CN116479070B - 一种提高大肠埃希氏菌岩藻糖基乳糖产量的发酵生产方法 - Google Patents
一种提高大肠埃希氏菌岩藻糖基乳糖产量的发酵生产方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于微生物发酵技术领域,具体涉及一种提高大肠埃希氏菌岩藻糖基乳糖产量的发酵生产方法。本发明通过在大肠埃希氏菌菌群生长的衰退期再次接种菌种和补加乳糖,提高了2'‑岩藻糖基乳糖和3‑岩藻糖基乳糖的发酵产量,且减少了产品的杂质种类。为提高2'‑岩藻糖基乳糖或3‑岩藻糖基乳糖的工业发酵产量、满足市场需求提供了新的生产工艺。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域,具体涉及一种提高大肠埃希氏菌岩藻糖基乳糖产量的发酵生产方法。
背景技术
母乳是婴儿早期的食物和营养来源,其含有乳糖和具有丰富营养价值的母乳低聚糖(Human milk oligosaccharides,HMO)。这些HMO包括2'-岩藻糖基乳糖(2'-Fucosyllactose, 2'-FL;CAS:41263-94-9,分子量488.4g/mol)、3-岩藻糖基乳糖 (3-Fucosyllactose, 3-FL; CAS:41312-47-4,分子量488.4g/mol)、6'-唾液乳糖(6'-sialyllactose, 6'-SL)和3'-唾液乳糖(3'-sialyllactose, 3'-SL)等。含HMO的乳制品可为婴幼儿提供此类活性物质,促进健康成长。其中乳糖虽属于能量物质,但人体存在乳糖不耐受问题,因此含HMO的乳制品对乳糖含量有严格限制,例如2022年的12月1日正式生效的美国《食品化学法典》规定,2'-FL中乳糖含量不得高于8%。
HMO可采用提取法生产或采用动物乳制品替代,但包括牛乳在内的动物乳制品,HMO含量较低,无法满足营养需求。而从动物乳品中提取HMO的提取效率也较低。尽管有关于化学合成法制备HMO的报道,但HMO的化学合成仍然效率低下,其主要原因是HMO具有多个手性中心,为减少副产物,需要对多个羟基进行保护,从而使合成复杂化。因此,发酵法是目前生产HMO的主要工业生产方法。
关于发酵法制备HMO的改进是目前国内外研究的热点。其中改进方向主要有两个,一个方向是针对菌株的改进,即通过对菌株中涉及HMO合成和分泌相关的生物合成途径进行基因工程改造,提高HMO的合成和分泌;另一个方向是根据菌株的发酵生长过程,对工艺参数进行优化。前者的相关研究较多,如CN202011240682.5、CN202110823715.7、CN202211067625.0提供了几种工程大肠埃希氏菌提高了2'-FL、3-FL的产量。后者则主要根据发酵菌株不同生长阶段的目标产物合成和分泌特点及其对发酵培养条件的需求差异,人为延长目标产物合成和分泌的时间或量。例如,已知菌体生长的主要阶段包括延滞期(也称为调整期、延迟期、迟缓期或适应期)、指数期(也称为对数期)、减速期(如分批发酵培养可能存在明显的减速期)、稳定期(也称为平衡期、恒定期或最高生长期)、衰亡期。其中菌株生长曲线各阶段对碳源、温度、pH、溶氧的需求存在不同,目标产物合成和分泌主要在对数生长期至稳定期,放罐收获通常在衰亡期(农业出版社1992年出版,山西省原平农业学校主编《农业微生物学》第114-117页;中国医药科技出版社1999年出版,李榆梅主编《微生物学》第18-19页;中国农业出版社2001年出版,徐凤彩主编《酶工程》第57-58页;武汉理工大学出版社2011出版年,刘明华、全永亮主编《食品发酵与酿造技术》第80-82页)。因此,根据菌株在不同阶段对培养条件的需求差异(中国农业出版社2001年出版,徐凤彩主编《酶工程》第57-58页;中国医药科技出版社2005年出版,余伯阳主编《中药生物技术》第137-144页),通过动态调控温度、pH、溶氧或改变补料策略调控碳源浓度可在一定程度上提高目标产物产量。如,CN202110110430.9提供了一种分批补料的发酵策略,提高了2'-FL的产量。
然而,包括2'-FL和3-FL 在内的HMO目前发酵生产水平仍然较低,尤其是3-FL的产量受诸多因素限制,面临瓶颈。
发明内容
针对现有技术面临的上述问题,本发明的目的是提供一种提高大肠埃希氏菌岩藻糖基乳糖产量的发酵生产方法,以提高括2'-岩藻糖基乳糖和3-岩藻糖基乳糖的发酵生产水平。
为实现上述目的,本发明的采用的技术方案如下:
一种提高大肠埃希氏菌岩藻糖基乳糖产量的发酵生产方法,所述岩藻糖基乳糖为2'-岩藻糖基乳糖或3-岩藻糖基乳糖中的一种,所述发酵生产方法包括如下步骤:
S1绘制生长曲线:取大肠埃希氏菌接种至种子摇瓶液培养后,取种子摇瓶液转接入种子罐进行种子培养,种子培养后取种子罐培养液接种至发酵罐中进行发酵培养,监测发酵罐中菌群生长状态、碳源浓度、乳糖浓度,绘制菌群生长曲线,确定菌群生长的衰亡期;
S2发酵生产:按照步骤S1的发酵培养条件,在发酵罐中生产岩藻糖基乳糖,培养至衰亡期时,取步骤S1所述种子罐培养液再次接种至发酵罐,补加乳糖,再次发酵培养。其中乳糖是大肠埃希氏菌转化生成岩藻糖基乳糖的底物,而非碳源。因此,本领域公知,乳糖的补加可与再次接种同时进行,也可于再次接种后,间隔一定时间再补加乳糖。
优选地,步骤S2所述再次接种的接种量为体积比0.5%~10%;步骤S2所述再次发酵培养的时间为≥4h,优选为4h~24h。进一步优选地,步骤S2所述再次接种的接种量为体积比1%。在一个再进一步优选的方案中,步骤S2所述再次发酵培养的时间为≥7h,优选为7h~24h;步骤S2中再次接种后1h~5h补加乳糖。在另一个再进一步优选的方案,步骤S2所述再次发酵培养的时间为≥11h,优选为11h~24h;步骤S2中再次接种后5h~8h补加乳糖。
优选地,所述大肠埃希氏菌选自大肠埃希氏菌K-12 MG1655、大肠埃希氏菌DE3、大肠埃希氏菌DSM33491中的一种。
优选地,前述步骤S1采用OD600nm值监测菌群生长状态。
通常认为,发酵过程中,菌群生长进入衰亡期后,由于培养液中营养物质失衡、底物限制、大量抑制性中间产物生成、pH和溶氧失衡等原因导致菌群死亡大于生成。虽然此时发酵罐中仍存在碳源等营养物质和底物,但目标产物合成趋于停滞,目标产物积累的增长幅度极小。因此发酵工艺中通常将菌群生长的衰亡期作为放罐收获期。目前通常在指数生长期、稳定期等阶段,进行补料发酵、pH调控、溶氧调控等尽可能推迟衰亡期,延长目标产物合成所在的稳定期等菌体生长和目标物分泌阶段。
申请人在考察大肠埃希氏菌发酵生产2'-岩藻糖基乳糖或3-岩藻糖基乳糖的菌群生长各阶段特征时,出乎预料地发现:发酵培养至菌群生长的衰退期后,虽然补加底物乳糖或补加培养基(即碳源)不能显著提高2'-岩藻糖基乳糖或3-岩藻糖基乳糖产量,但当补加一定量的菌种和底物乳糖后,仍可显著提高产2'-岩藻糖基乳糖和3-岩藻糖基乳糖的产量。推测其原因可能是,此过程中对菌种的生物合成途径中某种或某些相关酶造成了有利于促进目标物合成的突变或表达水平的转变。
显然,S2工艺中,衰亡期补加乳糖可以超量补加,也可仅按最低乳糖补加量进行补加。当不要求岩藻糖基乳糖产量达到同等条件最大值是(如同等再次接种接种量、同等发酵罐体积、同等发酵罐培养液体积、同等搅拌速度、同等温度、同等pH、同等溶氧量条件下),也可适当降低乳糖补加量,即低于所述“最低乳糖补加量”。换言之,此处所述“最低乳糖补加量”为S1工艺同等条件下,衰亡期再次接种的接种量相同、衰亡期乳糖补加量不同时,达到S2工艺的岩藻糖基乳糖产量最大值所需的最低的乳糖补加量。显然通过超量补加乳糖,可较快的获得该条件下S2工艺的岩藻糖基乳糖产量最大值。
其中本领域技术人员可通过同等条件下不断调整乳糖补加量进行常规探索(由高到低逐渐摸索),通过有限次实验获得S2工艺中岩藻糖基乳糖产量最大值对应的最低乳糖补加量。本领域技术人员也可根据乳糖转化率,采用如下常用公式,计算获得最低乳糖补加量:
LS2min=(FS2max-FS1)/T-LS1res;其中LS2min为S2工艺的衰亡期最低乳糖补加量,单位为g;LS1res为S2工艺再次接种前发酵罐培养液中剩余的乳糖量,单位为g;FS1为S1工艺的岩藻糖基乳糖产量,单位为g;FS2max为S1工艺同等条件下,衰亡期再次接种的接种量相同、衰亡期乳糖补加量不同时,S2工艺的岩藻糖基乳糖产量最大值,单位为g;T为S1工艺的乳糖转化率,T=岩藻糖基乳糖产量的g数/生成对应g数岩藻糖基乳糖所消耗的乳糖g数。
在给定条件下T为可测定的确切值,这是本领域所公知的,可参见文献:梁山泉,张登娅, 杨绍青,等. 不同通路配置对大肠杆菌合成2'-岩藻糖基乳糖的影响[J]. 食品科学.2022, 43(24):112。
本发明的有益效果:本发明通过在菌群生长的衰亡期再次接种菌种和补加底物乳糖进行常规发酵培养,无需再次进行复杂的pH、溶氧等动态调控即可显著提高2'-岩藻糖基乳糖或3-岩藻糖基乳糖产量;为提高2'-岩藻糖基乳糖或3-岩藻糖基乳糖的工业发酵产量提供了新的工艺和方法。
附图说明
图1为大肠埃希氏菌K-12 MG1655发酵生产3-岩藻糖基乳糖的菌群生长曲线;
图2为两种不同工艺发酵生产3-岩藻糖基乳糖第47h的样品HLPC色谱图;
图3为大肠埃希氏菌K-12 MG1655发酵生产2'-岩藻糖基乳糖的菌群生长曲线
图4为两种不同工艺发酵生产2'-岩藻糖基乳糖第49h的样品HLPC色谱图;
图中,S1工艺未在衰退期再次接种菌种和补加乳糖;S2工艺在衰退期再次接种菌种和补加乳糖。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的技术进行进一步说明,所列举的实施例仅用于对本发明的解释和说明。由于篇幅限制,发酵参数的变化宽泛而无法穷举,但在本发明的基本思路已阐明的前提下,基于相同思路,不同发酵条件导致的参数变化,进而导致对其他发酵参数的调整(例如不同条件下菌群进入衰亡期的时间、OD600nm的数值变化;或衰亡期再次接种菌种的接种量;衰亡期补加乳糖的补加量;再次接种和补加乳糖后的继续培养时间等)均属于本领域技术人员基于基本实验技能的常规选择,仍属于本发明的保护范围。
以下实施例中发酵培养液中2'-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、乳糖的浓度测定采用HPLC法。HPLC分析所用色谱柱为Carbohydrate ES 5u 250mm*4.6mm,检测器为蒸发光检测器,流动相为70%乙腈(乙腈:水),流速为0.8mL/min,柱温设定为30℃,进样量为5µL。也可采用文献报道的方法进行检测:Christensen AS , Skov SH , Lendal SE , et al.Quantifying the human milk oligosaccharides 2'-fucosyllactose and 3-fucosyllactose in different food applications by high-performance liquidchromatography with refractive index detection[J]. Journal of Food Science,2020, 85(2):332-338。发酵过程中可采用发酵罐配套的传感分析仪监测发酵罐培养液甘油(碳源)浓度、pH、溶氧量等。
以下实施例中大肠埃希氏菌K-12 MG1655发酵生产2'-岩藻糖基乳糖的培养基和培养条件分别为:
种子摇瓶培养基及培养条件:
培养基:甘油 20 g/L、KH2PO4 5 g/L、K2HPO4 5g/L、(NH4)2SO4 4.0 g/L、一水合柠檬酸 1.7 g/L、MgSO4·7H2O 1.4 g/L、硫胺素 4.5 mg/L 和微量元素 1%(v/v),用氢氧化钠调至 pH 6.8。
微量元素液:FeSO4·7H2O 10 g/L、ZnSO4·7H2O 2.2 g/L、CuSO4·5H2O 1.0 g/L、MnSO4·H2O 0.38 g/L、Na2B4O7·10H2O 0.02 g/L、(NH4)6Mo7O24 0.1 g/L 和 CaCl2 2.0 g/L,溶解于 5 mol/L盐酸。
培养条件:37°C,200rpm,培养10h~12h,
20L种子罐培养基及培养条件:
培养基:甘油 20 g/L、KH2PO4 5 g/L、K2HPO4 5g/L、(NH4)2SO4 4.0 g/L、一水合柠檬酸 1.7 g/L、MgSO4·7H2O 1.4 g/L、硫胺素 4.5 mg/L 和微量元素 1%(v/v),用氢氧化钠调至 pH 6.8。
微量元素液:FeSO4·7H2O 10 g/L、ZnSO4·7H2O 2.2 g/L、CuSO4·5H2O 1.0 g/L、MnSO4·H2O 0.38 g/L、Na2B4O7·10H2O 0.02 g/L、(NH4)6Mo7O24 0.1 g/L 和 CaCl2 2.0 g/L,溶解于 5 mol/L盐酸。
培养条件:种子罐不控制pH,转速200rpm,通气量1.0vvm,培养周期4h~5h。
50L发酵罐培养基及培养条件:
培养基:甘油 20 g/L、KH2PO4 5 g/L、K2HPO4 5g/L、(NH4)2SO4 4.0 g/L、一水合柠檬酸 1.7 g/L、MgSO4·7H2O 1.4 g/L、硫胺素 4.5 mg/L 和微量元素 1%(v/v),用氢氧化钠调至 pH 6.8。
微量元素液:FeSO4·7H2O 10 g/L、ZnSO4·7H2O 2.2 g/L、CuSO4·5H2O 1.0 g/L、MnSO4·H2O 0.38 g/L、Na2B4O7·10H2O 0.02 g/L、(NH4)6Mo7O24 0.1 g/L 和 CaCl2 2.0 g/L,溶解于 5 mol/L盐酸。
培养条件:接种量10%(v/v),培养过程中,用氨水控制pH约为6.8;溶氧控制在30%~40%;搅拌转速初始为200rpm,最高为900rpm;初始通气量为25L/min~30L/min;当OD600nm达到20时开始流加诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷,加入乳糖,补甘油。
以下实施例中大肠埃希氏菌K-12 MG1655发酵生产3-岩藻糖基乳糖的培养基和培养条件分别为:
种子摇瓶培养基及培养条件:
培养基:甘油 20 g/L、KH2PO4 5 g/L、K2HPO4 5g/L、(NH4)2SO4 4.0 g/L、一水合柠檬酸 1.7 g/L、MgSO4·7H2O 1.4 g/L、硫胺素 4.5 mg/L 和微量元素 1%(v/v),用氢氧化钠调至 pH 6.8。
微量元素液:FeSO4·7H2O 10 g/L、ZnSO4·7H2O 2.2 g/L、CuSO4·5H2O 1.0 g/L、MnSO4·H2O 0.38 g/L、Na2B4O7·10H2O 0.02 g/L、(NH4)6Mo7O24 0.1 g/L 和 CaCl2 2.0 g/L,溶解于 5 mol/L盐酸。
培养条件:37°C,200rpm,培养10h~12h,
20L种子罐培养基及培养条件:
培养基:甘油 20 g/L、KH2PO4 5 g/L、K2HPO4 5g/L、(NH4)2SO4 4.0 g/L、一水合柠檬酸 1.7 g/L、MgSO4·7H2O 1.4 g/L、硫胺素 4.5 mg/L 和微量元素 1%(v/v),用氢氧化钠调至 pH 6.8。
微量元素液:FeSO4·7H2O 10 g/L、ZnSO4·7H2O 2.2 g/L、CuSO4·5H2O 1.0 g/L、MnSO4·H2O 0.38 g/L、Na2B4O7·10H2O 0.02 g/L、(NH4)6Mo7O24 0.1 g/L 和 CaCl2 2.0 g/L,溶解于 5 mol/L盐酸。
培养条件:种子罐不控制pH,转速200rpm,通气量1.0vvm,培养周期4h~5h。
50L发酵罐培养基及培养条件:
培养基:甘油 20 g/L、KH2PO4 5 g/L、K2HPO4 5g/L、(NH4)2SO4 4.0 g/L、一水合柠檬酸 1.7 g/L、MgSO4·7H2O 1.4 g/L、硫胺素 4.5 mg/L 和微量元素 1%(v/v),用氢氧化钠调至 pH 6.8。
微量元素液:FeSO4·7H2O 10 g/L、ZnSO4·7H2O 2.2 g/L、CuSO4·5H2O 1.0 g/L、MnSO4·H2O 0.38 g/L、Na2B4O7·10H2O 0.02 g/L、(NH4)6Mo7O24 0.1 g/L 和 CaCl2 2.0 g/L,溶解于 5 mol/L盐酸。
培养条件:接种量10%(v/v),培养过程中,用氨水控制pH约为6.8;溶氧控制在30%~40%;搅拌转速初始为200rpm,最高为900rpm;初始通气量为25L/min~30L/min;当OD600nm达到20时开始流加诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷,加入乳糖,补甘油。
实施例1 大肠埃希氏菌K-12 MG1655发酵生产3-岩藻糖基乳糖的方法
S1绘制生长曲线:取大肠埃希氏菌接种至种子摇瓶液培养后,取种子摇瓶液转接入种子罐进行种子培养,种子培养后取种子罐培养液接种至发酵罐中进行发酵培养48h,动态监测发酵罐培养液甘油浓度、pH、溶氧量、乳糖浓度等,并监测发酵罐培养液的OD600nm数值以掌握菌群生长状态,绘制菌群生长曲线,确定菌群生长的衰亡期。
如图1所示,发酵培养至37h时开始,OD600nm达到约为153,并逐步降低,菌群生长进入衰退期。此时动态检测显示,发酵罐培养液中甘油浓度约为3g/L。经验证此阶段单纯补加乳糖或补加碳源甘油对3-岩藻糖基乳糖产量无明显改善,进一步证明菌群生长进入衰退期。如图2所示,本工艺下即使到第47h,发酵罐培养液中仍含有较多的乳糖。
S2发酵生产:按照步骤S1的发酵培养条件,启动发酵培养,在第37h(进入衰退期)时按照体积比1%的接种量将种子罐培养液再次接种至发酵罐,6h后向发酵罐培养液中补加乳糖,补加量为每升发酵罐培养液补加12g乳糖,继续培养至第47h。
分别取S1和S2两种发酵工艺,发酵末期(47h)的发酵罐培养液样品,HPLC法进行检测,对比其中杂质峰个数,3-岩藻糖基乳糖峰的峰面积。结果见表1和图2。
表1发酵末期发酵罐培养液样品的HPLC色谱中3-岩藻糖基乳糖的峰面积
S1和S2两种发酵工艺样品的HPLC色谱图如图2所示,其中S2发酵工艺样品的稀释倍数为S1样品的2倍(S1和S2样品的稀释倍数分别为50和100),换算所得样品中3-岩藻糖基乳糖的峰面积如表1所示。如图2和表1可见,S2工艺的3-岩藻糖基乳糖产量(峰面积)约为S1工艺的1.42倍,且S2工艺的产品HPLC色谱图杂质峰数明显少于S1工艺的产品HPLC色谱图。
显然,本实施例的S2工艺中补加乳糖的量高于最低乳糖补加量。因此,如图2所示,S2工艺样品的HPLC色谱图中仍可检测到乳糖色谱峰。
如果按照公式LS2min=(FS2max-FS1)/T-LS1res计算S2工艺的最低乳糖补加量(LS2min,单位g),则可按照如下方式获得各项参数并进行计算:
S1工艺的总乳糖添加量(单位g)是投料过程即可得知的参数,通过监测可获得S1工艺发酵液中最终残余的乳糖量(LS1res,单位g)以及S1工艺的3-岩藻糖基乳糖产量(FS1,单位g),按照文献《不同通路配置对大肠杆菌合成2'-岩藻糖基乳糖的影响》(梁山泉, 张登娅, 杨绍青,等. 食品科学.2022年第43卷第24期第112页)的公式(2)可计算出该菌种在该工艺条件下的乳糖转化率(T),即T= FS1/(总乳糖添加量- LS1res)。
采用逐步提高衰亡期乳糖补加量的方法或估算投料法,可获得S2工艺的3-岩藻糖基乳糖产量最大值(FS2max,单位g)。如本实施例下,可在第37h按照体积比1%的接种量将种子罐培养液再次接种至发酵罐,从再次接种起即补加乳糖,监测3-岩藻糖基乳糖的产量,至3-岩藻糖基乳糖产量不再增加且发酵罐中乳糖仍有残留时,此时的3-岩藻糖基乳糖产量即为S2工艺的3-岩藻糖基乳糖产量最大值。
采用估算投料法获得S2工艺的3-岩藻糖基乳糖产量最大值,可以采用如下方法:例如,通过计算已知T为0.9,则事先假设衰亡期再次接种可增加的3-岩藻糖基乳糖产量仍可达到FS1,此时可按照FS1/0.9计算出乳糖的估算补加量。由于衰亡期再次接种导致的3-岩藻糖基乳糖产量增加值实际无法达到FS1,因此此时计算的乳糖估算补加量是超量的。按此估算补加量在S2工艺衰亡期(如第37h开始)补加乳糖则S2工艺得到的3-岩藻糖基乳糖产量即为S2工艺的3-岩藻糖基乳糖产量最大值。
至此即可获得S2工艺的最低乳糖补加量(LS2min)计算公式的所有参数,从而计算得出LS2min,便于避免乳糖投料过量造成浪费。可见,计算衰亡期的最低乳糖补加量目的是尽可能提高岩藻糖基乳糖产量的情况下,节省乳糖投料减少浪费或减少最终发酵液中乳糖的残留量(便于后续的产品纯化),实际操作中可采用估算投料法超量投料。
乳糖是大肠埃希氏菌转化生成岩藻糖基乳糖的底物,而非碳源。因此,本领域公知,本实施例的S2工艺中乳糖的补加可与再次接种同时进行,也可于再次接种后,间隔一定时间再补加乳糖,例如再次接种后1h或2h补加乳糖。
实施例2大肠埃希氏菌K-12 MG1655发酵生产2'-岩藻糖基乳糖的方法
S1绘制生长曲线:取大肠埃希氏菌接种至种子摇瓶液培养后,取种子摇瓶液转接入种子罐进行种子培养,种子培养后取种子罐培养液接种至发酵罐中进行发酵培养49h,动态监测发酵罐培养液甘油浓度、pH、溶氧量、乳糖浓度等,并监测发酵罐培养液的OD600nm数值以掌握菌群生长状态,绘制菌群生长曲线,确定菌群生长的衰亡期。
如图3所示,发酵培养至32h时开始,OD600nm达到120左右,并逐步降低,菌群生长进入衰退期。此时动态检测显示,发酵罐培养液中甘油浓度约为5g/L。经验证此阶段单纯补加乳糖或补加碳源甘油对2'-岩藻糖基乳糖产量无明显改善。进一步证明菌群生长进入衰退期。如图4所示,本工艺下即使到第49h,发酵罐培养液中仍含有较多的乳糖。
S2发酵生产:按照步骤S1的发酵培养条件,启动发酵培养,在第32h(进入衰退期)时按照体积比1%的接种量将种子罐培养液再次接种至发酵罐,8h后向发酵罐培养液中补加乳糖,补加量为每升发酵罐培养液补加12g乳糖,继续培养至第49h。分别取S1和S2两种发酵工艺,发酵末期(49h)的发酵罐培养液样品,HPLC法进行检测,对比其中杂质峰个数,2'-岩藻糖基乳糖峰的峰面积。结果见表2和图4
表2发酵末期发酵罐培养液样品的HPLC色谱2'-岩藻糖基乳糖的峰面积
S1和S2两种发酵工艺样品的HPLC色谱图如图4所示,其中S2发酵工艺样品的稀释倍数为S1样品的4倍(S1和S2样品的稀释倍数分别为25和100),换算所得样品中所得样品中2'-岩藻糖基乳糖的峰面积如表2所示。如图4和表2可见,S2工艺的2'-岩藻糖基乳糖产量(峰面积)约为S1工艺的1.23倍,且S2工艺的产品HPLC色谱图杂质峰数明显少于S1工艺的产品HPLC色谱图。
显然,本实施例的S2工艺中补加乳糖的量高于最低乳糖补加量。因此,如图4所示,样品的HPLC色谱图中仍可检测到乳糖色谱峰。
如果按照公式LS2min=(FS2max-FS1)/T-LS1res计算S2工艺的最低乳糖补加量(LS2min,单位g),则可按照如下方式获得各项参数并进行计算:
S1工艺的总乳糖添加量(单位g)是投料过程即可得知的参数,通过监测可获得S1工艺发酵液中最终残余的乳糖量(LS1res,单位g)以及S1工艺的2'-岩藻糖基乳糖产量(FS1,单位g),按照文献《不同通路配置对大肠杆菌合成2'-岩藻糖基乳糖的影响》(梁山泉,张登娅, 杨绍青,等. 食品科学.2022年第43卷第24期第112页)的公式(2)可计算出该菌种在该工艺条件下的乳糖转化率(T),即T= FS1/(总乳糖添加量- LS1res)。
采用逐步提高衰亡期乳糖补加量的方法或估算投料法,可获得S2工艺的2'-岩藻糖基乳糖最大值(FS2max,单位g)。如本实施例下,可在第32h按照体积比1%的接种量将种子罐培养液再次接种至发酵罐,从再次接种起即补加乳糖,监测2'-岩藻糖基乳糖的产量,至2'-岩藻糖基乳糖产量不再增加且发酵罐中乳糖仍有残留时,此时的2'-岩藻糖基乳糖产量即为S2工艺的2'-岩藻糖基乳糖产量最大值。
采用估算投料法获得S2工艺的2'-岩藻糖基乳糖产量最大值,可以采用如下方法:例如,通过计算已知T为0.9,则事先假设衰亡期再次接种可增加的2'-岩藻糖基乳糖仍可达到FS1,此时可按照FS1/0.9计算出乳糖的估算补加量。由于衰亡期再次接种导致的2'-岩藻糖基乳糖产量增加值实际无法达到FS1,因此此时计算的乳糖估算补加量是超量的。按此估算补加量在S2工艺衰亡期(如第32h开始)补加乳糖则S2工艺得到的2'-岩藻糖基乳糖即为S2工艺的2'-岩藻糖基乳糖产量最大值。
至此即可获得S2工艺的最低乳糖补加量(LS2min)计算公式的所有参数,从而计算得出LS2min,便于避免乳糖投料过量造成浪费。可见,计算衰亡期的最低乳糖补加量目的是尽可能提高岩藻糖基乳糖产量的情况下,节省乳糖投料减少浪费或减少最终发酵液中乳糖的残留量(便于后续的产品纯化),实际操作中可采用估算投料法超量投料。
乳糖是大肠埃希氏菌转化生成岩藻糖基乳糖的底物,而非碳源。因此,本领域公知,本实施例的S2工艺中乳糖的补加可与再次接种同时进行,也可于再次接种后,间隔一定时间再补加乳糖,例如再次接种后1h或2h补加乳糖。
实施例3 再次发酵培养时间及补加乳糖时间的考察
进一步研究发现,虽然实施例1和实施例2的S2工艺的样品取样时间分别在发酵开始后第47h和49h,即再次发酵培养后11h和18h;但发酵罐培养液中累积的2'-岩藻糖基乳糖和3-岩藻糖基乳糖并不会减少,而是继续缓慢增加。因此,再次发酵培养的时间可延长至24h或更长,以尽可能消耗发酵罐培养液中残留的乳糖。
换言之,在再次发酵培养11h和18h已实现2'-岩藻糖基乳糖和3-岩藻糖基乳糖产量显著增加23%和42%的前提下,本领域技术人员可基于提高目标物产量之外的目的继续延长再次发酵培养的时间。也可基于发酵时间的考虑,适当缩短再次发酵培养的时间。
例如将实施例1的S2工艺再次发酵培养时间缩短为8h,再次接种后5h后向发酵罐培养液中补加乳糖,经测定S1工艺和S2工艺3-岩藻糖基乳糖峰面积分别为132553和181862,S2工艺的3-岩藻糖基乳糖产量(峰面积)约为S1工艺的1.37倍。
将实施例1的S2工艺再次发酵培养时间缩短为7h,再次接种后5h后向发酵罐培养液中补加乳糖,经测定3-岩藻糖基乳糖S1工艺和S2工艺3-岩藻糖基乳糖峰面积分别为130407和175001,S2工艺的3-岩藻糖基乳糖产量(峰面积)约为S1工艺的1.34倍。
Claims (8)
1.一种提高大肠埃希氏菌岩藻糖基乳糖产量的发酵生产方法,其特征在于,所述岩藻糖基乳糖为2'-岩藻糖基乳糖或3-岩藻糖基乳糖中的一种,所述发酵生产方法包括如下步骤:
S1绘制生长曲线:取大肠埃希氏菌接种至种子摇瓶液培养后,取种子摇瓶液转接入种子罐进行种子培养,种子培养后取种子罐培养液接种至发酵罐中进行发酵培养,监测发酵罐中菌群生长状态、碳源浓度、乳糖浓度,绘制菌群生长曲线,确定菌群生长的衰亡期;
S2发酵生产:按照步骤S1的发酵培养条件,在发酵罐中生产岩藻糖基乳糖,培养至衰亡期时,取步骤S1所述种子罐培养液再次接种至发酵罐,补加乳糖,再次发酵培养。
2.根据权利要求1所述的发酵生产方法,其特征在于,所述步骤S1采用OD600nm值监测菌群生长状态。
3.根据权利要求1所述的发酵生产方法,其特征在于,所述步骤S2中衰亡期乳糖补加量≥最低乳糖补加量, 所述最低乳糖补加量为S1工艺同等条件下,衰亡期再次接种的接种量相同、衰亡期乳糖补加量不同时,达到S2工艺的岩藻糖基乳糖产量最大值所需的最低的乳糖补加量。
4.根据权利要求3所述的发酵生产方法,其特征在于,所述步骤S2中衰亡期的最低乳糖补加量按如下公式计算:LS2min=(FS2max-FS1)/T-LS1res;其中LS2min为S2工艺衰亡期的最低乳糖补加量,单位为g;LS1res为S2工艺再次接种前发酵罐培养液中剩余的乳糖量,单位为g;FS1为S1工艺的岩藻糖基乳糖产量,单位为g;FS2max为S1工艺同等条件下,衰亡期再次接种的接种量相同、衰亡期乳糖补加量不同时,S2工艺的岩藻糖基乳糖产量最大值,单位为g;T为S1工艺的乳糖转化率,T=岩藻糖基乳糖产量的g数/生成对应g数岩藻糖基乳糖所消耗的乳糖g数。
5.根据权利要求1所述的发酵生产方法,其特征在于,所述步骤S2中再次接种的接种量为体积比1%;所述步骤S2中再次发酵培养的时间为≥4h。
6.根据权利要求5所述的发酵生产方法,其特征在于,所述步骤S2中再次发酵培养的时间为≥7h;所述步骤S2中再次接种后1h~5h补加乳糖。
7.根据权利要求5所述的发酵生产方法,其特征在于,所述步骤S2中再次发酵培养的时间为≥11h;所述步骤S2中再次接种后5h~8h补加乳糖。
8.根据权利要求1至7任一项所述的发酵生产方法,其特征在于,所述大肠埃希氏菌选自大肠埃希氏菌K-12 MG1655、大肠埃希氏菌DE3、大肠埃希氏菌DSM33491中的一种。
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