具体实施方式
实施例1
含L-阿拉伯糖调控元件和赖氨酸脱羧酶基因表达盒的载体的构建
使用引物cadA-SacI-F(SEQ ID No:1)和cadA-XbaI-R(SEQ ID No:2)将赖氨酸脱羧酶(SEQ ID No:3)基因cadA(SEQ ID No:4)从大肠杆菌MG1655K12(E.coli MG1655K12,购自北京天恩泽生物技术有限公司)的基因组中扩增出来,通过SacI和XbaI双酶切后,连入同样双酶切的pUC18质粒(购自宝生物工程(大连)有限公司)中。
利用CaCl2法制备感受态,并用热激法将连接产物转化至大肠杆菌E.coli BL21(购自宝生物工程(大连)有限公司)细胞中,利用LB培养基中添加氨苄抗生素进行筛选,克隆PCR和测序验证正确后,提取质粒,即得到pCIB60质粒。
以质粒pCIB60为模板,进一步利用引物cadA-F2(SEQ ID No:5)和cadA-R2(SEQ IDNo:6)对pCIB60质粒中cadA基因起始密码子ATG上游的序列进行优化。具体的,利用引物cadA-F2和cadA-R2以pCIB60质粒为模板进行PCR扩增,扩增后利用DpnI限制性内切酶对PCR产物进行消化,同样利用热激法转化至E.coli BL21感受态细胞中,测序验证后得到质粒pCIB70。经过上述优化后,CadA可以顺利在大肠杆菌E.coli BL21中转录和翻译。经过所述优化后,cadA基因起始密码子上游的序列由5’-GACCATGATTACGAATTCGAGCTC-3’(SEQ IDNO:24)替换为5’-GACCATGATTACGAATTCGTTTTTTTGGGAATTCACACACAGGAGGAGCTC-3’(SEQ IDNO:25)。进一步,同样的做法,以质粒pCIB70为模板,利用引物KpnI-F(SEQ ID No:7)和KpnI-R(SEQ ID No:8)在pCIB70质粒中引入KpnI酶切位点,测序验证后得到质粒pCIB71,包含KpnI酶切位点在内的50个碱基的序列为5’-CTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGTACCGGATAACCGTATTACCGCCTTT-3’(SEQ ID NO:26)。
然后利用引物ara-KpnI-F(SEQ ID No:9)和ara-SacI-R(SEQ ID No:10)将L-阿拉伯糖代谢相关基因的启动子及调控蛋白表达盒序列(ParaB-Pc-araC)从大肠杆菌MG1655K12(E.coli MG1655K12)的基因组中扩增出来,得到L-阿拉伯糖调控元件(ParaB-Pc-araC,SEQID No:11)。利用KpnI和SacI双酶切扩增得到的L-阿拉伯糖调控元件,与KpnI和SacI双酶切的pCIB71载体连接,构建含有L-阿拉伯糖调控元件和赖氨酸脱羧酶基因的质粒pCIB61(图1)。经测序验证后,将pCIB61质粒转化至大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞中得到大肠杆菌S1L-阿拉伯糖菌株。
表1.本发明中所用到的引物。
实施例2
含D-木糖调控元件和赖氨酸脱羧酶基因表达盒的载体的构建
利用引物PxylR-BamHI-F(SEQ ID No:12)和PxylA-SacI-R(SEQ ID No:13)将D-木糖调控蛋白启动子-D-木糖代谢相关基因的启动子(PxylR-PxylAB,SEQ ID No:14)及利用引物xylR-BamHI-F(SEQ ID No:15)和xylR-KpnI-R(SEQ ID No:16)将木糖调控蛋白编码基因xylR+RBS(SEQ ID No:17)从大肠杆菌MG1655K12(E.coli MG1655K12)的基因组中扩增出来。然后,利用KpnI和BamHI双酶切扩增得到的木糖调控蛋白编码基因xylR+RBS(SEQ IDNo:17)和质粒pCIB61,二者连接构建得到含有D-木糖调控蛋白xylR和赖氨酸脱羧酶的质粒pCIB62(图2)。测序验证正确后,利用BamHI和SacI酶切扩增得到的启动子PxylR-PxylAB(SEQID No:14)和质粒pCIB62,二者连接得到含有D-木糖调控元件和赖氨酸脱羧酶基因表达盒的质粒pCIB63(图3)。构建好的质粒经测序验证后,将pCIB63质粒转化至大肠杆菌E.coliBL21感受态细胞中得到E.coli S2D-木糖菌株。
实施例3
含L-鼠李糖调控元件和赖氨酸脱羧酶基因表达盒的载体的构建
利用引物rhaR-KpnI-F(SEQ ID No:18)和rhaB-SacI-R(SEQ ID No:19)将L-鼠李糖调控元件(RhaR-RhaS-Prs-PBAD,SEQ ID No:20)从大肠杆菌MG1655(E.coli MG1655K12)的基因组中扩增出来。然后利用KpnI和SacI双酶切扩增得到的L-鼠李糖调控元件RhaR-RhaS-Prs-PBAD和pCIB61,二者连接构建得到含有L-鼠李糖感应调控元件RhaR-RhaS-Prs-PBAD和赖氨酸脱羧酶基因的表达盒的质粒pCIB64(图4)。测序验证正确后,将pCIB64质粒分别转化至大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞中得到E.coli S3L-鼠李糖菌株。
实施例4
培养过程中分别添加三种糖对相应的三种大肠杆菌菌株生长的影响
首先分析E.coli S1L-阿拉伯糖菌株、E.coli S2D-木糖菌株和E.coli S3L-鼠李糖菌株在培养过程中添加或不添加对应的单糖,对其菌株生长的影响。以CIB71菌株(构建的pCIB71质粒转化到E.coli BL21细胞中)为对照,首先挑取单克隆在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基中培养过夜后,转接到添加(+,终浓度为0.2%w/v)或者不添加(-)对应的单糖的培养基中继续培养过夜,其中S1代表所构建的E.coli S1L-阿拉伯糖菌株,S2代表E.coli S2D-木糖菌株,S3代表E.coli S3L-鼠李糖菌株;CIB71菌株的培养基中不添加任何糖。
测定过夜培养之后各菌株的生长情况。结果如图5所示,E.coli S1L-阿拉伯糖菌株在培养的时候,加入L-阿拉伯糖会使得它比不添加L-阿拉伯糖的菌株相比OD提高50%;E.coli S2D-木糖菌株在培养的时候,加入D-木糖会使得它比不添加D-木糖的对照相比,OD提高40%;而E.coli S3L-鼠李糖菌株表在加入L-鼠李糖后OD提高了73%。结果显示,这三株菌都可以利用这三种单糖作为碳源生长。
实施例5
利用三种大肠杆菌通过L-赖氨酸生产1,5-戊二胺
接下来分析E.coli S1L-阿拉伯糖菌株、E.coli S2D-木糖菌株和E.coli S3L-鼠李糖菌株在培养过程中添加不同浓度的或不添加对应的单糖,对其菌株生产赖氨酸脱羧酶及体外转化赖氨酸生产1,5-戊二胺的影响。由于上述构建的CIB71菌株为组成型lac启动子表达赖氨酸脱羧酶的菌株,为了比较本发明中构建的三种糖诱导型启动子相比诱导型乳糖启动子的诱导强度,进一步利用引物lacIq-KpnI-F(SEQ ID No:21)和Ptac-SacI-R(SEQ IDNo:22)将阻遏蛋白LacIq-Ptac启动子调控元件(SEQ ID No:23)从质粒pGEX-4T-1(购自GE医疗集团,GE Healthcare,美国)中扩增出来,并利用KpnI、SacI双酶切连入同样双酶切的pCIB61中,构建质粒pCIB81,并将其转化至E.coli BL21感受态中得到重组大肠杆菌CIB81在本实施例中作为对照。
挑取不同菌株的单克隆在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基中培养过夜后,再转接到添加不同浓度(0.05%,0.1%,0.16%,0.2%,0.5%w/v)的或者不添加对应单糖的培养基中继续培养过夜,其中S1代表S1L-阿拉伯糖菌株,S2代表S2D-木糖菌株,S3代表S3L-鼠李糖菌株。CIB81菌株在培养基中添加乳糖(终浓度为0.1%和0.2%w/v),以培养过程中不添加乳糖的作为对照。
1)利用SDS-PAGE检测这几株菌表达的赖氨酸脱羧酶的量。
以添加了0.2%w/v的乳糖进行培养的CIB81菌株作为对照,从图6中可以看出,对于S1L-阿拉伯糖菌株、S2D-木糖菌株和S3L-鼠李糖菌株这三株菌而言,大肠杆菌S1L-阿拉伯糖菌株添加终浓度0.2%w/v的L-阿拉伯糖;大肠杆菌S2D-木糖菌株大肠杆菌分别添加终浓度为0.16%和0.2%w/v的D-木糖;大肠杆菌S3L-鼠李糖菌株分别添加终浓度为0.1%,0.16%和0.2%w/v的L-鼠李糖时,它们都可以正常的表达赖氨酸脱羧酶(CadA);并且和使用诱导型乳糖启动子的对照CIB81菌株相比,S1,S2和S3这三株菌可以表达更大量的赖氨酸脱羧酶。
2)通过测定菌体相同时间内转化L-赖氨酸的百分比来分析各菌株赖氨酸脱羧酶的作用转化为1,5-戊二胺的情况。
通过L-赖氨酸转化实验进行测定。
按如下配制反应体系:
过夜培养的菌液 |
600μl |
Lys-HCl(400g/l) |
400μl |
辅酶磷酸吡哆醛(PLP,20mM) |
5μl |
具体而言,分别取600μl的各菌株过夜培养的菌液至1.5mlEP管中,并加入400μl(浓度为400g/l)的赖氨酸盐酸溶液和辅酶PLP(终浓度为0.1mM),于37℃、250rpm反应2hrs,反应结束后对反应液进行离心(12000rpm,3min),取500μl的反应液上清于核磁管中,并加入100μl D2O:DMSO=30:1作为内标,利用核磁共振(BRUKER ULTRASHIEDTM400PLUS,BeckmanNMR)扫描混合物的氢谱并积分得到反应体系中剩余的L-赖氨酸的峰面积C以及L-赖氨酸和1,5-戊二胺的混合物的峰面积A,利用公式(A-2×C)/4计算生成的1,5-戊二胺的峰面积,生成的1,5-戊二胺的峰面积(A-2×C)/4除以剩余的L-赖氨酸和生成的1,5-戊二胺的总峰面积(C+(A-2×C)/4)计算L-赖氨酸转化率。
L-赖氨酸转化率的结果如图7所示。从图7中可以看出,S1L-阿拉伯糖菌株在培养的时候,加入浓度为0.1%、0.16%和0.2%w/v的L-阿拉伯糖时菌体的赖氨酸转化率分别为35%、59%和62%。相比之下,不添加L-阿拉伯糖的S1菌株的赖氨酸转化率为0.5%。另外,当L-阿拉伯糖浓度为0.05%w/v时,L-赖氨酸的转化率为6%,当添加的L-阿拉伯糖的浓度为0.5%w/v时,L-赖氨酸的转化率为55%。
S2D-木糖菌株在培养的时候,当加入不同浓度0.05%、0.1%、0.16%w/v的D-木糖时,L-赖氨酸转化率分别为10%、29%和81%。加入0.2%w/v的D-木糖时,L-赖氨酸转化率为为86%,但当加入的D-木糖的浓度增加至0.5%w/v时,L-赖氨酸转化率为66%。相比之下,不添加D-木糖的对照S2基本检测不到L-赖氨酸的转化。
S3L-鼠李糖菌株在加入浓度分别为0.05%、0.1%、0.16%和0.2%w/v的L-鼠李糖之后,其菌体的L-赖氨酸转化率分别为70%、78%、85%和90%。相比之下,不添加L-鼠李糖的对照有一定量的背景表达,菌体L-赖氨酸转化率转化率为24%。随着鼠李糖浓度的进一步提高,加入0.5%w/v的L-鼠李糖,发现菌体的L-赖氨酸转化率为80%。
综合分析各菌株的L-赖氨酸转化率的测定结果,相比对照使用乳糖诱导型Ptac启动子的菌株CIB81而言,在控制L-阿拉伯糖的浓度为0.16~0.5%w/v,最优选择0.16~0.2%w/v;控制D-木糖的浓度为0.16~0.5%,最优选择0.16~0.2%w/v;以及控制L-鼠李糖的浓度为0.05~0.5%,最优选择0.05~0.2%w/v时,L-赖氨酸的转化率都会出现显著提高,有利于提高工业中1,5-戊二胺的生产量。
在本发明的方法中,所构建的微生物菌株可以感应和利用可替代性单糖作为碳源生长和表达赖氨酸脱羧酶,同时控制这些单糖的使用浓度以平衡它们作为碳源对于菌体生长和作为诱导剂诱导赖氨酸脱羧酶基因表达的效果,从而实现了1,5-戊二胺高转化率。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海凯赛生物技术研发中心有限公司
凯赛生物产业有限公司
<120> 生产1, 5-戊二胺的方法
<130> LZ1700068CN01
<160> 26
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 1
tccgagctca tgaacgttat tgcaatattg 30
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 2
gcctctagac cacttccctt gtacgagc 28
<210> 3
<211> 715
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 3
Met Asn Val Ile Ala Ile Leu Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu
1 5 10 15
Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gln
20 25 30
Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn
35 40 45
Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu
50 55 60
Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ser Lys Met Asn Glu Asn Leu Pro Leu Tyr
65 70 75 80
Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu
85 90 95
Arg Leu Gln Ile Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp
100 105 110
Ile Ala Asn Lys Ile Lys Gln Thr Thr Asp Glu Tyr Ile Asn Thr Ile
115 120 125
Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys
130 135 140
Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gln Lys
145 150 155 160
Ser Pro Val Gly Ser Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Pro Asn Thr Met
165 170 175
Lys Ser Asp Ile Ser Ile Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp
180 185 190
His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Gln Tyr Ile Ala Arg Val Phe
195 200 205
Asn Ala Asp Arg Ser Tyr Met Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn
210 215 220
Lys Ile Val Gly Met Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Ser Thr Ile Leu Ile
225 230 235 240
Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp
245 250 255
Val Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu
260 265 270
Gly Gly Ile Pro Gln Ser Glu Phe Gln His Ala Thr Ile Ala Lys Arg
275 280 285
Val Lys Glu Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr
290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Phe Ile Lys Lys
305 310 315 320
Thr Leu Asp Val Lys Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr
325 330 335
Thr Asn Phe Ser Pro Ile Tyr Glu Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Gly
340 345 350
Arg Val Glu Gly Lys Val Ile Tyr Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Leu
355 360 365
Leu Ala Ala Phe Ser Gln Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly Asp Val
370 375 380
Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser
385 390 395 400
Pro His Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met
405 410 415
Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu Ile Asn Gly Ser Ile Glu Arg Ala
420 425 430
Ile Lys Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Leu Arg Thr Glu Ser Asp Gly
435 440 445
Trp Phe Phe Asp Val Trp Gln Pro Asp His Ile Asp Thr Thr Glu Cys
450 455 460
Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Thr Trp His Gly Phe Lys Asn Ile Asp
465 470 475 480
Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro
485 490 495
Gly Met Glu Lys Asp Gly Thr Met Ser Asp Phe Gly Ile Pro Ala Ser
500 505 510
Ile Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly Ile Val Val Glu Lys Thr
515 520 525
Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr
530 535 540
Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe
545 550 555 560
Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu
565 570 575
Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gln Glu Leu Ala Gln Asn
580 585 590
Ile His Lys Leu Ile Val His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg
595 600 605
Ala Phe Glu Val Leu Pro Thr Met Val Met Thr Pro Tyr Ala Ala Phe
610 615 620
Gln Lys Glu Leu His Gly Met Thr Glu Glu Val Tyr Leu Asp Glu Met
625 630 635 640
Val Gly Arg Ile Asn Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val
645 650 655
Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Ile Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val
660 665 670
Leu Glu Phe Leu Gln Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly
675 680 685
Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Tyr Arg Gln Ala Asp Gly Arg Tyr
690 695 700
Thr Val Lys Val Leu Lys Glu Glu Ser Lys Lys
705 710 715
<210> 4
<211> 2148
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 4
atgaacgtta ttgcaatatt gaatcacatg ggggtttatt ttaaagaaga acccatccgt 60
gaacttcatc gcgcgcttga acgtctgaac ttccagattg tttacccgaa cgaccgtgac 120
gacttattaa aactgatcga aaacaatgcg cgtctgtgcg gcgttatttt tgactgggat 180
aaatataatc tcgagctgtg cgaagaaatt agcaaaatga acgagaacct gccgttgtac 240
gcgttcgcta atacgtattc cactctcgat gtaagcctga atgacctgcg tttacagatt 300
agcttctttg aatatgcgct gggtgctgct gaagatattg ctaataagat caagcagacc 360
actgacgaat atatcaacac tattctgcct ccgctgacta aagcactgtt taaatatgtt 420
cgtgaaggta aatatacttt ctgtactcct ggtcacatgg gcggtactgc attccagaaa 480
agcccggtag gtagcctgtt ctatgatttc tttggtccga ataccatgaa atctgatatt 540
tccatttcag tatctgaact gggttctctg ctggatcaca gtggtccaca caaagaagca 600
gaacagtata tcgctcgcgt ctttaacgca gaccgcagct acatggtgac caacggtact 660
tccactgcga acaaaattgt tggtatgtac tctgctccag caggcagcac cattctgatt 720
gaccgtaact gccacaaatc gctgacccac ctgatgatga tgagcgatgt tacgccaatc 780
tatttccgcc cgacccgtaa cgcttacggt attcttggtg gtatcccaca gagtgaattc 840
cagcacgcta ccattgctaa gcgcgtgaaa gaaacaccaa acgcaacctg gccggtacat 900
gctgtaatta ccaactctac ctatgatggt ctgctgtaca acaccgactt catcaagaaa 960
acactggatg tgaaatccat ccactttgac tccgcgtggg tgccttacac caacttctca 1020
ccgatttacg aaggtaaatg cggtatgagc ggtggccgtg tagaagggaa agtgatttac 1080
gaaacccagt ccactcacaa actgctggcg gcgttctctc aggcttccat gatccacgtt 1140
aaaggtgacg taaacgaaga aacctttaac gaagcctaca tgatgcacac caccacttct 1200
ccgcactacg gtatcgtggc gtccactgaa accgctgcgg cgatgatgaa aggcaatgca 1260
ggtaagcgtc tgatcaacgg ttctattgaa cgtgcgatca aattccgtaa agagatcaaa 1320
cgtctgagaa cggaatctga tggctggttc tttgatgtat ggcagccgga tcatatcgat 1380
acgactgaat gctggccgct gcgttctgac agcacctggc acggcttcaa aaacatcgat 1440
aacgagcaca tgtatcttga cccgatcaaa gtcaccctgc tgactccggg gatggaaaaa 1500
gacggcacca tgagcgactt tggtattccg gccagcatcg tggcgaaata cctcgacgaa 1560
catggcatcg ttgttgagaa aaccggtccg tataacctgc tgttcctgtt cagcatcggt 1620
atcgataaga ccaaagcact gagcctgctg cgtgctctga ctgactttaa acgtgcgttc 1680
gacctgaacc tgcgtgtgaa aaacatgctg ccgtctctgt atcgtgaaga tcctgaattc 1740
tatgaaaaca tgcgtattca ggaactggct cagaatatcc acaaactgat tgttcaccac 1800
aatctgccgg atctgatgta tcgcgcattt gaagtgctgc cgacgatggt aatgactccg 1860
tatgctgcat tccagaaaga gctgcacggt atgaccgaag aagtttacct cgacgaaatg 1920
gtaggtcgta ttaacgccaa tatgatcctt ccgtacccgc cgggagttcc tctggtaatg 1980
ccgggtgaaa tgatcaccga agaaagccgt ccggttctgg agttcctgca gatgctgtgt 2040
gaaatcggcg ctcactatcc gggctttgaa accgatattc acggtgcata ccgtcaggct 2100
gatggccgct ataccgttaa ggtattgaaa gaagaaagca aaaaataa 2148
<210> 5
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
gtttttttgg gaattcacac acaggaggag ctcatgaacg ttattgcaat attg 54
<210> 6
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
gagctcctcc tgtgtgtgaa ttcccaaaaa aacgaattcg taatcatggt c 51
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 7
gttatccggt accacagaat caggggataa cgcaggaaag 40
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<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 8
gattctgtgg taccggataa ccgtattacc gcctttgagt g 41
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<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 9
cggggtacct tattatgaca acttgacggc tacatcattc ac 42
<210> 10
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 10
tccgagctcc tcctgtgtgt gaattcccaa aaaaacgggt atggagaaac agtagagag 59
<210> 11
<211> 1182
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 11
ttatgacaac ttgacggcta catcattcac tttttcttca caaccggcac ggaactcgct 60
cgggctggcc ccggtgcatt ttttaaatac ccgcgagaaa tagagttgat cgtcaaaacc 120
aacattgcga ccgacggtgg cgataggcat ccgggtggtg ctcaaaagca gcttcgcctg 180
gctgatacgt tggtcctcgc gccagcttaa gacgctaatc cctaactgct ggcggaaaag 240
atgtgacaga cgcgacggcg acaagcaaac atgctgtgcg acgctggcga tatcaaaatt 300
gctgtctgcc aggtgatcgc tgatgtactg acaagcctcg cgtacccgat tatccatcgg 360
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<211> 34
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<220>
<223> 引物
<400> 12
cgcggatccg tagttagagg acagttttaa taag 34
<210> 13
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 13
tccgagctcc tcctgtgtgt gaattcccaa aaaaacaatc aggtaatgcc gcgggtg 57
<210> 14
<211> 338
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 14
gtagttagag gacagtttta ataagtaaca atcaccgcga taaacgtaac caatttttag 60
caactaaaca ggggaaaaca attacagatt tttatctttc gattacgatt tttggtttat 120
ttcttgattt atgaccgaga tcttactttt gttgcgcaat tgtacttatt gcatttttct 180
cttcgaggaa ttacccagtt tcatcattcc attttatttt gcgagcgagc gcacacttgt 240
gaattatctc aatagcagtg tgaaataaca taattgagca actgaaaggg agtgcccaat 300
attacgacat catccatcac ccgcggcatt acctgatt 338
<210> 15
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 15
cgcggatccg agtttttgca tgattcagca gg 32
<210> 16
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 16
cggggtaccc tacaacatga cctcgctatt tac 33
<210> 17
<211> 1211
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 17
gagtttttgc atgattcagc aggaaaagaa ccatgtttac taaacgtcac cgcatcacat 60
tactgttcaa tgccaataaa gcctatgacc ggcaggtagt agaaggcgta ggggaatatt 120
tacaggcgtc acaatcggaa tgggatattt tcattgaaga agatttccgc gcccgcattg 180
ataaaatcaa ggactggtta ggagatggcg tcattgccga cttcgacgac aaacagatcg 240
agcaagcgct ggctgatgtc gacgtcccca ttgttggggt tggcggctcg tatcaccttg 300
cagaaagtta cccacccgtt cattacattg ccaccgataa ctatgcgctg gttgaaagcg 360
catttttgca tttaaaagag aaaggcgtta accgctttgc tttttatggt cttccggaat 420
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cgcaaaatcg gctggcagac tggctacaaa cgctaccacc gcaaaccggg attattgccg 600
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cggaaaaatt atgcgtgatt ggcatcgata acgaagaact gacccgctat ctgtcgcgtg 720
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tgcatcgatt attagataaa gaagaaatgc cgctacagcg aattttggtc ccaccagttc 840
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ccatgcatta cattcgtaat cacgcctgta aagggattaa agtggatcag gtactggatg 960
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tccatgccat gattcatgcc gagaagctgg agaaagcgcg cagtctgctg atttcaacca 1080
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tcatgttgta g 1211
<210> 18
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 18
cggggtacct taatctttct gcgaattgag atgac 35
<210> 19
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 19
tccgagctcc tcctgtgtgt gaattcccaa aaaaacgaat ttcattacga ccagtcta 58
<210> 20
<211> 2032
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 20
ttaatctttc tgcgaattga gatgacgcca ctggctgggc gtcatcccgg tttcccgggt 60
aaacaccacc gaaaaatagt tactatcttc aaagccacat tcggtcgaaa tatcactgat 120
taacaggcgg ctatgctgga gaagatattg cgcatgacac actctgacct gtcgcagata 180
ttgattgatg gtcattccag tctgctggcg aaattgctga cgcaaaacgc gctcactgca 240
cgatgcctca tcacaaaatt tatccagcgc aaagggactt ttcaggctag ccgccagccg 300
ggtaatcagc ttatccagca acgtttcgct ggatgttggc ggcaacgaat cactggtgta 360
acgatggcga ttcagcaaca tcaccaactg cccgaacagc aactcagcca tttcgttagc 420
aaacggcaca tgctgactac tttcatgctc aagctgaccg ataacctgcc gcgcctgcgc 480
catccccatg ctacctaagc gccagtgtgg ttgccctgcg ctggcgttaa atcccggaat 540
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<210> 21
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
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<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 22
tccgagctcc tcctgtgtgt gaattcccaa aaaaacacat tatacgagcc gatgatta 58
<210> 23
<211> 1864
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 23
gtgaaaccag taacgttata cgatgtcgca gagtatgccg gtgtctctta tcagaccgtt 60
tcccgcgtgg tgaaccaggc cagccacgtt tctgcgaaaa cgcgggaaaa agtggaagcg 120
gcgatggcgg agctgaatta cattcccaac cgcgtggcac aacaactggc gggcaaacag 180
tcgttgctga ttggcgttgc cacctccagt ctggccctgc acgcgccgtc gcaaattgtc 240
gcggcgatta aatctcgcgc cgatcaactg ggtgccagcg tggtggtgtc gatggtagaa 300
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atgt 1864
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<213> 大肠杆菌
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