CN109136297A

CN109136297A - 生产1,5-戊二胺的方法

Info

Publication number: CN109136297A
Application number: CN201710453415.8A
Authority: CN
Inventors: 陈玲; 周豪宏; 刘修才
Original assignee: Shanghai Cathay Biotechnology Research and Development Center Co Ltd; Cathay Industrial Biotech Ltd
Current assignee: Cathay R&D Center Co Ltd; CIBT America Inc
Priority date: 2017-06-15
Filing date: 2017-06-15
Publication date: 2019-01-04
Anticipated expiration: 2037-06-15
Also published as: CN109136297B

Abstract

本申请提供了一种利用工程化宿主细胞发酵生产1,5‑戊二胺的方法。所述方法能够利用其它单糖，成本低廉，且产率高。

Description

生产1，5-戊二胺的方法

技术领域

本发明涉及利用工程化宿主细胞发酵生产1,5-戊二胺的方法。更具体的，本发明涉及利用转化有赖氨酸脱羧酶的工程化宿主细胞生产1,5-戊二胺的方法。

背景技术

赖氨酸脱羧酶(lysine decarboxylase,简称LDC,分类号为EC 4.1.1.18)广泛存在于微生物、动物和高等植物中，其可以将L-赖氨酸脱去一个羧基生成1,5-戊二胺(尸胺)和CO₂。1,5-戊二胺的用途相当广泛，例如可以和二元酸进行聚合反应合成新型尼龙，在工业生产中具有很高的应用价值。目前，微生物法戊二胺生产主要采用微生物发酵生产和微生物体外酶催化生产戊二胺。

利用微生物发酵生产或微生物体外酶催化生产1,5-戊二胺时，使用较多的是根据乳糖操纵子来构建赖氨酸脱羧酶基因表达盒，中国专利CN105441497A通过构建结构为LacIq-IPTG/乳糖诱导型启动子(Ptac)-信号肽-赖氨酸脱羧酶基因-终止子的表达盒，使得赖氨酸脱羧酶基因分泌表达。

研究人员发现利用L-阿拉伯糖或者L-鼠李糖操纵子来对基因进行表达时，菌株可以利用L-阿拉伯糖和L-鼠李糖作为诱导剂诱导基因表达(Wegerer A,Sun TQ andAltenbuchneJ(2008)Optimization of an E.coli L-rhamnose-inducible expressionvector:test of various genetic module combinations.BMC Biotech,8:2)。另外，通过细菌如大肠杆菌基因组分析发现了存在如上所述的可以代谢D-木糖、L-阿拉伯糖和L-鼠李糖的结构基因(Jindan Zhou and Kenneth E.Rudd(2013)EcoGene 3.0Nucleic AcidsResearch,41(D1):D613-D624.)。

本发明通过基因工程手段对宿主细胞进行改造，以实现赖氨酸脱羧酶基因的高效表达和1,5-戊二胺的高产率。

发明内容

本发明提供了一种生产1,5-戊二胺的方法，所述方法包括：

1)提供基因工程化的宿主细胞，所述细胞中含有赖氨酸脱羧酶基因以及L-阿拉伯糖或者D-木糖或者L-鼠李糖单糖调控元件；

2)向培养基中加入相应的单糖。

在一些实施方式中，加入的单糖L-阿拉伯糖或者D-木糖或者L-鼠李糖可以是在培养开始时加入，也可以是在培养过程中加入。

在一些实施方式中，所加入的单糖的浓度范围为0.01％～1％w/v(即0.1～10g/L)，优选0.05％～0.5％w/v。在一些实施方式中，L-阿拉伯糖的浓度为0.16～0.5％w/v，优选是0.16～0.2％w/v，例如L-阿拉伯糖浓度是0.16％、0.2％、0.5％w/v。在一些实施方式中，D-木糖的浓度为0.16～0.5％w/v，优选是0.16～0.2％w/v，例如D-木糖浓度是0.16％、0.2％、0.5％w/v。在一些实施方式中，L-鼠李糖的浓度为0.05～0.5％w/v，优选是0.05～0.2％w/v，例如L-鼠李糖的浓度是0.05％、0.1％、0.16％、0.2％、0.5％w/v。

本发明中，所提供的基因工程化的宿主细胞可以利用除葡萄糖之外的单糖L-阿拉伯糖或者D-木糖或者L-鼠李糖作为碳源生长，并生产赖氨酸脱羧酶。

在一些实施方案中，可以感应葡萄糖之外的单糖的调控元件可以是在宿主细胞的染色体基因组中编码的，也可是重组的或人工合成的。本文所选的宿主细胞可以是微生物、植物或动物细胞，优选微生物细胞。

在一些实施方案中，选择作为宿主的微生物可以是大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，优选大肠杆菌或蜂房哈夫尼菌。

本发明中，细胞可以感应的除葡萄糖之外的单糖的调控元件是L-阿拉伯糖，D-木糖或L-鼠李糖的调控元件。

在一些实施案例中，赖氨酸脱羧酶(LDC)的基因可以是来自微生物、动物或植物的细胞，包括但不局限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)、天蓝色链霉菌、蜂房哈夫尼菌、谷氨酸棒状杆菌或奥克西托克雷白杆菌(Klebsiellaoxytoca)等。优选地，赖氨酸脱羧酶(LDC)基因是来自于大肠杆菌的诱导型赖氨酸脱羧酶基因SEQ ID No:4。另外，赖氨酸脱羧酶也可以来自于上述菌株经过诱变或随机突变之后的菌株或基因工程菌。赖氨酸脱羧酶还可以是上述来源的赖氨酸脱羧酶的突变体(包括天然突变体和人工重组突变体)或者活性片段(保留了赖氨酸脱羧酶活性的截短形式的蛋白片段)。

在一些实施方案中，赖氨酸脱羧酶基因的序列为SEQ ID NO:4的序列或其编码具有赖氨酸脱羧酶活性的肽的变体或同源序列。在一些实施方案中，赖氨酸脱羧酶基因cadA的序列是与SEQ ID NO:4具有至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、85％、80％、75％、70％同源性的序列。

在一些实施例中，赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:3的序列或其具有赖氨酸脱羧酶活性的变体。在一些实施方案中，赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列是与SEQ ID NO:3具有至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、85％、80％、75％、70％同源性且保持赖氨酸脱羧酶活性的序列。

在一些实施方案中，赖氨酸脱羧酶基因的上游序列是经过优化的序列，即上游的序列5’-GACCATGATTACGAATTCGAGCTC-3’(SEQ ID No:24)替换为5’-GACCATGATTACGAATTCGTTTTTTTGGGAATTCACACACAGGAG GAGCTC-3’(SEQ ID No:25)。

在本文中，L-阿拉伯糖调控元件、D-木糖调控元件和L-鼠李糖调控元件均可以为任何已知的元件序列。

在一些实施方案中，L-阿拉伯糖调控元件的序列为SEQ ID NO:11。

在一些实施方案中，D-木糖调控元件包含序列为SEQ ID NO:14的木糖启动子和序列为SEQ ID NO:17的木糖调控蛋白编码基因及其核糖体结合位点(RBS)。

在一些实施方案中，L-鼠李糖调控元件的序列为SEQ ID NO:20。

在一些实施方式中，引入的赖氨酸脱羧酶基因和单糖调控元件在一个载体上。

在一些实施方案中，所构建的含有可以感应葡萄糖之外的单糖的元件的重组质粒载体由在宿主细胞中可复制骨架质粒衍生而成。

可复制骨架质粒可以是能够在宿主菌中复制的任何一种质粒。在一个实施例中，稳定的重组表达质粒可以是由一个可以在大肠杆菌或蜂房哈夫尼菌中复制的骨架质粒衍生而来的，骨架质粒包括但不局限于，pUC(例如pUC18和pUC19)、pBR322质粒和他们的衍生质粒。

在一些实施方案中，赖氨酸脱羧酶基因和L-阿拉伯糖调控元件包含在载体pCIB61中。在一些实施方案中，赖氨酸脱羧酶基因和D-木糖调控元件包含在载体pCIB63中。在在一些实施方案中，赖氨酸脱羧酶基因和L-鼠李糖调控元件包含在载体pCIB64中。

本发明的方法还包括将所构建的包含可以感应除葡萄糖之外的单糖的元件以及赖氨酸脱羧酶基因的稳定的重组质粒转化进宿主细胞，从而得到的基因工程化宿主细胞。

本发明中所使用的核苷酸序列或DNA分子可以包括该序列的片段、同源序列、衍生序列和突变序列。核苷酸序列或聚核苷酸序列的突变体(如突变DNA)的例子，包括自然发生的突变，人工突变，和/或删除、替换、添加和/或插入一个或数个核苷酸残基等突变。这种突变体所编码的多肽应该理解为与未突变的原DNA分子实质上具有相同的功能。

在一些实施例中，宿主菌是，例如大肠杆菌E.coli BL21(DE3)、E.coli Top10、E.coli JM109菌株。

在一些实施例中，基因工程化的宿主细胞是大肠杆菌E.coli BL21菌株，赖氨酸脱羧酶基因和L-阿拉伯糖调控元件包含在载体pCIB61中，赖氨酸脱羧酶基因和D-木糖调控元件包含在载体pCIB63中，赖氨酸脱羧酶基因和L-鼠李糖调控元件包含在载体pCIB64中，并且加入的L-阿拉伯糖的浓度为0.16％、0.2％或0.5％w/v，D-木糖浓度是0.16％、0.2％或0.5％w/v，L-鼠李糖的浓度是0.05％、0.1％、0.16％、0.2％或0.5％w/v。

在一些实施案例中，工程化宿主细胞的培养基含有多肽，蛋白胨，维生素，微量元素和矿物质，这样的培养基可以包括但不局限于常用的LB培养基(由胰蛋白胨，酵母提取物和氯化钠溶解于水制成)。

在本发明中，本领域技术人员可以确定所使用的培养基的pH的范围。例如，在一些实施方案中，能够利用葡萄糖之外的单糖作为碳源生长并诱导表达赖氨酸脱羧酶的培养基pH范围为5.0～9.0，优选的pH条件为6.0～pH8.0。

在本发明中，本领域技术人员可以确定所使用的培养温度的范围。例如，在一些实施方案中，培养宿主细胞(例如菌体)或转化子的温度可以是任何能够让其生长的温度，较合适的温度是20～40℃，优选30～40℃，更优选35～37℃。在一些实施方案中，能够利用葡萄糖之外的单糖作为碳源生长并诱导表达赖氨酸脱羧酶的多肽的温度范围较合适的温度是20～40℃，优选30～40℃，更优选35～37℃。

培养的时间可以是约1天，约2天，约3天，约4天，约5天，约6天，约7天，约8天，约9天或者约10天。

在一些实施方案中，细胞生产的1,5-戊二胺的量采用核磁共振方法通过赖氨酸转化率来计算。

以下结合附图和具体的实施案例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明而不能限定本发明的范围。对于本领域的技术人员来说，在本发明范围内所做的任何变更，修改或直接采用实施例中的同等条件而实施的例子，都应理解为在本发明的涵盖范围内。

以下实施例中提到的PCR扩增、质粒提取、酶切、酶切产物连接、转化的具体步骤、条件参数等均按所购相关酶和试剂的说明书建议的条件进行。其中PCR扩增所用的DNA聚合酶、酶切所用的限制性内切酶、酶切产物连接所用的连接酶均购自宝生物工程(大连)有限公司。质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒、PCR纯化试剂盒均购自康宁生命科学有限公司(吴江，商标Axygen)，引物均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司(商标INVITROGEN)。

以下实施例中提到的质粒转化方法如下：将10μl的连接产物加入至100μl的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，冰浴20min后在42℃中热激90s。冰上孵育5min后加入1ml的LB。涂布至相对应的抗性平板上。

附图说明

图1：显示构建的含有L-阿拉伯糖调控元件和赖氨酸脱羧酶基因表达盒的质粒pCIB61。

图2：显示所构建的含有D-木糖调控蛋白xylR和赖氨酸脱羧酶基因表达盒的质粒pCIB62。

图3.显示所构建的含D-木糖调控元件和赖氨酸脱羧酶基因表达盒的质粒pCIB63。

图4.显示所构建的含有L-鼠李糖调控元件和赖氨酸脱羧酶抗性基因表达盒的质粒pCIB64。

图5.显示S1L-阿拉伯糖菌株、S2D-木糖菌株和S3L-鼠李糖菌株分别在加入对应的三种不同单糖之后的生长情况。其中CIB71菌株作为对照，每个克隆结果均为三个克隆的平均值，误差线代表标准偏差。-，不添加对应的单糖；+，添加终浓度为0.2％w/v的对应的单糖；CIB71菌株的培养基中不添加任何糖。

图6.通过SDS-PAGE分析大肠杆菌S1L-阿拉伯糖菌株、S2D-木糖菌株和S3L-鼠李糖菌株三株菌在培养过程中分别加入三种单糖后细胞内的赖氨酸脱羧酶的蛋白表达水平。

图7.显示S1L-阿拉伯糖菌株、S2D-木糖菌株和S3L-鼠李糖菌株各菌株在培养过程中添加不同浓度的对应的单糖后菌体的L-赖氨酸转化率的影响。图中的结果为三个重复测定的平均值，误差线代表标准偏差。-，不添加对应的单糖；+，添加不同浓度(w/v)的对应的单糖；

具体实施方式

实施例1

含L-阿拉伯糖调控元件和赖氨酸脱羧酶基因表达盒的载体的构建

使用引物cadA-SacI-F(SEQ ID No:1)和cadA-XbaI-R(SEQ ID No:2)将赖氨酸脱羧酶(SEQ ID No:3)基因cadA(SEQ ID No:4)从大肠杆菌MG1655K12(E.coli MG1655K12，购自北京天恩泽生物技术有限公司)的基因组中扩增出来，通过SacI和XbaI双酶切后，连入同样双酶切的pUC18质粒(购自宝生物工程(大连)有限公司)中。

利用CaCl₂法制备感受态，并用热激法将连接产物转化至大肠杆菌E.coli BL21(购自宝生物工程(大连)有限公司)细胞中，利用LB培养基中添加氨苄抗生素进行筛选，克隆PCR和测序验证正确后，提取质粒，即得到pCIB60质粒。

以质粒pCIB60为模板，进一步利用引物cadA-F2(SEQ ID No:5)和cadA-R2(SEQ IDNo:6)对pCIB60质粒中cadA基因起始密码子ATG上游的序列进行优化。具体的，利用引物cadA-F2和cadA-R2以pCIB60质粒为模板进行PCR扩增，扩增后利用DpnI限制性内切酶对PCR产物进行消化，同样利用热激法转化至E.coli BL21感受态细胞中，测序验证后得到质粒pCIB70。经过上述优化后，CadA可以顺利在大肠杆菌E.coli BL21中转录和翻译。经过所述优化后，cadA基因起始密码子上游的序列由5’-GACCATGATTACGAATTCGAGCTC-3’(SEQ IDNO：24)替换为5’-GACCATGATTACGAATTCGTTTTTTTGGGAATTCACACACAGGAGGAGCTC-3’(SEQ IDNO：25)。进一步，同样的做法，以质粒pCIB70为模板，利用引物KpnI-F(SEQ ID No:7)和KpnI-R(SEQ ID No:8)在pCIB70质粒中引入KpnI酶切位点，测序验证后得到质粒pCIB71，包含KpnI酶切位点在内的50个碱基的序列为5’-CTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGTACCGGATAACCGTATTACCGCCTTT-3’(SEQ ID NO：26)。

然后利用引物ara-KpnI-F(SEQ ID No:9)和ara-SacI-R(SEQ ID No:10)将L-阿拉伯糖代谢相关基因的启动子及调控蛋白表达盒序列(P_araB-P_c-araC)从大肠杆菌MG1655K12(E.coli MG1655K12)的基因组中扩增出来，得到L-阿拉伯糖调控元件(P_araB-P_c-araC,SEQID No:11)。利用KpnI和SacI双酶切扩增得到的L-阿拉伯糖调控元件，与KpnI和SacI双酶切的pCIB71载体连接，构建含有L-阿拉伯糖调控元件和赖氨酸脱羧酶基因的质粒pCIB61(图1)。经测序验证后，将pCIB61质粒转化至大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞中得到大肠杆菌S1L-阿拉伯糖菌株。

表1.本发明中所用到的引物。

实施例2

含D-木糖调控元件和赖氨酸脱羧酶基因表达盒的载体的构建

利用引物PxylR-BamHI-F(SEQ ID No:12)和PxylA-SacI-R(SEQ ID No:13)将D-木糖调控蛋白启动子-D-木糖代谢相关基因的启动子(P_xylR-P_xylAB,SEQ ID No:14)及利用引物xylR-BamHI-F(SEQ ID No:15)和xylR-KpnI-R(SEQ ID No:16)将木糖调控蛋白编码基因xylR+RBS(SEQ ID No:17)从大肠杆菌MG1655K12(E.coli MG1655K12)的基因组中扩增出来。然后，利用KpnI和BamHI双酶切扩增得到的木糖调控蛋白编码基因xylR+RBS(SEQ IDNo:17)和质粒pCIB61，二者连接构建得到含有D-木糖调控蛋白xylR和赖氨酸脱羧酶的质粒pCIB62(图2)。测序验证正确后，利用BamHI和SacI酶切扩增得到的启动子P_xylR-P_xylAB(SEQID No:14)和质粒pCIB62，二者连接得到含有D-木糖调控元件和赖氨酸脱羧酶基因表达盒的质粒pCIB63(图3)。构建好的质粒经测序验证后，将pCIB63质粒转化至大肠杆菌E.coliBL21感受态细胞中得到E.coli S2D-木糖菌株。

实施例3

含L-鼠李糖调控元件和赖氨酸脱羧酶基因表达盒的载体的构建

利用引物rhaR-KpnI-F(SEQ ID No:18)和rhaB-SacI-R(SEQ ID No:19)将L-鼠李糖调控元件(RhaR-RhaS-Prs-P_BAD,SEQ ID No:20)从大肠杆菌MG1655(E.coli MG1655K12)的基因组中扩增出来。然后利用KpnI和SacI双酶切扩增得到的L-鼠李糖调控元件RhaR-RhaS-Prs-P_BAD和pCIB61，二者连接构建得到含有L-鼠李糖感应调控元件RhaR-RhaS-Prs-P_BAD和赖氨酸脱羧酶基因的表达盒的质粒pCIB64(图4)。测序验证正确后，将pCIB64质粒分别转化至大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞中得到E.coli S3L-鼠李糖菌株。

实施例4

培养过程中分别添加三种糖对相应的三种大肠杆菌菌株生长的影响

首先分析E.coli S1L-阿拉伯糖菌株、E.coli S2D-木糖菌株和E.coli S3L-鼠李糖菌株在培养过程中添加或不添加对应的单糖，对其菌株生长的影响。以CIB71菌株(构建的pCIB71质粒转化到E.coli BL21细胞中)为对照，首先挑取单克隆在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基中培养过夜后，转接到添加(+，终浓度为0.2％w/v)或者不添加(-)对应的单糖的培养基中继续培养过夜，其中S1代表所构建的E.coli S1L-阿拉伯糖菌株，S2代表E.coli S2D-木糖菌株，S3代表E.coli S3L-鼠李糖菌株；CIB71菌株的培养基中不添加任何糖。

测定过夜培养之后各菌株的生长情况。结果如图5所示，E.coli S1L-阿拉伯糖菌株在培养的时候，加入L-阿拉伯糖会使得它比不添加L-阿拉伯糖的菌株相比OD提高50％；E.coli S2D-木糖菌株在培养的时候，加入D-木糖会使得它比不添加D-木糖的对照相比，OD提高40％；而E.coli S3L-鼠李糖菌株表在加入L-鼠李糖后OD提高了73％。结果显示，这三株菌都可以利用这三种单糖作为碳源生长。

实施例5

利用三种大肠杆菌通过L-赖氨酸生产1,5-戊二胺

接下来分析E.coli S1L-阿拉伯糖菌株、E.coli S2D-木糖菌株和E.coli S3L-鼠李糖菌株在培养过程中添加不同浓度的或不添加对应的单糖，对其菌株生产赖氨酸脱羧酶及体外转化赖氨酸生产1,5-戊二胺的影响。由于上述构建的CIB71菌株为组成型lac启动子表达赖氨酸脱羧酶的菌株，为了比较本发明中构建的三种糖诱导型启动子相比诱导型乳糖启动子的诱导强度，进一步利用引物lacIq-KpnI-F(SEQ ID No：21)和Ptac-SacI-R(SEQ IDNo：22)将阻遏蛋白LacIq-Ptac启动子调控元件(SEQ ID No：23)从质粒pGEX-4T-1(购自GE医疗集团，GE Healthcare，美国)中扩增出来，并利用KpnI、SacI双酶切连入同样双酶切的pCIB61中，构建质粒pCIB81，并将其转化至E.coli BL21感受态中得到重组大肠杆菌CIB81在本实施例中作为对照。

挑取不同菌株的单克隆在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基中培养过夜后，再转接到添加不同浓度(0.05％,0.1％,0.16％,0.2％,0.5％w/v)的或者不添加对应单糖的培养基中继续培养过夜，其中S1代表S1L-阿拉伯糖菌株，S2代表S2D-木糖菌株，S3代表S3L-鼠李糖菌株。CIB81菌株在培养基中添加乳糖(终浓度为0.1％和0.2％w/v)，以培养过程中不添加乳糖的作为对照。

1)利用SDS-PAGE检测这几株菌表达的赖氨酸脱羧酶的量。

以添加了0.2％w/v的乳糖进行培养的CIB81菌株作为对照，从图6中可以看出，对于S1L-阿拉伯糖菌株、S2D-木糖菌株和S3L-鼠李糖菌株这三株菌而言，大肠杆菌S1L-阿拉伯糖菌株添加终浓度0.2％w/v的L-阿拉伯糖；大肠杆菌S2D-木糖菌株大肠杆菌分别添加终浓度为0.16％和0.2％w/v的D-木糖；大肠杆菌S3L-鼠李糖菌株分别添加终浓度为0.1％，0.16％和0.2％w/v的L-鼠李糖时，它们都可以正常的表达赖氨酸脱羧酶(CadA)；并且和使用诱导型乳糖启动子的对照CIB81菌株相比，S1，S2和S3这三株菌可以表达更大量的赖氨酸脱羧酶。

2)通过测定菌体相同时间内转化L-赖氨酸的百分比来分析各菌株赖氨酸脱羧酶的作用转化为1,5-戊二胺的情况。

通过L-赖氨酸转化实验进行测定。

按如下配制反应体系：

过夜培养的菌液	600μl
		Lys-HCl(400g/l)	400μl
辅酶磷酸吡哆醛(PLP,20mM)	5μl

具体而言，分别取600μl的各菌株过夜培养的菌液至1.5mlEP管中，并加入400μl(浓度为400g/l)的赖氨酸盐酸溶液和辅酶PLP(终浓度为0.1mM)，于37℃、250rpm反应2hrs，反应结束后对反应液进行离心(12000rpm，3min)，取500μl的反应液上清于核磁管中，并加入100μl D₂O：DMSO＝30：1作为内标，利用核磁共振(BRUKER ULTRASHIED^TM400PLUS,BeckmanNMR)扫描混合物的氢谱并积分得到反应体系中剩余的L-赖氨酸的峰面积C以及L-赖氨酸和1,5-戊二胺的混合物的峰面积A，利用公式(A-2×C)/4计算生成的1,5-戊二胺的峰面积，生成的1,5-戊二胺的峰面积(A-2×C)/4除以剩余的L-赖氨酸和生成的1,5-戊二胺的总峰面积(C+(A-2×C)/4)计算L-赖氨酸转化率。

L-赖氨酸转化率的结果如图7所示。从图7中可以看出，S1L-阿拉伯糖菌株在培养的时候，加入浓度为0.1％、0.16％和0.2％w/v的L-阿拉伯糖时菌体的赖氨酸转化率分别为35％、59％和62％。相比之下，不添加L-阿拉伯糖的S1菌株的赖氨酸转化率为0.5％。另外，当L-阿拉伯糖浓度为0.05％w/v时，L-赖氨酸的转化率为6％，当添加的L-阿拉伯糖的浓度为0.5％w/v时，L-赖氨酸的转化率为55％。

S2D-木糖菌株在培养的时候，当加入不同浓度0.05％、0.1％、0.16％w/v的D-木糖时，L-赖氨酸转化率分别为10％、29％和81％。加入0.2％w/v的D-木糖时，L-赖氨酸转化率为为86％，但当加入的D-木糖的浓度增加至0.5％w/v时，L-赖氨酸转化率为66％。相比之下，不添加D-木糖的对照S2基本检测不到L-赖氨酸的转化。

S3L-鼠李糖菌株在加入浓度分别为0.05％、0.1％、0.16％和0.2％w/v的L-鼠李糖之后，其菌体的L-赖氨酸转化率分别为70％、78％、85％和90％。相比之下，不添加L-鼠李糖的对照有一定量的背景表达，菌体L-赖氨酸转化率转化率为24％。随着鼠李糖浓度的进一步提高，加入0.5％w/v的L-鼠李糖，发现菌体的L-赖氨酸转化率为80％。

综合分析各菌株的L-赖氨酸转化率的测定结果，相比对照使用乳糖诱导型Ptac启动子的菌株CIB81而言，在控制L-阿拉伯糖的浓度为0.16～0.5％w/v，最优选择0.16～0.2％w/v；控制D-木糖的浓度为0.16～0.5％，最优选择0.16～0.2％w/v；以及控制L-鼠李糖的浓度为0.05～0.5％，最优选择0.05～0.2％w/v时，L-赖氨酸的转化率都会出现显著提高，有利于提高工业中1,5-戊二胺的生产量。

在本发明的方法中，所构建的微生物菌株可以感应和利用可替代性单糖作为碳源生长和表达赖氨酸脱羧酶，同时控制这些单糖的使用浓度以平衡它们作为碳源对于菌体生长和作为诱导剂诱导赖氨酸脱羧酶基因表达的效果，从而实现了1,5-戊二胺高转化率。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海凯赛生物技术研发中心有限公司

凯赛生物产业有限公司

<120> 生产1, 5-戊二胺的方法

<130> LZ1700068CN01

<160> 26

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 1

tccgagctca tgaacgttat tgcaatattg 30

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 2

gcctctagac cacttccctt gtacgagc 28

<210> 3

<211> 715

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 3

Met Asn Val Ile Ala Ile Leu Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu

1 5 10 15

Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gln

20 25 30

Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn

35 40 45

Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu

50 55 60

Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ser Lys Met Asn Glu Asn Leu Pro Leu Tyr

65 70 75 80

Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu

85 90 95

Arg Leu Gln Ile Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp

100 105 110

Ile Ala Asn Lys Ile Lys Gln Thr Thr Asp Glu Tyr Ile Asn Thr Ile

115 120 125

Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys

130 135 140

Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gln Lys

145 150 155 160

Ser Pro Val Gly Ser Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Pro Asn Thr Met

165 170 175

Lys Ser Asp Ile Ser Ile Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp

180 185 190

His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Gln Tyr Ile Ala Arg Val Phe

195 200 205

Asn Ala Asp Arg Ser Tyr Met Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn

210 215 220

Lys Ile Val Gly Met Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Ser Thr Ile Leu Ile

225 230 235 240

Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp

245 250 255

Val Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu

260 265 270

Gly Gly Ile Pro Gln Ser Glu Phe Gln His Ala Thr Ile Ala Lys Arg

275 280 285

Val Lys Glu Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr

290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Phe Ile Lys Lys

305 310 315 320

Thr Leu Asp Val Lys Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr

325 330 335

Thr Asn Phe Ser Pro Ile Tyr Glu Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Gly

340 345 350

Arg Val Glu Gly Lys Val Ile Tyr Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Leu

355 360 365

Leu Ala Ala Phe Ser Gln Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly Asp Val

370 375 380

Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser

385 390 395 400

Pro His Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met

405 410 415

Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu Ile Asn Gly Ser Ile Glu Arg Ala

420 425 430

Ile Lys Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Leu Arg Thr Glu Ser Asp Gly

435 440 445

Trp Phe Phe Asp Val Trp Gln Pro Asp His Ile Asp Thr Thr Glu Cys

450 455 460

Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Thr Trp His Gly Phe Lys Asn Ile Asp

465 470 475 480

Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro

485 490 495

Gly Met Glu Lys Asp Gly Thr Met Ser Asp Phe Gly Ile Pro Ala Ser

500 505 510

Ile Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly Ile Val Val Glu Lys Thr

515 520 525

Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr

530 535 540

Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe

545 550 555 560

Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu

565 570 575

Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gln Glu Leu Ala Gln Asn

580 585 590

Ile His Lys Leu Ile Val His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg

595 600 605

Ala Phe Glu Val Leu Pro Thr Met Val Met Thr Pro Tyr Ala Ala Phe

610 615 620

Gln Lys Glu Leu His Gly Met Thr Glu Glu Val Tyr Leu Asp Glu Met

625 630 635 640

Val Gly Arg Ile Asn Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val

645 650 655

Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Ile Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val

660 665 670

Leu Glu Phe Leu Gln Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly

675 680 685

Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Tyr Arg Gln Ala Asp Gly Arg Tyr

690 695 700

Thr Val Lys Val Leu Lys Glu Glu Ser Lys Lys

705 710 715

<210> 4

<211> 2148

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 4

atgaacgtta ttgcaatatt gaatcacatg ggggtttatt ttaaagaaga acccatccgt 60

gaacttcatc gcgcgcttga acgtctgaac ttccagattg tttacccgaa cgaccgtgac 120

gacttattaa aactgatcga aaacaatgcg cgtctgtgcg gcgttatttt tgactgggat 180

aaatataatc tcgagctgtg cgaagaaatt agcaaaatga acgagaacct gccgttgtac 240

gcgttcgcta atacgtattc cactctcgat gtaagcctga atgacctgcg tttacagatt 300

agcttctttg aatatgcgct gggtgctgct gaagatattg ctaataagat caagcagacc 360

actgacgaat atatcaacac tattctgcct ccgctgacta aagcactgtt taaatatgtt 420

cgtgaaggta aatatacttt ctgtactcct ggtcacatgg gcggtactgc attccagaaa 480

agcccggtag gtagcctgtt ctatgatttc tttggtccga ataccatgaa atctgatatt 540

tccatttcag tatctgaact gggttctctg ctggatcaca gtggtccaca caaagaagca 600

gaacagtata tcgctcgcgt ctttaacgca gaccgcagct acatggtgac caacggtact 660

tccactgcga acaaaattgt tggtatgtac tctgctccag caggcagcac cattctgatt 720

gaccgtaact gccacaaatc gctgacccac ctgatgatga tgagcgatgt tacgccaatc 780

tatttccgcc cgacccgtaa cgcttacggt attcttggtg gtatcccaca gagtgaattc 840

cagcacgcta ccattgctaa gcgcgtgaaa gaaacaccaa acgcaacctg gccggtacat 900

gctgtaatta ccaactctac ctatgatggt ctgctgtaca acaccgactt catcaagaaa 960

acactggatg tgaaatccat ccactttgac tccgcgtggg tgccttacac caacttctca 1020

ccgatttacg aaggtaaatg cggtatgagc ggtggccgtg tagaagggaa agtgatttac 1080

gaaacccagt ccactcacaa actgctggcg gcgttctctc aggcttccat gatccacgtt 1140

aaaggtgacg taaacgaaga aacctttaac gaagcctaca tgatgcacac caccacttct 1200

ccgcactacg gtatcgtggc gtccactgaa accgctgcgg cgatgatgaa aggcaatgca 1260

ggtaagcgtc tgatcaacgg ttctattgaa cgtgcgatca aattccgtaa agagatcaaa 1320

cgtctgagaa cggaatctga tggctggttc tttgatgtat ggcagccgga tcatatcgat 1380

acgactgaat gctggccgct gcgttctgac agcacctggc acggcttcaa aaacatcgat 1440

aacgagcaca tgtatcttga cccgatcaaa gtcaccctgc tgactccggg gatggaaaaa 1500

gacggcacca tgagcgactt tggtattccg gccagcatcg tggcgaaata cctcgacgaa 1560

catggcatcg ttgttgagaa aaccggtccg tataacctgc tgttcctgtt cagcatcggt 1620

atcgataaga ccaaagcact gagcctgctg cgtgctctga ctgactttaa acgtgcgttc 1680

gacctgaacc tgcgtgtgaa aaacatgctg ccgtctctgt atcgtgaaga tcctgaattc 1740

tatgaaaaca tgcgtattca ggaactggct cagaatatcc acaaactgat tgttcaccac 1800

aatctgccgg atctgatgta tcgcgcattt gaagtgctgc cgacgatggt aatgactccg 1860

tatgctgcat tccagaaaga gctgcacggt atgaccgaag aagtttacct cgacgaaatg 1920

gtaggtcgta ttaacgccaa tatgatcctt ccgtacccgc cgggagttcc tctggtaatg 1980

ccgggtgaaa tgatcaccga agaaagccgt ccggttctgg agttcctgca gatgctgtgt 2040

gaaatcggcg ctcactatcc gggctttgaa accgatattc acggtgcata ccgtcaggct 2100

gatggccgct ataccgttaa ggtattgaaa gaagaaagca aaaaataa 2148

<210> 5

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 5

gtttttttgg gaattcacac acaggaggag ctcatgaacg ttattgcaat attg 54

<210> 6

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 6

gagctcctcc tgtgtgtgaa ttcccaaaaa aacgaattcg taatcatggt c 51

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 7

gttatccggt accacagaat caggggataa cgcaggaaag 40

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 8

gattctgtgg taccggataa ccgtattacc gcctttgagt g 41

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 9

cggggtacct tattatgaca acttgacggc tacatcattc ac 42

<210> 10

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 10

tccgagctcc tcctgtgtgt gaattcccaa aaaaacgggt atggagaaac agtagagag 59

<210> 11

<211> 1182

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 11

ttatgacaac ttgacggcta catcattcac tttttcttca caaccggcac ggaactcgct 60

cgggctggcc ccggtgcatt ttttaaatac ccgcgagaaa tagagttgat cgtcaaaacc 120

aacattgcga ccgacggtgg cgataggcat ccgggtggtg ctcaaaagca gcttcgcctg 180

gctgatacgt tggtcctcgc gccagcttaa gacgctaatc cctaactgct ggcggaaaag 240

atgtgacaga cgcgacggcg acaagcaaac atgctgtgcg acgctggcga tatcaaaatt 300

gctgtctgcc aggtgatcgc tgatgtactg acaagcctcg cgtacccgat tatccatcgg 360

tggatggagc gactcgttaa tcgcttccat gcgccgcagt aacaattgct caagcagatt 420

tatcgccagc agctccgaat agcgcccttc cccttgcccg gcgttaatga tttgcccaaa 480

caggtcgctg aaatgcggct ggtgcgcttc atccgggcga aagaaccccg tattggcaaa 540

tattgacggc cagttaagcc attcatgcca gtaggcgcgc ggacgaaagt aaacccactg 600

gtgataccat tcgcgagcct ccggatgacg accgtagtga tgaatctctc ctggcgggaa 660

cagcaaaata tcacccggtc ggcaaacaaa ttctcgtccc tgatttttca ccaccccctg 720

accgcgaatg gtgagattga gaatataacc tttcattccc agcggtcggt cgataaaaaa 780

atcgagataa ccgttggcct caatcggcgt taaacccgcc accagatggg cattaaacga 840

gtatcccggc agcaggggat cattttgcgc ttcagccata cttttcatac tcccgccatt 900

cagagaagaa accaattgtc catattgcat cagacattgc cgtcactgcg tcttttactg 960

gctcttctcg ctaaccaaac cggtaacccc gcttattaaa agcattctgt aacaaagcgg 1020

gaccaaagcc atgacaaaaa cgcgtaacaa aagtgtctat aatcacggca gaaaagtcca 1080

cattgattat ttgcacggcg tcacactttg ctatgccata gcatttttat ccataagatt 1140

agcggatcct acctgacgct ttttatcgca actctctact gt 1182

<210> 12

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 12

cgcggatccg tagttagagg acagttttaa taag 34

<210> 13

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 13

tccgagctcc tcctgtgtgt gaattcccaa aaaaacaatc aggtaatgcc gcgggtg 57

<210> 14

<211> 338

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 14

gtagttagag gacagtttta ataagtaaca atcaccgcga taaacgtaac caatttttag 60

caactaaaca ggggaaaaca attacagatt tttatctttc gattacgatt tttggtttat 120

ttcttgattt atgaccgaga tcttactttt gttgcgcaat tgtacttatt gcatttttct 180

cttcgaggaa ttacccagtt tcatcattcc attttatttt gcgagcgagc gcacacttgt 240

gaattatctc aatagcagtg tgaaataaca taattgagca actgaaaggg agtgcccaat 300

attacgacat catccatcac ccgcggcatt acctgatt 338

<210> 15

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 15

cgcggatccg agtttttgca tgattcagca gg 32

<210> 16

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 16

cggggtaccc tacaacatga cctcgctatt tac 33

<210> 17

<211> 1211

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 17

gagtttttgc atgattcagc aggaaaagaa ccatgtttac taaacgtcac cgcatcacat 60

tactgttcaa tgccaataaa gcctatgacc ggcaggtagt agaaggcgta ggggaatatt 120

tacaggcgtc acaatcggaa tgggatattt tcattgaaga agatttccgc gcccgcattg 180

ataaaatcaa ggactggtta ggagatggcg tcattgccga cttcgacgac aaacagatcg 240

agcaagcgct ggctgatgtc gacgtcccca ttgttggggt tggcggctcg tatcaccttg 300

cagaaagtta cccacccgtt cattacattg ccaccgataa ctatgcgctg gttgaaagcg 360

catttttgca tttaaaagag aaaggcgtta accgctttgc tttttatggt cttccggaat 420

caagcggcaa acgttgggcc actgagcgcg aatatgcatt tcgtcagctt gtcgccgaag 480

aaaagtatcg cggagtggtt tatcaggggt tagaaaccgc gccagagaac tggcaacacg 540

cgcaaaatcg gctggcagac tggctacaaa cgctaccacc gcaaaccggg attattgccg 600

ttactgacgc ccgagcgcgg catattctgc aagtatgtga acatctacat attcccgtac 660

cggaaaaatt atgcgtgatt ggcatcgata acgaagaact gacccgctat ctgtcgcgtg 720

tcgccctttc ttcggtcgct cagggcgcgc ggcaaatggg ctatcaggcg gcaaaactgt 780

tgcatcgatt attagataaa gaagaaatgc cgctacagcg aattttggtc ccaccagttc 840

gcgtcattga acggcgctca acagattatc gctcgctgac cgatcccgcc gttattcagg 900

ccatgcatta cattcgtaat cacgcctgta aagggattaa agtggatcag gtactggatg 960

cggtcgggat ctcgcgctcc aatcttgaga agcgttttaa agaagaggtg ggtgaaacca 1020

tccatgccat gattcatgcc gagaagctgg agaaagcgcg cagtctgctg atttcaacca 1080

ccttgtcgat caatgagata tcgcaaatgt gcggttatcc atcgctgcaa tatttctact 1140

ctgtttttaa aaaagcatat gacacgacgc caaaagagta tcgcgatgta aatagcgagg 1200

tcatgttgta g 1211

<210> 18

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 18

cggggtacct taatctttct gcgaattgag atgac 35

<210> 19

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 19

tccgagctcc tcctgtgtgt gaattcccaa aaaaacgaat ttcattacga ccagtcta 58

<210> 20

<211> 2032

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 20

ttaatctttc tgcgaattga gatgacgcca ctggctgggc gtcatcccgg tttcccgggt 60

aaacaccacc gaaaaatagt tactatcttc aaagccacat tcggtcgaaa tatcactgat 120

taacaggcgg ctatgctgga gaagatattg cgcatgacac actctgacct gtcgcagata 180

ttgattgatg gtcattccag tctgctggcg aaattgctga cgcaaaacgc gctcactgca 240

cgatgcctca tcacaaaatt tatccagcgc aaagggactt ttcaggctag ccgccagccg 300

ggtaatcagc ttatccagca acgtttcgct ggatgttggc ggcaacgaat cactggtgta 360

acgatggcga ttcagcaaca tcaccaactg cccgaacagc aactcagcca tttcgttagc 420

aaacggcaca tgctgactac tttcatgctc aagctgaccg ataacctgcc gcgcctgcgc 480

catccccatg ctacctaagc gccagtgtgg ttgccctgcg ctggcgttaa atcccggaat 540

cgccccctgc cagtcaagat tcagcttcag acgctccggg caataaataa tattctgcaa 600

aaccagatcg ttaacggaag cgtaggagtg tttatcgtca gcatgaatgt aaaagagatc 660

gccacgggta atgcgataag ggcgatcgtt gagtacatgc aggccattac cgcgccagac 720

aatcaccagc tcacaaaaat catgtgtatg ttcagcaaag acatcttgcg gataacggtc 780

agccacagcg actgcctgct ggtcgctggc aaaaaaatca tctttgagaa gttttaactg 840

atgcgccacc gtggctacct cggccagaga acgaagttga ttattcgcaa tatggcgtac 900

aaatacgttg agaagattcg cgttattgca gaaagccatc ccgtccctgg cgaatatcac 960

gcggtgacca gttaaactct cggcgaaaaa gcgtcgaaaa gtggttactg tcgctgaatc 1020

cacagcgata ggcgatgtca gtaacgctgg cctcgctgtg gcgtagcaga tgtcgggctt 1080

tcatcagtcg caggcggttc aggtatcgct gaggcgtcag tcccgtttgc tgcttaagct 1140

gccgatgtag cgtacgcagt gaaagagaaa attgatccgc cacggcatcc caattcacct 1200

catcggcaaa atggtcctcc agccaggcca gaagcaagtt gagacgtgat gcgctgtttt 1260

ccaggttctc ctgcaaactg cttttacgca gcaagagcag taattgcata aacaagatct 1320

cgcgactggc ggtcgagggt aaatcatttt ccccttcctg ctgttccatc tgtgcaacca 1380

gctgtcgcac ctgctgcaat acgctgtggt taacgcgcca gtgagacgga tactgcccat 1440

ccagctcttg tggcagcaac tgattcagcc cggcgagaaa ctgaaatcga tccggcgagc 1500

gatacagcac attggtcaga cacagattat cggtatgttc atacagatgc cgatcatgat 1560

cgcgtacgaa acagaccgtg ccaccggtga tggtataggg ctgcccatta aacacatgaa 1620

tacccgtgcc atgttcgaca atcacaattt catgaaaatc atgatgatgt tcaggaaaat 1680

ccgcctgcgg gagccggggt tctatcgcca cggacgcgtt accagacgga aaaaaatcca 1740

cactatgtaa tacggtcata ctggcctcct gatgtcgtca acacggcgaa atagtaatca 1800

cgaggtcagg ttcttacctt aaattttcga cggaaaacca cgtaaaaaac gtcgattttt 1860

caagatacag cgtgaatttt caggaaatgc ggtgagcatc acatcaccac aattcagcaa 1920

attgtgaaca tcatcacgtt catctttccc tggttgccaa tggcccattt tcctgtcagt 1980

aacgagaagg tcgcgaattc aggcgctttt tagactggtc gtaatgaaat tc 2032

<210> 21

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 21

cggggtaccg cctttttacg gttcctggcc ttttgctg 38

<210> 22

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 22

tccgagctcc tcctgtgtgt gaattcccaa aaaaacacat tatacgagcc gatgatta 58

<210> 23

<211> 1864

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 23

gtgaaaccag taacgttata cgatgtcgca gagtatgccg gtgtctctta tcagaccgtt 60

tcccgcgtgg tgaaccaggc cagccacgtt tctgcgaaaa cgcgggaaaa agtggaagcg 120

gcgatggcgg agctgaatta cattcccaac cgcgtggcac aacaactggc gggcaaacag 180

tcgttgctga ttggcgttgc cacctccagt ctggccctgc acgcgccgtc gcaaattgtc 240

gcggcgatta aatctcgcgc cgatcaactg ggtgccagcg tggtggtgtc gatggtagaa 300

cgaagcggcg tcgaagcctg taaagcggcg gtgcacaatc ttctcgcgca acgcgtcagt 360

gggctgatca ttaactatcc gctggatgac caggatgcca ttgctgtgga agctgcctgc 420

actaatgttc cggcgttatt tcttgatgtc tctgaccaga cacccatcaa cagtattatt 480

ttctcccatg aagacggtac gcgactgggc gtggagcatc tggtcgcatt gggtcaccag 540

caaatcgcgc tgttagcggg cccattaagt tctgtctcgg cgcgtctgcg tctggctggc 600

tggcataaat atctcactcg caatcaaatt cagccgatag cggaacggga aggcgactgg 660

agtgccatgt ccggttttca acaaaccatg caaatgctga atgagggcat cgttcccact 720

gcgatgctgg ttgccaacga tcagatggcg ctgggcgcaa tgcgcgccat taccgagtcc 780

gggctgcgcg ttggtgcgga tatctcggta gtgggatacg acgataccga agacagctca 840

tgttatatcc cgccgttaac caccatcaaa caggattttc gcctgctggg gcaaaccagc 900

gtggaccgct tgctgcaact ctctcagggc caggcggtga agggcaatca gctgttgccc 960

gtctcactgg tgaaaagaaa aaccaccctg gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc 1020

gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag 1080

tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct cactcattag gcaccccagg ctttacactt 1140

tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 1200

cagctatgac catgattacg gattcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa 1260

accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta 1320

atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat 1380

ggcgctttgc ctggtttccg gcaccagaag cggtgccgga aagctggctg gagtgcgatc 1440

ttcctgaggc cgatactgtc gtcgtcccct caaactggca gatgcacggt tacgatgcgc 1500

ccatctacac caacgtaacc tatcccatta cggtcaatcc gccgtttgtt cccacggaga 1560

atccgacggg ttgttactcg ctcacattta atgttgatga aagctggcta caggaaggcc 1620

agacgcgaat tatttttgat ggcgttggaa ttacgttatc gactgcacgg tgcaccaatg 1680

cttctggcgt caggcagcca tcggaagctg tggtatggct gtgcaggtcg taaatcactg 1740

cataattcgt gtcgctcaag gcgcactccc gttctggata atgttttttg cgccgacatc 1800

ataacggttc tggcaaatat tctgaaatga gctgttgaca attaatcatc ggctcgtata 1860

atgt 1864

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 24

gaccatgatt acgaattcga gctc 24

<210> 25

<211> 51

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 25

gaccatgatt acgaattcgt ttttttggga attcacacac aggaggagct c 51

<210> 26

<211> 50

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 26

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Claims

1.一种生产1,5-戊二胺的方法，所述方法包括：

2)向培养基中加入相应的单糖。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述相应单糖的浓度是0.01％～1％w/v，优选0.05％～0.5％w/v。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，L-阿拉伯糖的浓度为0.16～0.5％w/v，优选是0.16～0.2％w/v，例如L-阿拉伯糖浓度是0.16％、0.2％、0.5％w/v。

4.根据权利要求2所述的方法，其中，D-木糖的浓度为0.16～0.5％w/v，优选是0.16～0.2％w/v，例如D-木糖浓度是0.16％、0.2％、0.5％w/v。

5.根据权利要求2所述的方法，其中，L-鼠李糖的浓度为0.05～0.5％w/v，优选是0.05～0.2％w/v，例如L-鼠李糖的浓度是0.05％、0.1％、0.16％、0.2％、0.5％w/v。

6.根据以上任一项权利要求所述的方法，其中，所述宿主细胞是微生物、植物或动物细胞。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述微生物是大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。

8.根据以上任一项权利要求所述的方法，其中，赖氨酸脱羧酶基因来自微生物、动物或植物的细胞，包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)、天蓝色链霉菌、蜂房哈夫尼菌、谷氨酸棒状杆菌或奥克西托克雷白杆菌(Klebsiella oxytoca)。

9.根据以上任一项权利要求所述的方法，其中，所述赖氨酸脱羧酶基因的序列为SEQID NO:4的序列或其编码具有赖氨酸脱羧酶活性的肽的变体或同源序列，例如与SEQ IDNO:4具有至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、85％、80％、75％、70％同源性的序列。

10.根据以上任一项权利要求所述的方法，其中，所述赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:3的序列或其具有赖氨酸脱羧酶活性的变体，例如与SEQ ID NO:3具有至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、85％、80％、75％、70％同源性且保持赖氨酸脱羧酶活性的序列。

11.根据以上任一项权利要求所述的方法，其中，赖氨酸脱羧酶基因序列上游的序列SEQ ID No:24替换为SEQ ID No:25。

12.根据以上任一项权利要求所述的方法，其中，L-阿拉伯糖调控元件的序列为SEQ IDNO:11，D-木糖调控元件包含序列为SEQ ID NO:14的木糖启动子和序列为SEQ ID NO:17的木糖调控蛋白编码基因及其核糖体结合位点，L-鼠李糖调控元件的序列为SEQ ID NO:20。

13.根据以上任一项权利要求所述的方法，其中，赖氨酸脱羧酶基因和L-阿拉伯糖调控元件包含在载体pCIB61中，赖氨酸脱羧酶基因和D-木糖调控元件包含在载体pCIB63中，赖氨酸脱羧酶基因和L-鼠李糖调控元件包含在载体pCIB64中。

14.根据以上任一项权利要求所述的方法，其中，基因工程化的宿主细胞是大肠杆菌E.coli BL21菌株，赖氨酸脱羧酶基因和L-阿拉伯糖调控元件包含在载体pCIB61中，赖氨酸脱羧酶基因和D-木糖调控元件包含在载体pCIB63中，赖氨酸脱羧酶基因和L-鼠李糖调控元件包含在载体pCIB64中，并且L-阿拉伯糖的浓度为0.16％、0.2％或0.5％w/v，D-木糖浓度是0.16％、0.2％或0.5％w/v，L-鼠李糖的浓度是0.05％、0.1％、0.16％、0.2％或0.5％w/v。