JP2017093432A - 操作された細菌におけるヒト乳オリゴ糖の生合成 - Google Patents
操作された細菌におけるヒト乳オリゴ糖の生合成 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2017093432A JP2017093432A JP2016225751A JP2016225751A JP2017093432A JP 2017093432 A JP2017093432 A JP 2017093432A JP 2016225751 A JP2016225751 A JP 2016225751A JP 2016225751 A JP2016225751 A JP 2016225751A JP 2017093432 A JP2017093432 A JP 2017093432A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- exogenous
- fucosyltransferase
- lactose
- bacterium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H13/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids
- C07H13/02—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids
- C07H13/04—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids having the esterifying carboxyl radicals attached to acyclic carbon atoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H3/00—Compounds containing only hydrogen atoms and saccharide radicals having only carbon, hydrogen, and oxygen atoms
- C07H3/06—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2468—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on beta-galactose-glycoside bonds, e.g. carrageenases (3.2.1.83; 3.2.1.157); beta-agarase (3.2.1.81)
- C12N9/2471—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
- C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
- C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
- C12Y204/01065—3-Galactosyl-N-acetylglucosaminide 4-alpha-L-fucosyltransferase (2.4.1.65), i.e. alpha-1-3 fucosyltransferase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01023—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y306/00—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6)
- C12Y306/03—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6) acting on acid anhydrides; catalysing transmembrane movement of substances (3.6.3)
- C12Y306/03018—Oligosaccharide-transporting ATPase (3.6.3.18)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Abstract
Description
本出願は、35 U.S.C.§119(e)の下で、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、2011年2月16日に提出された米国特許仮出願第61/443,470号に対する優先権の恩典を主張する。
本発明は、精製オリゴ糖、特にヒト乳中に典型的に見いだされるある種のフコシル化および/またはシアリル化オリゴ糖を産生するための組成物および方法を提供する。
ヒト乳は、多様で豊富な一連の中性および酸性オリゴ糖(ヒト乳オリゴ糖、HMOS)を含む。これらの分子の多くは、乳児によって栄養として直接利用されないが、とはいえ健康な腸マイクロビオームの確立、疾患の予防、および免疫機能において重要な役割を果たす。本明細書において記述される本発明より前では、HMOSを大規模で安価に産生する能力には問題があった。たとえば、化学合成によるHMOS産生は、立体特異性の問題、前駆体の利用能、生成物の不純物、および総じて高い費用により制限された。そのため、多様な商業的応用のために大量のHMOSを安価に製造するための新規戦略が緊急に必要である。
機能的β-ガラクトシダーゼ遺伝子、外因性のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子、GDP-フコース合成経路、機能的ラクトースパーミアーゼ遺伝子を含む細菌を提供する段階;
ラクトースの存在下で該細菌を培養する段階;および
該細菌からまたは該細菌の培養上清からフコシル化オリゴ糖を回収する段階、
を含む、細菌においてフコシル化オリゴ糖を産生する方法。
[本発明1002]
β-ガラクトシダーゼ遺伝子が大腸菌(E. coli)lacZ遺伝子を含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
β-ガラクトシダーゼ遺伝子が内因性のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子または外因性のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子である、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記細菌が、増加した細胞内ラクトースプールを蓄積し、かつ低レベルβ-ガラクトシダーゼを産生する、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記外因性のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子がα(1,2)フコシルトランスフェラーゼまたはα(1,3)フコシルトランスフェラーゼをコードする、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ遺伝子がバクテロイデス・フラギリス(Bacteroides fragilis)wcfW遺伝子を含む、本発明1005の方法。
[本発明1007]
前記α(1,3)フコシルトランスフェラーゼ遺伝子が、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)26695 futA遺伝子を含む、本発明1005の方法。
[本発明1008]
前記細菌が、α(1,2)フコシルトランスフェラーゼをコードする外因性のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子およびα(1,3)フコシルトランスフェラーゼをコードする外因性のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子の両方を含む、本発明1005の方法。
[本発明1009]
前記GDP-フコース合成経路が内因性の酵素または外因性の酵素を含む、本発明1001の方法。
[本発明1010]
前記ラクトースパーミアーゼ遺伝子が、内因性のラクトースパーミアーゼ遺伝子または外因性のラクトースパーミアーゼ遺伝子である、本発明1001の方法。
[本発明1011]
機能的β-ガラクトシダーゼ遺伝子、外因性のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子、コラン酸合成遺伝子における変異、および機能的ラクトースパーミアーゼ遺伝子を含む腸内細菌を提供する段階;
ラクトースの存在下で該細菌を培養する段階;および
該細菌からまたは該細菌の培養上清からフコシル化オリゴ糖を回収する段階、
を含む、細菌においてフコシル化オリゴ糖を産生する方法。
[本発明1012]
前記β-ガラクトシダーゼ遺伝子が、大腸菌lacZ遺伝子を含む、本発明1011の方法。
[本発明1013]
前記外因性のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子がα(1,2)フコシルトランスフェラーゼまたはα(1,3)フコシルトランスフェラーゼをコードする、本発明1011の方法。
[本発明1014]
前記腸内細菌が大腸菌を含む、本発明1011の方法。
[本発明1015]
前記コラン酸合成遺伝子がwcaJ遺伝子を含む、本発明1014の方法。
[本発明1016]
前記細菌がlon遺伝子における変異をさらに含む、本発明1014の方法。
[本発明1017]
前記細菌が内因性のlon遺伝子に挿入された機能的な野生型大腸菌lacZ+遺伝子を含む、本発明1014の方法。
[本発明1018]
前記大腸菌の内因性のlacZ遺伝子が欠失している、本発明1014の方法。
[本発明1019]
前記細菌が外因性のrcsAまたはrcsB遺伝子をさらに含む、本発明1014の方法。
[本発明1020]
前記細菌がlacA遺伝子における変異をさらに含む、本発明1014の方法。
[本発明1021]
機能的β-ガラクトシダーゼ遺伝子、外因性のシアリル-トランスフェラーゼ遺伝子、外因性のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子、GDP-フコース合成経路、欠陥(deficient)シアル酸異化経路、シアル酸合成能、および機能的ラクトースパーミアーゼ遺伝子を含む細菌において、3'-シアリル-3-フコシルラクトース(3'-S3FL)を産生する方法:
ラクトースの存在下で該細菌を培養する段階;および
該細菌からまたは該細菌の培養上清から3'-S3FLを回収する段階。
[本発明1022]
前記外因性のシアリル-トランスフェラーゼ遺伝子がα(2,3)シアリル-トランスフェラーゼをコードする、本発明1021の方法。
[本発明1023]
前記外因性のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子が、α(1,3)フコシルトランスフェラーゼをコードする、本発明1021の方法。
[本発明1024]
前記欠陥シアル酸異化経路が内因性のN-アセチルノイラミネートリアーゼまたはN-アセチルマンノサミンキナーゼ遺伝子においてヌル変異を含む、本発明1021の方法。
[本発明1025]
前記シアル酸合成能が、外因性のUDP-GlcNAc 2-エピメラーゼ遺伝子、外因性のNeu5Acシンターゼ遺伝子、または外因性のCMP-Neu5Acシンテターゼ遺伝子を含む、本発明1021の方法。
[本発明1026]
機能的lacZ遺伝子、外因性のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子、外因性のシアリルトランスフェラーゼ遺伝子、内因性のコラン酸合成遺伝子における変異、機能的ラクトースパーミアーゼ遺伝子、欠陥シアル酸異化経路、およびシアル酸合成能を含む腸内細菌において、3'-シアリル-3-フコシルラクトース(3'-S3FL)を産生する方法:
ラクトースの存在下で該細菌を培養する段階;および
該細菌からまたは該細菌の培養上清から3'-S3FLを回収する段階。
[本発明1027]
前記外因性のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子がα(1,3)フコシルトランスフェラーゼをコードする、本発明1026の方法。
[本発明1028]
前記外因性のシアリルトランスフェラーゼ遺伝子がα(2,3)シアリルトランスフェラーゼをコードする、本発明1026の方法。
[本発明1029]
前記欠陥シアル酸異化経路が、内因性のN-アセチルノイラミネートリアーゼまたはN-アセチルマンノサミンキナーゼ遺伝子においてヌル変異を含む、本発明1026の方法。
[本発明1030]
前記シアル酸合成能が外因性のUDP-GlcNAc 2-エピメラーゼ遺伝子、外因性のNeu5Acシンターゼ遺伝子、または外因性のCMP-Neu5Acシンテターゼ遺伝子を含む、本発明1026の方法。
[本発明1031]
低いが検出可能なレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性を生じるように操作されている挿入された組み換え型β-ガラクトシダーゼ遺伝子を利用することによる、その本来のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子が欠失しているかまたは不活化されている宿主細胞における遺伝子座の表現型標識(phenotypic marking)法。
[本発明1032]
低いが検出可能なレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性を生じるように操作されている挿入された組み換え型β-ガラクトシダーゼ遺伝子を利用することによって、その本来のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子が欠失しているかまたは不活化されているβ-ガラクトシダーゼ陰性宿主細胞において残留ラクトースを細菌培養から枯渇させる方法。
[本発明1033]
低いが検出可能なレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性を生じるように操作されている挿入された組み換え型β-ガラクトシダーゼ遺伝子を利用することによって、その本来のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子が欠失しているかまたは不活化されているβ-ガラクトシダーゼ陰性宿主細胞の培養物において細菌細胞の溶解を検出する方法。
[本発明1034]
細菌細胞溶解物または細菌の細菌細胞培養上清からのフコシル化オリゴ糖をカーボンカラムに結合させる段階、および該カラムからフコシル化オリゴ糖を溶出させる段階を含む、本発明1001の方法によって産生されたフコシル化オリゴ糖を精製する方法。
[本発明1035]
欠陥コラン酸合成経路、低減されたレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性、および外因性のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む、単離された大腸菌細菌。
[本発明1036]
本発明1001の方法によって産生された精製フコシル化オリゴ糖。
[本発明1037]
欠失した内因性β-ガラクトシダーゼ遺伝子、低活性の置換機能的β-ガラクトシダーゼ遺伝子、GDP-フコース合成経路、機能的ラクトースパーミアーゼ遺伝子、および欠失したラクトースアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含む細菌宿主株に形質転換された外因性のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む核酸構築物。
[本発明1038]
前記外因性のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子が、α(1,2)フコシルトランスフェラーゼまたはα(1,3)フコシルトランスフェラーゼをコードする、本発明1037の核酸構築物。
本発明の他の特色および利点は、好ましい態様に関する以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。それ以外であると明記している場合を除き、本明細書において用いられる全ての科学技術用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書において記述される方法および材料と類似または同等の方法および材料を、本発明の実践または試験において用いることができるが、適した方法および材料を以下に記述する。本明細書において引用された公開された外国の特許および特許出願は全て、参照により本明細書に組み入れられる。本明細書において引用されたアクセッション番号によって示されるGenbankおよびNCBI提出物は、参照により本明細書に組み入れられる。本明細書において引用された他の全ての公開された参考文献、文書、原稿および科学論文は、参照により本明細書に組み入れられる。矛盾する場合は、定義を含めて本明細書が優先するであろう。さらに、材料、方法、および実施例は説明するために限られ、制限的であると意図されない。
オリゴ糖(HMOS)とその複合糖質の両方を含むヒト乳グリカンは、ヒト乳児の保護および発育、ならびに特に乳児の消化管(GI)において有意な役割を果たす。様々な哺乳動物において見いだされる乳オリゴ糖は大きく異なり、ヒトにおけるその組成は独自である(Hamosh M., 2001 Pediatr Clin North Am, 48:69-86; Newburg D.S., 2001 Adv Exp Med Biol, 501 :3-10)。その上、ヒト乳中のグリカンレベルは、授乳期間のあいだでも変化して、また個体間でも広く変化する(Morrow A.L. et al., 2004 J Pediatr, 145:297-303; Chaturvedi P et al., 2001 Glycobiology, 11 :365-372)。これまで、HMOSの役割を完全に調べることは、これらの化合物を適切に特徴付けして測定することができなかったために限られていた。近年、中性および酸性HMOSの両方を分析するための感度のよい再現性のよい定量的方法が開発されている(Erney, R., Hilty, M., Pickering, L., Ruiz-Palacios, G., and Prieto, P. (2001) Adv Exp Med Biol 501, 285-297. Bao, Y., and Newburg, D. S. (2008) Electrophoresis 29, 2508-2515)。およそ200個の別個のオリゴ糖がヒト乳中において同定されており、この多様性の原因となっているのは少数の単純なエピトープの組み合わせである(Newburg D.S., 1999 Curr Med Chem, 6:117-127; Ninonuevo M. et al, 2006 J Agric Food Chem, 54:7471-74801)。HMOSは、5種類の単糖類、すなわちD-グルコース(Glc)、D-ガラクトース(Gal)、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、L-フコース(Fuc)、およびシアル酸(N-アセチルノイラミン酸、Neu5Ac、NANA)で構成される。HMOSは、通常、その化学構造に従って2つの群、すなわちGlc、Gal、GlcNAcおよびFucを含み、ラクトース(Galβ1-4 Glc)コアに結合した中性化合物と、同じ糖を含み、しばしば同じコア構造に加えてNANAを含む酸性化合物とに分けられる(Charlwood J. et al, 1999 Anal Biochem, 273:261-277; Martin-Sosa et al, 2003 J Dairy Sci, 86:52-59; Parkkinen J. and Finne J., 1987 Methods Enzymol, 138:289-300; Shen Z. et al, 2001 J Chromatogr A, 921:315-321)。ヒト乳中のオリゴ糖のおよそ70〜80%がフコシル化され、その合成経路は、図1に示される経路と類似の様式で進行すると考えられる(タイプIおよびタイプII亜群は、異なる前駆体分子によって始まる)。ヒト乳中のオリゴ糖のより小さい割合がシアリル化されるか、またはフコシル化されてシアリル化される。図2は、シアリル化(酸性)HMOSに関して可能性がある生合成経路を概要するが、ヒトにおける実際の合成経路はまだ完全には定義されていない。
大腸菌K12原栄養体W3110を、フコシル化HMOS生合成のための親バックグラウンドとして選択した。この株は、トリプトファン誘導PtrpB-cI+リプレッサー構築物の導入によってampC座で既に改変されており(McCoy, J. & Lavallie, E. Current protocols in molecular biology/edited by Frederick M. Ausubel...[et al.] (2001))、ミリモル濃度のトリプトファンによる誘導(Mieschendahl, M., Petri, T. & Hanggi, U. Nature Biotechnology 4, 802-808 (1986))を通して、ファージλPLプロモーターからの組み換え型タンパク質の経済的産生を可能にする(Sanger, F., Coulson, A. R., Hong, G. F., Hill, D. F. & Petersen, G. B. J Mol Biol 162, 729-773 (1982))。ampCにおいてトリプトファン誘導PtrpB-cI+リプレッサー構築物を含む大腸菌W3110誘導体である株GI724を、さらなる大腸菌株操作の基礎として用いた(図14)。
ampC::(PtrpBλcI+), PlacI q(ΔlacI-lacZ)158lacY+, ΔwcaJ, thyA748::Tn10, Δlon::(kan, lacZ+)
ampC::(PtrpBλcl+), PlacI q(ΔlacI-lacZ)158lacY+, ΔwcaJ, thyA748::Tn10, Δlon::(kan, lacZ+)ΔlacA
様々な代替α(1,2)フコシルトランスフェラーゼが糖アクセプターとしてラクトースを利用することができ、大腸菌E214、E390、またはE403において適切な培養条件で発現させる場合、2'-FL合成の目的にとって利用可能である。たとえば、プラスミドpG175(ColE1, thyA+, bla+, PL2-wbsJ, rcsA+)(SEQ ID NO: 1、図7)は、大腸菌株O128:B12のwbsJα(1,2)フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を有し、大腸菌株E403において2'-FLの産生を指示することができる。もう1つの例において、プラスミドpG171(ColE1, thyA+, bla+, PL2-futC, rcsA+)(SEQ ID NO: 5)は、H.ピロリ26695. futCα(1,2)フコシルトランスフェラーゼ遺伝子(Wang, G., Rasko, D. A., Sherburne, R. & Taylor, D. E. Mol Microbiol 31, 1265-1274 (1999))を有し、同様に株E403において2'-FLの産生を指示するであろう。好ましい例において、プラスミドpG180(ColE1, thyA+, bla+, PL2-wcfW, rcsA+)(SEQ ID NO: 6)は、本発明のこれまで特徴付けされていないバクテロイデス・フラギリスNCTC 9343 wcfWα(1,2)フコシルトランスフェラーゼ遺伝子を有し、大腸菌株E403において2'-FLの産生を指示する。
2'-FLは、プラスミドpG171、pG175、またはpG180のいずれか1つによって形質転換された、宿主大腸菌株E214、E390、またはE403のいずれか1つによってバイオリアクターにおいて産生することができる。形質転換株の生育は、10 L作業容量のバイオリアクターにおいて、溶存酸素、pH、ラクトース基質、消泡剤、および栄養レベルの制御下で最少の培地中で行われる。最少の「FERM」培地をバイオリアクターにおいて用い、これを以下に詳細に記述する。
Ferm(10リットル):以下を含む最少培地
40g (NH4)2HPO4
lOOg KH2PO4
lOg MgSO4.7H2O
40g NaOH
微量元素:
1.3g NTA
0.5g FeSO4.7H2O
0.09g MnCl2.4H2O
0.09g ZnSO4.7H2O
O.Olg CoCl2.6H2O
O.Olg CuCl2.2H2O
O.O2g H3BO3
O.Olg Na2MoO4.2H2O(pH 6.8)
水を加えて10リットルにする
DF204消泡剤(O.lml/L)
グリセロール150 g(初回バッチ生育)の後に流加培養モードで90%グリセロール-1%MgSO4-1×微量元素を、様々な速度で様々な時間に与える。
大腸菌発酵ブロスからの2'-FL精製は、5つの段階を通して行われる。
発酵ブロスを回収して、細胞を6000×gで30分の分取遠心分離機での沈降によって除去する。各バイオリアクター実行は、部分的清澄化上清約5〜7 Lを生じる。清澄化上清は、発酵の過程で生じたカラメル化糖の分画により、特に発酵培地に存在するアンモニウムイオンによって促進される副反応により、茶色/オレンジ色の着色を有する。
粗目カーボン(Calgon 12×40 TR)を充填した容積〜1000 mlのカラム(寸法は、直径5 cm×長さ60 cm)を1カラム容積(CV)の水によって平衡にして、清澄化培養上清を流速40 ml/分でロードする。このカラムは、糖(ラクトース)約120 gの全容量を有する。ローディングおよび糖の捕捉後、カラムを1.5 CVの水によって洗浄した後、50%エタノールまたは25%イソプロパノール(この段階では、生成物を溶出するためにはエタノールの低濃度(25〜30%)で十分でありうる)の2.5 CVによって溶出する。この溶媒溶出段階は、カラム上の総結合糖の約95%および少量の着色体(カラメル)を放出する。この最初の段階では、糖の最大量を捕捉することが主目的である。混入物の分離は目的ではない。カラムは、5 CVの水による洗浄によって再生することができる。
捕捉カラムからのエタノールまたはイソプロパノール溶出物の2.5 L量を56℃でロータリーエバポレートして、糖シロップ水を作製する(これは典型的に黄色-茶色である)。この段階のために用いられうる代替法には、凍結乾燥または噴霧乾燥が挙げられる。
Biotage Isolera One FLASH Chromatography Systemに接続したカラム(GE Healthcare HiScale50/40、5×40 cm、最大圧20 bar)にDarco活性炭G60(100メッシュ):celite 535(粗目)の1:1混合物750 mlを充填する(いずれのカラム充填剤もSigmaから得た)。カラムを5 CVの水によって平衡にして、Celiteローディングカートリッジまたは直接注射のいずれかを用いて、段階3からの糖(混入ラクトースに対する2'-FLの比率に応じて10〜50 g)をロードする。クロマトグラフィーの際に溶出する糖のピークを検出するために、カラムを蒸発光散乱(ELSD)検出器に接続する。2'-FLを単糖(存在すれば)、ラクトース、および着色体から分離するために、イソプロパノール、エタノール、またはメタノールの4段階勾配を行い、たとえばB=エタノールに関して:段階1、2.5 CV 0%B;段階2、4 CV 10%B(単糖類およびラクトース混入物を溶出);段階3、4 CV 25%B(2'-FLを溶出);段階4、5 CV 50%B(いくつかの着色体を溶出および部分的にカラムを再生する)である。さらなるカラム再生は、50%メタノールおよび50%イソプロパノールを用いて行われる。糖のピークに対応する分画を、120 mLボトルに自動的に採取して、プールし、段階5に向ける。通常より長い発酵からのある精製実行において、2'-FL含有分画を陰イオン交換および陽イオン交換カラムに通過させると、過剰なタンパク質/DNA/カラメル体混入物を除去することができる。この目的のために試験して成功した樹脂は、陰イオン交換樹脂に関してDowex 22およびToyopearl Mono-Qであり、陽イオン交換樹脂に関してDowex 88である。Mixed bed Dowex樹脂は、それらが疎水性相互作用を介して高い親和性で糖を吸着する傾向があることから不適であることが証明された。図19は、フラッシュクロマトグラフィーモードで用いた場合に2'-フコシルラクトースからのラクトースの分離におけるDarco G60:celiteの1:1混合物の性能を図示する。
25%B溶媒分画3.0 Lを、乾燥するまで56℃でロータリーエバポレートする。固形糖の塊を最少量の水に溶解して、溶液を凍結した後、凍結乾燥する。プロセス終了時に、白色、結晶の甘い粉末(2'-FL)が得られる。得られた2'-FLの純度は、95から99%のあいだである。
大腸菌宿主株E214、E390、またはE403の任意の1つを、糖アクセプター基質としてラクトースを用いることができるα(1,3)フコシルトランスフェラーゼを発現するプラスミドによって形質転換すると、ヒト乳オリゴ糖生成物、3-フコシルラクトース(3FL)を産生するであろう。図9は、3FLの産生を得るために本発明の操作された大腸菌株において利用される経路を図解する。たとえば、プラスミドpG176(ColE1, thyA+, bla+, PL2-futA, rcsA+)(SEQ ID NO: 2)は、α(1,2)FT(wbsJ)配列がヘリコバクター・ピロリfutA遺伝子に置換されているpG175の誘導体である(Dumon, C, Bosso, C, Utille, J. P., Heyraud, A. & Samain, E. Chembiochem 7, 359-365 (2006))。pG176を、宿主大腸菌株E214、E390、またはE403の任意の1つにおいて形質転換すると、3FLの産生を指示するであろう。図11は、pG176によって形質転換したE403の3FL産生のTLC分析を示す。さらに、3FLの合成を指示するために用いることができるヘリコバクター・ピロリにおいて同定されたいくつかの他の関連する細菌型α(1,3)フコシルトランスフェラーゼ、たとえば「11639 FucTa」(Ge, Z., Chan, N. W., Palcic, M. M. & Taylor, D. E. J Biol Chem 272, 21357-21363 (1997); Martin, S. L., Edbrooke, M. R., Hodgman, T. C, van den Eijnden, D. H. & Bird, M. I. J Biol Chem 272, 21349-21356 (1997))および「UA948 FucTa」(Rasko, D. A., Wang, G., Palcic, M. M. & Taylor, D. E. J Biol Chem 275, 4988-4994 (2000))が存在する。H.ピロリのα(1,3)フコシルトランスフェラーゼのほかに、ヘリコバクター・へパティクスから単離されたα(1,3)フコシルトランスフェラーゼ(Hh0072、配列アクセッションAAP76669)は、非シアリル化およびシアリル化タイプ2オリゴ糖アクセプター基質の両方に対して活性を示す(Zhang, L., Lau, K., Cheng, J., Yu, H., et al. Glycobiology (2010))。さらに、本発明の方法に従って3FLを作製するために用いられうるいくつかのさらなる細菌α(1,3)-フコシルトランスフェラーゼが存在する。たとえば、 Hh0072の近縁の相同体は、H. H. ビリス(HRAG_01092遺伝子、配列アクセッション番号EEO24035)、およびC. ジェジュニ(C1336_000250319遺伝子、配列アクセッション番号EFC31050)において見いだされる。
大腸菌株E214、E390、およびE403は、先に考察したように、ラクトースおよびGDP-フコースの両方の細胞質プールを蓄積し、α(1,2)フコシルトランスフェラーゼまたはα(1,3)フコシルトランスフェラーゼのいずれかを発現するプラスミドによって形質転換すると、それぞれ、ヒト乳オリゴ糖2'-FLまたは3FLを合成することができる。四糖類であるラクトジフコテトロース(LDFT)は、ヒト乳中に見いだされるもう1つの主要なフコシル化オリゴ糖であり、α(1,2)-およびα(1,3)-結合フコース残基の両方を含む。pG177(図10、SEQ ID NO:3)は、wbsJ遺伝子がヘリコバクター・ピロリfutA遺伝子およびヘリコバクター・ピロリfutC遺伝子を含む2つの遺伝子オペロン(すなわち、α(1,3)-およびα(1,2)-フコシルトランスフェラーゼの両方を含むオペロン)に置換されているpG175の誘導体である。大腸菌株E214、E390、およびE403は、プラスミドpG177によって形質転換され、上記のように小規模でまたはバイオリアクターにおいて生育させると、LDFTを産生する。図11において(レーンpG177)、pG177によって指示され、大腸菌において作製されるLDFTは、薄層クロマトグラフィーによる細胞抽出物の分析において観察された。
大腸菌における3'-シアリルラクトース(3'-SL)産生の第一段階は、ラクトースおよびCMP-Neu5Ac(CMP-シアル酸)の両方の細胞質プールを蓄積する宿主バックグラウンド株の生成である。細胞質ラクトースの蓄積は、lacパーミアーゼであるlacYに対する極性効果を最小限にするように注意しながら、ラクトースの存在下での生育および内因性の大腸菌β-ガラクトシダーゼ遺伝子(lacZ)の不活化によって得られる。ラクトースプールのこの蓄積は、2'-FL、3FL、およびLDFTを産生するよう操作されている大腸菌宿主において既に得られており、上記で記述されている。
本明細書において記述される本発明より前では、同じ細菌株において任意の特定のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子と任意の特定のシアリルトランスフェラーゼ遺伝子を組み合わせることによって、3'-S3FLを生じることができるとは予想できなかった。以下に、同じLacZ+大腸菌株におけるフコシルトランスフェラーゼ遺伝子とシアリルトランスフェラーゼ遺伝子の組み合わせによって、3'-S3FLの産生が起こったことを証明する結果を記述する。これらの予想外の結果は、おそらく利用される特定のフコシルトランスフェラーゼおよびシアリルトランスフェラーゼ酵素の驚くほど緩い基質特異性による可能性がある。
本発明は、その詳細な説明と共に記述してきたが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲の範囲によって定義される、本発明の範囲を例証するのであって、制限すると意図されない。他の局面、長所、および変更は以下の特許請求の範囲の範囲内である。
Claims (38)
- 機能的β-ガラクトシダーゼ遺伝子、外因性のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子、GDP-フコース合成経路、機能的ラクトースパーミアーゼ遺伝子を含む細菌を提供する段階;
ラクトースの存在下で該細菌を培養する段階;および
該細菌からまたは該細菌の培養上清からフコシル化オリゴ糖を回収する段階、
を含む、細菌においてフコシル化オリゴ糖を産生する方法。 - β-ガラクトシダーゼ遺伝子が大腸菌(E. coli)lacZ遺伝子を含む、請求項1記載の方法。
- β-ガラクトシダーゼ遺伝子が内因性のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子または外因性のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子である、請求項1記載の方法。
- 前記細菌が、増加した細胞内ラクトースプールを蓄積し、かつ低レベルβ-ガラクトシダーゼを産生する、請求項1記載の方法。
- 前記外因性のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子がα(1,2)フコシルトランスフェラーゼまたはα(1,3)フコシルトランスフェラーゼをコードする、請求項1記載の方法。
- 前記α(1,2)フコシルトランスフェラーゼ遺伝子がバクテロイデス・フラギリス(Bacteroides fragilis)wcfW遺伝子を含む、請求項5記載の方法。
- 前記α(1,3)フコシルトランスフェラーゼ遺伝子が、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)26695 futA遺伝子を含む、請求項5記載の方法。
- 前記細菌が、α(1,2)フコシルトランスフェラーゼをコードする外因性のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子およびα(1,3)フコシルトランスフェラーゼをコードする外因性のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子の両方を含む、請求項5記載の方法。
- 前記GDP-フコース合成経路が内因性の酵素または外因性の酵素を含む、請求項1記載の方法。
- 前記ラクトースパーミアーゼ遺伝子が、内因性のラクトースパーミアーゼ遺伝子または外因性のラクトースパーミアーゼ遺伝子である、請求項1記載の方法。
- 機能的β-ガラクトシダーゼ遺伝子、外因性のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子、コラン酸合成遺伝子における変異、および機能的ラクトースパーミアーゼ遺伝子を含む腸内細菌を提供する段階;
ラクトースの存在下で該細菌を培養する段階;および
該細菌からまたは該細菌の培養上清からフコシル化オリゴ糖を回収する段階、
を含む、細菌においてフコシル化オリゴ糖を産生する方法。 - 前記β-ガラクトシダーゼ遺伝子が、大腸菌lacZ遺伝子を含む、請求項11記載の方法。
- 前記外因性のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子がα(1,2)フコシルトランスフェラーゼまたはα(1,3)フコシルトランスフェラーゼをコードする、請求項11記載の方法。
- 前記腸内細菌が大腸菌を含む、請求項11記載の方法。
- 前記コラン酸合成遺伝子がwcaJ遺伝子を含む、請求項14記載の方法。
- 前記細菌がlon遺伝子における変異をさらに含む、請求項14記載の方法。
- 前記細菌が内因性のlon遺伝子に挿入された機能的な野生型大腸菌lacZ+遺伝子を含む、請求項14記載の方法。
- 前記大腸菌の内因性のlacZ遺伝子が欠失している、請求項14記載の方法。
- 前記細菌が外因性のrcsAまたはrcsB遺伝子をさらに含む、請求項14記載の方法。
- 前記細菌がlacA遺伝子における変異をさらに含む、請求項14記載の方法。
- 機能的β-ガラクトシダーゼ遺伝子、外因性のシアリル-トランスフェラーゼ遺伝子、外因性のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子、GDP-フコース合成経路、欠陥(deficient)シアル酸異化経路、シアル酸合成能、および機能的ラクトースパーミアーゼ遺伝子を含む細菌において、3'-シアリル-3-フコシルラクトース(3'-S3FL)を産生する方法:
ラクトースの存在下で該細菌を培養する段階;および
該細菌からまたは該細菌の培養上清から3'-S3FLを回収する段階。 - 前記外因性のシアリル-トランスフェラーゼ遺伝子がα(2,3)シアリル-トランスフェラーゼをコードする、請求項21記載の方法。
- 前記外因性のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子が、α(1,3)フコシルトランスフェラーゼをコードする、請求項21記載の方法。
- 前記欠陥シアル酸異化経路が内因性のN-アセチルノイラミネートリアーゼまたはN-アセチルマンノサミンキナーゼ遺伝子においてヌル変異を含む、請求項21記載の方法。
- 前記シアル酸合成能が、外因性のUDP-GlcNAc 2-エピメラーゼ遺伝子、外因性のNeu5Acシンターゼ遺伝子、または外因性のCMP-Neu5Acシンテターゼ遺伝子を含む、請求項21記載の方法。
- 機能的lacZ遺伝子、外因性のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子、外因性のシアリルトランスフェラーゼ遺伝子、内因性のコラン酸合成遺伝子における変異、機能的ラクトースパーミアーゼ遺伝子、欠陥シアル酸異化経路、およびシアル酸合成能を含む腸内細菌において、3'-シアリル-3-フコシルラクトース(3'-S3FL)を産生する方法:
ラクトースの存在下で該細菌を培養する段階;および
該細菌からまたは該細菌の培養上清から3'-S3FLを回収する段階。 - 前記外因性のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子がα(1,3)フコシルトランスフェラーゼをコードする、請求項26記載の方法。
- 前記外因性のシアリルトランスフェラーゼ遺伝子がα(2,3)シアリルトランスフェラーゼをコードする、請求項26記載の方法。
- 前記欠陥シアル酸異化経路が、内因性のN-アセチルノイラミネートリアーゼまたはN-アセチルマンノサミンキナーゼ遺伝子においてヌル変異を含む、請求項26記載の方法。
- 前記シアル酸合成能が外因性のUDP-GlcNAc 2-エピメラーゼ遺伝子、外因性のNeu5Acシンターゼ遺伝子、または外因性のCMP-Neu5Acシンテターゼ遺伝子を含む、請求項26記載の方法。
- 低いが検出可能なレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性を生じるように操作されている挿入された組み換え型β-ガラクトシダーゼ遺伝子を利用することによる、その本来のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子が欠失しているかまたは不活化されている宿主細胞における遺伝子座の表現型標識(phenotypic marking)法。
- 低いが検出可能なレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性を生じるように操作されている挿入された組み換え型β-ガラクトシダーゼ遺伝子を利用することによって、その本来のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子が欠失しているかまたは不活化されているβ-ガラクトシダーゼ陰性宿主細胞において残留ラクトースを細菌培養から枯渇させる方法。
- 低いが検出可能なレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性を生じるように操作されている挿入された組み換え型β-ガラクトシダーゼ遺伝子を利用することによって、その本来のβ-ガラクトシダーゼ遺伝子が欠失しているかまたは不活化されているβ-ガラクトシダーゼ陰性宿主細胞の培養物において細菌細胞の溶解を検出する方法。
- 細菌細胞溶解物または細菌の細菌細胞培養上清からのフコシル化オリゴ糖をカーボンカラムに結合させる段階、および該カラムからフコシル化オリゴ糖を溶出させる段階を含む、請求項1記載の方法によって産生されたフコシル化オリゴ糖を精製する方法。
- 欠陥コラン酸合成経路、低減されたレベルのβ-ガラクトシダーゼ活性、および外因性のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む、単離された大腸菌細菌。
- 請求項1記載の方法によって産生された精製フコシル化オリゴ糖。
- 欠失した内因性β-ガラクトシダーゼ遺伝子、低活性の置換機能的β-ガラクトシダーゼ遺伝子、GDP-フコース合成経路、機能的ラクトースパーミアーゼ遺伝子、および欠失したラクトースアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含む細菌宿主株に形質転換された外因性のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む核酸構築物。
- 前記外因性のフコシルトランスフェラーゼ遺伝子が、α(1,2)フコシルトランスフェラーゼまたはα(1,3)フコシルトランスフェラーゼをコードする、請求項37記載の核酸構築物。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201161443470P | 2011-02-16 | 2011-02-16 | |
US61/443,470 | 2011-02-16 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013554607A Division JP6047505B2 (ja) | 2011-02-16 | 2012-02-16 | 操作された細菌におけるヒト乳オリゴ糖の生合成 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016255725A Division JP6580549B2 (ja) | 2011-02-16 | 2016-12-28 | 操作された細菌におけるヒト乳オリゴ糖の生合成 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2017093432A true JP2017093432A (ja) | 2017-06-01 |
JP6737691B2 JP6737691B2 (ja) | 2020-08-12 |
Family
ID=46637176
Family Applications (5)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013554607A Active JP6047505B2 (ja) | 2011-02-16 | 2012-02-16 | 操作された細菌におけるヒト乳オリゴ糖の生合成 |
JP2016225751A Active JP6737691B2 (ja) | 2011-02-16 | 2016-11-21 | 操作された細菌におけるヒト乳オリゴ糖の生合成 |
JP2016255725A Active JP6580549B2 (ja) | 2011-02-16 | 2016-12-28 | 操作された細菌におけるヒト乳オリゴ糖の生合成 |
JP2019155229A Active JP6788714B2 (ja) | 2011-02-16 | 2019-08-28 | 操作された細菌におけるヒト乳オリゴ糖の生合成 |
JP2020182022A Pending JP2021007417A (ja) | 2011-02-16 | 2020-10-30 | 操作された細菌におけるヒト乳オリゴ糖の生合成 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013554607A Active JP6047505B2 (ja) | 2011-02-16 | 2012-02-16 | 操作された細菌におけるヒト乳オリゴ糖の生合成 |
Family Applications After (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016255725A Active JP6580549B2 (ja) | 2011-02-16 | 2016-12-28 | 操作された細菌におけるヒト乳オリゴ糖の生合成 |
JP2019155229A Active JP6788714B2 (ja) | 2011-02-16 | 2019-08-28 | 操作された細菌におけるヒト乳オリゴ糖の生合成 |
JP2020182022A Pending JP2021007417A (ja) | 2011-02-16 | 2020-10-30 | 操作された細菌におけるヒト乳オリゴ糖の生合成 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (8) | US9453230B2 (ja) |
EP (1) | EP2675899A4 (ja) |
JP (5) | JP6047505B2 (ja) |
AU (3) | AU2012217650B9 (ja) |
CA (2) | CA3098403C (ja) |
DE (1) | DE12746649T1 (ja) |
DK (1) | DK2675899T1 (ja) |
WO (1) | WO2012112777A2 (ja) |
Families Citing this family (91)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA3098403C (en) | 2011-02-16 | 2022-05-10 | Glycosyn LLC | Biosynthesis of human milk oligosaccharides in engineered bacteria |
WO2012158517A1 (en) | 2011-05-13 | 2012-11-22 | Glycosyn LLC | The use of purified 2'-fucosyllactose, 3-fucosyllactose and lactodifucotetraose as prebiotics |
US9029136B2 (en) | 2012-07-25 | 2015-05-12 | Glycosyn LLC | Alpha (1,2) fucosyltransferases suitable for use in the production of fucosylated oligosaccharides |
WO2014048439A1 (en) * | 2012-09-25 | 2014-04-03 | Glycom A/S | Glycoconjugate synthesis |
ES2640978T3 (es) | 2012-10-31 | 2017-11-07 | Jennewein Biotechnologie Gmbh | Proceso de producción de monosacáridos |
EP2943500B1 (en) * | 2012-11-13 | 2017-11-08 | Glycom A/S | Crystalline 3-o-fucosyllactose |
WO2014086373A1 (en) | 2012-12-07 | 2014-06-12 | Glycom A/S | Crystallisation of human milk oligosaccharides (hmo) |
EP2931737A4 (en) * | 2012-12-14 | 2016-11-16 | Glycom As | MIXTURE FROM FUCOSYLATE LACTOSES |
US9944965B2 (en) * | 2012-12-20 | 2018-04-17 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Biosynthesis of oligosaccharides |
US9758803B2 (en) * | 2013-03-14 | 2017-09-12 | Glycosyn LLC | Microorganisms and methods for producing sialylated and N-acetylglucosamine-containing oligosaccharides |
US9902984B2 (en) | 2013-09-06 | 2018-02-27 | Glycom A/S | Fermentative production of oligosaccharides |
EP3041947A4 (en) | 2013-09-06 | 2017-07-26 | Glycom A/S | Fermentative production of oligosaccharides |
ES2875327T3 (es) * | 2013-09-10 | 2021-11-10 | Chr Hansen Hmo Gmbh | Producción de oligosacáridos |
JP6441806B2 (ja) * | 2013-09-12 | 2018-12-19 | 協和発酵バイオ株式会社 | N−アセチルノイラミン酸及びn−アセチルノイラミン酸含有糖質の製造法 |
EP2857410A1 (en) * | 2013-10-04 | 2015-04-08 | Jennewein Biotechnologie GmbH | Process for purification of 2´-fucosyllactose using simulated moving bed chromatography |
PL2896628T3 (pl) * | 2014-01-20 | 2019-03-29 | Jennewein Biotechnologie Gmbh | Sposób wydajnego oczyszczania obojętnych oligosacharydów ludzkiego mleka (HMO) z fermentacji mikrobiologicznej |
EP3461890A1 (en) * | 2014-03-31 | 2019-04-03 | Jennewein Biotechnologie GmbH | Total fermentation of oligosaccharides |
SG11201609366TA (en) * | 2014-05-15 | 2016-12-29 | Glycosyn LLC | Alpha (1,2) fucosyltransferase syngenes for use in the production of fucosylated oligosaccharides |
DE202015009782U1 (de) | 2014-06-11 | 2020-02-10 | Glycom A/S | Trennung von 2'-O-Fucosyllactose aus Fermentationsbrühe |
KR101718681B1 (ko) * | 2014-06-23 | 2017-03-22 | 서울대학교산학협력단 | 가용성 단백질 발현량 및 활성이 증대된 헬리코박터 파일로리 유래 α-1,3 푸코실 전달효소의 유전자와 단백질 및 α-1,3 푸코실올리고당 생산에의 응용 |
US11926858B2 (en) | 2014-06-27 | 2024-03-12 | Glycom A/S | Oligosaccharide production |
WO2015197082A1 (en) | 2014-06-27 | 2015-12-30 | Glycom A/S | Oligosaccharide production |
RU2017104525A (ru) * | 2014-07-14 | 2018-08-14 | Басф Се | Биотехнологическое получение lnt, lnnt и их фукозилированных производных |
JP6737788B2 (ja) * | 2014-09-09 | 2020-08-12 | グリコシン リミテッド ライアビリティー カンパニー | フコシル化オリゴ糖の生産において使用するためのα(1,3)フコシルトランスフェラーゼ |
US9616114B1 (en) | 2014-09-18 | 2017-04-11 | David Gordon Bermudes | Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity |
WO2016063262A1 (en) | 2014-10-24 | 2016-04-28 | Glycom A/S | MIXTURES OF HMOs |
US10858684B2 (en) * | 2014-11-14 | 2020-12-08 | Inbiose N.V. | Mutant microorganisms resistant to lactose killing |
WO2016086947A1 (en) | 2014-12-05 | 2016-06-09 | Glycom A/S | Crystalline difucosyllactose |
PL3233875T3 (pl) * | 2014-12-16 | 2023-01-23 | Glycom A/S | Oddzielanie 2’-FL z bulionu fermentacyjnego |
EP3390652A4 (en) | 2015-12-18 | 2019-06-12 | Glycom A/S | Fermentative preparation of oligosaccharides |
EP3426670A4 (en) * | 2016-03-07 | 2019-11-13 | Glycom A/S | SEPARATION OF OLIGOSACCHARIDES FROM A FERMENTATION BROTH |
US11312741B2 (en) | 2016-04-19 | 2022-04-26 | Glycom A/S | Separation of oligosaccharides from fermentation broth |
KR101731263B1 (ko) * | 2016-04-25 | 2017-05-02 | 서울대학교 산학협력단 | 코리네박테리움 글루타미쿰을 이용한 2'-푸코실락토오스의 생산방법 |
EP3474861A4 (en) | 2016-06-24 | 2020-04-15 | Glycom A/S | COMPOUNDS COMPRISING HMOS FOR THE PREVENTION AND / OR TREATMENT OF VIRAL AND / OR BACTERIAL INFECTIONS. |
CA3035290A1 (en) * | 2016-08-31 | 2018-03-08 | Oligoscience Biotechnology Gmbh | Use of human milk oligosaccharides in calves fattening |
DK3315610T3 (da) * | 2016-10-29 | 2021-03-08 | Jennewein Biotechnologie Gmbh | Fremgangsmåde til fremstilling af fucosylerede oligosaccharider |
US11180535B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-11-23 | David Gordon Bermudes | Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria |
US11129906B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-09-28 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
DK3375291T3 (da) * | 2017-03-17 | 2022-10-31 | Chr Hansen Hmo Gmbh | Fremgangsmåde til hæmning af isomerisering af et reducerende saccharid efter termisk behandling |
KR102050522B1 (ko) * | 2017-04-21 | 2020-01-08 | 서울대학교산학협력단 | 코리네박테리움 글루타미쿰을 이용한 3'-푸코실락토오스의 생산방법 |
US20200123184A1 (en) | 2017-06-30 | 2020-04-23 | Glycom A/S | Purification of oligosaccharides |
CN110914284A (zh) | 2017-07-12 | 2020-03-24 | 格礼卡姆股份公司 | 包含中性单糖或寡糖和酸性非碳水化合物组分的无定形混合物 |
EP3438122A1 (en) | 2017-08-01 | 2019-02-06 | OligoScience Biotechnology GmbH | Microorganism for producing human milk oligosaccharide |
EP3450443A1 (en) * | 2017-08-29 | 2019-03-06 | Jennewein Biotechnologie GmbH | Process for purifying sialylated oligosaccharides |
EP3688005A1 (en) | 2017-09-29 | 2020-08-05 | FrieslandCampina Nederland B.V. | Process for the purification of a neutral human milk oligosaccharide (hmo) from microbial fermentation |
EP3486326A1 (en) | 2017-11-21 | 2019-05-22 | Jennewein Biotechnologie GmbH | Method for the purification of n-acetylneuraminic acid from a fermentation broth |
JP2021505171A (ja) * | 2017-12-08 | 2021-02-18 | イェンネワイン バイオテクノロジー ゲーエムベーハーJennewein Biotechnologie GmbH | 噴霧乾燥シアリルラクトース |
WO2020079146A1 (en) | 2018-10-18 | 2020-04-23 | Basf Se | Crystalline form ii of 2'-o-fucosyllactose, process for its preparation, nutritional, cosmetic or pharmaceutical formulation containing the same |
CN109439708B (zh) * | 2018-11-15 | 2021-11-30 | 中国科学院上海高等研究院 | 一种抗酸型高密度生长的大肠杆菌生产可拉酸的方法 |
CN109749976B (zh) * | 2019-01-30 | 2022-04-01 | 光明乳业股份有限公司 | 一种高效合成鸟苷二磷酸岩藻糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用 |
CN109735480B (zh) * | 2019-02-27 | 2021-11-12 | 光明乳业股份有限公司 | 一种合成乳酰-n-新四糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用 |
WO2020239724A1 (en) | 2019-05-29 | 2020-12-03 | Frieslandcampina Nederland B.V. | Compositions comprising 2 -fucosyllactose and gos |
MX2021014526A (es) | 2019-05-29 | 2022-03-17 | Frieslandcampina Nederland Bv | Metodos no terapeuticos para mantener un peso corporal saludable o perder peso corporal. |
EP3751003A1 (en) * | 2019-06-12 | 2020-12-16 | Jennewein Biotechnologie GmbH | Production of fucosylated oligosaccharides in bacillus |
TW202114543A (zh) | 2019-07-12 | 2021-04-16 | 荷蘭商弗里斯蘭康必奶荷蘭有限公司 | 誘導飽足感之方法 |
US20230173066A1 (en) | 2019-07-23 | 2023-06-08 | Frieslandcampina Nederland B.V. | Nutritional composition comprising milk fat and immunoglobulin |
WO2021019104A2 (en) | 2019-09-18 | 2021-02-04 | Basf Se | A production host for producing human milk oligosaccharides |
TW202128190A (zh) | 2019-10-24 | 2021-08-01 | 荷蘭商弗里斯蘭康必奶荷蘭有限公司 | 用於預防氣喘的包含2’-岩藻糖基乳糖之組成物 |
JPWO2021125245A1 (ja) * | 2019-12-16 | 2021-06-24 | ||
JP2023506284A (ja) | 2019-12-19 | 2023-02-15 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | ファインケミカルを生成する際の空時収率、炭素変換効率、及び炭素基質適応性の増加 |
CN115003812A (zh) | 2020-01-23 | 2022-09-02 | 格礼卡姆股份公司 | Hmo生产中的新的主要易化因子超家族(mfs)蛋白质(bad) |
AU2021210607A1 (en) | 2020-01-23 | 2022-07-14 | Glycom A/S | HMO production |
BR112022014420A2 (pt) | 2020-01-23 | 2022-09-27 | Glycom As | Produção de hmo |
EP4093749A1 (en) | 2020-01-23 | 2022-11-30 | Glycom A/S | Hmo production |
AU2021241800A1 (en) | 2020-03-25 | 2022-08-04 | Frieslandcampina Nederland B.V. | Compositions comprising one or more HMO's with a core of LacNac-Lac |
EP3888661A1 (en) | 2020-03-31 | 2021-10-06 | FrieslandCampina Nederland B.V. | Compositions comprising 2 -fucosyllactose to prevent viral infections |
WO2021231751A1 (en) | 2020-05-13 | 2021-11-18 | Glycosyn LLC | Fucosylated oligosaccharides for prevention of coronavirus infection |
WO2021231750A1 (en) | 2020-05-13 | 2021-11-18 | Glycosyn LLC | 2'-fucosyllactose for the prevention and treatment of coronavirus-induced inflammation |
CN111808790B (zh) * | 2020-06-05 | 2022-02-15 | 武汉中科光谷绿色生物技术有限公司 | 一株大肠杆菌及其在合成岩藻糖基化寡糖中的应用 |
WO2022013143A1 (en) | 2020-07-13 | 2022-01-20 | Glycom A/S | Oligosaccharide production |
EP4192945A1 (en) * | 2020-08-10 | 2023-06-14 | Inbiose N.V. | Cellular production of sialylated di- and/or oligosaccharides |
WO2022034081A1 (en) * | 2020-08-10 | 2022-02-17 | Inbiose N.V. | Cellular production of di- and/or oligosaccharides |
CN112501095B (zh) * | 2020-12-08 | 2023-05-26 | 南开大学 | 一种合成3-岩藻乳糖的重组大肠杆菌构建方法及其应用 |
TW202233201A (zh) | 2020-12-16 | 2022-09-01 | 荷蘭商弗里斯蘭康必奶荷蘭有限公司 | 包含LNFP III和LSTa的合成組成物 |
DK180952B1 (en) | 2020-12-22 | 2022-08-10 | Glycom As | A dfl-producing strain |
JP2024505126A (ja) | 2021-01-22 | 2024-02-05 | グリコム・アクティーゼルスカブ | シアル酸付加hmoの産生における新規の主要ファシリテータースーパーファミリー(mfs)タンパク質(fred) |
DK181497B1 (en) | 2021-05-17 | 2024-03-12 | Dsm Ip Assets Bv | ENHANCING FORMATION OF THE HMOS LNT AND/OR LNnT BY MODIFYING LACTOSE IMPORT IN THE CELL |
WO2022243310A1 (en) | 2021-05-17 | 2022-11-24 | Dsm Ip Assets B.V. | Novel technology to enable sucrose utilization in strains for biosyntetic production |
DK181242B1 (en) | 2021-05-17 | 2023-05-30 | Dsm Ip Assets Bv | GENETICALLY ENGINEERED CELLS COMPRISING A RECOMBINANT NUCLEIC ACID SEQUNCE ENCODING AN α-1,2-FUCOSYLTRANSFERASE CAPABLE OF PRODUCING LNFP-I, NUCLEIC ACID SEQUENCES ENCODING SAME AND METHODS FOR USE OF SAME |
BE1029435B1 (nl) | 2021-06-15 | 2023-07-31 | Dsm Ip Assets Bv | Scheiding van moedermelkoligosachariden uit een fermentatiebouillon |
BE1029434B1 (nl) | 2021-06-15 | 2023-07-31 | Dsm Ip Assets Bv | Scheiding van moedermelkoligosachariden uit een fermentatiebouillon |
WO2022263426A1 (en) | 2021-06-15 | 2022-12-22 | Dsm Ip Assets B.V. | Separation of human milk oligosaccharides from a fermentation broth |
WO2022263425A1 (en) | 2021-06-15 | 2022-12-22 | Dsm Ip Assets B.V. | Separation of human milk oligosaccharides from a fermentation broth |
CN113637620B (zh) * | 2021-07-27 | 2023-07-18 | 西宝生物科技(上海)股份有限公司 | 一种克拉酸高产菌株构建方法和应用 |
WO2023034973A1 (en) * | 2021-09-02 | 2023-03-09 | Amyris, Inc. | Methods of producing human milk oligosaccharides and compositions thereof |
WO2023058772A1 (ja) | 2021-10-08 | 2023-04-13 | 協和発酵バイオ株式会社 | N-アセチルノイラミン酸及び/又はn-アセチルノイラミン酸含有糖質の生産能を有する微生物及び該微生物を用いたn-アセチルノイラミン酸及び/又はn-アセチルノイラミン酸含有糖質の製造方法 |
DK202170552A1 (en) * | 2021-11-11 | 2023-09-01 | Dsm Ip Assets Bv | Combined fermentation process for producing one or more human milk oligosaccharide(s) (hmo(s)) |
CN114107342B (zh) * | 2021-12-27 | 2024-01-26 | 黄山同兮生物科技有限公司 | 一种去除发酵液中乳糖的方法 |
DK202200588A1 (en) | 2022-06-20 | 2024-02-23 | Dsm Ip Assets Bv | Mixture of fucosylated HMOs |
CN114957509B (zh) * | 2022-08-01 | 2022-10-21 | 深圳柏垠生物科技有限公司 | 一种可放大的可拉酸纯化方法 |
CN116425810B (zh) * | 2023-06-14 | 2023-08-11 | 山东合成远景生物科技有限公司 | 一种混合液中3-岩藻糖基乳糖的纯化方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20080145899A1 (en) * | 2004-09-17 | 2008-06-19 | Neose Technologies Inc | Production of Oligosaccharides By Microorganisms |
WO2010070104A1 (en) * | 2008-12-19 | 2010-06-24 | Jennewein Biotechnologie Gmbh | Synthesis of fucosylated compounds |
JP2013535962A (ja) * | 2010-07-12 | 2013-09-19 | ユニヴェルシテイト ヘント | 付加価値バイオ生成物の生成のための代謝操作された生物 |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US211536A (en) * | 1879-01-21 | Improvement in pulley attachments to sewing-machines | ||
US5270181A (en) | 1991-02-06 | 1993-12-14 | Genetics Institute, Inc. | Peptide and protein fusions to thioredoxin and thioredoxin-like molecules |
FR2796082B1 (fr) | 1999-07-07 | 2003-06-27 | Centre Nat Rech Scient | Procede de production d'oligosaccharides |
EP1578946A4 (en) | 2002-08-23 | 2009-08-26 | Du Pont | USE OF STARCH PRODUCTS IN BIOLOGICAL PRODUCTION BY FERMENTATION |
US7820422B2 (en) | 2005-06-16 | 2010-10-26 | Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) | Efficient production of oligosaccharides using metabolically engineered microorganisms |
EP2530168B1 (en) * | 2006-05-11 | 2015-09-16 | Raindance Technologies, Inc. | Microfluidic Devices |
DK2479263T3 (da) | 2011-01-20 | 2014-02-03 | Jennewein Biotechnologie Gmbh | Nye fucosyltransferaser og deres anvendelser |
CA3098403C (en) | 2011-02-16 | 2022-05-10 | Glycosyn LLC | Biosynthesis of human milk oligosaccharides in engineered bacteria |
EP3461890A1 (en) | 2014-03-31 | 2019-04-03 | Jennewein Biotechnologie GmbH | Total fermentation of oligosaccharides |
-
2012
- 2012-02-16 CA CA3098403A patent/CA3098403C/en active Active
- 2012-02-16 AU AU2012217650A patent/AU2012217650B9/en active Active
- 2012-02-16 DE DE12746649.8T patent/DE12746649T1/de active Pending
- 2012-02-16 DK DK12746649.8T patent/DK2675899T1/da unknown
- 2012-02-16 US US13/398,526 patent/US9453230B2/en active Active
- 2012-02-16 EP EP12746649.8A patent/EP2675899A4/en active Pending
- 2012-02-16 JP JP2013554607A patent/JP6047505B2/ja active Active
- 2012-02-16 WO PCT/US2012/025450 patent/WO2012112777A2/en active Application Filing
- 2012-02-16 CA CA2827313A patent/CA2827313C/en active Active
-
2013
- 2013-09-23 US US14/033,664 patent/US9587241B2/en active Active
-
2016
- 2016-11-21 JP JP2016225751A patent/JP6737691B2/ja active Active
- 2016-12-28 JP JP2016255725A patent/JP6580549B2/ja active Active
-
2017
- 2017-02-24 US US15/442,127 patent/US11028419B2/en active Active
- 2017-02-24 US US15/442,131 patent/US10815511B2/en active Active
- 2017-08-02 AU AU2017210559A patent/AU2017210559B2/en active Active
- 2017-09-21 US US15/712,074 patent/US9970018B2/en active Active
-
2018
- 2018-05-15 US US15/980,349 patent/US10487346B2/en active Active
-
2019
- 2019-08-28 JP JP2019155229A patent/JP6788714B2/ja active Active
- 2019-10-21 AU AU2019253776A patent/AU2019253776A1/en not_active Abandoned
- 2019-11-25 US US16/694,097 patent/US20200080119A1/en not_active Abandoned
-
2020
- 2020-10-30 JP JP2020182022A patent/JP2021007417A/ja active Pending
-
2021
- 2021-04-27 US US17/241,441 patent/US20210261995A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20080145899A1 (en) * | 2004-09-17 | 2008-06-19 | Neose Technologies Inc | Production of Oligosaccharides By Microorganisms |
WO2010070104A1 (en) * | 2008-12-19 | 2010-06-24 | Jennewein Biotechnologie Gmbh | Synthesis of fucosylated compounds |
JP2013535962A (ja) * | 2010-07-12 | 2013-09-19 | ユニヴェルシテイト ヘント | 付加価値バイオ生成物の生成のための代謝操作された生物 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
J BACTERIOL, 1999, VOL.181, NO.2, P.577-584, JPN6017034765, ISSN: 0003852325 * |
J. BACTERIOL, 1996, VOL.178, P.4885-4893, JPN6017034767, ISSN: 0003638796 * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6788714B2 (ja) | 操作された細菌におけるヒト乳オリゴ糖の生合成 | |
JP6944886B2 (ja) | フコシル化オリゴ糖の生産における使用に適したアルファ(1,2)フコシルトランスフェラーゼ | |
JP2020188761A (ja) | フコシル化オリゴ糖の生産に使用するためのアルファ(1,2)フコシルトランスフェラーゼ・シンジーン | |
EP3467100A1 (en) | Microorganisms and methods for producing sialylated and n-acetylglucosamine-containing oligosaccharides | |
JP2019115349A (ja) | フコシル化オリゴ糖の生産において使用するためのα(1,3)フコシルトランスフェラーゼ |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20161216 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20161216 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170106 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170911 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20171208 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180306 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20180806 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20181213 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20200207 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200507 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20200716 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6737691 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |