖苷转移酶的存在下，使3-FL和组分B进行反应以制备反应混合物，然后从所述反应混合物中除去乳糖和所述α1-3/4岩藻糖苷转移酶。
44.根据权利要求43所述的方法，其用于获得根据权利要求14至21中任一项所述的混合物。
45.根据权利要求43或44所述的方法，其包括以下步骤：在α1-3/4岩藻糖苷转移酶的存在下，使3-FL和组分B以1：5至5：1的摩尔比进行反应，所述α1-3/4岩藻糖苷转移酶对于3-FL和组分B的反应的转化率为至少35％至多80％。
46.根据权利要求45所述的方法，其中使3-FL和组分B以1：3至3：1的摩尔比进行反应。
47.根据权利要求45所述的方法，其中使3-FL和组分B以1：2至2：1的摩尔比进行反应。
48.根据权利要求45所述的方法，其中使3-FL和组分B以1：1的摩尔比进行反应。
49.根据权利要求45所述的方法，其中所述α1-3/4岩藻糖苷转移酶对于3-FL和组分B的反应的转化率为至少40％。
50.根据权利要求45所述的方法，其中所述α1-3/4岩藻糖苷转移酶对于3-FL和组分B的反应的转化率为至少50％。
51.一种用于治疗细菌感染的抗感染组合物，其包括：
-3-FL，
-组分B，其为LNT、LNnT、LNFP-I或2’-FL，以及
-组分C，其：
当组分B为LNT时为LNFP-II，或
当组分B为LNnT时为LNFP-III，或
当组分B为LNFP-I时为LNDFH-I，或
当组分B为2’-FL时为DFL。
52.一种用于治疗细菌感染的抗感染组合物，其由以下组成：
-3-FL，
-组分B，其为LNT、LNnT、LNFP-I或2’-FL，以及
-组分C，其：
当组分B为LNT时为LNFP-II，或
当组分B为LNnT时为LNFP-III，或
当组分B为LNFP-I时为LNDFH-I，或
当组分B为2’-FL时为DFL。
53.一种用于治疗细菌感染的抗感染组合物，其由以下组成：
-3-FL，
-组分B，其为LNT、LNnT、LNFP-I或2’-FL，
-组分C，其：
当组分B为LNT时为LNFP-II，或
当组分B为LNnT时为LNFP-III，或
当组分B为LNFP-I时为LNDFH-I，或
当组分B为2’-FL时为DFL，以及
-乳糖。
54.一种用于治疗细菌感染的抗感染组合物，其包括：
-DFL，
-组分E，其为LNT、LNnT或LNFP-I，
-组分F，其
当组分E为LNT时为LNFP-II，或
当组分E为LNnT时为LNFP-III，或
当组分E为LNFP-I时为LNDFH-I，以及
-2’-FL。
55.一种用于治疗细菌感染的抗感染组合物，其由以下组成：
-DFL，
-组分E，其为LNT、LNnT或LNFP-I，
-组分F，其
当组分E为LNT时为LNFP-II，或
当组分E为LNnT时为LNFP-III，或
当组分E为LNFP-I时为LNDFH-I，以及
-2’-FL。
56.组合物在制备用于调节人微生物组以增加双歧杆菌(Bifidobacterium)丰度和Barnesiella丰度的药物中的用途，
i)所述组合物包括：
-3-FL，
-组分B，其为LNT、LNnT、LNFP-I或2’-FL，以及
-组分C，其：
当组分B为LNT时为LNFP-II，或
当组分B为LNnT时为LNFP-III，或
当组分B为LNFP-I时为LNDFH-I，或
当组分B为2’-FL时为DFL；
或者
ii)所述组合物由以下组成：
-3-FL，
-组分B，其为LNT、LNnT、LNFP-I或2’-FL，以及
-组分C，其：
当组分B为LNT时为LNFP-II，或
当组分B为LNnT时为LNFP-III，或
当组分B为LNFP-I时为LNDFH-I，或
当组分B为2’-FL时为DFL；以及
-乳糖；
或者
iii)所述组合物包括：
-DFL
-组分E，其为LNT、LNnT或LNFP-I，
-岩藻糖基化组分F，其：
当组分E为LNT时为LNFP-II，或
当组分E为LNnT时为LNFP-III，或
当组分E为LNFP-I时为LNDFH-I，以及
-2’-FL。
57.根据权利要求56所述的用途，其用于减少厚壁菌(Firmicutes)丰度。
58.根据权利要求57所述的用途，其用于减少梭状芽孢杆菌(Clostridia)。
59.根据权利要求56所述的用途，其中i)中的组合物由以下组成：
-3-FL，
-组分B，其为LNT、LNnT、LNFP-I或2’-FL，以及
-组分C，其：
当组分B为LNT时为LNFP-II，或
当组分B为LNnT时为LNFP-III，或
当组分B为LNFP-I时为LNDFH-I，或
当组分B为2’-FL时为DFL。
60.根据权利要求56所述的用途，其中iii)中的组合物由以下组成：
-DFL
-组分E，其为LNT、LNnT或LNFP-I，
-岩藻糖基化组分F，其：
当组分E为LNT时为LNFP-II，或
当组分E为LNnT时为LNFP-III，或
当组分E为LNFP-I时为LNDFH-I，以及
-2’-FL。
61.组合物在制备用于预防或治疗人细菌感染的药物中的用途，i)所述组合物包括：
-3-FL，
-组分B，其为LNT、LNnT、LNFP-I或2’-FL，以及
-组分C，其：
当组分B为LNT时为LNFP-II，或
当组分B为LNnT时为LNFP-III，或
当组分B为LNFP-I时为LNDFH-I，或
当组分B为2’-FL时为DFL；
或者
ii)所述组合物由以下组成：
-3-FL，
-组分B，其为LNT、LNnT、LNFP-I或2’-FL，以及
-组分C，其：
当组分B为LNT时为LNFP-II，或
当组分B为LNnT时为LNFP-III，或
当组分B为LNFP-I时为LNDFH-I，或
当组分B为2’-FL时为DFL；以及
-乳糖；
或者
iii)所述组合物包括：
-DFL，
-组分E，其为LNT、LNnT或LNFP-I，
-岩藻糖基化组分F，其：
当组分E为LNT时为LNFP-II，或
当组分E为LNnT时为LNFP-III，或
当组分E为LNFP-I时为LNDFH-I，以及
-2’-FL。
62.根据权利要求61所述的用途，其中所述细菌感染是抗生素耐药性细菌感染。
63.根据权利要求61所述的用途，其中i)中的组合物由以下组成：
-3-FL，
-组分B，其为LNT、LNnT、LNFP-I或2’-FL，以及
-组分C，其：
当组分B为LNT时为LNFP-II，或
当组分B为LNnT时为LNFP-III，或
当组分B为LNFP-I时为LNDFH-I，或
当组分B为2’-FL时为DFL。
64.根据权利要求61所述的用途，其中iii)中的组合物由以下组成：
-DFL，
-组分E，其为LNT、LNnT或LNFP-I，
-岩藻糖基化组分F，其：
当组分E为LNT时为LNFP-II，或
当组分E为LNnT时为LNFP-III，或
当组分E为LNFP-I时为LNDFH-I，以及
-2’-FL。
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