DE12746649T1 - Biosynthese menschlicher milcholigosaccaride in manipulierten Bakterien - Google Patents

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Abstract

Verfahren zum Herstellen eines fukosylierten Oligosaccharids in einem Bakterium, umfassend Bereitstellen eines Bakteriums, wobei dieses Bakterium ein funktionelles β-Galaktosidasegen, ein exogenes Fukosyltransferasegen, einen GDP-Fukosesyntheseweg, ein funktionelles Laktosepermeasegen umfasst; Kultivieren dieses Bakteriums in der Anwesenheit von Laktose; und Rückgewinnen eines fukosylierten Oligosaccharids von diesem Bakterium oder von einem Kulturüberstand dieses Bakteriums.

Claims (38)

  1. Verfahren zum Herstellen eines fukosylierten Oligosaccharids in einem Bakterium, umfassend Bereitstellen eines Bakteriums, wobei dieses Bakterium ein funktionelles β-Galaktosidasegen, ein exogenes Fukosyltransferasegen, einen GDP-Fukosesyntheseweg, ein funktionelles Laktosepermeasegen umfasst; Kultivieren dieses Bakteriums in der Anwesenheit von Laktose; und Rückgewinnen eines fukosylierten Oligosaccharids von diesem Bakterium oder von einem Kulturüberstand dieses Bakteriums.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei dieses β-Galaktosidasegen ein E. coli-lacZ-Gen umfasst.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei dieses β-Galaktosidasegen ein endogenes β-Galaktosidasegen oder ein exogenes β-Galaktosidasegen ist.
  4. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei dieses Bakterium einen erhöhten intrazellulären Laktosepool anhäuft und ein niedriges Level von β-Galaktosidase produziert.
  5. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei dieses exogene Fukosyltransferasegen α(1,2)Fukosyltransferase oder α(1,3)Fukosyltransferase kodiert.
  6. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei dieses α(1,2)Fukosyltransferasegen ein wcfW-Gen von Bacteroides fragilis umfasst.
  7. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei dieses α(1,3)Fukosyltransferasegen ein futA-Gen von Helicobacter pylori 26695 umfasst.
  8. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei dieses Bakterium sowohl ein exogenes Fukosyltransferasegen, das α(1,2)Fukosyltransferase kodiert, als auch ein exogenes Fukosyltransferasegen, das α(1,3)Fukosyltransferase kodiert, umfasst.
  9. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der GDP-Fukosesyntheseweg endogene Enzyme oder exogene Enzyme umfasst.
  10. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei dieses Laktosepermeasegen ein endogenes Laktosepermeasegen oder ein exogenes Laktosepermeasegen ist.
  11. Verfahren zum Herstellen eines fukosylierten Oligosaccharids in einem Bakterium, umfassend Bereitstellen eines enterischen Bakteriums, wobei dieses Bakterium ein funktionelles β-Galaktosidasegen, ein exogenes Fukosyltransferasegen, eine Mutation in einem Colansäuresynthesegen und ein funktionelles Laktosepermeasegen umfasst; Kultivieren dieses Bakteriums in der Anwesenheit von Laktose; und Rückgewinnen eines fukosylierten Oligosaccharids von diesem Bakterium oder von einem Kulturüberstand dieses Bakteriums.
  12. Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei dieses β-Galaktosidasegen ein E. coli-lacZ-Gen umfasst.
  13. Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei dieses exogene Fukosyltransferasegen α(1,2)Fukosyltransferase oder α(1,3)Fukosyltransferase kodiert.
  14. Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei dieses enterische Bakterium E. coli umfasst.
  15. Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei dieses Colansäuresynthesegen ein wcaJ-Gen umfasst.
  16. Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei dieses Bakterium weiterhin eine Mutation in einem Ion-Gen umfasst.
  17. Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei dieses Bakterium ein funktionelles Wildtyp-lacZ+-Gen von E. coli, insertiert in ein endogenes Ion-Gen, umfasst.
  18. Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei ein endogenes lacZ-Gen dieses E. coli deletiert ist.
  19. Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei dieses Bakterium weiterhin ein exogenes rcsA- oder rcsB-Gen umfasst.
  20. Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei dieses Bakterium weiterhin eine Mutation in einem lacA-Gen umfasst.
  21. Verfahren zum Herstellen einer 3'-Sialyl-3-fukosyllaktose (3'-S3FL) in einem Bakterium, wobei dieses Bakterium ein funktionelles β-Galaktosidasegen, ein exogenes Sialyltransferasegen, ein exogenes Fukosyltransferasegen, einen GDP-Fukosesyntheseweg, einen defizienten Sialinsäure-katabolischen Weg, eine Sialinsäure-synthetische Fähigkeit und ein funktionelles Laktosepermeasegen umfasst; Kultivieren dieses Bakteriums in der Anwesenheit von Laktose; und Rückgewinnen dieser 3'-S3FL von diesem Bakterium oder von einem Kulturüberstand dieses Bakteriums.
  22. Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei dieses exogene Sialyltransferasegen α(2,3)Sialyltransferase kodiert.
  23. Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei dieses exogene Fukosyltransferasegen α(1,3)Fukosyltransferase kodiert.
  24. Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei dieser defiziente Sialinsäure-katabolische Weg eine Nullmutation in endogenen N-Acetylneuraminatlyase- oder N-Acetylmannosaminkinase-Genen umfasst.
  25. Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei diese Sialinsäure-synthetische Fähigkeit ein exogenes UDP-GlcNAc-2-Epimerasegen, ein exogenes Neu5Ac-Synthasegen oder ein exogenes CMP-Neu5Ac-Synthetasegen umfasst.
  26. Verfahren zum Herstellen einer 3'-Sialyl-3-fukosyllaktose (3'-S3FL) in einem enterischen Bakterium, wobei dieses enterische Bakterium ein funktionelles lacZ-Gen, ein exogenes Fukosyltransferasegen, ein exogenes Sialyltransferasegen, eine Mutation in einem endogenen Colansäuresynthesegen, ein funktionelles Laktosepermeasegen, einen defizienten Sialinsäure-katabolischen Weg und Sialinsäure-synthetische Fähigkeit umfasst; Kultivieren dieses Bakteriums in der Anwesenheit von Laktose; und Rückgewinnen dieses 3'-S3FL von diesem Bakterium oder von einem Kulturüberstand dieses Bakteriums.
  27. Verfahren gemäß Anspruch 26, wobei dieses exogene Fukosyltransferasegen eine α(1,3)Fukosyltransferase kodiert.
  28. Verfahren gemäß Anspruch 26, wobei dieses exogene Sialyltransferasegen eine α(2,3)Sialyltransferase kodiert.
  29. Verfahren gemäß Anspruch 26, wobei dieser defiziente Sialinsäure-katabolische Weg eine Nullmutation in endogenen N-Acetylneuraminatlyase- oder N-Acetylmannosaminkinasegenen umfasst.
  30. Verfahren gemäß Anspruch 26, wobei diese Sialinsäure-synthetische Fähigkeit ein exogenes UDP-GlcNAc-2-Epimerasegen, ein exogenes Neu5Ac-Synthasegen oder ein exogenes CMP-Neu5Ac-Synthetasegen umfasst.
  31. Verfahren zum phänotypischen Markieren eines Gen-Locus in einer Wirtszelle, deren natives β-Galaktosidasegen deletiert oder inaktiviert ist, unter Verwendung eines insertierten rekombinanten β-Galaktosidasegens, das konstruiert wurde, um ein niedriges, aber nachweisbares Level von β-Galaktosidaseaktivität zu produzieren.
  32. Verfahren zum Abreichern einer bakteriellen Kultur von Restlaktose in einer β-Galaktosidase-negativen Wirtszelle, deren natives β-Galaktosidasegen deletiert oder inaktiviert ist, unter Verwendung eines insertierten rekombinanten β-Galaktosidasegens, das konstruiert wurde, um ein niedriges, aber nachweisbares Level von β-Galaktosidaseaktivität zu produzieren.
  33. Verfahren zum Nachweisen bakterieller Zelllyse in einer Kultur einer β-Galaktosidase-negativen Wirtszelle, deren natives β-Galaktosidasegen deletiert oder inaktiviert ist, unter Verwendung eines insertierten rekombinanten β-Galaktosidasegens, das konstruiert wurde, um ein niedriges, aber nachweisbares Level von β-Galaktosidaseaktivität zu produzieren.
  34. Verfahren zum Reinigen eines fukosylierten Oligosaccharids, produziert durch das Verfahren gemäß Anspruch 1, umfassend das Binden dieses fukosylierten Oligosaccharids von einem bakteriellen Zelllysat oder bakteriellen Zellkulturüberstand dieses Bakteriums an eine Kohlenstoffsäule und Eluieren dieses fukosylierten Oligosaccharids von dieser Säule.
  35. Isoliertes E. coli-Bakterium, umfassend einen fehlerhaften Colansäuresyntheseweg, ein reduziertes Level von β-Galaktosidaseaktivität und ein exogenes Fukosyltransferasegen.
  36. Gereinigtes fukosyliertes Oligosaccharid, produziert durch das Verfahren gemäß Anspruch 1.
  37. Nukleinsäurekonstrukt, umfassend ein exogenes Fukosyltransferasegen, transformiert in einen bakteriellen Wirtsstamm, der ein deletiertes endogenes β-Galaktosidasegen, ein funktionelles Ersatz-β-Galaktosidasegen von niedriger Aktivität, einen GDP-Fukosesyntheseweg, ein funktionelles Laktosepermeasegen und ein deletiertes Laktoseacetyltransferasegen umfasst.
  38. Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 37, wobei dieses exogene Fukosyltransferasegen eine α(1,2)Fukosyltransferase oder α(1,3)Fukosyltransferase kodiert.
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