BR102023003679A2 - Sialiltransferases para síntese in vivo de 3'sl - Google Patents

Abstract

A presente divulgação se refere à produção de Oligossacarídeos do Leite Humano (HMOs) sialilados, em particular à produção biossintética de 3'-sialilactose (3'SL) e a células geneticamente modificadas e métodos adequados para a referida produção.

Description

CAMPO

[0001] A presente divulgação se refere à produção de Oligossacarídeos de Leite Humano (HMOs) sialilados, em particular à produção biossintética de 3'-sialilactose (3'SL) e a células geneticamente modificadas adequadas para uso na referida produção.

ANTECEDENTES

[0002] O projeto e a construção de fábricas de células bacterianas para produzir Oligossacarídeos de Leite Humano (HMOs) sialilados, especialmente Oligossacarídeos de Leite Humano (HMOs) sialilados mais complexos, é de suma importância para fornecer soluções inovadoras e escaláveis para os produtos mais complexos de amanhã.

[0003] Para este fim, princípios racionais de engenharia de cepa são comumente aplicados a células bacterianas individuais. Tais princípios geralmente se referem a a) introdução de uma via biossintética desejada para o hospedeiro, b) aumento dos agrupamentos celulares de açúcares ativados relevantes necessários como doadores nas reações desejadas, c) aumento da importação de lactose pela permease de lactose nativa LacY, e d) introdução de glicosiltransferases adequadas para facilitar a produção biossintética de oligossacarídeos sialilados (para revisão, ver Bych et al 2019, Current Opinion in Biotechnology 56:130 a 137).

[0004] WO 2007/101862 divulga a produção de HMOs sialilados usando, por exemplo, a alfa-2,3- sialiltransferase, Nst, de Neisseria meningitidis em combinação com a expressão dos genes neuBCA para produzir CMP-neu5AC.

[0005] Outras tentativas de produzir HMOs sialilados são apresentadas em WO 2019/020707, que descreve uma série de sialiltransferases que são capazes de produzir HMOs sialilados complexos em uma célula, em que 3'SL poderia hipoteticamente ser produzido como um subproduto menor.

[0006] Schelch et al 2020, Biotechnology Advances 44, 107613, é uma revisão sobre as propriedades das sialiltransferases bacterianas. A Tabela 2 resume as sialiltransferases bacterianas expressas em E. coli, sem indicação de quais sialiloligossacarídeos foram produzidos, se houver.

[0007] A produção de HMOs sialilados pode ser prejudicada por atividades secundárias das sialiltransferases na cepa de produção, o que pode afetar a capacidade da célula de crescer de forma robusta mesmo na ausência de substrato, o que, por sua vez, se reflete em baixos rendimentos do produto HMO sialilado.

[0008] Em resumo, as sialiltransferases para a produção de HMO que permitem um maior rendimento do produto sialilado, bem como um crescimento estável da cepa de produção, são necessárias para obter uma plataforma robusta de produção de HMO sialilado que seja escalável para a produção industrial de HMOs sialilados, em particular de 3'SL.

SUMÁRIO

[0009] A presente divulgação se refere a uma célula geneticamente modificada compreendendo uma sequência de ácido nucleico recombinante que codifica uma enzima com atividade de α-2,3-sialiltransferase, capaz de produzir HMOs sialilados, em particular 3'SL com alto rendimento, enquanto mantém um crescimento estável de tensão de produção em grande escala. Em particular, o crescimento estável é observado em uma faixa mais ampla de taxas de crescimento durante a formação do produto, o que, por sua vez, permite uma variação mais rápida e maior na alimentação da fonte de carbono durante a fermentação.

[00010] Em particular, a presente divulgação se refere a uma célula geneticamente modificada que superexpressa uma α-2,3-sialiltransferase selecionada a partir do grupo que consiste em Clari1, Neigon, Poral e PmN, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de uma das SEQ ID NOs: 1, 2, 3 ou 4 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade com uma das SEQ ID NOs: 1, 2, 3 ou 4. De um modo preferido, a célula geneticamente modificada exibe crescimento estável, quando a α-2,3- sialiltransferase selecionada é expressa sob o controle de um promotor forte e de um modo preferido heterólogo, bem como um alto rendimento do produto e, portanto, adequado para uso industrial em produção de larga escala de HMOs sialilados. O HMO sialilado produzido pela célula da presente divulgação é tipicamente selecionado a partir do grupo que consiste em 3'SL, FSL, DSLNT e LST-a. De um modo preferido, o HMO sialilado produzido é 3'SL, em particular 3'SL sem a presença de outros subprodutos de HMO.

[00011] A célula geneticamente modificada de acordo com a presente divulgação pode compreender adicionalmente um elemento promotor que controla a expressão do ácido nucleico recombinante que codifica uma enzima com atividade de α-2,3- sialiltransferase. A sialiltransferase pode, por exemplo, estar sob o controle de um promotor selecionado a partir do grupo que consiste em PglpF, PglpA, PglpT, Plac, PmglB e variantes dos mesmos com uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 12 a 22 ou 41 a 54, respectivamente. De um modo preferido, a sialiltransferase está sob o controle de um promotor recombinante, que é mais forte que o promotor nativo de E. coli Plac. De um modo preferido, a sialiltransferase está sob o controle de um promotor recombinante selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 13, 18, 19, 20, 21, 22, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 e 51.

[00012] A presente divulgação se refere adicionalmente a um construto de ácido nucleico compreendendo uma sequência de ácido nucleico recombinante que codifica uma enzima com atividade α-2,3- sialiltransferase, em que a referida enzima é selecionada a partir do grupo de sialiltransferases consistindo em Clari1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 1, Neigon compreendendo ou consistindo em a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 2, Poral compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 3 e PmN compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 4 e em que a referida sequência de ácido nucleico está sob o controle de uma sequência promotora selecionada a partir do grupo que consiste em PglpF, PglpA, PglpT, Plac, PmglB e variantes dos mesmos, com as sequências de ácido nucleico de acordo com as SEQ ID NOs: 12 a 22 ou 41 a 54. O referido construto de ácido nucleico é tipicamente usado em uma célula hospedeira para produzir um HMO sialilado, tal como 3'SL.

[00013] A célula geneticamente modificada de acordo com a presente divulgação pode compreender adicionalmente uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína transportadora MFS capaz de exportar o HMO sialilado para o meio extracelular. De um modo preferido, a proteína transportadora MFS é a proteína Nec, YberC ou Fred, com uma sequência de aminoácidos de acordo com as SEQ ID NOs: 38, 39 ou 40, respectivamente.

[00014] A célula geneticamente modificada de acordo com a presente divulgação pode compreender uma via biossintética para produzir um nucleotídeo de açúcar de ácido siálico, tal como CMP-Neu5Ac. A referida via de nucleotídeo de açúcar de ácido siálico pode ser codificada pela sequência de ácido nucleico que codifica NeuBCA de Campylobacter jejuni (SEQ ID NO:35). A sequência de ácido nucleico que codifica NeuBCA pode ser codificada a partir de um plasmídeo de alta cópia contendo o operon neuBCA.

[00015] A célula geneticamente modificada de acordo com a presente divulgação pode ser um micro-organismo, tal como uma bactéria ou um fungo, em que o referido fungo pode ser selecionado a partir de uma célula de levedura, tal como dos gêneros Komagataella, Kluyveromyces, Yarrowia, Pichia, Saccaromyces, Schizosaccharomyces ou Hansenula, ou de um fungo filamentoso dos gêneros Aspargillus, Fusarium ou Thricoderma, e a referida bactéria pode ser selecionada a partir do grupo exemplificado que consiste em Escherichia sp., Bacillus sp., lactobacillus sp. e Campylobacter sp.. Consequentemente, a célula geneticamente modificada de acordo com a presente divulgação pode ser E coli.

[00016] A célula geneticamente modificada da presente divulgação pode ser usada na produção de um HMO sialilado, em particular 3'SL, com alto rendimento, mantendo um crescimento estável.

[00017] Consequentemente, a presente divulgação também se refere a um método para produzir um oligossacarídeo de leite humano (HMO) sialilado, em particular 3'-SL, o referido método compreendendo cultivar uma célula geneticamente modificada compreendendo uma sequência de ácido nucleico recombinante que codifica uma enzima com atividade de α-2,3-sialiltransferase, em que a referida enzima é selecionada a partir do grupo que consiste em Clari1, Neigon, Poral e PmN, compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de uma das SEQ ID NOs: 1, 2, 3 ou 4 ou uma sequência de aminoácido com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% de identidade com uma das SEQ ID NOs: 1, 2, 3 ou 4. Em algumas modalidades, a referida célula geneticamente modificada compreende pelo menos uma modificação adicional de acordo com a presente divulgação.

[00018] Várias modalidades e detalhes exemplares são descritos a seguir, com referência às figuras e às sequências quando relevantes. Deve-se notar que as figuras se destinam apenas a facilitar a descrição das modalidades. Elas não pretendem ser uma descrição exaustiva da divulgação ou uma limitação do escopo da divulgação. Além disso, uma modalidade ilustrada não precisa ter todos os aspectos ou vantagens mostrados. Um aspecto ou uma vantagem descritos em conjunto com uma modalidade particular não são necessariamente limitados a essa modalidade e podem ser praticados em quaisquer outras modalidades, mesmo que não seja assim ilustrada, ou se não for explicitamente descrita.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[00019] Figura 1: Porcentagem, %, do conteúdo molar de 3'SL (mM) em cepas que expressam uma determinada atividade de α-2,3-sialiltransferase em relação ao conteúdo molar de células que expressam Nst sob o controle do promotor Plac (barra tracejada). CstI e PM70, são conhecidos na técnica anterior por serem capazes de produzir 3'SL e são indicados por barras pontilhadas.

[00020] Figura 2: Perfis de alimentação (linha contínua) e temperatura (linha pontilhada) usados no teste de estabilidade de crescimento.

[00021] Figura 3: Dados do teste de estabilidade de crescimento de quatro cepas diferentes com Nst_Plac (linha em negrito), Nst_PglpF (linha fina), clari1 (linha tracejada) ou poral (linha pontilhada). A) mostra a taxa de evolução do dióxido de carbono (Cer) das cepas durante a fermentação. B) mostra a reflexão da mesma fermentação durante o tempo de fermentação.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[00022] A presente divulgação aborda os desafios biotecnológicos da produção in vivo de HMO, em particular de HMOs sialilados que contêm pelo menos um monossacarídeo de sialila, tal como os HMOs sialilados 3'SL, FSL e LST-a. A presente divulgação oferece soluções de engenharia de cepas específicas para produzir HMOs sialilados específicos, em particular 3'SL, explorando a especificidade do substrato em relação à fração galactose terminal na lactose e atividade das α-2,3-sialiltransferases da presente divulgação, o que melhora a produção de HMOs sialilados, tanto em termos de estabilidade da cepa em fermentações em larga escala quanto em maiores rendimentos de produção.

[00023] Em outras palavras, uma célula geneticamente modificada coberta pela presente divulgação expressa genes que codificam enzimas chave para a biossíntese de HMO sialilado, em algumas modalidades, juntamente com um ou mais genes que codificam uma via biossintética para produzir um nucleotídeo de açúcar de ácido siálico, tal como o operon neuBCA de Campylobacter jejuni mostrado na SEQ ID NO: 35, que permite que a célula produza um oligossacarídeo sialilado a partir de substratos, tal como lactose e açúcares ativados por nucleotídeos, tal como em particular o ácido CMP-N- acetilneuramínico.

[00024] Em particular, o(s) HMO(s) sialilado(s) produzido(s) é(são) selecionado(s) a partir do grupo que consiste em 3'SL, FSL, DSLNT e LST-a, e presentemente preferido, o HMO sialilado produzido é 3'SL. Para produzir FSL, DSLNT e LST-a, a célula geneticamente modificada, requer a presença de glicosiltransferases adicionais, tal como β- 1,3-N-acetil-glucosaminiltransferase e β-1,3- galactosiltransferase para produzir LST-a a partir de lactose como substrato inicial, ou uma α-1,3- fucosiltransferase para produzir FSL.

[00025] A vantagem de usar qualquer uma das α-2,3- sialiltransferases da presente divulgação no presente contexto é sua capacidade de reconhecer e sialilar a lactose especificamente para gerar 3'SL como o único HMO ao partir da lactose como substrato inicial e sendo capaz de ser expresso a partir de um promotor forte enquanto mantém o crescimento estável da cepa de produção. As enzimas apresentadas neste documento não apenas fornecem altos títulos de 3'SL, mas também fornecem um crescimento estável que atinge uma alta densidade de crescimento. Exemplos de cepas que exibem um crescimento estável ao atingir uma alta densidade de crescimento são fornecidos no exemplo 1. Em particular, a presente divulgação descreve α-2,3- sialiltransferases que produzem títulos mais altos de 3'SL do que as α-2,3-sialiltransferases descritas na técnica anterior, tal como CstI e PM70 (ver WO 2019/020707) e/ou exibem uma densidade de crescimento maior ou semelhante a CstII e/ou Nst (ver WO 2007/101862) usado na mesma célula hospedeira sob as mesmas condições de crescimento. As características das α-2,3-sialiltransferases descritas neste documento são, portanto, adequadas para produção industrial em larga escala de 3'SL.

[00026] As células geneticamente modificadas da presente divulgação, que expressam uma α-2,3- sialiltransferase da presente divulgação, permitem a produção de altos títulos de 3'SL enquanto mantêm ou melhoram um crescimento estável da referida célula geneticamente modificada quando comparada com a α-2,3-sialiltransferase Nst (SEQ ID NO: 5). Assim, a presente divulgação permite uma produção de 3'SL mais eficiente, que é altamente benéfica na produção biotecnológica de HMOs sialilados simples, tal como 3'SL.

[00027] Conforme mostrado no exemplo 1, as células geneticamente modificadas da presente divulgação formam 3'SL em um nível que é pelo menos igual ou pelo menos 5%, tal como 10% acima do nível de 3'SL formado por uma cepa Nst_plac, uma cepa PM70 ou uma cepa CstI nas mesmas condições de crescimento. Em particular, as cepas que expressam Clari1, Poral, Neigon ou PmN produziram mais de 3 vezes mais 3'SL do que as cepas que expressam CstI nas mesmas condições.

[00028] A densidade óptica (OD) mostrada no Exemplo 1 sugere que a superexpressão de Nst usando o promotor heterólogo PglpF em vez do promotor Plac está realmente afetando o crescimento das células, o que não é o caso na mesma extensão para qualquer uma das sialiltransferases da presente divulgação sob o promotor heterólogo PglpF, tornando assim possível usar essas sialiltransferases de forma mais eficaz na produção em escala industrial de HMOs sialilados, tal como 3'SL.

[00029] Nas seções a seguir, elementos individuais da divulgação e, em particular, da célula geneticamente modificada são descritos, entende-se que esses elementos podem ser combinados nas seções individuais.

Oligossacarídeos

[00030] No presente contexto, o termo "oligossacarídeo"significa um polímero de açúcar contendo pelo menos três unidades de monossacarídeo, isto é, um tri-, tetra-, penta-, hexa- ou oligossacarídeo superior. O oligossacarídeo pode ter uma estrutura linear ou ramificada contendo unidades monossacarídicas que estão ligadas umas às outras por ligações interglicosídicas. Particularmente, o oligossacarídeo compreende um resíduo de lactose na extremidade redutora e um ou mais monossacarídeos naturais de 5 a 9 átomos de carbono selecionados a partir de aldoses (por exemplo, glicose, galactose, ribose, arabinose, xilose, etc.), cetoses (por exemplo, frutose, sorbose, tagatose, etc.), desoxiaçúcares (por exemplo, ramnose, fucose, etc.), desoxiaminoaçúcares (por exemplo, N-acetil-glucosamina, N- acetil-manosamina, N-acetil-galactosamina, etc.), ácidos urônicos e ácidos cetoaldônicos (por exemplo, ácido N- acetilneuramínico). De um modo preferido, o oligossacarídeo é um HMO. Oligossacarídeo do leite humano (HMO)

[00031] Os oligossacarídeos preferidos da divulgação são os oligossacarídeos do leite humano (HMOs).

[00032] O termo "oligossacarídeo do leite humano" ou "HMO" no presente contexto significa um carboidrato complexo encontrado no leite materno humano. Os HMOs têm uma estrutura central que compreende uma unidade de lactose na extremidade redutora que pode ser alongada por um ou mais beta-N-acetil- lactosaminila e/ou uma ou mais unidades beta-lacto-N- biosila, e esta estrutura central pode ser substituída por uma fração alfa-L-fucopiranosila e/ou alfa-N-acetil- neuraminila (sialila). As estruturas de HMO são, por exemplo, divulgadas por Xi Chen no Capítulo 4 de Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, 2015, volume 72.

[00033] A presente divulgação se concentra em HMOs sialilados, que são geralmente ácidos. Exemplos de HMOs ácidos incluem 3'-sialillactose (3'SL), 6'-sialillactose (6'SL), 3-fucosil-3'-sialillactose (FSL), 3'-O-sialil- lacto-N-tetraose a (LST-a), fucosil-LST-a (FLST-a), 6'-O- sialilacto-N-tetraose b (LST-b), fucosil-LST b (FLST b), 6'- O-sialilacto-N-neotetraose (LST-c), fucosil-LST-c (FLST-c), 3'-O-sialilacto-N-neotetraose (LST-d), fucosil-LST d (FLST- d), sialil-lacto-N-hexaose (SLNH), sialil-lacto-N-neo- hexaose I (SLNH-I), sialil-lacto-N-neo-hexaose II (SLNH-II) e dissialil-lacto-N-tetraose (DSLNT).

[00034] Em um aspecto da presente divulgação, o oligossacarídeo de leite humano (HMO) sialilado produzido pela célula é um HMO sialilado selecionado a partir do grupo que consiste em 3'SL, FSL, DSLNT e LST-a. Em outro aspecto da presente divulgação, o oligossacarídeo de leite humano (HMO) sialilado produzido pela célula é um HMO de três unidades de monossacarídeo, tal como 3'SL.

[00035] A produção de alguns desses HMOs pode exigir a presença de duas ou mais atividades de glicosiltransferase, em particular se começar a partir da lactose como oligossacarídeo aceitador. No entanto, este não é o caso da produção de 3'SL, que requer apenas a expressão de uma glicosiltransferase com atividade de α-2,3- sialiltransferase.

Oligossacarídeo aceitador

[00036] Uma célula geneticamente modificada de acordo com a presente divulgação compreende uma sequência de ácido nucleico recombinante que codifica uma enzima com atividade α-2,3-sialiltransferase capaz de transferir ácido siálico de um açúcar ativado para a galactose terminal de um oligossacarídeo aceitador.

[00037] No contexto da presente divulgação, um oligossacarídeo aceitador é um oligossacarídeo que pode atuar como um substrato para uma glicosiltransferase capaz de transferir uma fração de glicosila de um doador de glicosila para o oligossacarídeo aceptor. O doador de glicosila é de um modo preferido um açúcar ativado por nucleotídeo, conforme descrito na seção “glicosiltransferases”. De um modo preferido, o oligossacarídeo aceitador é um precursor para fazer um HMO e, também, pode ser denominado molécula precursora.

[00038] No presente contexto, o referido oligossacarídeo aceitador é de um modo preferido a lactose para a produção de 3'SL. A produção de HMOs mais complexos do que 3'SL, tal como LST-a ou FSL, também pode incluir moléculas aceitadoras mais complexas, tal como lacto-N- neotetraose (LNT), que é produzida a partir das moléculas precursoras de lactose e/ou lacto-N-triose II (LNT-II) ou 3FL. Em ambos os casos, a molécula precursora pode ser alimentada à célula geneticamente modificada que é capaz de produzir o HMO sialilado a partir do precursor ou a célula pode ser modificada para produzir a molécula aceitadora mais complexa a partir da lactose.

[00039] O oligossacarídeo aceitador pode ser um produto intermediário do presente processo de fermentação, um produto final de um processo de fermentação separado empregando uma célula geneticamente modificada separada ou uma molécula produzida enzimaticamente ou quimicamente.

Glicosiltransferases

[00040] A célula geneticamente modificada de acordo com a presente divulgação compreende pelo menos uma sequência de ácido nucleico recombinante que codifica pelo menos uma glicosiltransferase capaz de transferir um resíduo sialila de um doador de sialila para um oligossacarídeo aceitador para sintetizar um produto de oligossacarídeo de leite humano sialilado, isto é, uma sialiltransferase.

[00041] A célula geneticamente modificada, de acordo com a presente divulgação, pode compreender pelo menos uma outra sequência de ácido nucleico recombinante que codifica pelo menos uma glicosiltransferase capaz de transferir um resíduo de glicosila de um doador de glicosila para um oligossacarídeo aceitador. A(s) glicosiltransferase(s) adicional(is) pode(m) permitir que a célula geneticamente modificada sintetize LNT a partir de uma molécula precursora, tal como lactose ou LNT-II, ou sintetizar 3FL a partir de lactose. A glicosiltransferase adicional também pode ser capaz de decorar adicionalmente, por exemplo, uma molécula 3'SL para gerar, por exemplo, FSL ou uma molécula LST-a ou LST-b para gerar DSLNT.

[00042] A glicosiltransferase adicional é de um modo preferido selecionada a partir do grupo que consiste em fucosiltransferases, galactosiltransferases, glucosaminiltransferases, sialiltransferases e N- acetilglucosaminiltransferases.

[00043] Quando se deseja produzir HMOs mais complexos, a α-2,3-sialiltransferase descrita neste documento pode ser combinada com uma ou mais glicosiltransferases selecionadas a partir do grupo que consiste em β-1,3-galactosiltransferases, β-1,4- galactosiltransferases e β-1,3-N-acetil- glucosaminiltransferases. Em modalidades específicas, a glicosiltransferase adicional pode ser uma β-1,3- galactosiltransferase, ou uma β-1,4-galactosiltransferase, ou uma combinação de uma β-1,3-galactosiltransferase e uma β-1,3-N-acetil-glucosaminiltransferases, ou combinação de uma β-1,4-galactosiltransferase e uma β-1,3-N-acetil- glucosaminiltransferase. Em outra modalidade, uma fucosiltransferase selecionada a partir do grupo que consiste em α-1,2-fucosiltransferases, α-1,3- fucosiltransferase e α-1,3/4-fucosiltransferase pode ser introduzida na célula geneticamente modificada descrita neste documento.

[00044] Em um aspecto, a sialiltransferase na célula geneticamente modificada da presente divulgação é uma α-2,3- sialiltransferase. De um modo preferido, a α-2,3- sialiltransferase é capaz de transferir uma unidade de ácido siálico para a galactose terminal de uma molécula de lactose. De um modo preferido, apenas na posição C3 da galactose, gerando assim 3'SL como o único HMO ao partir da lactose como substrato inicial.

[00045] Na presente divulgação, pelo menos uma enzima funcional (α-2,3-sialiltransferase) capaz de transferir uma fração sialila de um doador de sialila para um oligossacarídeo aceitador pode ser selecionada a partir da lista que consiste em Clari1, Neigon, Poral e PmN (tabela 1). Essas enzimas, uma vez expressas em uma célula geneticamente modificada, podem, por exemplo, ser usadas para produzir 3'SL.

[00046] Em uma modalidade, a expressão de uma α-2,3- sialiltransferase da divulgação é combinada adicionalmente com uma β-1,3-galactosiltransferase, tal como galTK de Helicobacter pylori (SEQ ID NO: 37, ou uma variante funcional da mesma). Em outra modalidade, uma terceira enzima é adicionada, tal como uma β-1,3-N-acetil- glucosaminiltransferase, por exemplo, LgtA de Neisseria meningitidis (SEQ ID NO: 36, ou uma variante funcional da mesma).

[00047] As glicosiltransferases exemplificadas são de um modo preferido selecionadas a partir das glicosiltransferases descritas abaixo. α-2,3-sialiltransferase

[00048] Uma alfa-2,3-sialiltransferase se refere a uma glicosiltransferase que catalisa a transferência de sialila de um substrato doador, tal como o ácido CMP-N- acetilneuramínico, para uma molécula aceitadora em uma ligação alfa-2,3. De um modo preferido, uma alfa-2,3- sialiltransferase usada neste documento não se origina na espécie da célula geneticamente modificada, ou seja, o gene que codifica a alfa-2,3-sialiltransferase é de origem heteróloga e é selecionado de um alfa-2,3-sialiltransferase identificada na tabela 1. Alfa 2,3-sialiltransferases heterólogas que são capazes de transferir uma porção sialila para a lactose são conhecidas na técnica, três das quais são identificadas na tabela 1.

[00049] As α-2,3-sialiltransferases investigadas no presente pedido estão listadas na tabela 1. A sialiltransferase pode ser selecionada a partir de uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como 80%, tal como pelo menos 90%, tal como em pelo menos 95%, ou pelo menos 99% de identidade com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das alfa-2,3-sialiltransferases listadas na tabela 1. Tabela 1. Lista de enzimas alfa-2,3-sialiltransferase capazes de produzir 3'SL

[00050] Os IDs do GenBank refletem as enzimas completas, na presente divulgação podem ter sido usadas versões truncadas ou mutadas, estas são representadas por SEQ ID NOs.

[00051] As alfa-2,3-sialiltransferases Nst, PM70 e CstI são conhecidas da técnica anterior como alfa-2,3- sialiltransferases que podem produzir HMOs sialilados.

[00052] O exemplo 1 da presente divulgação identificou as alfa-2,3-sialiltransferases heterólogas Clari1, Neigon e Poral (SEQ ID NO: 1, 2 e 3, respectivamente), que são capazes de produzir títulos 3'SL maiores ou iguais quando introduzidos em uma célula geneticamente modificada, do que as conhecidas alfa-2,3- sialiltransferases Nst, PM70 e CstI.

[00053] O exemplo 1 da presente divulgação identificou ainda que as alfa-2,3-sialiltransferases heterólogas Clari1, Neigon, Poral e PmN (SEQ ID NO: 1, 2, 3 e 4, respectivamente), são capazes de produzir títulos de 3'SL semelhantes ou superiores quando introduzidos em uma célula geneticamente modificada, do que as conhecidas alfa- 2,3-sialiltransferases Nst, PM70 e CstI, embora não afetem significativamente o crescimento da célula geneticamente modificada.

[00054] Em uma modalidade da divulgação, a enzima com atividade de α-2,3-sialiltransferase é Clari1 de Campylobacter lari compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, ou tal como pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 1.

[00055] Em outra modalidade da divulgação, a enzima com atividade de α-2,3-sialiltransferase é Neigon de Neisseria gonorrhoeae FA 1090 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 50%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, ou tal como pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 2.

[00056] Em outra modalidade da divulgação, a enzima com atividade de α-2,3-sialiltransferase é Poral de Pasteurella oralis compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, ou tal como pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 3.

[00057] Em outra modalidade da divulgação, a enzima com atividade de α-2,3-sialiltransferase é PmN de Pasteurella compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como em pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, ou tal como pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 4.

[00058] Em uma modalidade, a célula geneticamente modificada que expressa uma α-2,3-sialiltransferase da presente divulgação resulta em uma produção de 3'SL que é pelo menos igual a, pelo menos 5%, tal como pelo menos 10%, tal como pelo menos 15% ou pelo menos 20% superior a quantidade de 3'SL produzida por uma célula geneticamente modificada que expressa a α-2,3-sialiltransferase Nst (SEQ ID NO: 5), quando a expressão de Nst é regulada através de um promotor Plac.

[00059] Em uma modalidade, a célula geneticamente modificada que expressa a α-2,3-sialiltransferase Clari1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, ou tal como pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 1, resulta em uma produção de 3'SL que é pelo menos igual a, pelo menos 5%, tal pelo menos 10%, pelo menos 15% ou pelo menos 20% superior à quantidade de 3'SL produzida por uma célula geneticamente modificada que expressa a α-2,3-sialiltransferase Nst (SEQ ID NO: 5), quando a expressão de Nst é regulada por meio de um promotor Plac.

[00060] Em uma modalidade, a célula geneticamente modificada que expressa a α-2,3-sialiltransferase Neigon compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, ou tal como pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 2, resulta em uma produção de 3'SL que é pelo menos igual a, pelo menos 5%, tal pelo menos 7%, pelo menos 10% ou pelo menos 15% superior à quantidade de 3'SL produzida por uma célula geneticamente modificada que expressa a α-2,3-sialiltransferase Nst (SEQ ID NO: 5), quando a expressão de Nst é regulada por meio de um promotor Plac.

[00061] Em uma modalidade, a célula geneticamente modificada que expressa a α-2,3-sialiltransferase Poral compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, ou tal como pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 3, resulta em uma produção de 3'SL que é pelo menos igual a, pelo menos 2%, tal como pelo menos 4%, ou pelo menos 5% superior à quantidade de 3'SL produzida por uma célula geneticamente modificada que expressa a α-2,3- sialiltransferase Nst (SEQ ID NO: 5), quando a expressão de Nst é regulada através de um promotor Plac.

[00062] Em uma modalidade, a célula geneticamente modificada que expressa a α-2,3-sialiltransferase PmN compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, ou tal como pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 4, resulta em uma produção de 3'SL que é aproximadamente igual à quantidade de 3'SL produzida por uma célula geneticamente modificada que expressa a α-2,3- sialiltransferase Nst (SEQ ID NO: 5), quando a expressão de Nst é regulada por meio de um promotor Plac.

[00063] Em uma modalidade, a célula geneticamente modificada que expressa uma α-2,3-sialiltransferase da presente divulgação resulta em uma produção de 3'SL que é de pelo menos 5%, tal como pelo menos 10%, tal como pelo menos 15%, tal como pelo menos 20% ou pelo menos 25% superior à quantidade de 3'SL produzida por uma célula geneticamente modificada que expressa a α-2,3-sialiltransferase PM70 (SEQ ID NO: 6), quando a expressão de PM70 é regulada através de um promotor Plac ou PglpF.

[00064] Em uma modalidade, a célula geneticamente modificada que expressa a α-2,3-sialiltransferase Clari1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, ou tal como pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 1, resulta em uma produção de 3'SL que é de pelo menos 5%, tal como pelo menos 10%, tal como pelo menos 15%, tal como pelo menos 20% ou tal como pelo menos 25% superior à quantidade de 3'SL produzida por uma célula geneticamente modificada que expressa a α-2,3- sialiltransferase PM70 (SEQ ID NO: 6), quando a expressão de PM70 é regulada por um promotor Plac ou PglpF.

[00065] Em uma modalidade, a célula geneticamente modificada que expressa a α-2,3-sialiltransferase Neigon compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, ou tal como pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 2, resulta em uma produção de 3'SL que é de pelo menos 5%, tal como pelo menos 10%, tal como pelo menos 15%, tal como pelo menos 20% ou tal como pelo menos 25% superior à quantidade de 3'SL produzida por uma célula geneticamente modificada que expressa a α-2,3- sialiltransferase PM70 (SEQ ID NO: 6), quando a expressão de PM70 é regulada por um promotor Plac ou PglpF.

[00066] Em uma modalidade, a célula geneticamente modificada que expressa a α-2,3-sialiltransferase Poral compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, ou tal como pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 3, resulta em uma produção de 3'SL que é de pelo menos 3%, tal como pelo menos 5%, tal como pelo menos 7%, tal como pelo menos 9% ou tal como pelo menos 10% superior à quantidade de 3'SL produzida por uma célula geneticamente modificada que expressa a α-2,3-sialiltransferase PM70 (SEQ ID NO: 6), quando a expressão de PM70 é regulada por um promotor Plac ou PglpF.

[00067] Em uma modalidade, a célula geneticamente modificada que expressa a α-2,3-sialiltransferase PmN compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, ou tal como pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 4, resulta em uma produção de 3'SL que é de pelo menos 5%, tal como pelo menos 10%, tal como pelo menos 15%, tal como pelo menos 20% ou tal como pelo menos 25% superior à quantidade de 3'SL produzida por uma célula geneticamente modificada que expressa a α-2,3- sialiltransferase PM70 (SEQ ID NO: 6), quando a expressão de PM70 é regulada por um promotor Plac ou PglpF.

[00068] Em uma modalidade, a célula geneticamente modificada que expressa uma α-2,3-sialiltransferase da presente divulgação resulta na produção de 3'SL, enquanto a célula geneticamente modificada exibe um crescimento estável em uma faixa mais ampla de taxas de crescimento em comparação com uma célula geneticamente modificada que expressa a α- 2,3-sialiltransferase Nst (SEQ ID NO: 5) quando a expressão de Nst é regulada pelo promotor PglpF.

[00069] Em uma modalidade, a célula geneticamente modificada que expressa a α-2,3-sialiltransferase Clari1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, ou tal como pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 1, resulta na produção de 3'SL enquanto a célula geneticamente modificada exibe crescimento estável ao longo de uma faixa mais ampla de taxas de crescimento em comparação com uma célula geneticamente modificada que expressa a α-2,3-sialiltransferase Nst (SEQ ID NO: 5) quando a expressão de Nst é regulada por meio de um promotor PglpF.

[00070] Em uma modalidade, a célula geneticamente modificada que expressa a α-2,3-sialiltransferase Poral compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, ou tal como pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 2, resulta na produção de 3'SL enquanto a célula geneticamente modificada exibe crescimento estável ao longo de uma faixa mais ampla de taxas de crescimento em comparação com uma célula geneticamente modificada que expressa a α-2,3-sialiltransferase Nst (SEQ ID NO: 5) quando a expressão de Nst é regulada por meio de um promotor PglpF.

[00071] Em uma modalidade, a célula geneticamente modificada que expressa a α-2,3-sialiltransferase Neigon compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, ou tal como pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 3, resulta na produção de 3'SL enquanto a célula geneticamente modificada exibe crescimento estável ao longo de uma faixa mais ampla de taxas de crescimento em comparação com uma célula geneticamente modificada que expressa a α-2,3-sialiltransferase Nst (SEQ ID NO: 5) quando a expressão de Nst é regulada por meio de um promotor PglpF.

[00072] Em uma modalidade, a célula geneticamente modificada que expressa a α-2,3-sialiltransferase PmN compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, ou tal como pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 4, resulta na produção de 3'SL enquanto a célula geneticamente modificada exibe crescimento estável ao longo de uma faixa mais ampla de taxas de crescimento em comparação com uma célula geneticamente modificada que expressa a α-2,3-sialiltransferase Nst (SEQ ID NO: 5) quando a expressão de Nst é regulada por meio de um promotor PglpF. Doador de glicosila - vias de açúcar ativadas por nucleotídeo

[00073] Ao realizar o método desta divulgação, ocorre de um modo preferido uma reação de glicosilação mediada por glicosiltransferase na qual um nucleotídeo de açúcar ativado serve como doador de glicosila. Um nucleotídeo de açúcar ativado geralmente tem um resíduo glicosila fosforilado ligado a um nucleosídeo. Uma enzima glicosiltransferase específica aceita apenas um nucleotídeo de açúcar específico. Assim, de um modo preferido, os seguintes nucleotídeos de açúcar ativados estão envolvidos na transferência de glicosila: glicose-UDP-GlcNAc, UDP- galactose, UDP-glicose, UDP-N-acetilglucosamina, UDP-N- acetilgalactosamina (GlcNAc) e ácido CMP-N- acetilneuramínico. A célula geneticamente modificada de acordo com a presente divulgação pode compreender uma ou mais vias para produzir um açúcar ativado por nucleotídeo selecionado a partir do grupo que consiste em glicose-UDP- GlcNAc, GDP-fucose, UDP-galactose, UDP-glicose, UDP-N- acetilglucosamina, UDP-N-acetilgalactosamina e ácido CMP-N- acetilneuramínico.

[00074] Em uma modalidade do método, a célula geneticamente modificada é capaz de produzir um ou mais nucleotídeos de açúcar ativados mencionados acima por uma via de novo. A este respeito, um nucleotídeo de açúcar ativado é produzido pela célula sob a ação de enzimas envolvidas na via biossintética de novo desse nucleotídeo de açúcar respectivo em uma sequência de reação passo a passo a partir de uma fonte de carbono simples como glicerol, sacarose, frutose ou glicose (para uma revisão do metabolismo de monossacarídeos, ver, por exemplo, H. H. Freeze e A. D. Elbein: Capítulo 4: Glycosylatio Precursors, em: Essentials of Glycobiology, 2aedição (Eds. A. Varki et al.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (2009)).

[00075] As enzimas envolvidas na via biossintética de novo de um nucleotídeo de açúcar ativado podem estar naturalmente presentes na célula ou introduzidas na célula por meio de tecnologia genética ou técnicas de DNA recombinante, todas elas fazem parte do conhecimento geral da pessoa versada na técnica.

[00076] Em outra modalidade, a célula geneticamente modificada pode utilizar monossacarídeos recuperados para o nucleotídeo de açúcar. Na via de recuperação, os monossacarídeos derivados de oligossacarídeos degradados são fosforilados por quinases e convertidos em açúcares nucleotídicos por pirofosforilases. As enzimas envolvidas no procedimento podem ser heterólogas ou nativas da célula hospedeira. Via de síntese de nucleotídeos de açúcar do ácido siálico

[00077] De um modo preferido, a célula geneticamente modificada de acordo com a presente divulgação compreende uma capacidade de síntese de nucleotídeo de açúcar de ácido siálico, ou seja, a célula geneticamente modificada compreende uma via biossintética para produzir um nucleotídeo de açúcar sialato, tal como ácido CMP-N- acetilneuramínico como doador de glicosila para a alfa-2,3- sialiltransferase da presente divulgação. Por exemplo, a célula geneticamente modificada compreende uma capacidade sintética de ácido siálico através do fornecimento de uma UDP-GlcNAc 2-epimerase exógena (por exemplo, NeuC de Campylobacter jejuni (GenBank AAK91727.1) ou equivalente (por exemplo, (GenBank CAR04561.1), um Neu5Ac sintase (por exemplo, NeuB de C. jejuni (GenBank AAK91726.1) ou equivalente, (por exemplo, ácido siálico sintase de Flavobacterium limnosediminis, GenBank WP_023580510.1) e/ou uma CMP-Neu5Ac sintetase (por exemplo, NeuA de C. jejuni (GenBank AAK91728.1) ou equivalente, (por exemplo, CMP-ácido siálico sintase de Vibrio brasiliensis, GenBank WP_006881452.1).

[00078] Em um ou mais exemplos, UDP-GlcNAc 2- epimerase, CMP-Neu5Ac sintetase, Neu5Ac sintase de Campylobacter jejuni, também referido como NeuBCA de Campylobacter jejuni ou simplesmente o operon neuBCA, pode ser transportado por plasmídeo ou integrado no genoma da célula geneticamente modificado. De um modo preferido, a via do nucleotídeo do açúcar do ácido siálico é codificada pela sequência de ácido nucleico que codifica NeuBCA de Campylobacter jejuni (SEQ ID NO: 35) ou uma variante funcional da mesma com uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% idêntica, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90% ou pelo menos 99% para SEQ ID NO: 35.

[00079] Além disso, a sequência de ácido nucleico que codifica NeuBCA é de um modo preferido codificada a partir de um plasmídeo de alta cópia contendo o operon neuBCA. Em modalidades, o plasmídeo de alta cópia é o plasmídeo BlueScribe M13 (pBS). Em relação à presente divulgação, um plasmídeo de alta cópia é um plasmídeo que se replica para um número de cópias acima de 50 quando introduzido na célula. Via catabólica de ácido siálico deficiente

[00080] A célula geneticamente modificada da presente divulgação de um modo preferido tem uma via catabólica de ácido siálico deficiente. Por "via catabólica do ácido siálico"se entende uma sequência de reações, normalmente controladas e catalisadas por enzimas, que resulta na degradação do ácido siálico. Uma via catabólica de ácido siálico exemplificativa descrita a seguir é a via de E. coli. Nesta via, o ácido siálico (Neu5Ac; ácido N- acetilneuramínico) é degradado pelas enzimas NanA (ácido N- acetilneuramínico liase) e NanK (N-acetilmanosamina quinase) e NanE (N-acetilmanosamina-6-fosfato epimerase), todas codificadas do operon nanATEK-yhcH e reprimido por NanR (http://ecocyc.org/ECOLI). Uma via catabólica de ácido siálico deficiente é processada no hospedeiro E. coli pela introdução de uma mutação nos genes endógenos nanA (N- acetilneuraminato liase) (por exemplo, número de acesso GenBank D00067.1(GL216588)) e/ou nanK (N-acetilmannosamina quinase) (por exemplo, número de acesso do GenBank (aminoácido) BAE77265.1 (GL85676015)) e/ou nanE (N- acetilmanosamina-6-fosfato epimerase, GI: 947745), incorporado neste documento por referência). Opcionalmente, o gene nanT (transportador de N-acetilneuraminato) também é inativado ou mutado. Outros intermediários do metabolismo do ácido siálico incluem: (ManNAc-6-P) N-acetilmanosamina-6- fosfato; (GlcNAc-6-P) N-acetilglucosamina-6-fosfato; (GlcN- 6-P) Glucosamina-6-fosfato e (Fruc-6-P) Frutose-6-fosfato. Em algumas modalidades preferidas, nanA está mutado. Em outras modalidades preferidas, nanA e nanK são mutados, enquanto nanE permanece funcional. Em outra modalidade preferencial, nanA e nanE são mutados, enquanto nanK não foi mutado, inativado ou deletado. Uma mutação é uma ou mais alterações na sequência de ácido nucleico que codifica o produto gênico de nanA, nanK, nanE e/ou nanT. Por exemplo, a mutação pode ser 1, 2, até 5, até 10, até 25, até 50 ou até 100 alterações na sequência de ácido nucleico. Por exemplo, os genes nanA, nanK, nanE e/ou nanT são mutados por uma mutação nula. Mutações nulas como descritas neste documento abrangem substituições, adições, deleções ou inserções de aminoácidos, que causam uma perda de função da enzima (isto é, atividade reduzida ou nenhuma) ou perda da enzima (isto é, nenhum produto gênico). Por "excluído"se entende que a região de codificação é removida completamente ou em parte, de modo que nenhum produto gênico (funcional) seja produzido. Por inativado se entende que a sequência de codificação foi alterada de modo que o produto gênico resultante seja funcionalmente inativo ou codifique um produto gênico com menos de 100%, por exemplo, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30% ou 20% da atividade do produto gênico endógeno nativo, de ocorrência natural. Assim, na presente divulgação, os genes nanA, nanK, nanE e/ou nanT são de um modo preferido inativados. Proteínas transportadoras da superfamília de facilitadores principais (MFS)

[00081] O produto oligossacarídeo, o HMO produzido pela célula, pode ser acumulado tanto na matriz intra- quanto na extracelular. O produto pode ser transportado para o sobrenadante de forma passiva, ou seja, difunde-se para fora através da membrana celular. Alternativamente, o transporte de HMO pode ser facilitado por proteínas transportadoras da superfamília de facilitadores principais que promovem a efluência de derivados de açúcar da célula para o sobrenadante. O principal transportador da superfamília de facilitadores pode estar presente de forma exógena ou endógena e é superexpresso nas condições da fermentação para aumentar a exportação do derivado de oligossacarídeo (HMO) produzido. A especificidade para a porção de açúcar do produto a ser secretado pode ser alterada por mutação por meio de técnicas de DNA recombinante conhecidas.

[00082] Assim, a célula geneticamente modificada de acordo com a presente divulgação pode compreender adicionalmente uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína transportadora da superfamília de facilitadores principais capaz de exportar o(s) produto(s) oligossacarídeo(s) de leite humano sialilado.

[00083] Nos últimos anos, foram identificadas várias novas e eficientes proteínas transportadoras da superfamília de facilitadores, cada uma com especificidade para diferentes HMOs produzidos de forma recombinante e o desenvolvimento de células recombinantes que expressam as referidas proteínas é vantajoso para a fabricação industrial de HMO em alta escala. WO 2021/123113 reivindica diferentes E. coli e transportadores heterólogos para a exportação de 3'SL, 6'SL e LST-a.

[00084] Assim, em uma ou mais modalidades exemplares, a célula geneticamente modificada de acordo com o método descrito neste documento compreende adicionalmente um produto gênico que atua como um transportador da superfamília de facilitadores principais. O produto gênico que atua como um transportador da superfamília de facilitadores principais pode ser codificado por uma sequência de ácido nucleico recombinante que é expressa na célula geneticamente modificada. A sequência de ácido nucleico recombinante que codifica um transportador de superfamília de facilitadores principais pode ser integrada no genoma da célula geneticamente modificada ou expressa usando um plasmídeo.

[00085] Em uma modalidade, a célula geneticamente modificada da divulgação compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína transportadora da superfamília de facilitadores principais capaz de exportar o produto de oligossacarídeo do leite humano sialilado para o meio extracelular, em particular, os transportadores com especificidade para 3'SL são preferidos. Nec

[00086] Em uma modalidade, a célula geneticamente modificada da divulgação compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína transportadora de efluxo capaz de exportar o produto de oligossacarídeo de leite humano sialilado, tal como 3'SL; no meio extracelular. No contexto atual, a referida proteína transportadora de efluxo é de um modo preferido um gene heterólogo0 que codifica uma proteína transportadora putativa MFS (superfamília de facilitadores principais), originária da bactéria Rosenbergiella nectarea. Mais especificamente, a divulgação se refere a uma célula geneticamente modificada otimizada para produzir um oligossacarídeo, em particular um HMO sialilado, compreendendo um ácido nucleico recombinante que codifica uma proteína com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da sequência de aminoácidos com ID de acesso no GenBank WP_092672081.1 ou SEQ ID NO: 38.

[00087] Além disso, a proteína transportadora da MFS com o ID de acesso no GenBank WP_092672081.1 é descrita adicionalmente em WO 2021/148615 e é identificada neste documento como "proteína Nec" ou "transportador Nec" ou "Nec", de forma intercambiável; uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína Nec é identificada neste documento como "ácido nucleico/DNA que codifica nec" ou "gene nec" ou "nec".

[00088] Espera-se que Nec facilite um aumento no efluxo dos HMOs sialilados produzidos, por exemplo, 3'SL nas células geneticamente modificadas da divulgação atual.

[00089] Consequentemente, em uma modalidade, a célula geneticamente modificada da presente divulgação compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína transportadora Nec.

Fred/YberC

[00090] Em modalidades, a célula geneticamente modificada da presente divulgação compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína transportadora de efluxo capaz de exportar o produto de oligossacarídeo de leite humano sialilado simples, tal como 3'SL e 6'SL para o meio extracelular. No contexto atual, a referida proteína transportadora de efluxo é de um modo preferido um gene heterólogo que codifica uma proteína transportadora putativa MFS (superfamília de facilitadores principais), originada da bactéria Yersinia frederiksenii e/ou da bactéria Yersinia bercovieri. Mais especificamente, a divulgação se refere a uma célula geneticamente modificada otimizada para produzir um oligossacarídeo, em particular um HMO sialilado, compreendendo um ácido nucleico recombinante que codifica uma proteína com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da sequência de aminoácidos possuindo a ID de acesso do GenBank WP_087817556.1 (SEQ ID NO: 40) ou acesso do GenBank EEQ08298 (SEQ ID NO: 39).

[00091] A proteína transportadora de MFS com o ID de acesso no GenBank WP_087817556.1 é descrita adicionalmente em WO 2021/148620 e é identificada neste documento como “proteína Fred” ou “transportador Fred” ou “Fred”, alternadamente; uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína Fred é identificada neste documento como "ácido nucleico/DNA codificador de fred" ou "gene fred" ou "fred".

[00092] Consequentemente, em uma modalidade, a célula geneticamente modificada da presente divulgação compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína transportadora Nec ou Fred.

[00093] Além disso, a proteína transportadora de MFS com o ID de acesso do GenBank EEQ08298 é descrita adicionalmente em WO 2021/148610 e é identificada neste documento como “proteína YberC” ou “transportador YberC” ou “YberC”, de forma intercambiável; uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína YberC é identificada neste documento como "ácido nucleico/DNA codificador de YberC" ou "gene yberC" ou "yberC".

[00094] Fred e YberC facilitam um aumento no efluxo dos HMOs sialilados produzidos, por exemplo, 3'SL nas células geneticamente modificadas da divulgação atual.

[00095] Consequentemente, em uma modalidade, a célula geneticamente modificada da presente divulgação compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína transportadora Fred. Em uma modalidade, a célula geneticamente modificada da presente divulgação compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína transportadora YberC.

Célula geneticamente modificada

[00096] No presente contexto, os termos "uma célula geneticamente modificada" e "uma célula geneticamente desenvolvida"são usados de forma intercambiável. Conforme usado neste documento, "uma célula geneticamente modificada"é uma célula hospedeira cujo material genético foi alterado por intervenção humana usando uma técnica de engenharia genética, tal técnica é, por exemplo, mas não limitada a, transformação ou transfecção, por exemplo, com uma sequência polinucleotídica heteróloga, edição Crisper/Cas e/ou mutagênese aleatória. Em uma modalidade, a célula geneticamente modificada foi transformada ou transfectada com uma sequência de ácido nucleico recombinante.

[00097] As modificações genéticas podem, por exemplo, ser selecionadas a partir da inclusão de glicosiltransferases e/ou engenharia de vias metabólicas e inclusão de transportadores de MFS conforme descrito nas seções acima, que o especialista saberá como combinar uma célula geneticamente modificada capaz de produzir um ou HMOs mais sialilados.

[00098] Em um aspecto da divulgação, a célula geneticamente modificada compreende uma sequência de ácido nucleico recombinante que codifica uma enzima com atividade α-2,3-sialiltransferase, que é capaz de produzir pelo menos 5% a mais de conteúdo molar de HMO 3'SL em comparação com uma célula que expressa a α-2,3-sialiltransferase Nst em que a expressão de Nst é regulada por um promotor Plac.

[00099] A célula geneticamente modificada é de um modo preferido uma célula microbiana, tal como uma célula procariótica ou célula eucariótica. Células microbianas apropriadas que podem funcionar como uma célula hospedeira incluem células bacterianas, células arqueobacterianas, células de algas e células fúngicas.

[000100] A célula geneticamente modificada pode ser, por exemplo, uma célula bacteriana ou de levedura. Em uma modalidade preferencial, a célula geneticamente modificada é uma célula bacteriana.

Células hospedeiras

[000101] Quanto às células hospedeiras bacterianas, em princípio não há limitações; podem ser eubactérias (gram- positivas ou gram-negativas) ou arqueobactérias, desde que permitam a manipulação genética para inserção de um gene de interesse e possam ser cultivadas em escala industrial. De um modo preferido, a célula hospedeira tem a propriedade de permitir o cultivo em altas densidades celulares. Exemplos não limitativos de células hospedeiras bacterianas que são adequadas para a produção industrial recombinante de um HMO de acordo com a divulgação podem ser Erwinia herbicola (Pantoea agglomerans), Citrobacter freundii, Campylobacter sp, Pantoea citrea, Pectobacterium carotovorum ou Xanthomonas campestris. Podem também ser utilizadas bactérias do gênero Bacillus, incluindo Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus coagulans, Bacillus thermophilus, Bacillus laterosporus, Bacillus megaterium, Bacillus mycoides, Bacillus pumilus, Bacillus lentus, Bacillus cereus e Bacillus circulans. Da mesma forma, as bactérias dos gêneros Lactobacillus e Lactococcus podem ser manipuladas usando os métodos desta divulgação, incluindo, entre outros, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus casei, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus jensenii e Lactococcus lactis. Streptococcus termophiles e Proprionibacterium freudenreichiitambém são espécies bacterianas adequadas para a divulgação descrita neste documento. Também estão incluídas como parte desta divulgação as cepas, manipuladas conforme descrito neste documento, dos gêneros Enterococcus (por exemplo, Enterococcus faecium e Enterococcus termófilos), Bifidobacterium (por exemplo, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis e Bifidobacterium bifidum), Sporolactobacillus spp., Micromomospora spp., Micrococcus spp., Rhodococcus spp. e Pseudomonas (por exemplo, Pseudomonas fluorescens e Pseudomonas aeruginosa).

[000102] Exemplos não limitativos de células hospedeiras fúngicas que são adequadas para a produção industrial recombinante de um produto heterólogo são, por exemplo, células de levedura, tal como Komagataella phaffii, Kluyveromyces lactis, Yarrowia lipolytica, Pichia pastoris e Saccaromyces cerevisiae ou fungos filamentosos, tal como Aspargillus sp, Fusarium sp ou Thricoderma sp, espécies exemplares são A. niger, A. nidulans, A. oryzae, F. solani, F. graminearum e T. reesei.

[000103] Em uma ou mais modalidades exemplares, a célula geneticamente modificada é selecionada a partir do grupo que consiste em Escherichia sp., Bacillus sp., Lactobacillus sp., Corynebacterium sp. e Campylobacter sp..

[000104] Em uma ou mais modalidades exemplares, a célula geneticamente modificada é selecionada a partir do grupo que consiste em Escherichia coli, Bacillus subtilis, lactobacillus lactis, Corynebacterium glutamicum, Yarrowia lipolytica, Pichia pastoris e Saccharomyces cerevisiae.

[000105] Em uma ou mais modalidades exemplares, a célula geneticamente modificada é B. subtilis.

[000106] Em uma ou mais modalidades exemplares, a célula geneticamente modificada é S. Cerevisiae ou P pastoris.

[000107] Em uma ou mais modalidades exemplares, a célula geneticamente modificada é Escherichia coli.

[000108] Em uma ou mais modalidades exemplares, a divulgação se refere a uma célula geneticamente modificada, em que a célula é derivada da cepa E. coli K-12 ou DE3.

Sequência de ácido nucleico recombinante

[000109] A presente divulgação se refere a uma célula geneticamente modificada compreendendo uma sequência de ácido nucleico recombinante que codifica uma enzima com atividade α-2,3-sialiltransferase, tal como uma enzima selecionada a partir do grupo que consiste em Clari1, Neigon, Poral e PmN, em que a referida célula produz Oligossacarídeos do Leite Humano (HMO), em particular um HMO sialilado e de um modo preferido 3'SL.

[000110] No presente contexto, o termo "sequência de ácido nucleico recombinante", "gene recombinante/ácido nucleico/sequência de nucleotídeo/codificação de DNA" ou "sequência de ácido nucleico codificante"é usado de forma intercambiável e pretende significar uma sequência de ácido nucleico artificial (ou seja, produzida in vitro usando métodos de laboratório padrão para fazer sequências de ácidos nucleicos) que compreende 0um conjunto de tripletos (códons) consecutivos e não sobrepostos que são transcritos em mRNA e traduzidos em uma proteína quando sob o controle das sequências de controle apropriadas, ou seja, uma sequência promotora.

[000111] Os limites da sequência de codificação são geralmente determinados por um sítio de ligação ao ribossomo localizado logo a montante do quadro de leitura aberta na extremidade 5' do mRNA, um códon de início da transcrição (AUG, GUG ou UUG) e um códon de parada da tradução (UAA, UGA ou UAG). Uma sequência de codificação pode incluir, mas não está limitada a, DNA genômico, cDNA, sintético e sequências de ácidos nucleicos recombinantes.

[000112] O termo "ácido nucleico" inclui moléculas de RNA, DNA e cDNA. Entende-se que, tal como resultado da degenerescência do código genético, pode ser produzida uma multiplicidade de sequências de ácidos nucleicos que codificam uma determinada proteína.

[000113] A sequência de ácido nucleico recombinante pode ser uma sequência de DNA codificante, por exemplo, um gene, ou uma sequência de DNA não codificante, por exemplo, um DNA regulador, tal como uma sequência promotora ou outras sequências reguladoras não codificantes.

[000114] A sequência de ácido nucleico recombinante pode adicionalmente ser heteróloga. Tal como utilizado neste documento, "heterólogo"se refere a um polipeptídeo, sequência de aminoácidos, sequência de ácidos nucleicos ou sequência de nucleotídeos que é estranho a uma célula ou organismo, isto é, a um polipeptídeo, sequência de aminoácidos, molécula de ácido nucleico ou sequência de nucleotídeos que não ocorre na referida célula ou organismo.

[000115] A divulgação também se refere a um construto de ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleica codificante, ou seja, sequência de DNA recombinante de um gene de interesse, por exemplo, um gene da sialiltransferase e uma sequência de DNA regulatória não codificante, por exemplo, uma sequência de DNA promotora, por exemplo, um sequência promotora recombinante derivada da sequência promotora do operon lac ou operon glp, ou uma sequência promotora derivada de outra sequência de DNA promotor genômico, ou uma sequência promotora sintética, em que as sequências codificadoras e promotoras estão operacionalmente ligadas.

[000116] O termo "operacionalmente ligado" se refere a uma relação funcional entre dois ou mais segmentos de ácido nucleico (por exemplo, DNA). Refere-se à relação funcional de uma sequência regulatória transcricional com uma sequência transcrita. Por exemplo, uma sequência promotora está operativamente ligada a uma sequência de codificação se ela estimular ou modular a transcrição da sequência de codificação em uma célula hospedeira apropriada ou outro sistema de expressão.

[000117] Geralmente, as sequências do promotor que estão operacionalmente ligadas a uma sequência transcrita são fisicamente contíguas à sequência transcrita, isto é, são atuam em cis.

[000118] Em uma modalidade exemplificada, o construto de ácido nucleico da divulgação pode ser uma parte do DNA do vetor, em outra modalidade, o construto é um cassete/cartucho de expressão que está integrado no genoma de uma célula hospedeira.

[000119] Consequentemente, o termo "construto de ácido nucleico" significa um segmento de ácidos nucleicos construído artificialmente, em particular um segmento de DNA, que se destina a ser inserido em uma célula alvo, por exemplo, uma célula bacteriana, para modificar a expressão de um gene do genoma ou expressão de um gene/sequência de DNA codificadora que pode ser incluída no construto. Assim, em modalidades, a presente divulgação se refere a um construto de ácido nucleico compreendendo uma sequência de ácido nucleico recombinante que codifica uma sialiltransferase, em que a referida sequência de ácido nucleico recombinante é selecionada a partir do grupo que consiste em sequências de ácido nucleico que codificam Clari1, Neigon, Poral e PmN, tal como SEQ ID NO: 23, 24, 25 ou 27, ou variantes funcionais dos mesmos.

[000120] Uma modalidade da divulgação é um construto de ácido nucleico compreendendo uma sequência de ácido nucleico recombinante que codifica uma sialiltransferase, em que a referida sequência de ácido nucleico recombinante é selecionada a partir do grupo que consiste em a) Clari1 compreendendo ou consistindo nas sequências de ácido nucleico de SEQ ID NO: 23 ou uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, ou tal como pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 23; b) Neigon compreendendo ou consistindo nas sequências de ácido nucleico da SEQ ID NO: 24 ou uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 80%, tal como pelo menos 84%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, ou como como pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 24; c) Poral compreendendo ou consistindo na sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 25 ou uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, ou como como pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 25; e d) PmN compreendendo ou consistindo na sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 27 ou uma sequência de ácido nucleico com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como em pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, ou tal como pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 27. De um modo preferido, a sequência de codificação da sialiltransferase está sob o controle de uma sequência promotora selecionada a partir de sequências promotoras com uma sequência de ácido nucleico como identificados na Tabela 2. Tabela 2 - Sequências promotoras selecionadas *A atividade do promotor é avaliada no ensaio LacZ descrito abaixo com o promotor PglpF executado como referência positiva no mesmo ensaio. Para comparar entre os ensaios, a atividade é calculada em relação ao promotor PglpF, uma faixa indica resultados de vários ensaios.

[000121] O promotor pode ser de origem heteróloga, nativo da célula geneticamente modificada ou pode ser um promotor recombinante, combinando elementos heterólogos e/ou nativos.

[000122] Uma maneira de aumentar a produção de um produto pode ser regular a produção da atividade enzimática desejada usada para produzir o produto, tal como as glicosiltransferases ou enzimas envolvidas na via biossintética do doador de glicosila.

[000123] Aumentar a força do promotor que direciona a expressão da enzima desejada pode ser uma maneira de fazer isso. A força de um promotor pode ser avaliada usando um ensaio enzimático lacZ onde a atividade de β-galactosidase é avaliada conforme descrito anteriormente (ver, por exemplo, Miller J.H. Experiments in molecular genetics, Cold spring Harbor Laboratory Press, NY, 1972). Resumidamente, as células são diluídas em tampão Z e permeabilizadas com dodecil sulfato de sódio (0,1%) e clorofórmio. Os ensaios LacZ são realizados a 30 °C. As amostras são pré-aquecidas, o ensaio iniciado pela adição de 200 μ l de orto-nitro-fenil- β-galactosidase (4 mg/ml) e interrompido pela adição de 500 μ l de Na2CO3 1 M quando a amostra ficou ligeiramente amarela. A liberação de orto-nitrofenol é subsequentemente determinada como a mudança na densidade óptica em 420 nm. As atividades específicas são relatadas em Unidades Miller (MU) [A420/(min*ml*A600)]. Um elemento regulatório com atividade acima de 10.000 MU é considerado forte e um elemento regulatório com atividade abaixo de 3.000 MU é considerado fraco, o intermediário tem força intermediária. Um exemplo de elemento regulador forte é o promotor PglpF com uma atividade de aproximadamente 14.000 MU e um exemplo de promotor fraco é Plac que quando induzido com IPTG tem uma atividade de aproximadamente 2.300 MU.

[000124] Nem todas as enzimas são igualmente bem toleradas pela célula hospedeira quando expressas em grandes quantidades, tal como é o caso da alfa-2,3- sialiltransferase, Nst, conforme mostrado nos Exemplos 1 e 2. Portanto, quando Nst é usado para a produção de 3 'SL está sob controle do promotor fraco Plac, já que quando está sob controle de PglpF o crescimento da célula hospedeira é afetado.

[000125] Em um aspecto da divulgação, a expressão da sequência de ácido nucleico recombinante que codifica uma enzima com atividade de α-2,3-sialiltransferase é regulada por um promotor que confere uma expressão aumentada da referida enzima com α-2,3-sialiltransferase, selecionados a partir do grupo de promotores consistindo em Plac, PglpF, PglpA, PglpT ou PmglB e variantes dos mesmos. De um modo preferido, a sialiltransferase está sob o controle de um promotor recombinante forte selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 13, 18, 19, 20, 21, 22, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 e 51.

[000126] Em outro aspecto da divulgação, a expressão da sequência de ácido nucleico recombinante que codifica uma enzima com atividade de α-2,3-sialiltransferase é regulada por um promotor recombinante que confere uma expressão aumentada da referida enzima com atividade de α-2,3- sialiltransferase.

[000127] Além disso, os construtos da presente divulgação podem compreender adicionalmente uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam uma β-1,3-N- acetil-glucosaminil-transferase, tal como uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO 36: codificando LgtA, uma β- 1,3-galactosiltransferase, tal como uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 37 que codifica GalTK, um ou mais transportadores MFS, tal como uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 38, 39 ou 40 que codifica Nec, YberC ou Fred e um ou mais sequências de ácido nucleico que codificam uma ou mais enzimas da via de síntese de nucleotídeos de açúcar de ácido siálico, tais como sequências de ácido nucleico de SEQ ID NO: 35 que codificam as enzimas da via de síntese de nucleotídeos de açúcar de ácido siálico. Em modalidades, a expressão das referidas sequências de ácido nucleico da presente divulgação está sob o controle de um promotor PglpF (SEQ ID NO: 13) ou Plac_70UTR (SEQ ID NO: 18) ou PmglB_70UTR (SEQ ID NO: 20) ou variantes dos mesmos, tais como promotores identificados na Tabela 2, em particular promotores selecionados a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 13, 18, 19, 20, 21, 22, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 e 51. Outras variantes adequadas das sequências promotoras de PglpF e PmglB são descritas em WO 2019/123324 e WO2020/255054, respectivamente (incorporados neste documento por referência).

[000128] A integração do construto de ácido nucleico de interesse incluída na construto (cassete de expressão) no genoma bacteriano pode ser conseguida por métodos convencionais, por exemplo, usando cartuchos lineares que contêm sequências flanqueadoras homólogas a um sítio específico no cromossoma, conforme descrito para o sítio attTn7 (Waddell C.S. e Craig N.L., Genes Dev. (1988) Feb;2(2):137 a 149); métodos para integração genômica de sequências de ácido nucleico em que a recombinação é mediada pela função Red recombinase do fago À ou a função RecE/RecT recombinase do profago Rac (Murphy, J Bacteriol. (1998);180(8):2063 a 2067, Zhang et al., Nature Genetics (1998) 20: 123 a 128, Muyrers et al., EMBO Rep. (2000) 1(3): 239 a 243); métodos baseados na recombinação Red/ET (Wenzel et al., Chem Biol. (2005), 12(3):349 a 356; Vetcher et al., Appl Environ Microbiol. (2005);71(4):1829 a 1835); ou clones positivos, ou seja, clones que carregam o cassete de expressão, podem ser selecionados, por exemplo, por meio de um gene marcador, ou perda ou ganho da função do gene.

[000129] Em uma ou mais modalidades exemplares, a presente divulgação se refere a uma ou mais sequências de ácidos nucleicos recombinantes conforme ilustrado nas SEQ ID NOs: 23, 24, 25 ou 27.

[000130] Em particular, a presente divulgação se refere a uma ou mais de uma sequência de ácido nucleico recombinante e/ou a um homólogo funcional da mesma tendo uma sequência que é pelo menos 70% idêntica à SEQ ID NOs: 23, 24, 25 ou 27, tal como pelo menos 75% idêntica, pelo menos 80% idêntica, pelo menos 85% idêntica, pelo menos 90% idêntica, pelo menos 95% idêntica, pelo menos 98% idêntica ou 100% idêntica.

Identidade de sequência

[000131] O termo "identidade de sequência", conforme usado neste documento, descreve a relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos, ou seja, uma sequência candidata (por exemplo, uma sequência da divulgação) e uma sequência de referência (tal como uma sequência da técnica anterior) com base em seu alinhamento par a par. Para os fins da presente divulgação, a identidade de sequência entre duas sequências de aminoácidos é determinada usando o algoritmo Needleman- Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mo/. Biol. 48: 443 a 453) conforme implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276 a 277), de um modo preferido versão 5.0.0 ou posterior (disponível em https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/embossneedle/). Os parâmetros usados são penalidade de abertura de lacuna de 10, penalidade de extensão de lacuna de 0,5 e matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de 30 BLOSUM62). A saída de agulha rotulada como "identidade mais longa" (obtida usando a opção -nobrief) é usada como a identidade percentual e é calculada da seguinte forma: (Resíduos idênticos x 100)/(Comprimento do alinhamento - Número total de lacunas no alinhamento).

[000132] Para os fins da presente divulgação, a identidade de sequência entre duas sequências de nucleotídeos é determinada usando o algoritmo Needleman- Wunsch (Needleman e Wunsch, 1 970, supra) conforme implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276 a 277), de um modo preferido versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de abertura de lacuna de 10, penalidade de extensão de lacuna de 0,5 e a matriz de substituição DNAFULL (versão EMBOSS de NCBI NUC4.4). A saída de agulha rotulada como "identidade mais longa" (obtida usando a opção -nobrief) é usada como a identidade percentual e é calculada da seguinte forma: (Desoxirribonucleotídeos idênticos x 100)/(Comprimento do alinhamento — Número total de lacunas no alinhamento).

Homólogo funcional

[000133] Um homólogo funcional ou variante funcional de uma sequência de proteína/ácido nucleico como descrito neste ucleic é uma sequência de proteína/ácido ucleic com alterações no código genético, que retém sua funcionalidade original. Um homólogo ucleic al pode ser obtido por mutagênese ou pode ser ucleic de ocorrência natural da mesma ou de outras espécies. O homólogo ucleic al deve ter uma funcionalidade restante de pelo menos 50%, tal como pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% em comparação com a funcionalidade da sequência de proteína/ácido ucleic.

[000134] Um homólogo ucleic al de qualquer uma das sequências de aminoácidos ou ácidos nucleicos divulgadas também pode ter uma funcionalidade superior. Um homólogo ucleic al de qualquer uma das sequências de aminoácidos mostradas na Tabela 1 ou um ácido ucleic recombinante que codifica qualquer uma das sequências da Tabela 4 deve, idealmente, ser capaz de participar da produção de HMOs sialilados, em termos de rendimento aumentado de HMO, exportação de produto HMO para for a da célula ou importação de substrato para a produção de HMO, tal como lactose, pureza melhorada/formação de subprodutos, redução na formação de biomassa, viabilidade da célula geneticamente modificada, robustez da célula geneticamente modificada de acordo com a divulgação, ou redução de consumíveis necessários para a produção.

Uso de uma célula geneticamente modificada

[000135] A divulgação também se refere a qualquer uso comercial da(s) célula(s) geneticamente modificada(s) ou do(s) construto(s) de ácido nucleico divulgado(s) neste documento, tal como, mas não limitado a, em um método para produzir um oligossacarídeo de leite humano (HMO) sialilado.

[000136] Em uma modalidade exemplificada, a célula geneticamente modificada e/ou o construto de ácido nucleico de acordo com a divulgação é usado na fabricação de HMOs.

[000137] Em uma modalidade exemplificada, a célula geneticamente modificada e/ou o construto de ácido nucleico de acordo com a divulgação é usado na fabricação de um ou mais HMOs sialilados, em que os HMOs sialilados são 3'SL, FSL, DSLNT e LST-a.

[000138] A produção desses HMOs pode exigir a presença de duas ou mais atividades de glicosiltransferase.

[000139] Em uma ou mais modalidades, a célula geneticamente modificada e/ou o construto de ácido nucleico é usado na fabricação de 3'SL. De um modo preferido, 3'SL é o único HMO fabricado.

Método para produzir oligossacarídeos de leite humano sialilados (HMOs)

[000140] A presente divulgação também se refere a um método para produzir um oligossacarídeo de leite humano (HMO) sialilado, o referido método compreende cultivar uma célula geneticamente modificada de acordo com a presente divulgação. O exemplo 1 da presente divulgação identificou as alfa-2,3-sialiltransferases heterólogas Clari1, Neigon, Poral e PmN (SEQ ID NO: 1, 2, 3 e 4, respectivamente), que quando expressas em uma cepa de produção produzem 3' SL e apresentam crescimento estável quando comparados com as Nst alfa-2,3-sialiltransferases.

[000141] A presente divulgação se refere a um método para produzir oligossacarídeos de leite humano (HMOs) e, em particular, 3'SL é produzido. Em particular 3'SL sem a presença de outros HMOs.

[000142] A presente divulgação também se refere a um método para produzir oligossacarídeos de leite humano (HMOs) em que a quantidade de 3'SL produzida é de pelo menos 5%, tal como pelo menos 10%, tal como pelo menos 15% ou tal como pelo menos 20% superior à quantidade de 3'SL produzida por um método que compreende o uso de uma célula geneticamente modificada que expressa a α-2,3-sialiltransferase Nst (SEQ ID NO: 5), quando a expressão de Nst é regulada por meio de um promotor Plac.

[000143] A presente divulgação também se refere a um método para produzir oligossacarídeos de leite humano (HMOs) em que a quantidade de 3'SL é de pelo menos 5%, tal como pelo menos 10%, tal como pelo menos 15%, tal como pelo menos 20% ou tal como pelo menos 25% superior a quantidade de 3'SL produzida por um método que compreende o uso de uma célula geneticamente modificada que expressa a α-2,3- sialiltransferase PM70, quando a expressão de PM70 é regulada por meio de um promotor Plac ou PglpF.

[000144] A presente divulgação se refere assim a um método para produzir um oligossacarídeo sialilado do leite humano (HMO), o referido método compreendendo cultivar uma célula geneticamente modificada compreendendo uma sequência de ácido nucleico recombinante que codifica uma enzima com atividade α-2,3-sialiltransferase, em que a referida enzima é selecionada a partir do grupo composto por: a. Clari1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, ou como pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 1, b. Neigon compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, ou como pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 2, c. Poral compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, ou como pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 3 e d. PmN compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, ou como pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 4.

[000145] Em outras modalidades, a célula geneticamente modificada compreende pelo menos uma modificação adicional de acordo com a presente divulgação.

[000146] Em uma ou mais modalidades exemplares, a α- 2,3-sialiltransferase da presente divulgação está sob o controle de um promotor PglpF, PglpA_70UTR, PglpT_70UTR, Plac_70UTR ou PmglB_70UTR ou variantes dos mesmos, conforme divulgado na Tabela 2. De um modo preferido, a sialiltransferase está sob o controle de um promotor recombinante selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 13, 18, 19, 20, 21, 22, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 e 51. Assim, em uma modalidade exemplar, a α- 2,3-sialiltransferase da presente divulgação está sob o controle de um promotor PglpF ou uma variante do mesmo conforme divulgado na Tabela 2. Em outra modalidade exemplar, a α-2,3-sialiltransferase da presente divulgação está sob o controle de um promotor PmglB_70UTR ou uma variante do mesmo conforme divulgado na Tabela 2.

[000147] Outras modificações genéticas podem, por exemplo, ser selecionadas a partir da inclusão de glicosiltransferases adicionais e/ou engenharia de vias metabólicas e inclusão de transportadores MFS, conforme descrito nas seções acima, que a pessoa versada na técnica saberá como combinar em uma célula geneticamente modificada capaz de produzir um ou mais HMOs sialilados.

[000148] O método compreende particularmente cultivar uma célula geneticamente modificada que produz um HMO sialilado, em particular o HMO 3'SL sialilado.

[000149] O método compreendendo cultivar uma célula geneticamente modificada que produz um HMO sialilado e compreende ainda cultivar a referida célula geneticamente modificada na presença de uma fonte de energia (fonte de carbono) selecionada a partir do grupo que consiste em glicose, sacarose, frutose, xilose e glicerol.

[000150] Em um aspecto, o método de acordo com a presente divulgação produz um oligossacarídeo de leite humano (HMO) sialilado, tal como 3'SL, FSL, DSLNT e/ou LST- a.

[000151] Em um aspecto, o método de acordo com a presente divulgação produz 3'SL como o único HMO.

[000152] Para permitir a produção de HMOs sialilados no método de acordo com a presente divulgação, a célula geneticamente modificada pode compreender uma via biossintética para produzir um nucleotídeo de açúcar de ácido siálico, alternativamente ácido siálico pode ser adicionado durante o cultivo da célula.

[000153] Em modalidades preferidas dos métodos da presente divulgação, a célula geneticamente modificada compreende uma via biossintética para produzir um nucleotídeo de açúcar de ácido siálico. De um modo preferido, nos métodos da presente divulgação, o nucleotídeo de açúcar de ácido siálico é CMP-Neu5Ac. Assim, nos métodos da presente divulgação, a via do nucleotídeo de açúcar é expressa pela célula geneticamente modificada, em que a via CMP-Neu5Ac é codificada pelo operon neuBCA de Campylobacter jejuni de SEQ ID NO: 35. Nos métodos da presente divulgação, a via do nucleotídeo do açúcar de ácido siálico é codificada a partir de um plasmídeo de alta cópia contendo o operon neuBCA.

[000154] O método da presente divulgação compreende fornecer um doador de glicosila, que é sintetizado separadamente por uma ou mais células geneticamente modificadas e/ou é adicionado exogenamente ao meio de cultura a partir de uma fonte alternativa.

[000155] Em um aspecto, o método da presente divulgação compreende adicionalmente fornecer um sacarídeo aceitador como substrato para a formação de HMO, o sacarídeo aceitador compreendendo pelo menos duas unidades de monossacarídeo, que é adicionado exogenamente ao meio de cultura e/ou foi produzido por um processo separado fermentação microbiana.

[000156] Em um aspecto, o método da presente divulgação compreende fornecer um sacarídeo aceitador compreendendo pelo menos duas unidades de monossacarídeo, que é adicionado exogenamente ao meio de cultura e/ou foi produzido por uma fermentação microbiana separada e que é selecionado a partir de lactose, LNT- II e LNT, de um modo preferido lactose. Em uma modalidade preferida, o substrato para a formação de HMO é a lactose que é alimentada à cultura durante a fermentação da célula geneticamente modificada.

[000157] O oligossacarídeo de leite humano (HMO) sialilado é recuperado da cultura, seja do meio de cultura e/ou da célula geneticamente modificada.

[000158] Em particular, a presente divulgação se refere a um método para produzir um HMO sialilado, o referido método compreendendo: a) obter uma célula geneticamente modificada compreendendo i. uma sequência de ácido nucleico recombinante, de um modo preferido sob o controle de um promotor PglpF, que codifica uma enzima com atividade de α-2,3- sialiltransferase, em que a referida enzima é selecionada a partir do grupo que consiste em: Clari1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% ou como pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 1, Neigon compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, ou tal como pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 2, Poral compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 80%, tal como pelo menos 90 %, tal como pelo menos 95%, ou tal como pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 3 e PmN compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, ou tal como pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 4; ii. opcionalmente uma sequência de ácido nucleico que codifica uma β-1,3-galactosiltransferase heteróloga, tal como GalTK de Helicobacter pylori, de um modo preferido sob controle de um promotor PglpF; iii. opcionalmente, uma sequência de ácido nucleico que codifica uma β-1,3-N-acetil-glucosaminil-transferase, tal como LgtA de Neisseria meningitidis, de um modo preferido sob o controle de um promotor PglpF; e iv. opcionalmente, uma sequência de ácido nucleico que codifica um transportador MFS, tal como, mas não limitado a, Fred, Nec e/ou YberC, de um modo preferido sob o controle de um promotor PglpF ou Plac; e b) cultivar a referida célula geneticamente modificada em uma fonte de carbono contendo meio de cultura e na presença de lactose; e c) produzir o referido oligossacarídeo de leite humano (HMO) sialilado, em particular 3'SL e/ou LST-a, pela referida célula geneticamente modificada; e d) recuperar o oligossacarídeo de leite humano (HMO) sialilado, em particular 3'SL e/ou LST-a, do meio de cultura e/ou da célula geneticamente modificada.

[000159] Em particular, a presente divulgação se refere a um método para produzir 3'SL, o referido método compreendendo: a) obter uma célula geneticamente modificada compreendendo i. uma sequência de ácido nucleico recombinante que codifica uma enzima com atividade de α-2,3- sialiltransferase, em que a referida enzima é Clari1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 8%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, ou tal como pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 1; e ii. uma sequência de ácido nucleico que codifica um transportador MFS, tal como, mas não limitado a, Fred, Nec e/ou YberC, de um modo preferido sob o controle de um promotor PglpF ou Plac; e b) cultivar a referida célula geneticamente modificada em uma fonte de carbono contendo meio de cultura e na presença de lactose; e c) produzir o referido oligossacarídeo de leite humano (HMO) sialilado, em particular 3'SL, pela referida célula geneticamente modificada; e d) recuperar o oligossacarídeo de leite humano (HMO) sialilado, em particular 3'SL, do meio de cultura e/ou da célula geneticamente modificada.

[000160] Em particular, a presente divulgação refere a um método para produzir 3'SL, o referido método compreendendo: a) obter uma célula geneticamente modificada compreendendo i. uma sequência de ácido nucleico recombinante que codifica uma enzima com atividade de α-2,3- sialiltransferase, em que a referida enzima é Poral compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, ou tal como pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 2; e ii. uma sequência de ácido nucleico que codifica um transportador MFS, tal como, mas não limitado a, Fred, Nec e/ou YberC, de um modo preferido sob o controle de um promotor PglpF ou Plac; e b) cultivar a referida célula geneticamente modificada em uma fonte de carbono contendo meio de cultura e na presença de lactose; e c) produzir 3'SL, pela referida célula geneticamente modificada; e d) recuperar 3'SL, do meio de cultura e/ou da célula geneticamente modificada.

[000161] Em particular, a presente divulgação refere a um método para produzir 3'SL, o referido método compreendendo: a) obter uma célula geneticamente modificada compreendendo i. uma sequência de ácido nucleico recombinante que codifica uma enzima com atividade de α-2,3- sialiltransferase, em que a referida enzima é Poral compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, ou tal como pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 3; e ii. uma sequência de ácido nucleico que codifica um transportador MFS, tal como, mas não limitado a, Fred, Nec e/ou YberC, de um modo preferido sob o controle de um promotor PglpF ou Plac; e b) cultivar a referida célula geneticamente modificada em uma fonte de carbono contendo meio de cultura e na presença de lactose; e c) produzir 3'SL, pela referida célula geneticamente modificada; e d) recuperar o 3'SL, do meio de cultura e/ou da célula geneticamente modificada.

[000162] Em particular, a presente divulgação refere a um método para produzir 3'SL, o referido método compreendendo: a) obter uma célula geneticamente modificada compreendendo i. uma sequência de ácido nucleico recombinante que codifica uma enzima com atividade de α-2,3- sialiltransferase, em que a referida enzima é PmN compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95%, ou tal como pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 4; e ii. uma sequência de ácido nucleico que codifica um transportador MFS, tal como, mas não limitado a, Fred, Nec e/ou YberC, de um modo preferido sob o controle de um promotor PglpF ou Plac; e b) cultivar a referida célula geneticamente modificada em uma fonte de carbono contendo meio de cultura e na presença de lactose; e c) produzir 3'SL, pela referida célula geneticamente modificada; e d) recuperar 3'SL, do meio de cultura e/ou da célula geneticamente modificada.

[000163] Cultivar ou fermentar (usado de forma intercambiável neste documento) em um biorreator controlado compreende tipicamente (a) uma primeira fase de crescimento celular exponencial em um meio de cultura assegurado por uma fonte de carbono, e (b) uma segunda fase de crescimento celular em um meio de cultura executado sob limitação de carbono, onde a fonte de carbono é adicionada continuamente juntamente com o oligossacarídeo aceitador, tal como a lactose, permitindo a formação do produto de HMO nesta fase. Por limitação de carbono (açúcar) entende-se o estágio da fermentação em que a taxa de crescimento é cineticamente controlada pela concentração da fonte de carbono (açúcar) no caldo de cultivo, que por sua vez é determinada pela taxa de adição de carbono (taxa de alimentação de açúcar) para o fermentador.

[000164] A estabilidade de uma cepa microbiana quando levada para produção em larga escala é importante para obter uma fermentação bem-sucedida com alto rendimento e formação de produto. Muitos fatores durante a fermentação em grande escala podem fazer com que as células fiquem estressadas e potencialmente reduzam a atividade metabólica ou induzam uma alteração no metabolismo para formar subprodutos tóxicos, tal como ácido acético e fórmico, o que leva à parada prematura da fermentação. A mistura imperfeita durante uma fermentação em grande escala cria gradientes de, por exemplo, gases e fonte de carbono, que as células devem ser capazes de suportar. A expressão desequilibrada de genes heterólogos introduzidos na célula para produzir o produto desejado pode induzir toxicidade que pode reduzir a taxa máxima de crescimento das células que, por sua vez, pode desencadear a formação de subprodutos, especialmente quando expostos a gradientes de fonte de carbono. Em relação à superexpressão da Nst α-2,3-sialiltransferase de SEQ ID NO: 5 para produzir 3'SL em uma célula geneticamente modificada (cepa de Nst), os inventores observaram que a cepa é menos estável se a taxa de crescimento durante o estágio limitado de carbono se torna muito alto. É desejável ter uma cepa que exiba crescimento estável em uma faixa mais ampla de taxas de crescimento e, também, quando exposta a gradientes. Em comparação com a cepa de Nst, uma cepa que expressa uma α- 2,3-sialiltransferase da presente divulgação é mais flexível e capaz de lidar com perfis de alimentação mais agressivos, onde taxas de alimentação específicas mais altas da fonte de carbono são usadas para produzir produtividades volumétricas mais altas. Além disso, as células também são mais capazes de suportar versões pulsadas do perfil de alimentação de açúcar que imitam os gradientes de açúcar de fermentações em larga escala. A estabilidade das células geneticamente modificadas da presente divulgação pode ser comparada à estabilidade da cepa de Nst usando o "teste de estabilidade de crescimento" e o "teste de estresse" descritos na seção Método.

[000165] Os termos “fabricação” ou “escala de fabricação” ou “produção em larga escala” ou “fermentação em larga escala” são usados de forma intercambiável e no significado da divulgação define uma fermentação com um volume mínimo de 100 L, tal como 1.000L, tal como 10.000L, tal como 100.000L, tal como 200.000L de caldo de cultura. Normalmente, um processo de “escala de fabricação” é definido por ser capaz de processar grandes volumes rendendo quantidades do produto de HMO de interesse que atendem, por exemplo, no caso de um composto ou composição terapêutica, as demandas de testes de toxicidade, ensaios clínicos, bem como quanto ao abastecimento do mercado. Além do grande volume, um método de fabricação em escala, ao contrário de métodos simples em escala de laboratório, tal como o cultivo em frasco agitado, é definido pelo uso do sistema técnico de um biorreator (fermentador) que é equipado com dispositivos para agitação, aeração, alimentação, monitoramento e controle dos parâmetros do processo (pH, temperatura, tensão de oxigênio dissolvido, contrapressão etc.). Em grande medida, o comportamento de um sistema de expressão em um método de escala de laboratório, tal como frascos de agitação, biorreatores de bancada ou o formato de poço profundo descrito nos exemplos da divulgação, permite prever o comportamento desse sistema no ambiente complexo de um biorreator.

[000166] Com relação ao meio celular adequado utilizado no processo de fermentação, não há limitações. O meio de cultura pode ser semi-definido, isto é, contendo compostos de meios complexos (por exemplo, extrato de levedura, peptona de soja, casaminoácidos etc.), ou pode ser quimicamente definido, sem quaisquer compostos complexos. A fonte de carbono pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em glicose, sacarose, frutose, xilose e glicerol. Em uma ou mais modalidades exemplares, o meio de cultura é suplementado com uma ou mais fontes de energia e carbono selecionadas a partir do grupo contendo glicerol, sacarose e glicose.

[000167] Em uma ou mais modalidades exemplares, o meio de cultura contém sacarose como única fonte de carbono e energia. Em uma ou mais modalidades exemplares, a célula geneticamente modificada compreende uma ou mais sequências de ácidos nucleicos heterólogas que codificam um ou mais polipeptídeos heterólogos que permitem a utilização de sacarose como única fonte de carbono e energia da referida célula geneticamente modificada.

[000168] Em uma ou mais modalidades exemplares, a célula geneticamente modificada compreende um sistema de utilização de sacarose dependente de PTS, compreendendo ainda os operons scrYA e scrBR conforme descrito em WO 2015/197082 (incorporado neste documento por referência).

[000169] Depois de realizar o método desta divulgação, o HMO sialilado produzido pode ser coletado da cultura celular ou caldo de fermentação de maneira convencional.

Recuperação/Colheita

[000170] O oligossacarídeo de leite humano (HMO) sialilado é recuperado do meio de cultura e/ou da célula geneticamente modificada. No presente contexto, o termo “recuperação” é usado de forma intercambiável com o termo “colheita”. Tanto a "recuperação"quanto a "colheita" no contexto se referem à coleta do(s) HMO(s) produzido(s) da cultura/caldo após o término da fermentação. Em uma ou mais modalidades exemplares, pode incluir a coleta do(s) HMO(s) incluído(s) na biomassa (ou seja, nas células hospedeiras) e no meio de cultivo, ou seja, antes/sem separação do caldo de fermentação da biomassa. Em outras modalidades, os HMOs produzidos podem ser coletados separadamente da biomassa e do caldo de fermentação, ou seja, após/seguindo a separação da biomassa do meio de cultivo (ou seja, caldo de fermentação).

[000171] A separação das células do meio pode ser realizada com qualquer um dos métodos bem conhecidos da pessoa versada na técnica, tal como qualquer tipo adequado de centrifugação ou filtração. A separação das células do meio pode ocorrer imediatamente após a colheita do caldo de fermentação ou ser realizada posteriormente após o armazenamento do caldo de fermentação em condições apropriadas. A recuperação do(s) HMO(s) produzido(s) da biomassa restante (ou caldo de fermentação total) inclui a extração dos mesmos da biomassa (isto é, das células de produção).

[000172] Após a recuperação da fermentação, os HMO(s) estão disponíveis para posterior processamento e purificação.

[000173] Os HMOs podem ser purificados de acordo com os procedimentos conhecidos na técnica, por exemplo, tal como descrito em WO 2017/182965 ou WO 2017/152918, em que o último descreve a purificação de HMOs sialilados. Os HMOs purificados podem ser usados como nutracêuticos, farmacêuticos ou para qualquer outra finalidade, por exemplo, para pesquisa.

[000174] Ao final do cultivo, o oligossacarídeo como produto pode ser acumulado tanto na matriz intra- quanto na extracelular.

[000175] O método de acordo com a presente divulgação compreende cultivar a célula microbiana geneticamente modificada em um meio de cultura que é projetado para suportar o crescimento de micro-organismos e que contém uma ou mais fontes de carboidratos ou apenas fonte de carbono, tal como selecionado a partir do grupo que consiste em glicose, sacarose, frutose, xilose e glicerol. Em uma ou mais modalidades exemplares, o meio de cultura é suplementado com uma ou mais fontes de energia e carbono selecionadas a partir do grupo contendo glicerol, sacarose e glicose.

Produto fabricado

[000176] O termo "produto fabricado" de acordo com o uso da célula geneticamente modificada ou do construto de ácido nucleico se refere a um ou mais HMOs pretendidos como um ou mais produtos HMO(s). Os vários produtos são descritos acima.

[000177] Vantajosamente, os métodos divulgados neste documento fornecem uma proporção diminuída de subproduto para produto e um rendimento geral aumentado do produto (e/ou HMOs no total). Isso, menor formação de subprodutos em relação à formação de produtos, facilita uma produção elevada de produtos e aumenta a eficiência tanto do processo de produção quanto de recuperação de produtos, proporcionando um processo de fabricação superior de HMOs.

[000178] O produto fabricado pode ser um pó, uma composição, uma suspensão ou um gel compreendendo um ou mais HMOs.

Sequências

[000179] O presente pedido contém uma listagem de sequência em formato de texto e formato eletrônico que é incorporada neste documento por referência.

[000180] Uma visão geral das SEQ ID NOs usadas no presente pedido pode ser encontrada na Tabela 1 (sequências da proteína alfa-2,3-sialiltransferase), na Tabela 2 (sequências promotoras) e na Tabela 4 (sequências de DNA da alfa-2,3-sialiltransferase), as sequências adicionais descritas no pedido são a sequência de DNA que codifica o operon neuBCA de Campylobacter jejuni (SEQ ID NO: 35), a β- 1,3-N-acetilglucosaminiltransferase LgtA de N. meningitidis (SEQ ID NO: 36), β-1,3-galactosiltransferases galTK de H. pylori (SEQ ID NO: 37) e as sequências do transportador MFS Nec (SEQ ID NO: 38), YberC (SEQ ID NO: 39) e Fred (SEQ ID NO: 40).

Modalidades

[000181] Várias modalidades da presente divulgação são descritas nas seguintes cláusulas: 1. Uma célula geneticamente modificada compreendendo uma sequência de ácido nucleico recombinante que codifica uma enzima com atividade de α-2,3-sialiltransferase, em que a referida enzima é selecionada a partir do grupo de sialiltransferases consistindo em: a. Poral compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 3; b. Clari1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 1; c. PmN compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 4; e d. Neigon compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 2; em que a referida célula produz um HMO sialilado. 2. A célula geneticamente modificada de acordo com a cláusula 1, em que o HMO sialilado é selecionado a partir do grupo que consiste em 3'SL, FSL, DSLNT e LST-a. 3. A célula geneticamente modificada de acordo com qualquer uma das cláusulas 1 ou 2, em que o HMO sialilado é 3'SL. 4. A célula geneticamente modificada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, em que 3'SL é o único HMO produzido pela célula geneticamente modificada. 5. A célula geneticamente modificada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a sequência de ácido nucleico que codifica uma enzima com atividade de α- 2,3-sialiltransferase está sob o controle de um promotor selecionado a partir do grupo que consiste em PglpF, PglpA_70UTR, PglpT_70UTR, Plac_70UTR, PmglB_70UTR e variantes dos mesmos, com uma sequência de ácido nucleico conforme as SEQ ID NOs: 12 a 22 ou 41 a 54, de um modo preferido selecionadas a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 13, 18, 19, 20, 21, 22, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 e 51. 6. A célula geneticamente modificada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a célula compreende adicionalmente uma ou mais sequências de ácidos nucleicos que codificam uma ou mais glicosiltransferases selecionadas do grupo que consiste em β-1,3- galactosiltransferases, β-1,4-galactosiltransferases e β- 1,3-N-acetil-glucosaminil-transferases. 7. A célula geneticamente modificada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a célula compreende adicionalmente uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína transportadora de MFS capaz de exportar o HMO sialilado para o meio extracelular. 8. A célula geneticamente modificada de acordo com a cláusula 7, em que a proteína transportadora de MFS é a proteína Fred, YberC ou Nec. 9. A célula geneticamente modificada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a célula compreende uma via biossintética para produzir um nucleotídeo de açúcar de ácido siálico. 10. A célula geneticamente modificada de acordo com a cláusula 9, em que o nucleotídeo de açúcar de ácido siálico é CMP-Neu5Ac e a referida via de nucleotídeo de açúcar de ácido siálico é codificada pela sequência de ácido nucleico que codifica NeuBCA de Campylobacter jejuni (SEQ ID NO: 35). 11. A célula geneticamente modificada de acordo com a cláusula 9 ou 10, em que a via do nucleotídeo do açúcar do ácido siálico é codificada a partir de um plasmídeo de alta cópia contendo o operon neuBCA. 12. A célula geneticamente modificada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a referida célula modificada é um micro-organismo. 13. A célula geneticamente modificada de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, em que a referida célula modificada é uma bactéria ou um fungo. 14. A célula geneticamente modificada de acordo com a cláusula 13, em que o referido fungo é selecionado a partir de uma célula de levedura dos gêneros Komagataella, Kluyveromyces, Yarrowia, Pichia, Saccaromyces, Schizosaccharomyces ou Hansenula ou de um fungo filamentoso dos gêneros Aspargillus, Fusarium ou Thricoderma. 15. A célula geneticamente modificada de acordo com a cláusula 13, em que a referida bactéria é selecionada a partir do grupo que consiste em Escherichia sp., Bacillus sp., Lactobacillus sp., Corynebacterium sp e Campylobacter sp. 16. A célula geneticamente modificada de acordo com a cláusula 15, em que a referida bactéria é E. coli. 17. Método para produzir um oligossacarídeo de leite humano (HMO) sialilado, o referido método compreendendo cultivar uma célula geneticamente modificada compreendendo uma sequência de ácido nucleico recombinante que codifica uma enzima com atividade α-2,3-sialiltransferase, em que a referida enzima é selecionada a partir do grupo consiste em: a. Poral compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 3; b. Clari1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 1; c. PmN compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 4; e d. Neigon compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 2; em que a referida célula geneticamente modificada compreende opcionalmente pelo menos uma modificação adicional conforme as cláusulas 4 a 11. 18. O método de acordo com a cláusula 17, em que o oligossacarídeo do leite humano (HMO) sialilado produzido é 3'SL. 19. O método de acordo com a cláusula 17 ou 18, em que 3'SL é o único oligossacarídeo do leite humano (HMO) produzido. 20. O método de acordo com qualquer uma das cláusulas 17 a 19, em que o método compreende cultivar a célula geneticamente modificada na presença de uma fonte de carbono selecionada a partir do grupo que consiste em glicose, sacarose, frutose, xilose e glicerol. 21. O método de acordo com qualquer uma das cláusulas 17 a 20, em que a lactose é adicionada durante o cultivo das células geneticamente modificadas como um substrato para a formação de HMO sialilado. 22. O método de acordo com qualquer uma das cláusulas 17 a 21, em que o oligossacarídeo de leite humano (HMO) sialilado é recuperado do meio de cultura e/ou da célula geneticamente modificada. 23. Um Construto de ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico recombinante que codifica uma enzima com atividade de α-2,3-sialiltransferase, em que a referida sequência de ácido nucleico recombinante é selecionada a partir do grupo que consiste em: a. Poral compreendendo ou consistindo na sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 25 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°: 25, b. Clari1 compreendendo ou consistindo na sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 23 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°: 23, c. PmN compreendendo ou consistindo na sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 26 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°: 26 d. Neigon compreendendo ou consistindo na sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 24 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID N°: 24, em que a sequência de codificação da enzima está sob o controle de uma sequência promotora. 24. O construto de ácido nucleico de acordo com a cláusula 23, em que a sequência promotora é selecionada a partir do grupo que consiste em PglpF, PglpA_70UTR, PglpT_70UTR, Plac_70UTR, PmglB_70UTR e variantes das mesmas, com as sequências de ácido nucleico conforme as SEQ ID NOs: 12 a 22 ou 41 a 54, de um modo preferido selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 13, 18, 19, 20, 21, 22, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 e 51. 25. Uso de um construto de ácido nucleico de acordo com a cláusula 23 ou 24, em uma célula hospedeira para produzir um HMO sialilado. 26. Uso de uma célula geneticamente modificada de acordo com qualquer uma das cláusulas 1 a 16, na produção de um HMO sialilado.

EXEMPLOS Métodos

[000182] Salvo indicação em contrário, técnicas padrão, vetores, elementos de sequência de controle e outros elementos do sistema de expressão conhecidos no campo da biologia molecular são usados para manipulação, transformação e expressão de ácidos nucleicos. Essas técnicas, vetores e elementos padrão podem ser encontrados, por exemplo, em: Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (1995) (John Wiley & Sons); Sambrook, Fritsch, & Maniatis (eds.), Molecular Cloning (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY); Berger & Kimmel, Methods in Enzymology 152: Guide to Molecular Cloning Techniques (1987) (Academic Press); Bukhari et al. (eds.), DNA Insertion Elements, Plasmids and Episomes (1977) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY); Miller, J. H. Experiments in molecular genetics (1972.) (Cold spring Harbor Laboratory Press, NY).

[000183] As modalidades descritas abaixo são selecionadas para ilustrar a divulgação e não limitam a divulgação de forma alguma.

Enzimas:

[000184] 18 enzimas foram coletadas seguindo uma abordagem de seleção in silico que foi baseada em pesquisas BLAST de proteínas usando α-2,3-sialiltransferases conhecidas como consultas e explorando fontes de informação como artigos científicos ou bancos de dados, por exemplo, os bancos de dados KEGG e CAZY. Tabela 3. Lista das enzimas testadas no âmbito da presente divulgação

Cepas

[000185] As cepas (células geneticamente modificadas) construídas no presente pedido foram baseadas em Escherichia coli K-12 DH1 com o genótipo: F“, X-, gyrA96, recAl, relAl, endA1, thi-1, hsdR17, supE44. Modificações adicionais foram feitas na cepa de E. coli K-l2 DHl para gerar a cepa de MDO com as seguintes modificações: lacZ: deleção de l,5 kbp, lacA: deleção de 0,5 kbp, nanKETA: deleção de 3,3 kbp, melA: deleção de 0,9 kbp, wcaJ: deleção de 0,5 kbp, mdoH: deleção de 0,5 kbp e inserção do promotor Plac a montante do gene gmd.

[000186] Os métodos de inserção de gene(s) de interesse no genoma de E. colisão bem conhecidos das pessoas versadas na técnica. A inserção de cassetes genéticos no cromossomo de E. coli pode ser feita usando gene gorging (ver, por exemplo, Herring e Blattner 2004 J. Bacteriol. l86: 2673 a 268l e Warming et al 2005 Nucleic Acids Res. 33(4): e36) com genes marcadores de seleção específicos e métodos de triagem.

[000187] Sequências de DNA otimizadas por códon que codificam α-2,3-sialiltransferases individuais foram integradas genomicamente na cepa MDO. Além disso, cada cepa foi transformada com um plasmídeo de alta cópia contendo o operon neuBCA de Campylobacter jejuni (SEQ ID NO: 35) sob o controle do promotor Plac. O operon neuBCA codifica todas as enzimas necessárias para a formação de um nucleotídeo de açúcar de ácido siálico ativado (CMP-Neu5Ac). CMP-Neu5Ac atua como um doador para a reação pretendida de glicosiltransferase facilitada pela α-2,3-sialiltransferase sob investigação, ou seja, a transferência de ácido siálico do açúcar ativado CMP-Neu5Ac para a galactose terminal da lactose (aceitadora) para formar 3'SL.

[000188] Os genótipos da cepa de fundo (MDO) e as cepas que expressam α-2,3-sialiltransferase capazes de produzir 3'SL como o único HMO são fornecidos na Tabela 4. Tabela 4. Genótipos das cepas, capazes de produzir 3'SL usados nos presentes exemplos. *2,3-ST é uma abreviação de alfa-2,3-sialiltransferase e a sequência é inserida no genoma da cepa hospedeira.

Ensaio de poço profundo

[000189] As cepas foram rastreadas em placas de 96 poços profundos usando um protocolo de 4 dias. Durante as primeiras 24 horas, as pré-culturas foram cultivadas em altas densidades e posteriormente transferidas para um meio que permitisse a indução da expressão gênica e a formação do produto. Mais especificamente, durante o dia 1, pré-culturas frescas foram preparadas usando um meio basal mínimo suplementado com sulfato de magnésio, tiamina e glicose. As pré-culturas foram incubadas por 24 horas a 34 °C e agitação de 1.000 rpm e depois transferidas para um novo meio mínimo basal (BMM, pH 7,5) para iniciar a cultura principal. O novo BMM foi suplementado com sulfato de magnésio, tiamina, um bolo de solução de glicose a 20% (50 ul por 100 mL) e um bolo de solução de lactose a 20% (5 ml por 100 ml). Além disso, uma solução de sacarose a 50% foi fornecida como fonte de carbono, acompanhada da adição de sacarose hidrolase (invertase), de modo que a glicose foi liberada em uma taxa adequada para o crescimento limitado por C. IPTG (50 mg/ml) foi adicionado para induzir a expressão gênica e o antibiótico de ampicilina (100 mg/ml). As principais culturas foram incubadas por 72 horas a 28 °C e agitação de 1.000 rpm.

Teste de estabilidade de crescimento

[000190] As cepas de E. coli foram cultivadas em fermentadores de 250 mL (Ambr 250 Bioreactor system, Sartorius) começando com 100 mL de meio de cultura mineral composto por 6,9 g/L de glicose e um meio mineral composto por (NH4)2HPO4, KH2PO4, MgSO4 x 7H2O, KOH, NaOH, solução de oligoelementos, antiespuma e tiamina. O nível de oxigênio dissolvido foi mantido em 20% por uma cascata de primeira agitação e depois fluxo de ar começando em 700 rpm (até no máximo 4.500 rpm) e 1 VVM (até no máximo 3 VVM). O pH foi mantido em 6,8 por titulação com solução de NH4OH a 8,5%. Os cultivos foram iniciados com inóculos a 2% (v/v) de pré- cultivos cultivados em meio similar contendo glicose. Após o esgotamento da glicose contida no meio do lote, uma solução de alimentação contendo 49% (p/p) de glicose, MgSO4 x 7H2O, traços de metais e antiespuma foi alimentada continuamente usando o perfil de alimentação mostrado na figura 2 começando com uma taxa de alimentação inicial de 0,192 g de glicose/h. A temperatura estava inicialmente em 33 °C, mas caiu para 28 °C com uma rampa de 5 horas após 26 horas de alimentação (fig x). O crescimento, a atividade metabólica e o estado das células foram acompanhados por medições on-line de refletância e taxa de evolução de CO2.

Exemplo 1 - Síntese de 3'SL in vivo

[000191] Células geneticamente modificadas que expressam enzimas alfa-2,3-sialiltransferase individuais foram rastreadas quanto à sua capacidade de produzir o HMO sialilado, 3'SL, tal como o único HMO ao usar lactose como substrato inicial.

[000192] Um grupo de 18 enzimas (Tabela 3) foi compilado para testar sua capacidade de sintetizar 3'SL quando introduzidas em células geneticamente modificadas produtoras de ácido siálico ativado (CMP-Neu5Ac) e onde a célula foi alimentada com lactose como substrato para a produção de HMO.

[000193] Cepas geneticamente modificadas que expressam as 18 α-2,3-sialiltransferases individuais (Tabela 3) foram geradas conforme descrito na seção "Método". As células foram rastreadas em uma configuração de ensaio de poço profundo alimentado em lote, conforme descrito na seção "Método". O conteúdo molar de HMOs individuais produzidos pelas cepas foi medido por HPLC.

[000194] A Tabela 4 lista o genótipo das 13 cepas que produziram 3'SL como o único HMO.

[000195] Nst é uma enzima bem conhecida para a produção de 3'SL e foi usada como controle positivo no presente exemplo. Foram geradas duas cepas com Nst expressa sob o controle do promotor PglpF ou Plac, onde a cepa que expressa Nst sob o controle do promotor Plac tem um crescimento melhor em comparação com a cepa que expressa Nst sob o controle do promotor PglpF (10 vezes mais forte que Plac) conforme indicado pela densidade óptica das células no final da incubação (Tabela 5). Por este motivo, Nst_Plac foi utilizado como referência.

[000196] Os resultados das células produtoras de 3'SL são mostrados na Tabela 5 como a quantidade (conteúdo molar, mM) de 3'SL em comparação com a cepa de Nst_Plac (em porcentagem, %). 3'SL foi o único HMO produzido pela cepa. Tabela 5: Conteúdo molar de 3'SL (mM) produzido por cada cepa em relação ao conteúdo molar de 3'SL (mM) produzido pela cepa de Nst_Plac e a densidade óptica observada no final da incubação.

[000197] A partir dos dados apresentados na Tabela 5, pode-se ver que existem 3 enzimas (Clari1, Neigon e Poral) que podem formar 3'SL em um nível pelo menos 5% acima do nível de 3'SL formado pela cepa de Nst_Plac, enquanto a enzima PmN produziu níveis de 3'SL semelhantes aos da cepa de Nst_Plac. Esses níveis também estão acima da quantidade de 3'SL produzida por CstI e PM70, que são conhecidos na técnica anterior por formar 3'SL. A quantidade relativa de 3'SL produzida por essas cepas é mostrada na Figura 1.

[000198] Em uma configuração de ensaio de poço profundo, as células bacterianas podem produzir ácidos devido à oxigenação abaixo do ideal, especialmente no final dos experimentos, onde as culturas atingiram densidades ópticas mais altas. Embora a extensão em que esses ácidos são formados possa afetar as densidades ópticas finais, a densidade óptica no final da incubação pode ser usada como uma aproximação de quão bem as células lidam com a expressão da α-2,3-sialiltransferase heteróloga, quanto maior a densidade, melhor o crescimento. Com base nisso, pode-se ver que PmN tem um crescimento mais ideal do que a cepa de Nst_Plac, indicando que a cepa tolera melhor a PmN de α-2,3- sialiltransferase do que a Nst de α-2,3-sialiltransferase, isso é ainda mais suportado por reduzir significativamente o crescimento da cepa de Nst_PglpF onde Nst está sob o controle de um promotor mais forte e, portanto, é expresso em níveis mais altos.

[000199] A expressão de α-2,3-sialiltransferase Clari1, Neigon, Poral e PmN é bem tolerada pela cepa quando controlada pelo forte promotor PglpF e produz mais ou quantidade equivalente de 3'SL quando comparada à cepa Nst_Plac que tem propriedades de crescimento semelhantes.

Exemplo 2 - Estabilidade de crescimento de cepas que expressam α-2,3-sialiltransferase

[000200] A robustez das cepas que expressam as α-2,3- sialiltransferases é importante ao aumentar a escala da fabricação de 3'SL. No presente exemplo, o crescimento das cepas de melhor desempenho do exemplo 1, as cepas que expressam Clari1 ou Poral, foram comparadas com as cepas que expressam Nst sob controle do promotor PglpF ou Plac.

[000201] As cepas foram fermentadas de acordo com o teste de estabilidade de crescimento descrito na seção “Materiais”.

[000202] A taxa de evolução de dióxido de carbono (CER) registrada durante a fermentação reflete a taxa na qual as células produzem CO2 durante a fermentação e é essencialmente uma medida do metabolismo da cepa. Se a CER cair, é uma indicação de que o metabolismo das células mudou. No teste de estabilidade do crescimento, a alimentação começa com uma alta taxa de alimentação de glicose, que é reduzida significativamente por volta de 25 horas (figura 2). A Figura 3A mostra a CER medida durante a fermentação e mostra que todas as cepas têm uma queda na CER após a mudança no perfil de alimentação mostrado na figura 2. As cepas com a α-2,3- sialiltransferase da presente divulgação, Clari1 (tracejado linha) e Poral (linha pontilhada) se recuperam após a queda inicial no CER em 35 horas, enquanto ambas as cepas Nst com o promotor Plac (linha em negrito) e o promotor PglpF (linha cheia fina) nunca se recuperam.

[000203] A refletância medida durante a fermentação no sistema Ambr 250 Bioreactor é uma medida indireta da biomassa no reator, que normalmente continua a aumentar ao longo da fermentação. A Figura 3B mostra a refletância da mesma fermentação mostrada na figura 3A e, também, neste documento fica claro que as cepas que expressam a α-2,3- sialiltransferase, Poral e Clari1, mantêm a capacidade de crescer após a mudança no perfil de alimentação, enquanto a duas cepas de Nst param de crescer.

Claims (16)

1. Célula geneticamente modificada, caracterizada pelo fato de compreender uma sequência de ácido nucleico recombinante que codifica uma enzima com atividade de α-2,3- sialiltransferase, em que a referida enzima é selecionada a partir do grupo de sialiltransferases consistindo em: a. Poral compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 3, b. Clari1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 1, c. PmN compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 4, e d. Neigon compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 2, em que a referida célula produz um HMO sialilado.

2. Célula geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o HMO sialilado é selecionado a partir do grupo que consiste em 3'SL, FSL, DSLNT e LST-a.

3. Célula geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que 3'SL é o único HMO produzido pela célula geneticamente modificada.

4. Célula geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a sequência de ácido nucleico que codifica uma enzima com atividade de α-2,3-sialiltransferase está sob o controle de um promotor selecionado a partir do grupo que consiste em PglpF, PglpA_70UTR, PglpT_70UTR, Plac_70UTR, PmglB_70UTR e variantes dos mesmos, com uma sequência de ácido nucleico de acordo com as SEQ ID NOs: 12 a 22 ou 41 a 54, de um modo preferido selecionadas a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 13, 18, 19, 20, 21, 22, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 e 51.

5. Célula geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a célula compreende adicionalmente uma ou mais sequências de ácidos nucleicos que codificam uma ou mais glicosiltransferases selecionadas a partir do grupo que consiste em β-1,3-galactosiltransferases, β-1,4- galactosiltransferases e β-1,3-N-acetil- glucosaminiltransferases.

6. Célula geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a célula compreende adicionalmente uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína transportadora MFS capaz de exportar o HMO sialilado para o meio extracelular.

7. Célula geneticamente modificada, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a referida célula é selecionada a partir do grupo que consiste em Escherichia coli, Bacillus subtilis, lactobacillus lactis, Corynebacterium glutamicum, Yarrowia lipolytica, Pichia pastoris e Saccharomyces cerevisiae.

8. Método para produzir um oligossacarídeo de leite humano (HMO) sialilado, o referido método caracterizadopelo fato de compreender cultivar uma célula geneticamente modificada compreendendo uma sequência de ácido nucleico recombinante que codifica uma enzima com atividade α-2,3- sialiltransferase, em que a referida enzima é selecionada a partir do grupo consiste em: a. Poral compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 3, b. Clari1 compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 1, c. PmN compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 4, e d. Neigon compreendendo ou consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 2, em que a referida célula geneticamente modificada compreende opcionalmente pelo menos uma modificação adicional conforme definida em qualquer uma das reivindicações 4 a 6.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o oligossacarídeo do leite humano (HMO) sialilado produzido é selecionado a partir do grupo que consiste em 3'SL, FSL, DSLNT e LST-a.

10. Método, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que 3'SL é o único oligossacarídeo do leite humano (HMO) produzido.

11. Método, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que a lactose é adicionada durante o cultivo das células geneticamente modificadas como um substrato para a formação de HMO sialilado.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 12, caracterizado pelo fato de que o oligossacarídeo do leite humano (HMO) sialilado é recuperado do meio de cultura e/ou da célula geneticamente modificada.

13. Construto de ácido nucleico caracterizado pelo fato de compreender a sequência de ácido nucleico recombinante que codifica uma enzima com atividade de α-2,3- sialiltransferase, em que a referida sequência de ácido nucleico recombinante é selecionada a partir do grupo que consiste em: a. Poral compreendendo ou consistindo na sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 25 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 25, b. Clari1 compreendendo ou consistindo na sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 23 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 23, c. PmN compreendendo ou consistindo na sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 26 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 26, d. Neigon compreendendo ou consistindo na sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 24 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 24, em que a sequência de codificação da enzima está sob o controle de uma sequência promotora.

14. Construto de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que a sequência promotora é selecionada a partir do grupo que consiste em PglpF, PglpA_70UTR, PglpT_70UTR, Plac_70UTR, PmglB_70UTR e variantes dos mesmos, com as sequências de ácido nucleico de acordo com SEQ ID NOs: 12 a 22 ou 41 a 54, de um modo preferido selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 13, 18, 19, 20, 21, 22, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 e 51.

15. Uso de um construto de ácido nucleico conforme definido na reivindicação 13 ou 14, caracterizadopelo fato de ser em uma célula hospedeira para a produção de um HMO sialilado.

16. Uso de uma célula geneticamente modificada conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizadopelo fato de ser na produção de um HMO sialilado.