CN111808790B - 一株大肠杆菌及其在合成岩藻糖基化寡糖中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于发酵合成岩藻糖基化寡糖的大肠杆菌的构建方法，包括步骤：(1)在原核宿主细胞中过表达编码从头合成GDP‑L‑岩藻糖所必需的酶的至少一种基因；(2)在原核宿主细胞中表达编码岩藻糖基转移酶的外源基因；(3)在原核宿主细胞中降低或消除GDP‑甘露糖水解酶活性；(4)在原核宿主细胞中降低或消除β‑半乳糖苷酶活性。本发明通过所述方法构建了一种大肠杆菌，所述大肠杆菌在可用于制备岩藻糖基化寡糖。采用本发明构建的工程菌进行5L罐的岩藻糖基化寡糖(以2'‑岩藻糖基乳糖为例)的发酵生产验证，结果显示2'‑岩藻糖基乳糖(2'‑FL)的生产水平最高可达50g/L。

Description

一株大肠杆菌及其在合成岩藻糖基化寡糖中的应用

技术领域

本发明涉及代谢工程技术领域，还涉及一株大肠杆菌，尤其是利用所述大肠杆菌合成岩藻糖基化寡糖的方法。

背景技术

目前岩藻糖基化人乳寡糖(2'-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、二岩藻糖基乳糖等)的生物合成必需三要素：核苷酸活化的岩藻糖GDP-L-岩藻糖(GDP-L-fucose，主要作为该合成反应的供体底物，正常情况下细胞内水平极低，且不易大规模生产，价格昂贵)，受体糖(主要作为该反应中接受岩藻糖的底物，如乳糖、N-乙酰乳糖胺、岩藻糖基乳糖、乳-N-二糖、乳-N-四糖、唾液酸乳糖、二唾液酸乳糖等)，岩藻糖基转移酶(FucT，需要外源引入且高表达该酶，可以来源于幽门螺杆菌Helicobacter pylori、空肠弯曲杆菌Campylobacterjejuni、肝幽门螺杆菌Helicobacter hepaticus、鼬鼠螺杆菌Helicobacter mustelae、普通拟杆菌Bacteroides vulgatus ATCC8482以及大肠杆菌O86、O128、O126、O127等，在该合成反应中它能催化L-岩藻糖分子从GDP-L-岩藻糖转移到受体糖分子上，从而形成岩藻糖基化的人乳寡糖)；

在现有技术方案中，对于供体底物GDP-L-岩藻糖的生物合成目前已经确定有两种途径：从头途径(De novo pathway)和救助途径(Salvage pathway)。

从头合成途径(De novo pathway)主要起源于细菌的中央代谢活动，GDP-L-岩藻糖本身可以参与荚膜异多糖酸的生物合成，作为细胞壁的主要成分。该路径主要以糖酵解中间产物果糖-6-磷酸为起点，依次经过ManA(mannose6-phosphate isomerase，甘露糖-6-磷酸异构酶)，ManB(phosphomannomutase，磷酸甘露糖变位酶)，ManC(α-D-mannose-phosphate guanylyltransferase，α-D-甘露糖-磷酸鸟嘌呤基转移酶)，Gmd(GDP-mannose-4,6-dehydratase，GDP-甘露糖4,6-脱氢酶)和Fcl(GDP-L-fucosesynthase，GDP-L-岩藻糖合成酶)五个酶促反应步骤，生成中间体GDP-L-岩藻糖。整个反应过程中，1摩尔葡萄糖转化成1摩尔GDP-L-岩藻糖，并消耗1摩尔GTP和NADPH作为辅因子。在此基础上，只要外源引入特定的岩藻糖基转移酶和受体糖底物，理论上就能催化合成所需的岩藻糖基化的人乳寡糖。

补救合成途径(Salvage pathway)最初源于哺乳动物细胞和一些拟杆菌的代谢系统。该途径从L-岩藻糖开始，胞外L-岩藻糖被转移到细胞内，再依次通过L-岩藻糖激酶和GDP-L-岩藻糖焦磷酸化酶的催化作用合成GDP-L-岩藻糖。目前已经公开了一种来源于脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)的双功能酶(Fkp)可以同时含有L-岩藻糖激酶活性和GDP-L-岩藻糖焦磷酸化酶活性，这无疑促进了GDP-L-岩藻糖代谢工程化合成的可行性。整个反应过程中，1摩尔L-岩藻糖可以转化成1摩尔GDP-L-岩藻糖，同时消耗1摩尔ATP和GTP作为辅因子。整体上看，补救合成路径要相对简单，但是所需要的底物L-岩藻糖不易获得，且市场价格较高，因此该路径目前还不适合规模化的岩藻糖基化寡糖的生产。

尽管现有报道已经对GDP-L-岩藻糖的胞内合成路径做出了诸多努力，但目前GDP-L-岩藻糖浓度所能达到的水平仍保持在mg/L范围内[1,2,7^,8]。推测该合成路径中可能存在某个或某些中间产物存在反馈抑制效应或其他代谢支流，削弱了6-磷酸果糖向GDP-L-岩藻糖的代谢流动。我们发现，nudK和nudD可以通过影响细胞中GDP-甘露糖的浓度，进而参与细胞壁生物合成的调节，因此推测他们对GDP-L-岩藻糖的生物合成亦有反馈调节作用。

综上所述，现有技术受限于GDP-L-岩藻糖的胞内合成路径产量过低，导致岩藻糖基化人乳寡糖的产量过低，达不到工业化生产的需求。

发明内容

基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种高效合成岩藻糖基化人乳寡糖的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下几个方面：

在第一个方面，本发明提供了一种用于发酵合成岩藻糖基化寡糖的原核宿主细胞的构建方法，包括如下步骤：

(1)在原核宿主细胞中表达编码从头合成GDP-L-岩藻糖所必需的酶的至少一种基因；

(2)在原核宿主细胞中表达编码岩藻糖基转移酶的外源基因；

(3)在原核宿主细胞中降低或消除GDP-甘露糖水解酶活性；

(4)在原核宿主细胞中降低或消除β-半乳糖苷酶活性。

优选地，所述步骤(1)中GDP-L-岩藻糖所必需的酶的基因包括manA、manB、manC、gmd、fcl。

优选地，所述步骤(2)中编码岩藻糖基转移酶的外源基因为fucT，其核苷酸序列如SEQ ID NO：78所示。

优选地，所述步骤(3)中降低或消除GDP-甘露糖水解酶活性通过敲除基因nudK或/和nudD实现；所述步骤(4)中降低或消除β-半乳糖苷酶活性通过敲除基因lacZ实现。

本发明中为了获得具有合成岩藻糖基化寡糖的原核宿主细胞，对原核宿主细胞通过基因工程手段对其进行了遗传修饰：首先获得GDP-L-岩藻糖从头合成途径所必需酶的基因manA、manB、manC、gmd、fcl，构建了重组质粒pRSFDuet-manC-manB-gmd-fcl-manA；其次，获得表达外源性岩藻糖基转移酶基因fucT(为了更使用于原核宿主细胞表达系统，对fucT基因进行了优化和突变，本发明中使用的fucT基因序列如SEQ ID NO：78所示)，构建了重组质粒pETDuet-3gFT，将上述重组质粒转入宿主细胞获得具有合成岩藻糖基化寡糖功能的原核宿主细胞；再次，为了减少了胞内GDP-L岩藻糖合成途径中中间体的损失，提高GDP-L-岩藻糖及岩藻糖基化寡糖的合成通量，敲除了原核宿主细胞中nudK或/和nudD基因，从而降低或消除了GDP-甘露糖水解酶活性；进一步，为了减少胞内乳糖的分解，促进受体乳糖向2’-岩藻糖乳糖转化的通量，敲除了原核宿主细胞中lacZ基因。通过前述方法，本发明构建的原核宿主细胞大大提高了合成岩藻糖基化寡糖的效率和产量。

优选地，所述原核宿主细胞可以是采用酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌、乳酸乳球菌等。本发明中优先选用大肠杆菌作为宿主细胞。

本发明针对上述的具有合成岩藻糖基化寡糖的原核宿主细胞还进行了优化，进一步提高其岩藻糖基化寡糖的生产效率，进行了以下改进：

1、降低或消除磷酸十一碳烯基葡萄糖磷酸转移酶的活性：该步骤是为了防止GDP-L-岩藻糖继续向下游转化生成荚膜异多糖酸，因此，敲除了磷酸十一碳烯基葡萄糖磷酸转移酶基因wcaj。

2、过表达上调所述步骤(1)中编码从头合成GDP-L-岩藻糖所必需的阳性转录调节因子的基因：该步骤是为了提高从头合成GDP-L-岩藻糖所必需的阳性转录调节因子的基因表达，进一步提升胞内GDP-L-岩藻糖水平和岩藻糖基化寡糖的生产水平，因此，构建了阳性转录调节因子基因rcsA和rcsB过表达载体，将该载体与上述外源性岩藻糖基转移酶基因fucT重组，获得重组质粒

3、降低或消除ATP依赖性蛋白酶的活性：该步骤是为了防止其降解阳性转录调节因子RcsA，因此敲除了ATP依赖性蛋白酶基因lon。

4、降低或消除半乳糖苷乙酰基转移酶活性：该步骤是为了提高为受体糖乳糖的转化率，因此敲除半乳糖苷乙酰基转移酶lacA。

5、所述降低或消除1-磷酸甘露醇脱氢酶活性：该步骤为了阻断中间体果糖-6-磷酸的非必要的代谢支路，保障GDP-L-岩藻糖生物合成路径中关键前体果糖-6-磷酸的供应，因此敲除了1-磷酸甘露醇脱氢酶mtlD。

需要说明的是，上述敲除方法是利用CRISPR/Cas9编辑系统无痕敲除相关目的基因，该方法也可以被其他敲除手段替代，如传统的λ-Red同源重组法、Tn5转座子介导突变等。本发明的方法其实是将CRISPR/Cas9编辑系统与传统的λ-Red同源重组系统相结合的一种细菌基因组的编辑方法，该方法操作过程中无需引入抗性选择标记基因替换原有序列，因此减少了抗性选择标记基因的消除操作，耗时较短，且最终不会留下外源核苷酸序列，即可以实现无痕编辑。传统的λ-Red同源重组方法会在编辑位点留下一段外源序列，而这可能产生未知的影响。

所述的基因敲除可以是目的基因表达框的部分或整个去除，可以是目的基因表达框的失活或表达下调，也可以是目的基因编码区的替换或增加。总之，本发明的基因敲除涵盖了使目的基因所对应的酶失活的相关技术；

所述的对目的基因过表达，可以是通过构建合适的表达载体实现，也可以是构建目的基因的表达框并整合到生产宿主菌的基因组上实现。

在第二个方面，本发明提供了一株工程化大肠杆菌，所述工程化大肠杆菌相比大肠杆菌敲除了基因lacZ、lacA、wcaj、lon、nudK、nudD、mtlD中的至少一个，且包含能够过表达编码从头合成GDP-L-岩藻糖所必需的酶的至少一种基因，以及岩藻糖基转移酶的外源基因，同时过表达基因rcsA或/和rcsB。

优选地，所述工程化大肠杆菌敲除了基因lacZ，且包含能够过表达编码从头合成GDP-L-岩藻糖所必需的酶的至少一种基因，以及岩藻糖基转移酶的外源基因，同时过表达基因rcsA和rcsB，获得本发明如图6所示的大肠杆菌FL1901。

优选地，所述工程化大肠杆菌敲除了基因lacZ和lacA，且包含能够过表达编码从头合成GDP-L-岩藻糖所必需的酶的至少一种基因，以及岩藻糖基转移酶的外源基因，同时过表达基因rcsA和rcsB，获得本发明如图6所示的大肠杆菌FL1902。

优选地，所述工程化大肠杆菌敲除了基因lacZ、lacA和wcaj，且包含能够过表达编码从头合成GDP-L-岩藻糖所必需的酶的至少一种基因，以及岩藻糖基转移酶的外源基因，同时过表达基因rcsA和rcsB，获得本发明如图6所示的大肠杆菌FL1903。

优选地，所述工程化大肠杆菌敲除了基因lacZ、lacA、wcaj和lon，且包含能够过表达编码从头合成GDP-L-岩藻糖所必需的酶的至少一种基因，以及岩藻糖基转移酶的外源基因，同时过表达基因rcsA和rcsB，获得本发明如图6所示的大肠杆菌FL1904。

优选地，所述工程化大肠杆菌敲除了基因lacZ、lacA、wcaj、lon和nudK，且包含能够过表达编码从头合成GDP-L-岩藻糖所必需的酶的至少一种基因，以及岩藻糖基转移酶的外源基因，同时过表达基因rcsA和rcsB，获得本发明如图6所示的大肠杆菌FL1905。

优选地，所述工程化大肠杆菌敲除了基因lacZ、lacA、wcaj、lon和nudD，且包含能够过表达编码从头合成GDP-L-岩藻糖所必需的酶的至少一种基因，以及岩藻糖基转移酶的外源基因，同时过表达基因rcsA和rcsB，获得本发明如图6所示的大肠杆菌FL1906。

优选地，所述工程化大肠杆菌敲除了基因lacZ、lacA、wcaj、lon、nudK和nudD，且包含能够过表达编码从头合成GDP-L-岩藻糖所必需的酶的至少一种基因，以及岩藻糖基转移酶的外源基因，同时过表达基因rcsA和rcsB，获得本发明如图6所示的大肠杆菌FL1907。

优选地，所述工程化大肠杆菌敲除了基因lacZ、lacA、wcaj、lon、nudK、nudD、mtlD，且包含能够过表达编码从头合成GDP-L-岩藻糖所必需的酶的至少一种基因，以及岩藻糖基转移酶的外源基因，同时过表达基因rcsA和rcsB，获得本发明如图6所示的大肠杆菌FL1908。

最优选地，所述工程化大肠杆菌为大肠杆菌(Escherichia coli)FL1908命名为大肠埃希氏菌CASOV-11，已于2020年1月8日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2020027，保藏地址为中国武汉市武汉大学。需要说明的是，采用本发明的工程菌FL1908进行5L罐的岩藻糖基化寡糖(以2'-岩藻糖基乳糖为例，甘油为发酵底物)的发酵生产验证，结果显示2'-岩藻糖基乳糖(2'-FL)的生产水平最高可达50g/L。

在第三个方面，本发明提供了上述方法构建的大肠杆菌或工程化大肠杆菌在制备岩藻糖基化寡糖中的应用。

综上所述，本发明的有益效果为：

1)本发明所构建的工程菌FL1908敲除了中间代谢物GDP-甘露糖涉及的多条代谢支路，减少了GDP-L岩藻糖合成途径中中间体的损失，从而增加了GDP-L-岩藻糖及岩藻糖基化寡糖的合成通量；

2)采用本发明的代谢工程菌FL1908进行5L罐的岩藻糖基化寡糖(以2'-岩藻糖基乳糖为例、甘油为底物)的发酵生产验证，结果显示2'-岩藻糖基乳糖(2'-FL)的生产水平最高可达50g/L。

附图说明

图1是本发明岩藻糖基化寡糖代谢工程菌FL1908的构建过程的技术路线示意图；

图2是manA过表达盒的构建方法示意图；

图3是GDP-L-岩藻糖的从头合成途径的工程菌表达构建方法示意图；

图4是α-1,2-岩藻糖基转移酶的重组表达载体构建方法示意图；

图5是rcsA和rcsB的重组表达载体的构建方法示意图；

图6是本发明中构建的工程菌发酵生成GDP-L岩藻糖和2-岩藻糖基乳糖的性能检测结果图。

生物保藏信息为：大肠杆菌(Escherichia coli)FL1908命名为大肠埃希氏菌CASOV-11，已于2020年1月8日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2020027，保藏地址为中国武汉市武汉大学。

具体实施方式

本发明提出的一种利用甘油或者葡萄糖高效生物合成岩藻糖基化人乳寡糖的方法，旨在提高生物合成岩藻糖基化人乳寡糖的产量，具体包括如下方法：

(1)本发明通过敲除或突变大肠杆菌nudK和/或nudD编码序列，使二者的编码产物丧失GDP-甘露糖水解酶活性，保障了GDP-L-岩藻糖生物合成路径中中间产物GDP-甘露糖的供应，从而进一步提高细胞内岩藻糖基化寡糖合成的供体底物库(GDP-L-岩藻糖库)和岩藻糖基化寡糖的生产水平；

(2)本发明通过敲除或突变大肠杆菌lacZ和lacA编码序列，使二者编码的产物丧失β-半乳糖苷酶和半乳糖苷乙酰基转移酶，保障了乳糖供应，促进岩藻糖基化寡糖的合成；

(3)本发明通过敲除或突变大肠杆菌wcaj基因，使编码的产物丧失磷酸十一碳烯基葡萄糖磷酸转移酶活性，防止GDP-L-岩藻糖转化生成荚膜异多糖酸，增加了GDP-L-岩藻糖供应量，促进岩藻糖基化寡糖的合成；

(4)本发明通过过表达大肠杆菌rcsA和rcsB基因，过表达阳性转录调节因子，上调从头合成GDP-L-岩藻糖所必需的酶的基因表达，提高GDP-L-岩藻糖供应量，促进岩藻糖基化寡糖的合成；

(5)本发明通过敲除或突变大肠杆菌lon基因，使编码的产物丧失ATP依赖性蛋白酶功能，防止其降解阳性转录调节因子RcsA而影响从头合成GDP-L-岩藻糖所必需的酶的基因表达，提高GDP-L-岩藻糖供应量，促进岩藻糖基化寡糖的合成；

(6)本发明中通过敲除或者突变大肠杆菌mtlD基因，使编码的产物丧失1-磷酸甘露醇脱氢酶功能，减少果糖-6-磷酸代谢支路，提高GDP-L-岩藻糖供应量，促进岩藻糖基化寡糖的合成；

(7)本发明中通过过表达manA、manB、manC、gmd、fcl基因，过表达从头合成GDP-L-岩藻糖所必需的酶，提高GDP-L-岩藻糖供应量，促进岩藻糖基化寡糖的合成；

(8)本发明中通过表达外源fucT基因，表达岩藻糖基转移酶，合成岩藻糖基化寡糖。

在一些实施例中，采用本发明的代谢工程菌FL1908进行5L罐的岩藻糖基化寡糖(以岩藻糖基乳糖为例)的发酵生产验证，结果显示2'-岩藻糖基乳糖(2'-FL)的生产水平最高可到50g/L。

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，本发明中的实验方法均为常规方法；如无特别说明，本发明中的试剂、材料或细菌均可从市场上或其它公开渠道获得。下述实施例中，fucT是岩藻糖基转移酶的统称；而3gFT特指2’-岩藻糖基转移酶，主要用于2’-FL的合成。

实施例1

利用工程化大肠杆菌高效合成岩藻糖基化寡糖的研究已经进行了多年，基于现有技术，多数采用大肠杆菌代谢中间体果糖-6-磷酸为起点的GDP-L-岩藻糖从头合成途径。

本实施例的利用蔗糖高效生物合成岩藻糖基化人乳寡糖的代谢工程菌的构建方法，参见图1，包括以下步骤：

(1)构建工程菌株并过表达GDP-L-岩藻糖的从头合成途径基因。如图3和图4所示，分别PCR扩增来源于大肠杆菌str.K-12substr.MG1655(GenBank：NC_000913.3)的6-磷酸甘露糖异构酶基因manA(Gene ID：944840)，磷酸甘露糖变位酶manB(Gene ID：946574)，α-D-甘露糖1-磷酸鸟嘌呤基转移酶manC(Gene ID：946580)，GDP-甘露糖4,6-脱氢酶gmd(GeneID：946562)和GDP-L-岩藻糖合成酶fcl(Gene ID：946563)，并通过相应的酶切位点依次插入载体(pRSFDuet-1)构建获得重组质粒pRSFDuet-manC-manB-gmd-fcl-manA。将重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)(或其工程化改造菌)中共表达，从而获得GDP-L-岩藻糖的从头合成途径过表达的工程菌株；

(2)构建工程菌株并过表达外源性岩藻糖基转移酶基因(fucT)，从而将岩藻糖基从GDP-L-岩藻糖上转移至特定底物上，形成特定岩藻糖基化寡糖。具体方法为：如图5所示，根据幽门螺杆菌中α-1,2-岩藻糖基转移酶基因futC序列(GenBank：KY499613.1)，通过密码子优化和化学合成，获得了α-1,2-岩藻糖基转移酶基因3gFT的突变序列(如SEQ ID NO.78所示)。以3gFT-F/R为引物对(参见表1)，PCR扩增获得3gFT基因片段，并通过相应的酶切位点插入载体pETDuet-1上，获得重组载体pETDuet-3gFT。将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，获得合成2’-岩藻糖乳糖的菌株；

(3)岩藻糖基化寡糖合成途径中受体糖供给路径的优化。采用的方法为：以步骤(4)构建的大肠杆菌为出发菌株，利用CRISPR/Cas9系统无痕敲除β-半乳糖苷酶基因lacZ和半乳糖苷乙酰基转移酶基因lacA，减少了胞内乳糖的分解代谢，从而促进受体乳糖向2’-岩藻糖乳糖转化的通量。其中所述基因敲除方法采用CRISPR/Cas9编辑系统与传统λ-Red同源重组系统相结合的方法，操作过程中无需引入外源抗性选择标记基因替换原有序列，最终不会留下外源核苷酸序列，因此可以实现无痕编辑。具体敲除操作如下：

A)根据NCBI上收录的大肠杆菌BL21(DE3)基因组(GenBank:CP001509.3)上lacZ基因的核苷酸序列，利用http://crispr.dbcls.jp在线检索，筛选到一条含有20bp的目的基因特征序列lacZ-gRNA(如表1所示)。通过合适的载体表达出该段特征序列的RNA(gRNA)，引导具有核酸酶活性的Cas9蛋白识别并靶向lacZ基因的该特征序列上，进而将lacZ基因由此处切断；以质粒pTarget F序列为模板，使用primer5.0专业软件设计PCR引物，并送由商业公司合成，获得引物对pTF-lacZ-gRNA-F/R(如表1所示)。利用高保真聚合酶进行PCR扩增，再经过限制性内切酶DpnI消化处理除去模板质粒pTarget F，切胶纯化回收，获得含有20bp目的基因特征序列的线性片段pTF-lacZ-gRNA；

B)从-80℃冰箱中取出甘油管保藏的大肠杆菌DH5α菌种，在LB固体培养基上划线，37℃过夜培养；次日，挑单菌落接种于5mLLB液体培养基中，37℃，220rpm培养10～16h；镜检，并转接1％至50mL LB液体培养基中，37℃、220rpm培养至OD600≈0.4～0.6；以上述50mL培养物进行大肠杆菌DH5α化学感受态细胞的制备(CaCl₂法，实验操作参照《分子克隆实验指南》(第三版))；取3～4ul纯化回收的pTF-lacZ-gRNA片段，加入到50μl DH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min；42℃热激90s后，立即冰浴3min；加入1ml新鲜LB培养基，180rpm，37℃修复培养2h；5000rpm离心处理5min后弃上清，加入200μL新鲜LB培养基轻轻重悬菌体，然后均匀涂布于含50ug/mL大观霉素的LB平板上，37℃过夜培养。次日，挑取单菌落转接于含有50μg/mL大观霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃，220rpm过夜培养，并提取质粒进行测序验证。对测序正确的质粒pTF-lacZ-gRNA进行大量制备，-20℃保存备用；

C)根据NCBI上收录的大肠杆菌BL21(DE3)基因组(GenBank:CP001509.3)上lacZ基因及其上下游一段核苷酸序列，利用primer5.0专业软件设计上下游同源片段制备引物和敲除鉴定引物，如表1所示，并送由商业公司合成。以大肠杆菌BL21(DE3)基因组DNA为模板，利用引物对lacZ-UF/UR，lacZ-DF/DR(参见表1)和高保真聚合酶进行PCR扩增，切胶纯化回收，分别获得上下游同源片段lacZ-U和lacZ-D；再利用重叠延伸PCR(overlapPCR)扩增，将上下游同源片段lacZ-U和lacZ-D连接，切胶纯化回收，从而获得所需同源重组片段lacZ-UD；

D)从-80℃冰箱中取出甘油管保藏的大肠杆菌BL21(DE3)，在LB固体培养基上划线，37℃过夜培养；挑单菌落接种于5mLLB液体培养基中，37℃、220rpm培养10～16h；镜检，按1％比例转接于50ml液体LB培养基中，37℃，220rpm震荡培养至OD600为0.5～0.6时，转入冰盒中冰浴20～30min，然后在4℃，4000rpm/min条件下离心10min收集菌体；弃上清，将细胞重悬于等体积预冷的灭菌去离子水中，在4℃，4000rpm/min条件下离心10min收集菌体；弃上清，用预冷的10％(V/V)甘油溶液再清洗三次；弃上清，向其中加入2ml预冷的10％(V/V)甘油溶液重悬细胞，50μl分装于离心管中，-80℃保存备用；从-80℃取出大肠杆菌BL2(DE3)感受态细胞，置于冰上解冻，加入pCas质粒5μl，轻轻混匀，冰浴5min后，转移至直径为1mm的电转杯中，擦干电转杯外侧的冷凝水，放入电转仪进行电击(电击参数提前设置好：1.8kv、5ms)；电击后，立即加入1ml预冷LB复苏培养基，混匀，并移入离心管中；30℃，180rpm培养复苏培养2h；复苏培养物取100ul涂布于含有50ug/mL卡那霉素的抗性板上，并置于30℃过夜培养；次日，长出的单克隆即是含有质粒pCas的大肠杆菌BL21(DE3)；

E)转接上述含有质粒pCas的大肠杆菌BL21(DE3)于100ml含有50ug/mL卡那霉素的LB液体培养基中，30℃，220rpm震荡培养；培养至OD600达到0.2左右时，向培养基中加入L-阿拉伯糖至终浓度为20～30mM，继续培养直至OD600达到0.5～0.6时，转入冰盒中冰浴20～30min，然后在4℃，4000rpm/min条件下离心10min收集菌体；弃上清，将细胞重悬于等体积预冷的灭菌去离子水中，在4℃，4000rpm/min条件下离心10min收集菌体；弃上清，用预冷的10％(V/V)甘油溶液再清洗三次；弃上清，向其中加入2ml预冷的10％(V/V)甘油溶液重悬细胞，50μl分装于离心管中，-80℃保存备用；将200ng质粒pTF-lacZ-gRNA和400ng同源重组片段lacZ-UD提前混合好，小心加入大肠杆菌BL21(DE3)/pCas感受态中，轻轻混匀，冰上静置5min后，转移至直径为1mm的电转杯中，擦干电转杯外侧的冷凝水，放入电转仪进行电击(电击参数提前设置好：1.8kv、5ms)；电击后，迅速加入1ml预冷LB复苏培养基，混匀，并移入离心管中；转移至30℃，180rpm培养复苏培养3h；5000rpm离心处理5min后弃上清，加入200μL新鲜LB培养基轻轻重悬菌体，然后均匀涂布于于含有50ug/mL大观霉素的抗性板上，并置于30℃过夜培养；次日，挑取单菌落接种于含有50ug/mL卡那霉素和50ug/mL大观霉素的LB液体培养基中，30℃摇床培养至对数期，取少量菌体，以lacZ-F/R为鉴定引物，进行菌落PCR鉴定。通过进一步测序确认，获得lacZ基因被失活的大肠杆菌BL21(DE3)△lacZ；

F)上述鉴定成功的大肠杆菌同时含有pCas质粒和pTF-lacZ-gRNA质粒，因此需要进行质粒消除。将鉴定成功的单菌落接种到含有50ug/mL卡那霉素的LB液体培养基中，加入0.5mM的IPTG诱导pCas质粒上gRNA-pMB1的表达，30℃震荡培养过夜，即可消除pTF-lacZ-gRNA质粒。继续在含有50ug/mL卡那霉素的LB平板划线分离单克隆，即可获得仅含有pCas质粒的大肠杆菌BL21(DE3)△lacZ。

G)以步骤6)获得的工程菌BL21(DE3)△lacZ为基础，重复上述1)，2)，3)，5)和6)操作，即可获得lacA基因被失活的大肠杆菌BL21(DE3)△lacZA。最后将大观霉素抗性已经消除的单菌落接种到无抗性LB液体培养基中，38℃过夜培养，即可获得pCas质粒丢失的大肠杆菌BL21(DE3)△lacZA。

(4)为了防止GDP-L-岩藻糖继续向下游转化生成荚膜异多糖酸，利用CRISPR/Cas9系统无痕敲除磷酸十一碳烯基葡萄糖磷酸转移酶基因wcaj和ATP依赖性蛋白酶基因lon，同时构建阳性转录调节因子基因rcsA和(或)rcsB过表达载体，上调上述GDP-L-岩藻糖从头合成途径中的五个关键酶的表达，从而进一步提升胞内GDP-L-岩藻糖水平和岩藻糖基化寡糖的生产水平。具体操作步骤如下：

A)目的基因的敲除。以大肠杆菌工程菌BL21(DE3)△lacZA为出发菌株，通过参照步骤(5)中1)～7)操作，最终构建获得工程化大肠杆菌BL21(DE3)△lacZA△wcaj△lon。

B)GDP-L-岩藻糖从头合成途径的强化表达。如图6所示，分别PCR扩增来源于大肠杆菌str.K-12substr.MG1655(GenBank:NC_000913.3)的转录激活因子基因rcsA(Gene ID：946467)和rcsB(Gene ID：947441)，并通过相应的酶切位点依次插入载体(pETDuet-fucT)构建获得重组质粒pETDuet-fucT-rcsA-rcsB。将重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)△lacZA△wcaj△lon共表达，从而获得GDP-L-岩藻糖的从头合成途径强化表达的工程菌株。

(5)利用CRISPR/Cas9系统无痕敲除基因nudK和nudD中的一个或两个，阻断GDP-甘露糖的水解途径，增加GDP-甘露糖向GDP-L-岩藻糖转化的代谢通量，从而进一步提高胞内岩藻糖基化寡糖合成的供体底物库(GDP-L-岩藻糖)和岩藻糖基化寡糖的生产水平。具体敲除操作如下：

以大肠杆菌工程菌BL21(DE3)△lacZA△wcaj△lon为出发菌株，通过参照步骤(5)中1)～7)操作，最终构建获得GDP-甘露糖水解途径失活的工程化大肠杆菌BL21(DE3)

△lacZA△wcaj△lon△nudKD。

(6)利用CRISPR/Cas9系统无痕敲除基因mtlD，通过阻断经蔗糖代谢生成的果糖-6-磷酸的非必要性代谢支路，增加了从果糖-6-磷酸到GDP-L-岩藻糖生物合成途径的流通量，从而进一步提高了细胞内岩藻糖基化寡糖合成的供体底物库(GDP-L-岩藻糖)和岩藻糖基化寡糖的生产水平。具体敲除操作如下：

以大肠杆菌工程菌BL21(DE3)△lacZA△wcaj△lon△nudKD为出发菌株，参照步骤(5)中1)～7)操作，构建果糖-6-磷酸的多个非必要性代谢支路失活的工程化大肠杆菌BL21(DE3)△lacZA△wcaj△lon△nudKD△mtlD；

实施例2采用大肠杆菌发酵合成2’-岩藻糖乳糖(5L罐)

(1)种子培养基LB(g/L)：胰蛋白胨10、酵母提取物5、氯化钠10，pH7.2～7.4；制备固体培养基时，另加入17g/L琼脂粉；

初始发酵培养基(g/L)：葡萄糖10～20、硫酸铵3～7、磷酸氢二钾8～12、磷酸二氢钾6～10、柠檬酸0.5～1.0、CaCl₂1.0～1.5、维生素B10.01～0.1、消泡剂20～80ml/L、微量元素母液10～20mL/L；微量元素母液配方(g/L)：次氮基三乙酸(加适量碱，单独配制)8～12、柠檬酸铁铵5～7、七水硫酸锌0.5～1、CoCl₂·6H₂O 0.1～0.5、四水氯化锰0.6～1.2、CuCl₂·2H₂O 0.1～0.2、硼酸0.1～0.5、Na₂MoO₄·2H₂O 0.1～0.5；补料液(g/L)：蔗糖500～800、硫酸镁10～20。

(2)将实施例1构建的工程化大肠杆菌接种至含有相应抗生素的LB培养基中，37℃，220rpm/min培养12h，转入初始发酵培养基中，37℃，500～1200rpm转速培养至葡萄糖耗尽，加入IPTG(0.1～0.5mM)和初次乳糖20g/L，同时采用匀速流加模式添加补料液，补料速度为2.5～4.5g/L*h，并转入25℃进入发酵，继续发酵，以后每隔5h补加10g/L乳糖一次，连续补加4次。整个发酵过程中采用28％氨水调控pH维持在6.5。

(3)诱导发酵78h后，利用HPLC仪检测本发明的工程化大肠杆菌发酵生成GDP-L岩藻糖和2’-岩藻糖基乳糖的量，检测结果如图6所示。

表1本发明中所用引物及核苷酸序列

表1中加粗及下划线部分，指示限制性核酸内切酶识别位点序列。

3gFT的突变序列：

ATGGATGATGATGCATTCAAAGTGGTGCGTATTTGCGGCGGCCTGGGTAATCAGATGTTTCAGTATGCCTTTGCCAAAAGCCTGCAGAAACATAGTAATACCCCGGTGCTGCTGGATACCACCAGTTTTGATTGGAGTAATCGCAAAATTCAGCTGGAACTGTTTCCGATTGATCTGCCGTATGCAAGCGAAAAAGAAATTGCAATTGCCAAAATGCAGCATCTGCCGAAACTGGTTCGTGAAGTTCTGAAATGCATGGGCTTTGATCGCGTTAGCCAGGAAATTGTGTTTGAATATGAACCGAAACTGCTGAAACCGAGTCGTCTGACCTATTTTTATGGCTATTTTCAGGACCCTCGTTATTTTGATGCAATTAGTCCGCTGATTAAGCAGACCTTTACCCTGCCGCCGCCGCCGGAAAATAATAAGAATAATAATAAGAAGGAGGAGGAGTATCAGCGTAAACTGAGTCTGATTCTGGCAGCCAAAAATAGTGTTTTTGTTCATATTCGTCGCGGCGATTATGTTGGCATTGGTTGTCAGCTGGGTATTGATTATCAGAAAAAAGCACTGGAATACATGGCAAAACGTATGCCGAATATGGAACTGTTTGTGTTTTGTGAAGATCTGGAGTTTACTCAGAATCTGGATCTGGGTTATCCGTTTATGGATATGACCACCCGTAATAAGGAAGAAGAAGCCTATTGGGATATGCTGCTGATGCAGAGCTGCAAACATGGTATTATTGCAAATAGCACCTATAGCTGGTGGGCAGCATATCTGATTAATAATCCGGAAAAAATCATCATCGGCCCGAAACATTGGCTGTTTGGTCATGAAAATATTCTGTGCAAAGAATGGGTTAAAATCGAAAGTCATTTCGAAGTGAAAAGTCAGAAATATAACGCCTAA(SEQ ID NO.78)

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

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SEQUENCE LISTING

<110> 武汉中科光谷绿色生物技术有限公司

中国科学院合肥物质科学研究院

<120> 一株大肠杆菌及其在合成岩藻糖基化寡糖中的应用

<130> 8-20

<160> 78

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ccggcatatg caaaaactca ttaactc 27

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 合成

<400> 2

ccgctcgagt tacagcttgt tgtaaacac 29

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 合成

<400> 3

gaccatggat ggcgcagtcg aaact 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 合成

<400> 4

tcaagcttac tcgttcagca acgtc 25

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 合成

<400> 5

cgccatatga tgtcaaaagt cgctctc 27

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<212> DNA

<213> 合成

<400> 6

tgctcgagtt acccccgaaa gcggtc 26

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<212> DNA

<213> 合成

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ggctcgagat gcaaaaactc attaactc 28

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<211> 26

<212> DNA

<213> 合成

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ggcctaggtt acagcttgtt gtaaac 26

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<212> DNA

<213> 合成

<400> 9

acgccatgga tgatgatgca ttc 23

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<211> 27

<212> DNA

<213> 合成

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cgcaagctta ggcgttatat ttctgac 27

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<211> 27

<212> DNA

<213> 合成

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ggcgcatatg tcaacgatta ttatgga 27

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<212> DNA

<213> 合成

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cggctcgagt tagcgcatgt tgaca 25

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<212> DNA

<213> 合成

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gcggctcgag gttaacttta agaaggagat ataccatgaa caatatgaac gtaattattg 60

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<212> DNA

<213> 合成

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gcagcctagg ttagtcttta tctgccggac 30

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<212> DNA

<213> 合成

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tcacacagga aacagaccat gaccatgatt acggattcac 40

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<211> 40

<212> DNA

<213> 合成

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catccgccaa aacagccaag cttatttttg acaccagacc 40

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<212> DNA

<213> 合成

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gctggtggtg ttccagatgt 20

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<211> 40

<212> DNA

<213> 合成

<400> 18

gctggtggtg ttccagatgt gttttagagc tagaaatagc 40

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<211> 40

<212> DNA

<213> 合成

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acatctggaa caccaccagc actagtatta tacctaggac 40

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<211> 21

<212> DNA

<213> 合成

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gaactggtgt gcctgaaaga g 21

<210> 21

<211> 42

<212> DNA

<213> 合成

<400> 21

tactcaaggt cgaactcgac gtcgaccagt tgttgcagat tg 42

<210> 22

<211> 42

<212> DNA

<213> 合成

<400> 22

caatctgcaa caactggtcg acgtcgagtt cgaccttgag ta 42

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<211> 22

<212> DNA

<213> 合成

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cactaccgac agcagcttgt ag 22

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<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

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actctgctga cgttgctgaa 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 25

cgaactggtg gttgtcgata 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 26

actgcaatca gccagttcga 20

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<211> 40

<212> DNA

<213> 合成

<400> 27

actgcaatca gccagttcga gttttagagc tagaaatagc 40

<210> 28

<211> 40

<212> DNA

<213> 合成

<400> 28

tcgaactggc tgattgcagt actagtatta tacctaggac 40

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成

<400> 29

tcagcaatgc gtatctcgtc t 21

<210> 30

<211> 40

<212> DNA

<213> 合成

<400> 30

acaggatgaa tgtccagatc cgaccagcac tttgacggtg 40

<210> 31

<211> 40

<212> DNA

<213> 合成

<400> 31

caccgtcaaa gtgctggtcg gatctggaca ttcatcctgt 40

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

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cgtcgatcag acgattcagc 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 33

aatcctgagc gttctgaacg 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 34

ttgcagtcac aacctgcatg 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 35

gctgctggat aacgacgaac 20

<210> 36

<211> 40

<212> DNA

<213> 合成

<400> 36

gctgctggat aacgacgaac gttttagagc tagaaatagc 40

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<211> 40

<212> DNA

<213> 合成

<400> 37

gttcgtcgtt atccagcagc actagtatta tacctaggac 40

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 38

catgccaggc tcgaagaaag 20

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<211> 40

<212> DNA

<213> 合成

<400> 39

caatatcttc atcttcgaca ggtgatttgt tgcgtcatac 40

<210> 40

<211> 40

<212> DNA

<213> 合成

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gtatgacgca acaaatcacc tgtcgaagat gaagatattg 40

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<212> DNA

<213> 合成

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cagccgtggc gctatctccc 20

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<212> DNA

<213> 合成

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cggatgtgga aagccagtac 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

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atcggatttg tcggattgag 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

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accactcact atgtggtgct 20

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<211> 40

<212> DNA

<213> 合成

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accactcact atgtggtgct gttttagagc tagaaatagc 40

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<211> 40

<212> DNA

<213> 合成

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agcaccacat agtgagtggt actagtatta tacctaggac 40

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<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

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gattaccgtt cagtcatgcc 20

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<211> 40

<212> DNA

<213> 合成

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gtactccggc acgcttctca tttgccaagc agaaactcgc 40

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<211> 40

<212> DNA

<213> 合成

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gcgagtttct gcttggcaaa tgagaagcgt gccggagtac 40

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<213> 合成

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<212> DNA

<213> 合成

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<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 52

cgtggagacg ttatcgacgt 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

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gtcaatgctg tcagcagcat 20

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<211> 40

<212> DNA

<213> 合成

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gtcaatgctg tcagcagcat gttttagagc tagaaatagc 40

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<211> 40

<212> DNA

<213> 合成

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atgctgctga cagcattgac actagtatta tacctaggac 40

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<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

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aggatgcagg tctgtcgcag 20

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<211> 40

<212> DNA

<213> 合成

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ctcgctgttg gcatcaagac atgtacctga tagctatgac 40

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<212> DNA

<213> 合成

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gtcatagcta tcaggtacat gtcttgatgc caacagcgag 40

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<212> DNA

<213> 合成

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ccgtagattt catggcatca 20

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<212> DNA

<213> 合成

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ctctccacat ggagaaggtg g 21

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<213> 合成

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<212> DNA

<213> 合成

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<212> DNA

<213> 合成

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<212> DNA

<213> 合成

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<213> 合成

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acgacgtttg gtggaatgtc cgatcattcc gtcctgatat g 41

<210> 74

<211> 41

<212> DNA

<213> 合成

<400> 74

catatcagga cggaatgatc ggacattcca ccaaacgtcg t 41

<210> 75

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成

<400> 75

gcgaaacctg gtatcaaaca c 21

<210> 76

<211> 21

<212> DNA

<213> 合成

<400> 76

gtaggatcga ttgttggtgg t 21

<210> 77

<211> 20

<212> DNA

<213> 合成

<400> 77

gtgggtcaaa gaggcatgat 20

<210> 78

<211> 912

<212> DNA

<213> 合成

<400> 78

atggatgatg atgcattcaa agtggtgcgt atttgcggcg gcctgggtaa tcagatgttt 60

cagtatgcct ttgccaaaag cctgcagaaa catagtaata ccccggtgct gctggatacc 120

accagttttg attggagtaa tcgcaaaatt cagctggaac tgtttccgat tgatctgccg 180

tatgcaagcg aaaaagaaat tgcaattgcc aaaatgcagc atctgccgaa actggttcgt 240

gaagttctga aatgcatggg ctttgatcgc gttagccagg aaattgtgtt tgaatatgaa 300

ccgaaactgc tgaaaccgag tcgtctgacc tatttttatg gctattttca ggaccctcgt 360

tattttgatg caattagtcc gctgattaag cagaccttta ccctgccgcc gccgccggaa 420

aataataaga ataataataa gaaggaggag gagtatcagc gtaaactgag tctgattctg 480

gcagccaaaa atagtgtttt tgttcatatt cgtcgcggcg attatgttgg cattggttgt 540

cagctgggta ttgattatca gaaaaaagca ctggaataca tggcaaaacg tatgccgaat 600

atggaactgt ttgtgttttg tgaagatctg gagtttactc agaatctgga tctgggttat 660

ccgtttatgg atatgaccac ccgtaataag gaagaagaag cctattggga tatgctgctg 720

atgcagagct gcaaacatgg tattattgca aatagcacct atagctggtg ggcagcatat 780

ctgattaata atccggaaaa aatcatcatc ggcccgaaac attggctgtt tggtcatgaa 840

aatattctgt gcaaagaatg ggttaaaatc gaaagtcatt tcgaagtgaa aagtcagaaa 900

tataacgcct aa 912

Claims (2)

1.一种工程化大肠杆菌，其特征在于，所述工程化大肠杆菌（Escherichia coli）FL1908命名为大肠埃希氏菌CASOV-11，保藏编号为：CCTCC NO：M2020027，保藏地址为中国武汉市武汉大学，已于2020年1月8日在中国典型培养物保藏中心保藏；

所述大肠埃希氏菌CASOV-11是在原核宿主细胞中降低或消除GDP-甘露糖水解酶活性得到，所述降低或消除GDP-甘露糖水解酶活性通过敲除基因nudK或/和nudD实现。

2.权利要求1所述工程化大肠杆菌在制备岩藻糖基化寡糖中的应用。

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