CN116323930A - 唾液酸化双糖及/或寡糖的细胞生产 - Google Patents

唾液酸化双糖及/或寡糖的细胞生产 Download PDF

Info

Publication number
CN116323930A
CN116323930A CN202180050169.6A CN202180050169A CN116323930A CN 116323930 A CN116323930 A CN 116323930A CN 202180050169 A CN202180050169 A CN 202180050169A CN 116323930 A CN116323930 A CN 116323930A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
udp
phosphate
sialylated
acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180050169.6A
Other languages
English (en)
Inventor
苏菲·艾萨尔特
乔立·毕普瑞兹
彼得·卡斯曼
汤马士·狄康
诺希卡·兰诺
葛特·彼得斯
克里斯多夫·凡德沃
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Inbiose NV
Original Assignee
Inbiose NV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from EP20190205.3A external-priority patent/EP3954769A1/en
Priority claimed from EP20190203.8A external-priority patent/EP3954778B1/en
Application filed by Inbiose NV filed Critical Inbiose NV
Publication of CN116323930A publication Critical patent/CN116323930A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1081—Glycosyltransferases (2.4) transferring other glycosyl groups (2.4.99)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/12—Disaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/85—Saccharomyces
    • C12R2001/865—Saccharomyces cerevisiae

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于合成生物学及代谢工程改造的技术领域。更特定言之，本发明属于代谢上经工程改造的细胞及所述细胞在培养或发酵中的用途的技术领域。本发明描述一种代谢上经工程改造的细胞及一种借由用该细胞培养或发酵生产唾液酸化双糖及/或寡糖的方法。该代谢上经工程改造的细胞包含用于生产该唾液酸化双糖及/或寡糖的途径，且经修饰以用于表现及/或过度表现编码一或多种催化相同化学反应的同功蛋白质的多个编码DNA序列。此外，本发明提供该唾液酸化双糖及/或寡糖自培养物的纯化。

Description

唾液酸化双糖及/或寡糖的细胞生产
技术领域
本发明属于合成生物学及代谢工程改造的技术领域。更特定言之，本发明属于代谢上经工程改造的细胞及所述细胞在培养或发酵中的用途的技术领域。本发明描述一种代谢上经工程改造的细胞及一种借由用该细胞培养或发酵生产唾液酸化双糖及/或寡糖的方法。该代谢上经工程改造的细胞包含用于生产该唾液酸化双糖及/或寡糖的途径，且经修饰以用于表现及/或过度表现编码一或多种催化相同化学反应的同功蛋白质的多个编码DNA序列。此外，本发明提供该唾液酸化双糖及/或寡糖自培养物的纯化。
背景技术
唾液酸化双糖及寡糖，通常以与蛋白质及脂质的糖结合形式存在，参与许多生命现象，诸如发育、分化、受精、胚胎发生、宿主病原体黏附及发炎。唾液酸化寡糖亦可以非结合聚糖形式存在于体液及哺乳动物乳中，其中唾液酸化寡糖在重要的发育及免疫过程中作为生物活性聚糖进行调节(Bode，Early Hum.Dev.2015，91(11)：619-622；Bode，NestleNutr.Inst.Workshop Ser.2019，90：191-201；Reily等人，Nat.Rev.Nephrol.2019，15：346-366；Varki，Glycobiology 2017，27：3-49；Walsh等人，J.Funct.Foods 2020，72：10474)。由于唾液酸化双糖及寡糖具有宽功能谱，因此存在针对其的巨大科学及商业兴趣。然而，唾液酸化双糖及/或寡糖的可用性受到限制，因为生产依赖于化学或化学酶合成，或依赖于自天然来源，例如动物乳纯化。化学合成方法为费力且耗时的，且由于所涉及的大量步骤，所述方法难以扩大规模。使用核苷酸活化糖及糖基转移酶的酶方法提供优于化学合成的许多优点。糖基转移酶催化糖部分自核苷酸活化糖供体转移至糖或非糖受体上(Coutinho等人，J.Mol.Biol.2003，328：307-317)。此等糖基转移酶为生物技术人员合成唾液酸化双糖及寡糖的来源，且用于(化学)酶方法以及基于细胞的生产系统两者中。然而，糖基转移酶的立体特异性及区位选择性仍为难对付的挑战。另外，化学酶方法需要原位再生核苷酸活化糖供体。唾液酸化双糖及寡糖的细胞生产需要紧密控制互补糖基转移酶附近足够含量的核苷酸活化糖供体的时空可用性。归因于此等困难，当前方法通常导致唾液酸化双糖及/或寡糖的小规模合成。
PEP或磷酸烯醇丙酮酸(phosphoenolpyruvate)为细胞合成代谢中的常见前驱物，且对于次级代谢物(诸如类黄酮、芳族氨基酸及唾液酸化双糖及寡糖或唾液酸化双糖及寡糖修饰的许多单糖次单元)的合成至关重要。此类单糖次单元为例如N-乙酰基神经氨酸、退伍军人菌氨酸(legionaminic acid)、酮去氧辛酸、酮-去氧-壬酮糖酸、伪氨酸(pseudaminic acid)、N，N′-二乙酰基-8-表退伍军人菌氨酸(epilegionaminate)、N-乙酰基-D-胞壁酸及其核苷酸及磷酸化衍生物。为了增强此等单糖次单元及唾液酸化双糖及/或寡糖的合成，可借助于若干基因的过度表现及缺失来增强细胞中的PEP浓度。
Zhu等人(Biotechnol.Lett.2017，39：227-234)已显示，借由过度表现PEP合酶(EC：2.7.9.2)及PEP羧激酶(EC：4.1.1.49)，N-乙酰基神经氨酸的合成与对照相比分别增加96.4％及61％，组合过度表现与对照相比进一步增加合成高达116.7％。Zhu等人(Biotechnol.Lett 2016，doi 10.1007/s10529-016-2215-z)已进一步显示缺失受质磷酸转移酶(phosphotransferase；PTS)系统，如大肠杆菌(E.coli)中由基因nagE编码的N-乙酰基葡萄糖胺PTS系统，使用PEPN-乙酰基葡萄糖胺(N-acetylglucosamine；GlcNAc)及葡萄糖胺(glucosamine；GlcN)输送及磷酸化至细胞中，或如大肠杆菌中由基因manX、manY及manZ编码的甘露糖PTS系统，使用PEP甘露糖、N-乙酰基甘露糖胺、葡萄糖、果糖、GlcN及GlcNAc输送及磷酸化至细胞中，显著增加Neu5Ac合成。后续亦在EP3697805及EP3575404中显示大肠杆菌中ppsA的上调有效，亦将ppsA过度表现与manXYZ及nagE的缺失组合。
Zhang等人(Biotech and Bioeng.2018，115(9)：217-2231)以类似方式改良枯草杆菌(Bacillus subtilis)中的PEP合成。缺失葡萄糖PTS系统以减少葡萄糖吸收后的PEP使用，缺失基因丙酮酸激酶(EC：2.7.1.40)以减少PEP消耗，且过度表现基因PEP羧激酶(EC：4.1.1.49)以增强通量朝向。为了补偿葡萄糖PTS系统的缺失，葡萄糖透过酶(glucosepermase)及葡萄糖激酶用于内化及磷酸化细胞中的葡萄糖。此外，引入苹果酸酶(EC：1.1.1.38，EC：1.1.1.39或EC：1.1.1.40)以增加自克氏循环(Krebs cycle)朝向丙酮酸，即PEP的前驱物的通量。减少的糖解及恩纳杜道夫途径(Entner-Doudoroffpathway)的引入进一步增强N-乙酰基神经氨酸的生产。注意，此等菌株在其基础上其乙酸及乳酸合成能力经修饰，此本质上引起PEP、丙酮酸及乙酰基-CoA的可用性改良。
Zhang等人(Biotech.Adv.2019，37：787-800)亦评述且描述可如何调节N-乙酰基神经氨酸及唾液酸化寡糖的前驱物。借由影响细胞中的PEP及丙酮酸可用性，增强朝向唾液酸化寡糖及N-乙酰基神经氨酸(或如上文所描述的其他单糖次单元)的通量。同样在此，描述缺失或减弱糖解途径(包含磷酸果糖激酶(phosphofructokinase；pfkA基因，E.C.：2.7.1.11)及丙酮酸激酶(pyruvate kinase；pyk，EC：2.7.1.40))及上调磷酸烯醇丙酮酸合酶基因(phosphoenolpyruvate synthasegene；ppsA，EC：2.7.9.2)的技术。引入或过度表现恩纳杜道夫途径及PTS活性降低进一步引起合成改良。所描述的系统不仅借由过度表现或缺失，而且借由经由生物感测器的动力控制来达成，所述生物感测器选择性上调及下调细胞生物化学中的反应。
本发明的一目标为提供工具及方法，借助于所述工具及方法，唾液酸化双糖及/或寡糖可借由细胞生产，且较佳地以一种高效、有时间效益及成本效益的方式生产，且所述工具及方法产生大量所需唾液酸化双糖及/或寡糖。
发明内容
根据本发明，此目标及其他目标借由提供一种细胞及一种用于生产唾液酸化双糖及/或寡糖的方法来达成，其中该细胞经用于生产该唾液酸化双糖及/或寡糖的途径代谢工程改造，且其中该细胞经能够表现及/或过度表现一或多种催化相同化学反应的蛋白质的多个编码DNA序列修饰。出人意料地，现已发现，代谢上经工程改造以用于生产唾液酸化双糖及/或寡糖的本发明细胞不因引入编码一或多种催化相同化学反应的蛋白质的多个编码DNA序列而遭受纯系不稳定性、纯系异质性或转殖基因静默。本发明细胞中所述多个编码DNA序列的引入及表现及/或过度表现较佳对该唾液酸化双糖及/或寡糖的发酵生产具有正面效果，且甚至更佳为，在所述序列用于代谢工程改造生产该唾液酸化双糖及/或寡糖的细胞时，当与具有相同遗传背景但缺少如本发明中所定义的所述多个编码DNA序列的细胞相比时，提供该细胞的较好产率、生产率、比生产率及/或生长速度。本发明亦提供一种用于生产唾液酸化双糖及/或寡糖的方法。该方法包含以下步骤：提供包含用于生产唾液酸化双糖及/或寡糖的途径的细胞，其中该细胞经编码一或多种催化相同化学反应的蛋白质的多个编码DNA序列修饰，及在允许生产该唾液酸化双糖及/或寡糖的条件下培养该细胞。由多个编码DNA序列编码的蛋白质尤其包含参与核苷酸活化糖合成的酶，其中该核苷酸活化糖将用于生产该唾液酸化双糖及/或寡糖，及膜运输蛋白。本发明亦提供分离该唾液酸化双糖及/或寡糖的方法。
定义
用于本说明书中以描述本发明的字组及其各种具体实例应不仅以其通常所定义的含义来理解，而且应包括在通常所定义含义的范围以外的在本说明书中特定定义的结构、材料或作用。因此，若元件在本说明书的上下文中可理解为包括多于一个含义，则其在申请专利范围中的使用必须理解为由本说明书及字组自身支持的一般至所有可能含义。
本文所揭示的本发明的各种具体实例及具体实例的态样应不仅以本说明书中特定描述的次序及情形来理解，而且包括任何次序及其任何组合。每当情形需要时，将认为以单数形式使用的所有字组包括复数形式，且反之亦然。除非另外规定，否则本文中所用的所有技术及科学术语一般具有与本发明所属技术领域中具有通常知识者通常所理解相同的含义。一般而言，本文所使用的命名法及本文所描述的细胞培养中的实验步骤、分子遗传学、有机化学及核酸化学及杂合为所属技术领域中熟知且常用的命名法、细胞培养中的实验步骤、分子遗传学、有机化学及核酸化学及杂合。使用标准技术进行核酸及肽合成。一般而言，酶反应及纯化步骤是根据制造商说明书进行。
在图式及本说明书中，已揭示本发明的具体实例，且尽管采用特定术语，但所述术语仅以描述性意义使用且并非出于限制本发明的范围的目的，本发明的范围阐述于以下申请专利范围中。必须理解，所说明的具体实例仅出于示例目的而阐述，且不应视为限制本发明。所属技术领域中具有通常知识者将显而易见，改变、其他具体实例、改良、细节及用途可与本文中本发明的文字及精神一致且在本发明的范围内作出，本发明的范围仅受申请专利范围限制，申请专利范围根据专利法解释，包括等同原则。在以下申请专利范围中，用于指定权利要求步骤的参考标号仅为便于描述而提供，且并不意欲暗示进行所述步骤的任何特定顺序。
在此文件及其申请专利范围中，动词「包含(to comprise)」及其词形变化形式以其非限制性意义使用，意谓包括该字组之后的项目，但不排除未具体提及的项目。在整个申请案中，动词「包含」可由「由……组成(to consist)」或「基本上由……组成(to consistessentially of)」替换，且反之亦然。另外，动词「由……组成」可由「基本上由……组成」替换，意谓如本文所定义的组成物可包含除具体鉴别的组分外的(多种)额外组分，该(等)额外组分不改变本发明的独特特征。另外，借由不定冠词「一(a或an)」提及一元件并不排除存在多于一个元件的可能性，除非上下文明确要求存在一个且仅存在一个元件。因此不定冠词「一」通常意谓「至少一个(at least one)」。在整个申请案中，除非另外明确陈述，否则冠词「一」较佳由「至少两个(at least two)」替换，更佳由「至少三个(at least three)」替换，甚至更佳由「至少四个(at least four)」替换，甚至更佳由「至少五个(at leastfive)」替换，甚至更佳由「至少六个(at least six)」替换，最佳由「至少七个(at leastseven)」替换。
在整个本申请案中，除非另外明确陈述，否则特征「合成(synthesize)」、「合成(synthesized)」及「合成(synthesis)」可分别与特征「生产(produce)」、「生产(produced)」及「生产(production)」互换地使用。
除非另外指示，否则如本文中鉴别的各具体实例可组合在一起。本说明书中所提及的所有公开案、专利及专利申请案均以引用的方式并入本文中，其引用的程度如同各个别公开案、专利或专利申请案经具体且个别地指示以引用的方式并入一般。优先权申请案，包括EP21168997、EP20190198、EP20190200、EP20190205的全部内容亦以引用的方式并入，其引用的程度如同所述优先权申请案具体且个别地指示以引用的方式并入一般。
根据本发明，术语「聚核苷酸(polynucleotide)」一般是指可为未修饰RNA或DNA或经修饰RNA或DNA的任何聚核糖核苷酸或聚去氧核糖核苷酸。「聚核苷酸」包括但不限于单股及双股DNA；为单股及双股区或单股、双股及三股区的混合物的DNA；单股及双股RNA；及为单股及双股区的混合物的RNA；包含可为单股或更通常双股或三股区、或单股及双股区的混合物的DNA及RNA的杂合分子。另外，如本文所用，「聚核苷酸」是指包含RNA或DNA或RNA及DNA两者的三股区。此类区中的股可来自相同分子或来自不同分子。所述区可包括一或多个分子的全部，但更通常仅涉及一些分子的区。三螺旋区的分子中的一者通常为寡核苷酸。如本文所用，术语「聚核苷酸」亦包括含有一或多个经修饰碱基的如上文所描述的DNA或RNA。因此，出于稳定性或其他原因主链经修饰的DNA或RNA为根据本发明的「聚核苷酸」。此外，包含不常见碱基(诸如肌苷)或经修饰碱基(诸如三苯甲基化碱基)的DNA或RNA应理解为由术语「聚核苷酸」涵盖。应了解，已对DNA及RNA进行多种修饰，此用于所属技术领域中具有通常知识者已知的许多适用目的。如本文所采用的术语「聚核苷酸」涵盖聚核苷酸的此类化学、酶或代谢修饰形式，以及病毒及细胞，包括例如简单及复杂细胞的DNA及RNA特征的化学形式。术语「聚核苷酸」亦涵盖通常称为寡核苷酸的短聚核苷酸。
「多肽(polypeptide)」是指包含两个或更多个借由肽键或经修饰肽键彼此接合的氨基酸的任何肽或蛋白质。「多肽」是指短链(通常称为肽、寡肽及寡聚物)及长链(通常称为蛋白质)两者。多肽可含有除20种基因编码的氨基酸以外的氨基酸。「多肽」包括借由自然过程(诸如加工及其他转译后修饰)以及借由化学修饰技术修饰的多肽。此类修饰充分描述于基本教材及更详细专论中以及大量研究文献中，且为所属技术领域中具有通常知识者所熟知。相同类型的修饰可在给定多肽中若干位点处以相同或不同程度存在。此外，给定多肽可含有多种类型的修饰。修饰可发生在多肽中的任何位置，包括肽主链、氨基酸侧链及氨基端或羧基端。修饰包括例如乙酰化、酰化、ADP核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血基质部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、双硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、焦麸氨酸的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚定物形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、脂质连接、硫酸化、麸氨酸残基的γ-羧化、羟基化及ADP核糖基化、硒化、转移RNA介导的向蛋白质添加氨基酸，诸如精胺酰化，及泛素化。多肽可为分支链的，或为环状，具有或不具有分支。环状、分支链及分支链环状多肽可由转译后自然过程产生，且亦可借由完全合成方法制备。
「经分离(isolated)」意谓自天然状态「人工(by the hand of man)」改变，亦即若其存在于自然界中，则其自其原始环境改变或移除或两者。举例而言，天然存在于活生物体中的聚核苷酸或多肽未「经分离」，但与其天然状态的共存物质分离的相同聚核苷酸或多肽「经分离」，如该术语在本文中所用。类似地，如本文所用的术语「合成(synthetic)」序列意谓已合成产生且不直接自天然来源分离的任何序列。如本文所用的术语「合成(synthesized)」意谓任何合成产生的序列且不直接自天然来源分离。
「重组(recombinant)」意谓借由将来自一种物种的基因移植或剪接至不同物种的宿主生物体的细胞中来制备的经基因工程改造的DNA。此类DNA成为宿主基因组成的一部分且经复制。
在本发明的上下文内，术语「内源(endogenous)」是指任何作为细胞的天然部分且存在于其在细胞染色体中的天然位置处且与作用于其表现的天然控制机制相比，表现的控制尚未改变的聚核苷酸、多肽或蛋白质序列。术语「外源(exogenous)」是指任何来源于研究下的细胞的外部且不来源于细胞的天然部分或不存在于其在细胞染色体或质体中的天然位置处的聚核苷酸、多肽或蛋白质序列。
当提及聚核苷酸、基因、核酸、多肽或酶使用时，术语「异源(heterologous)」是指来自宿主生物体物种的外的源或衍生自宿主生物体物种的外的源的聚核苷酸、基因、核酸、多肽或酶。相反，本文使用「同源(homologous)」聚核苷酸、基因、核酸、多肽或酶表示衍生自宿主生物体物种的聚核苷酸、基因、核酸、多肽或酶。当提及基因调节序列或用于维持或操纵基因序列的辅助核酸序列(例如启动子、5′非转译区、3′非转译区、聚A添加序列、内含子序列、剪接位点、核糖体结合位点、内部核糖体进入序列、基因体同源区、重组位点等)时，“异源”意谓调节序列或辅助序列不与调节或辅助核酸序列在构筑体、基因体、染色体或游离基因体中并置的基因天然相关。因此，可操作地连接于在天然状态下(亦即在非基因工程改造生物体的基因体中)不与启动子可操作连接的基因的启动子在本文中称为「异源启动子(heterologous promoter)」，即使该启动子可衍生自与其连接的基因相同的物种(或在一些情况下，相同的生物体)。
如本文所用，术语「编码多肽的聚核苷酸(polynucleotide encoding apolypeptide)」涵盖包括编码本发明多肽的序列的聚核苷酸。术语亦涵盖包括编码多肽的单个连续区或非连续区(例如间杂有整合噬菌体或插入序列或编辑)以及亦可含有编码及/或非编码序列的额外区的聚核苷酸。
术语基因的「经修饰表现(modified expression)」是指在所需唾液酸化双糖及/或寡糖的生产过程的任何阶段中，与该基因的野生型表现相比的表现变化。该经修饰表现与野生型相比为较低或较高表现，其中术语「较高表现(higher expression)」亦定义为在内源基因情况下该基因的「过度表现(overexpression)」，或在不存在于野生型菌株中的异源基因情况下的「表现(expression)」。较低表现借助于所属技术领域中具有通常知识者的常见熟知技术(诸如使用siRNA、CrispR、CrispRi、核糖开关、重组工程、同源重组、ssDNA突变诱发、RNAi、miRNA、asRNA、突变基因、剔除基因、转位子突变诱发……)而获得，所述技术用于以使基因生产功能性最终产物的能力减弱(亦即与功能性野生型基因相比，统计显著『能力减弱』)或完全不能生产功能性最终产物(诸如剔除基因)的方式改变基因。如本文所用，术语「核糖开关(riboswitch)」定义为信使RNA的一部分，其折叠成借由干扰转译而阻断表现的错综复杂的结构。效应分子的结合诱导构形变化，允许转录后的调节表现。过度表现或表现借助于所属技术领域中具有通常知识者的常见熟知技术(诸如使用人工转录因子、从头设计启动子序列、核糖体工程改造、在常染色质处引入或再引入表现模组、使用高复制数质体)而获得，其中该基因为「表现卡匣(expression cassette)」的一部分，表现卡匣是指任何序列，其中存在启动子序列、非转译区序列(含有核糖体结合序列或科札克序列(Kozak sequence))、编码序列(例如N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶)及视情况选用的转录终止子，且引起功能性活性蛋白的表现。该表现为持续性或条件性或调节或可调的。
术语「持续性表现(constitutive expression)」定义为在某些生长条件下不受除RNA聚合酶的次单元(例如细菌σ因子)外的转录因子调节的表现。此类转录因子的非限制性实例为大肠杆菌中的CRP、LacI、ArcA、Cra、IclR，或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的Aft2p、Crz1p、Skn7，或枯草杆菌(B.subtilis)中的DeoR、GntR、Fur。此等转录因子结合于特定序列上且可在某些生长条件下阻断或增强表现。RNA聚合酶为用于自DNA模板合成RNA的催化机构。RNA聚合酶结合特定序列以起始转录，例如经由原核宿主中的σ因子或经由酵母中的MTF1。持续性表现在不需要诱导或抑制的情况下提供恒定表现量。
术语「调节表现(regulated expression)」定义为在某些生长条件下受除RNA聚合酶的次单元(例如与RNA聚合酶核心酶共缔合的细菌σ因子，如σ70、σ54或相关σ因子，及酵母粒线体RNA聚合酶特异性因子MTF1)外的转录因子调节的表现。此类转录因子的实例描述于上文。通常表现调节借助于以下者获得：诱导因子，诸如但不限于IPTG、阿拉伯糖、鼠李糖、岩藻糖、别乳糖(allo-lactose)，或pH变化，或温度变化，或碳耗乏或受质或生产的产物。
术语「控制序列(control sequence)」是指借由宿主细胞转录及转译系统识别的序列，允许聚核苷酸序列转录及转译成多肽。因此，此类DNA序列为在特定宿主细胞或生物体中表现可操作地连接的编码序列所需。此类控制序列可为但不限于启动子序列、核糖体结合序列、夏因达尔加诺序列(Shine Dalgarno sequence)、科札克序列、转录终止子序列。适用于原核生物的控制序列例如包括启动子、视情况选用的操纵序列及核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号及增强子。若前序列或分泌性前导序列的DNA表现为参与多肽分泌的前蛋白，则其可与该多肽的DNA可操作地连接；若启动子或增强子影响编码序列的转录，则其与该序列可操作地连接；或若核糖体结合位点影响编码序列的转录，则其与该序列可操作地连接；或若核糖体结合位点经定位以便促进转译，则其与编码序列可操作地连接。所述控制序列另外可经由诱导型启动子或经由诱导或抑制该聚核苷酸转录或转译成多肽的遗传回路，经外部化学物质，诸如但不限于IPTG、阿拉伯糖、乳糖、别乳糖、鼠李糖或岩藻糖控制。
一般而言，「可操作地连接(operably linked)」意谓所连接的DNA序列为连续的且在分泌性前导序列的情况下，为连续的且处于阅读阶段。然而，增强子不必为连续的。
术语「野生型(wild type)」是指其在自然界中存在时通常已知的遗传或表型情况。
如本文所用，术语「蛋白质的经修饰表现或活性(modified expression oractivity of a protein)」是指i)内源蛋白的较高表现或过度表现，ii)异源蛋白的表现或iii)与野生型(亦即天然)蛋白质相比，具有较高活性的变异蛋白的表现及/或过度表现。
如本文所用，术语「乳腺细胞(mammary cell)」大体上是指乳腺上皮细胞、乳腺上皮管腔细胞或哺乳动物上皮肺泡细胞或其任何组合。如本文所用，术语「类乳腺细胞(mammary-like cell)」大体上是指具有类似于(或实质上类似于)天然乳腺细胞但衍生自非乳腺细胞来源的表型/基因型的细胞。此类的类乳腺细胞可经工程改造以移除至少一个非所需遗传组件及/或包括至少一个乳腺细胞典型的预定遗传构筑体。类乳腺细胞的非限制性实例可包括类乳腺上皮细胞、类乳腺上皮管腔细胞、展现乳腺细胞谱系的细胞的一或多种特征的非乳腺细胞或其任何组合。类乳腺细胞的进一步非限制性实例可包括具有类似于(或实质上类似于)天然乳腺细胞的表型，或更特定言之类似于(或实质上类似于)天然乳腺上皮细胞的表型的细胞。具有类似于(或实质上类似于)天然乳腺细胞或乳腺上皮细胞的表型，或展现至少一种类似于(或实质上类似于)天然乳腺细胞或乳腺上皮细胞的特征的细胞可包含展现天然或已经工程改造以能够表现至少一种乳组分的细胞(例如衍生自乳腺细胞谱系或非乳腺细胞谱系)。
如本文所用，术语「非乳腺细胞(non-mammary cell)」一般可包括任何非乳腺谱系的细胞。在本发明的上下文中，非乳腺细胞可为能够经工程改造以表现至少一种乳组分的任何哺乳动物细胞。此类非乳腺细胞的非限制性实例包括肝细胞、血细胞、肾细胞、脐带血细胞、上皮细胞、表皮细胞、肌细胞、纤维母细胞、间叶细胞或其任何组合。在一些情况下，分子生物学及基因体编辑技术可经工程改造以同时消除、静默或减弱无数基因。
在整个本申请案中，除非另外明确陈述，否则表述「能够……＜动词＞(capableof...＜verb＞)」及「能够……＜动词＞(capable to…＜verb＞)」较佳地用该动词的主动语态替换，且反之亦然。举例而言，表述「能够表现(capable of expressing)」较佳地用「表现(express)」替换，且反之亦然，亦即「表现」较佳地用「能够表现」替换。
如本文所用，术语「变异体(variant)」为分别与参考聚核苷酸或多肽不同但保持基本特性的聚核苷酸或多肽。聚核苷酸的典型变异体与另一参考聚核苷酸在核苷酸序列方面不同。变异体的核苷酸序列的变化可能会或可能不会改变由参考聚核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。如下文所论述，核苷酸变化可能在参考序列编码的多肽中引起氨基酸取代、添加、缺失、融合及截断。多肽的典型变异体与另一参考多肽在氨基酸序列方面不同。通常，差异是有限的，以致参考多肽的序列与变异体的序列总体上十分相似且在许多区中一致。借由呈任何组合的一或多个取代、添加、缺失，变异体与参考多肽可在氨基酸序列方面不同。取代或插入的氨基酸残基可为或可不为由遗传密码编码的残基。聚核苷酸或多肽的变异体可为天然产生的，诸如对偶基因变异体，或其可为未已知为天然产生的变异体。聚核苷酸及多肽的非天然产生变异体可借由突变诱发技术、借由直接合成及借由所属技术领域中具有通常知识者已知的其他重组方法制得。
在一些具体实例中，本发明考虑借由修饰如本发明中所用的所关注蛋白质的结构来制备功能变异体。变异体可借由氨基酸取代、缺失、添加或其组合产生。举例而言，可合理地预期，白氨酸用异白氨酸或缬氨酸的独立置换、天冬氨酸用麸氨酸的独立置换、苏氨酸用丝氨酸的独立置换或氨基酸用结构上相关的氨基酸的类似置换(例如保守突变)不会对所得分子的生物活性产生重大影响。保守置换为在侧链相关的氨基酸家族内发生的置换。借由评定变异多肽以类似于野生型多肽的方式在细胞中产生反应的能力，可容易地确定本发明的多肽的氨基酸序列的变化是否产生功能同源物。
如本文所用，术语「功能同源物(functional homolog)」描述具有序列相似性且亦共有至少一种功能特征，诸如生物化学活性的彼等分子。更特定言之，如本文所用之术语「功能同源物」描述具有序列相似性(换言之，同源性)且同时具有至少一种功能相似性，诸如生物化学活性的彼等蛋白质(Altenhoff等人，PLoS Comput.Biol.8(2012)e1002514)。
功能同源物有时称为异种同源物，其中「异种同源物(ortholog)」是指作为另一物种中所参考的基因或蛋白质的功能等效物的同源基因或蛋白质。功能同源物典型地将产生类似但未必相同程度的相同特征。功能上同源的蛋白质产生相同特征，其中借由一种同源物产生的定量量测值为另一者的至少10％；更典型地，为由原始分子产生的定量量测值的至少20％，在约30％与约40％之间；例如在约50％与约60％之间；在约70％与约80％之间；或在约90％与约95％之间；在约98％与约100％之间，或大于100％。因此，在分子具有酶活性的情况下，功能同源物将具有与原始酶相比以上所列举的酶活性百分比。在分子为DNA结合分子(例如多肽)的情况下，与原始分子相比，如借由结合分子的重量所量测，同源物将具有结合亲和力的以上所列举百分比。
功能同源物及参考多肽可为天然产生的多肽，且序列相似性可归因于趋同或趋异进化事件。
可借由分析核苷酸及多肽序列比对来鉴别功能同源物。举例而言，对核苷酸或多肽序列的资料库执行查询可鉴别例如生物质调节多肽、糖基转移酶、参与核苷酸活化糖合成的蛋白质或膜运输蛋白。序列分析可涉及分别使用生物质调节多肽、糖基转移酶、参与核苷酸活化糖合成的蛋白质或膜运输蛋白的氨基酸序列作为参考序列对非冗余资料库进行BLAST、相互BLAST或PSI-BLAST分析。在一些情况下，氨基酸序列是自核苷酸序列推导出。典型地，资料库中具有超过40％序列一致性的彼等多肽为进一步评估是否适合分别作为生物质调节多肽、糖基转移酶、参与核苷酸活化糖合成的蛋白质或膜运输蛋白的候选物。氨基酸序列相似性允许保守氨基酸取代，诸如一个疏水性残基取代另一个或一个极性残基取代另一个。较佳地，借由保守取代，意指以下组合，诸如甘氨酸借由丙氨酸取代，且反之亦然；缬氨酸、异白氨酸及白氨酸借由甲硫氨酸取代，且反之亦然；天冬氨酸借由麸氨酸取代，且反的亦然；天冬酰胺借由麸酰氨酸取代，且反之亦然；丝氨酸借由苏氨酸取代，且反之亦然；离氨酸借由精氨酸取代，且反之亦然；半胱氨酸借由甲硫氨酸取代，且反之亦然；及苯丙氨酸及酪氨酸借由色氨酸取代，且反之亦然。视需要，可进行此类候选物的人工检验以便限制待进一步评估的候选物的数目。视需要，可进行此类候选物的人工检验以便限制待进一步评估的候选物的数目。人工检验可借由选择似乎具有存在于生产力调节多肽中的域(例如保守功能域)的彼等候选物来进行。
域可例如借由Pfam(El-Gebali等人，Nucleic Acids Res.47(2019)D427-D432)、InterPro域(InterPro domain；IPR)(Mitchell等人，Nucleic Acids Res.47(2019)D351-D360)、蛋白质指纹域(PRINTS)(Attwood等人，Nucleic Acids Res.31(2003)400-402)、SUBFAM域(Gough等人，J.Mol.Biol.313(2001)903-919)、TIGRFAM域(Selengut等人，Nucleic Acids Res.35(2007)D260-D264)、保守域资料库(Conserved Domain Database；CDD)名称(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)(Lu等人，Nucleic Acids Res.48(2020)D265-D268)、PTHR域(http：//www.pantherdb.org)(Mi等人，Nucleic Acids.Res.41(2013)D377-D386；Thomas等人，Genome Research 13(2003)2129-2141)或PATRIC标识符或PATRICDB全球家族域(https：//www.patricbrc.org/)(Davis等人，Nucleic Acids Res.48(D1)(2020)D606-D612)定性。所属技术领域中具有通常知识者应理解，对于本文所用的包含Pfam 32.0(2018年9月发布)、CDD v3.17(2019年4月3日发布)、eggnogdb 4.5.1(2016年9月发布)、InterPro 75.0(2019年7月4日发布)、TCDB(2019年6月17日发布)及PATRIC 3.6.9(2020年3月发布)的资料库，各资料库之内容在各发布版本中为固定的且不会改变。当特定资料库的内容改变时，此特定资料库接收具有新的发布日期的新的发布版本。各资料库的所有发布版本及其对应发布日期及如在此等特定发布日期标注的特定内容均为可获得的且为所属技术领域中具有通常知识者已知。
在整个申请案中，聚核苷酸序列可由SEQ ID NO或可替代地由GenBank NO表示。因此，除非另外明确陈述，否则术语「聚核苷酸SEQ ID NO(polynucleotide SEQ ID NO)」及「聚核苷酸GenBank NO.(polynucleotide GenBank NO.)」可互换使用。
在整个申请案中，多肽序列可由SEQ ID NO或可替代地由UniProt ID或GenBankNO表示。因此，除非另外明确陈述，否则术语「多肽SEQ ID NO(polypeptide SEQ ID NO)」及「多肽UniProtID(polypeptide UniProt ID)」及「多肽GenBank NO.(polypeptideGenBank NO.)」可互换使用。
如本文所用，术语f同功蛋白质(isoprotein)」是指具有相似结构及功能特性、催化相同化学反应的密切相关酶或蛋白质的任何家族。
如本文所用，术语「化学反应(chemical reaction)」是指一或多种物质，亦即反应物，分别转化或易位至一或多种不同物质或位置、产物或细胞位置的过程。物质为化学元素或化合物。化学反应重排或运输反应物的组成原子或分子以产生不同物质作为产物，或将原子或分子易位至细胞质或细胞外空间。此类化学反应的实例为生物化学、酶、有机化学、无机化学、生物催化及代谢反应，或为包含输入、流出、分泌及排泄反应的运输反应。
在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语「一致(identical)」或「一致性百分比(percentidentity)」或「一致性％(％identity)」是指当出于最大对应性比较及比对时，如使用序列比较算法或借由目视检验所量测，两个或更多个序列或子序列相同或具有相同核苷酸或氨基酸残基的指定百分比。对于序列比较，一个序列充当参考序列，将测试序列与其比较。当使用序列比较算法时，将测试序列及参考序列输入至电脑中，必要时指定子序列座标，且指定序列算法程序参数。接着，序列比较算法根据所指定的程序参数来计算测试序列相对于参考序列的序列一致性百分比。可在参考序列的全长序列内全域计算一致性百分比，得到整体一致性百分比评分。或者，可在参考序列的部分序列内计算一致性百分比，得到局部一致性百分比评分。在局部序列比对中使用参考序列的全长产生测试与参考序列之间的整体一致性百分比评分。
一致性百分比可使用不同算法如例如BLAST及PSI-BLAST(Altschul等人，1990，JMol Biol 215：3，403-410；Altschul等人，1997，Nucleic Acids Res 25：17，3389-402)、Clustal Omega方法(Sievers等人，2011，Mol.Syst.Biol.7：539)、MatGAT方法(Campanella等人，2003，BMC Bioinformatics，4：29)或EMBOSS Needle测定。
基本局部比对检索工具(Basic Local Alignment Search Tool；BLAST)比对方法为由国家生物技术资讯中心(National Center for Biotechnology Information；NCBI)提供以使用预设参数比较序列的算法。程序将核苷酸或蛋白质序列与序列资料库比较且计算统计显著性。位置特异性叠代基本局部比对检索工具(Position-Specific IterativeBasic Local Alignment Search Tool；PSI-BLAST)使用蛋白质-蛋白质BLAST(BLASTp)自侦测超过给定评分临限值的序列的多个序列比对导出位置特异性评分矩阵(position-specific scoring matrix；PSSM)或概况。BLAST方法可用于成对或多序列比对。成对序列比对用于鉴别具有相似性的区，其可以指示两个生物序列(蛋白质或核酸)之间的功能、结构及/或进化关系。BLAST的网页介面可在以下获得：https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi。
Clustal Omega(ClustalΩ)为一种使用种子导引树及HMM概况-概况技术以在三个或更多个序列之间产生比对的多序列比对程序。其产生发散序列的生物学上有意义的多序列比对。ClustalΩ的网页介面可在https：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/下获得。使用ClustalΩ方法进行多序列比对及蛋白质序列一致性百分比计算的预设参数为：启用输入序列的去比对：FALSE；启用mbed类集群引导树：TRUE；启用mbed类集群迭代：TRUE；(组合引导树/HMM)迭代的数目：预设(0)；最大引导树迭代：预设[-1]；最大HMM叠代：预设[-1]；命令：比对。
矩阵全域比对工具(Matrix Global Alignment Tool；MatGAT)为一种在不需要预比对资料的情况下产生DNA或蛋白质序列的相似性/一致性矩阵的电脑应用。程序使用迈尔斯及米勒全域比对算法(Myers and Miller global alignment algorithm)进行一系列成对比对，计算相似性及一致性，且接着将结果置于距离矩阵中。使用者可以指定采用何种类型的比对矩阵(例如BLOSUM50、BLOSUM62及PAM250)进行其蛋白质序列检查。
当考虑到两个序列的整个长度时，EMBOSS Needle(https：//galaxy-iuc.github.io/emboss-5.0-docs/needle.html)使用尼德曼-翁施(Needleman-Wunsch)全局比对算法寻找两个序列的最佳比对(包括空位)。借由动态程序化方法借由探究所有可能的比对且选择最佳比对来确保最佳比对。尼德曼-翁施算法为一类算法的成员，其可按mn步骤的次序计算最佳评分及比对(其中『n』及『m』为两个序列的长度)。空位开放罚分(预设10.0)为当产生空位时所扣除的分数。预设值假设您将EBLOSUM62矩阵用于蛋白质序列。空位延伸(预设0.5)罚分被添加至空位中的每一碱基或残基的标准空位罚分。此为惩罚长空位的方式。
如本文所用，与参考多肽序列的全长序列具有至少80％序列一致性的氨基酸序列的多肽应理解为与参考多肽序列的氨基酸序列全长具有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、91.50％、92.00％、92.50％、93.00％、93.50％、94.00％、94.50％、95.00％、95.50％、96.00％、96.50％、97.00％、97.50％、98.00％、98.50％、99.00％、99.50％、99.60％、99.70％、99.80％、99.90％、100％序列一致性的序列。在整个申请案中，除非另外明确指定，否则包含与参考多肽(或核苷酸序列)的全长氨基酸序列(或核苷酸序列)具有至少80％序列一致性的氨基酸序列(或核苷酸序列)的多肽(或DNA序列)/由与参考多肽(或核苷酸序列)的全长氨基酸序列(或核苷酸序列)具有至少80％序列一致性的氨基酸序列(或核苷酸序列)的多肽(或DNA序列)组成/具有与参考多肽(或核苷酸序列)的全长氨基酸序列(或核苷酸序列)具有至少80％序列一致性的氨基酸序列(或核苷酸序列)的多肽(或DNA序列)，通常用SEQ ID NO或UniProt ID或Genbank NO.指示，与全长参考序列较佳具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，更佳具有至少85％，甚至更佳具有至少90％，最佳具有至少95％的序列一致性。
出于本发明的目的，一致性百分比是使用MatGAT2.01(Campanella等人，2003，BMCBioinformatics 4：29)来测定。采用针对蛋白质的以下预设参数：(1)空位成本存在：12及延伸：2；(2)所用矩阵为BLOSUM65。在一个较佳具体实例中，序列一致性是基于给定SEQ IDNO，亦即参考序列的全长序列或其部分计算。其部分较佳意谓完整参考序列的至少50％、60％、70％、80％、90％或95％。
术语「唾液酸(sialic acid)」、「N-乙酰基神经氨酸(N-acetylneuraminate)」「N-酰基神经氨酸(N-acylneuraminate)」、「N-乙酰基神经氨酸(N-acetylneuraminic acid)」可互换使用且是指具有包含但不限于以下者的九碳主链的酸糖：Neu4Ac；Neu5Ac；Neu4，5Ac2；Neu5，7Ac2；Neu5，8Ac2；Neu5，9Ac2；Neu4，5，9Ac3；Neu5，7，9Ac3；Neu5，8，9Ac3；Neu4，5，7，9Ac4；Neu5，7，8，9Ac4，Neu4，5，7，8，9Ac5及Neu5Gc。
Neu4Ac亦称为4-O-乙酰基-5-氨基-3，5-双去氧-D-甘油-D-半乳-壬-2-酮哌喃糖酸或4-O-乙酰基神经氨酸且具有C11H19NO9作为分子式。Neu5Ac亦称为5-乙酰氨基-3，5-双去氧-D-甘油-D-半乳-壬-2-酮哌喃糖酸、D-甘油-5-乙酰氨基-3，5-双去氧-D-半乳-壬-2-酮-哌喃糖酸、5-(乙酰基氨基)-3，5-双去氧-D-甘油-D-半乳-2-壬酮哌喃糖酸、5-(乙酰基氨基)-3，5-双去氧-D-甘油-D-半乳-2-壬酮糖酸、5-(乙酰基氨基)-3，5-双去氧-D-甘油-D-半乳-壬-2-壬酮糖酸或5-(乙酰基氨基)-3，5-双去氧-D-甘油-D-半乳-壬-2-酮哌喃糖酸且具有C11H19NO9作为分子式。Neu4，5Ac2亦称为N-乙酰基-4-O-乙酰基神经氨酸、4-O-乙酰基-N-乙酰基神经氨酸、4-O-乙酰基-N-乙酰基神经氨酸、4-乙酸5-乙酰氨基-3，5-双去氧-D-甘油-D-半乳-壬酮糖酸、4-乙酸5-(乙酰基氨基)-3，5-双去氧-D-甘油-D-半乳-2-壬酮糖酸、4-乙酸5-乙酰氨基-3，5-双去氧-D-甘油-D-半乳-壬酮糖酸或4-乙酸5-(乙酰基氨基)-3，5-双去氧-D-甘油-D-半乳-2-壬酮糖酸且具有C13H21NO10作为分子式。Neu5，7Ac2亦称为7-O-乙酰基-N-乙酰基神经氨酸、N-乙酰基-7-O-乙酰基神经氨酸、7-O-乙酰基-N-乙酰基神经氨酸、7-乙酸5-乙酰氨基-3，5-双去氧-D-甘油-D-半乳-壬酮糖酸、7-乙酸5-(乙酰基氨基)-3，5-双去氧-D-甘油-D-半乳-2-壬酮糖酸、7-乙酸5-乙酰氨基-3，5-双去氧-D-甘油-D-半乳-壬酮糖酸或7-乙酸5-(乙酰基氨基)-3，5-双去氧-D-甘油-D-半乳-2-壬酮糖酸且具有C13H21NO10作为分子式。Neu5，8Ac2亦称为5-n-乙酰基-8-o-乙酰基神经氨酸且具有C13H21NO10作为分子式。Neu5，9Ac2亦称为N-乙酰基-9-O-乙酰基神经氨酸、9-凤梨，9-O-乙酰基唾液酸、9-O-乙酰基-N-乙酰基神经氨酸、5-n-乙酰基-9-O-乙酰基神经氨酸、N，9-O-二乙酰基神经氨酸或N，9-O-二乙酰基神经氨酸且具有C13H21NO10作为分子式。Neu4，5，9Ac3亦称为5-N-乙酰基-4，9-二-O-乙酰基神经氨酸。Neu5，7，9Ac3亦称为5-N-乙酰基-7，9-二-O-乙酰基神经氨酸。Neu5，8，9Ac3亦称为5-N-乙酰基-8，9-二-O-乙酰基神经氨酸。Neu4，5，7，9Ac4亦称为5-N-乙酰基-4，7，9-三-O-乙酰基神经氨酸。Neu5，7，8，9Ac4亦称为5-N-乙酰基-7，8，9-三-O-乙酰基神经氨酸。Neu4，5，7，8，9Ac5亦称为5-N-乙酰基-4，7，8，9-四-O-乙酰基神经氨酸。Neu5Gc亦称为N-羟乙酰基-神经氨酸、N-羟乙酰基神经氨酸、N-羟乙酰基神经氨酸、N-羟乙酰基-神经氨酸、N-羟乙酰基-神经氨酸、N-羟乙酰基神经氨酸、3，5-双去氧-5-((羟基乙酰基)氨基)-D-甘油-D-半乳-2-壬酮糖酸、3，5-双去氧-5-(羟乙酰基氨基)-D-甘油-D-半乳-2-壬酮哌喃糖酸、3，5-双去氧-5-(羟乙酰基氨基)-D-甘油-D-半乳-壬-2-酮哌喃糖酸、3，5-双去氧-5-[(羟基乙酰基)氨基]-D-甘油-D-半乳-壬-2-酮哌喃糖酸、D-甘油-5-羟乙酰基酰氨基-3，5-双去氧-D-半乳-壬-2-酮-哌喃糖酸且具有C11H19NO10作为分子式。
如本文所用的术语「NeunAc合酶(NeunAc synthase)、「N-乙酰基神经氨酸合酶(N-acetylneuraminic acid synthase)」、「N-乙酰基神经氨酸合酶(N-acetylneuraminatesynthase)」、「唾液酸合酶(sialic acid synthase)」、「NeuAc合酶(NeuAc synthase)」、「NeuB」、「NeuB1」、「NeuNAc合酶(NeuNAc synthase)」、「NANA缩合酶(NANA condensingenzyme)」、「N-乙酰基神经氨酸解离酶合酶(N-acetylneuraminate lyase synthase)」、「N-乙酰基神经氨酸缩合酶(N-acetylneuraminic acid condensing enzyme)」可互换使用且是指能够在反应中使用磷酸烯醇丙酮酸(phosphoenolpyruvate；PEP)自N-乙酰基甘露糖胺(N-acetylmannosamine；ManNAc)合成唾液酸的酶。
如本文所用的术语「CMP-唾液酸合酶(CMP-sialic acid synthase)」、「N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶(N-acylneuraminate cytidylyltransferase)」、「CMP-唾液酸合酶(CMP-sialate synthase)」、「CMP-NeuAc合酶(CMP-NeuAc synthase)」、「NeuA」及「CMP-N-乙酰基神经氨酸合酶(CMP-N-acetylneuraminic acid synthase)」可互换使用且是指能够在反应中使用CTP自N-乙酰基神经氨酸合成CMP-N-乙酰基神经氨酸的酶。
如本文所用的术语「N-酰基神经氨酸-9-磷酸合成酶(N-acylneuraminate-9-phosphate synthetase)」、「NANA合酶(NANA synthase)」、「NANAS」、「NANS」、「NmeNANAS」、「N-乙酰基神经氨酸丙酮酸解离酶(丙酮酸磷酸化)(N-acetylneuraminate pyruvate-lyase(pyruvate-phosphorylating))」可互换使用且是指能够在反应中使用磷酸烯醇丙酮酸(PEP)自N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸(ManNAc-6-磷酸)合成N-酰基神经氨酸-9-磷酸的酶。
术语「N-酰基神经氨酸-9-磷酸酶(N-acylneuraminate-9-phosphatase)」是指能够使N-酰基神经氨酸-9-磷酸去磷酸化以合成N-酰基神经氨酸的酶。
N-酰基葡萄糖胺2-表异构酶为催化反应N-酰基-D-葡萄糖胺＝N-酰基-D-甘露糖胺的酶。此酶的替代名称包含N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶、N-乙酰基-D-葡萄糖胺2-表异构酶、GlcNAc 2-表异构酶及N-酰基-D-葡萄糖胺2-表异构酶。
UDP-N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶为催化反应N-乙酰基-D-葡萄糖胺＝N-乙酰基甘露糖胺的酶。此酶的替代名称包含UDP-N-酰基葡萄糖胺2-表异构酶、UDP-GlcNAc-2-表异构酶及UDP-N-乙酰基-D-葡萄糖胺2-表异构酶。
N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶为催化反应N-乙酰基-D-葡萄糖胺6-磷酸＝N-乙酰基-D-甘露糖胺6-磷酸的酶。
双官能UDP-GlcNAc 2-表异构酶/激酶为催化反应UDP-N-乙酰基-D-葡萄糖胺＝N-乙酰基-D-甘露糖胺及反应N-乙酰基-D-甘露糖胺+ATP＝ADP+N-乙酰基-D-甘露糖胺6-磷酸的双官能酶。
术语「N-乙酰基神经氨酸解离酶(N-acetylneuraminate lyase)」、「Neu5Ac解离酶(Neu5Ac lyase)」、「N-乙酰基神经氨酸丙酮酸解离酶(N-acetylneuraminate pyruvate-lyase)」、「N-乙酰基神经氨酸醛缩酶(N-acetylneuraminic acid aldolase)」、「NAL酶(NALase)」、「唾液酸解离酶(sialate lyase)」、「唾液酸醛缩酶(sialic acidaldolase)」、「唾液酸解离酶(sialic acid lyase)」及「nanA」可互换使用且是指将N-乙酰基神经氨酸降解为N-乙酰基甘露糖胺(ManNAc)及丙酮酸的酶。
术语「N-乙酰基神经氨酸激酶(N-acetylneuraminate kinase)」、「ManNAc激酶(ManNAc kinase)」、「N-乙酰基-D-甘露糖胺激酶(N-acetyl-D-mannosamine kinase)」及「nanK」可互换使用且是指使ManNAc磷酸化以合成N-乙酰基甘露糖胺-磷酸(ManNAc-6-P)的酶。
术语「ManNAc-6-P异构酶(ManNAc-6-P isomerase)」、「ManNAc-6-P 2-表异构酶(ManNAc-6-P 2-epimerase)」及「nanE」可互换使用且是指将ManNAc-6-P转化为N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸(GlcNAc-6-P)的酶。
术语「N-乙酰基葡萄糖胺-6-P脱乙酰基酶(N-acetylglucosamine-6-Pdeacetylase)」及「nagA」可互换使用且是指催化N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸(GlcNAc-6-P)的N-乙酰基的水解以产生葡萄糖胺-6-磷酸(GlcN6P)及乙酸的酶。
术语「葡萄糖胺-6-P脱胺酶(glucosamine-6-P deaminase)」、「GlcN6P脱胺酶(GlcN6P deaminase)」、「葡萄糖胺-6-磷酸异构酶(glucosamine-6-phosphateisomerase)」、「glmID」及「nagB」可互换使用且是指催化葡萄糖胺-6-磷酸(GlcN6P)的可逆异构化-脱胺作用以形成果糖-6-磷酸及铵离子的酶。
如本文所用，术语「糖基转移酶」是指能够催化糖部分自活化供体分子转移至特异性受体分子，形成糖苷键的酶。已描述使用核苷酸二磷酸-糖、核苷酸单磷酸-糖及磷酸糖及相关蛋白将糖基转移酶分类成不同的基于序列的家族(Campbell等人，Biochem.J.326，929-939(1997))且可在碳水化合物活性酶(CArbohydrate-Active EnZymes；CAZy)网站(www.cazy.org)上获得。
如本文所用，糖基转移酶可选自包含但不限于以下清单：岩藻糖基转移酶(例如α-1，2-岩藻糖基转移酶、α-1，3/1，4-岩藻糖基转移酶、α-1，6-岩藻糖基转移酶)、唾液酸基转移酶(例如α-2，3-唾液酸基转移酶、α-2，6-唾液酸基转移酶、α-2，8-唾液酸基转移酶)、半乳糖基转移酶(例如β-1，3-半乳糖基转移酶、β-1，4-半乳糖基转移酶、α-1，3-半乳糖基转移酶、α-1，4-半乳糖基转移酶)、葡萄糖基转移酶、甘露糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶(例如β-1，3-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶、β-1，6-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶)、N-乙酰基半乳糖氨基转移酶(例如α-1，3-N-乙酰基半乳糖氨基转移酶、β-1，3-N-乙酰基半乳糖氨基转移酶)、N-乙酰基甘露糖氨基转移酶、木糖基转移酶、葡萄糖醛酸苷转移酶、半乳糖醛酸苷转移酶、葡萄糖氨基转移酶、N-羟乙酰基神经氨基转移酶、鼠李糖基转移酶、N-乙酰基鼠李糖基转移酶、UDP-4-氨基-4，6-双去氧-N-乙酰基-β-L-阿卓糖胺转胺酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺烯醇丙酮酰基转移酶及岩藻糖氨基转移酶。
岩藻糖基转移酶为将岩藻糖残基(Fuc)自GDP-岩藻糖(GDP-Fuc)供体转移至聚糖受体上的糖基转移酶。岩藻糖基转移酶包含α-1，2-岩藻糖基转移酶、α-1，3-岩藻糖基转移酶、α-1，4-岩藻糖基转移酶及α-1，6-岩藻糖基转移酶，所述岩藻糖基转移酶催化经由α-糖苷键使Fuc残基自GDP-Fuc转移至聚糖受体上。岩藻糖基转移酶可发现但不限于为GT10、GT11、GT23、GT65及GT68 CAZy家族。唾液酸基转移酶为将唾液酸(如Neu5Ac或Neu5Gc)自供体(如CMP-Neu5Ac或CMP-Neu5Gc)转移至聚糖受体上的糖基转移酶。唾液酸基转移酶包含α-2，3-唾液酸基转移酶、α-2，6-唾液酸基转移酶及α-2，8-唾液酸基转移酶，其催化经由α-糖苷键将唾液酸转移至聚糖受体上。唾液酸基转移酶可发现但不限于为GT29、GT42、GT80及GT97 CAZy家族。半乳糖基转移酶为将半乳糖基(Gal)自UDP-半乳糖(UDP-Gal)供体转移至聚糖受体上的糖基转移酶。半乳糖基转移酶包含β-1，3-半乳糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺β-1，3-半乳糖基转移酶、β-1，4-半乳糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺β-1，4-半乳糖基转移酶、α-1，3-半乳糖基转移酶及α-1，4-半乳糖基转移酶，其经由α-糖苷键或β-糖苷键将Gal残基自UDP-Gal转移至聚糖受体上。半乳糖基转移酶可发现但不限于为GT2、GT6、GT8、GT25及GT92 CAZy家族。葡萄糖基转移酶为将葡萄糖基(Glc)自UDP-葡萄糖(UDP-Glc)供体转移至聚糖受体上的糖基转移酶。葡萄糖基转移酶包含α-葡萄糖基转移酶、β-1，2-葡萄糖基转移酶、β-1，3-葡萄糖基转移酶及β-1，4-葡萄糖基转移酶，其经由α-糖苷键或β-糖苷键将Glc残基自UDP-Glc转移至聚糖受体上。葡萄糖基转移酶可发现但不限于为GT1、GT4及GT25CAZy家族。甘露糖基转移酶为将甘露糖基(Man)自GDP-甘露糖(GDP-Man)供体转移至聚糖受体上的糖基转移酶。甘露糖基转移酶包含α-1，2-甘露糖基转移酶、α-1，3-甘露糖基转移酶及α-1，6-甘露糖基转移酶，其经由α-糖苷键将Man残基自GDP-Man转移至聚糖受体上。甘露糖基转移酶可发现但不限于为GT22、GT39、GT62及GT69 CAZy家族。N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶为将N-乙酰基葡萄糖氨基(GlcNAc)自UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)供体转移至聚糖受体上的糖基转移酶。N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶可发现但不限于为GT2及GT4CAZy家族。半乳糖苷β-1，3-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶为N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶的一部分且经由β-1，3-键将GlcNAc自UDP-GlcNAc供体转移至存在于聚糖受体中的末端半乳糖单元上。β-1，6-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶为经由β-1，6-键将GlcNAc自UDP-GlcNAc供体转移至聚糖受体上的N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶。N-乙酰基半乳糖氨基转移酶为将N-乙酰基半乳糖氨基(GalNAc)自UDP-N-乙酰基半乳糖胺(UDP-GalNAc)供体转移至聚糖受体上的糖基转移酶。N-乙酰基半乳糖氨基转移酶可发现但不限于为GT7、GT12及GT27 CAZy家族。α-1，3-N-乙酰基半乳糖氨基转移酶为N-乙酰基半乳糖氨基转移酶的一部分，且经由α-1，3-键将GalNAc自UDP-GalNAc供体转移至聚糖受体。N-乙酰基甘露糖氨基转移酶为将N-乙酰基甘露糖氨基(ManNAc)自UDP-N-乙酰基甘露糖胺(UDP-ManNAc)供体转移至聚糖受体上的糖基转移酶。木糖基转移酶为将木糖残基(Xyl)自UDP-木糖(UDP-Xyl)供体转移至聚糖受体上的糖基转移酶。木糖基转移酶可发现但不限于为GT14、GT61及GT77 CAZy家族。葡萄糖醛酸苷转移酶为经由α-糖苷键或β-糖苷键将葡萄糖醛酸自UDP-葡萄糖醛酸供体转移至聚糖受体上的糖基转移酶。葡萄糖醛酸苷转移酶可发现但不限于为GT4、GT43及GT93 CAZy家族。半乳糖醛酸苷转移酶为将半乳糖醛酸自UDP-半乳糖醛酸供体转移至聚糖受体上的糖基转移酶。N-羟乙酰基神经氨基转移酶为将N-羟乙酰基神经氨酸基(Neu5Gc)自CMP-Neu5Gc供体转移至聚糖受体上的糖基转移酶。鼠李糖基转移酶为将鼠李糖残基自GDP-鼠李糖供体转移至聚糖受体上的糖基转移酶。鼠李糖基转移酶可发现但不限于为GT1、GT2及GT102 CAZy家族。N-乙酰基鼠李糖基转移酶为将N-乙酰基鼠李糖胺残基自UDP-N-乙酰基-L-鼠李糖胺供体转移至聚糖受体上的糖基转移酶。UDP-4-氨基-4，6-双去氧-N-乙酰基-β-L-阿卓糖胺转胺酶为使用UDP-2-乙酰氨基-2，6-双去氧--L-阿拉伯-4-己酮糖用于伪氨酸的生物合成的糖基转移酶，该伪氨酸为用于修饰鞭毛蛋白的类唾液酸糖。UDP-N-乙酰基葡萄糖胺烯醇丙酮酰基转移酶(murA)为将烯醇丙酮酰基(enolpyruvyl)自磷酸烯醇丙酮酸(PEP)转移至UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(UDPAG)以形成UDP-N-乙酰基葡萄糖胺烯醇丙酮酸的糖基转移酶。岩藻糖氨基转移酶为将N-乙酰基岩藻糖胺残基自dTDP-N-乙酰基岩藻糖胺或UDP-N-乙酰基岩藻糖胺供体转移至聚糖受体上的糖基转移酶。
如本发明中所用的术语「α-2，3-唾液酸基转移酶(alpha-2，3-sialyltransferase)」、「α2，3唾液酸基转移酶(alpha 2，3 sialyltransferase)」、「3-唾液酸基转移酶(3-sialyltransferase)」、「α-2，3-唾液酸基转移酶(α-2，3-sialyltransferase)」、「α2，3唾液酸基转移酶(α2，3 sialyltransferase)」、「3唾液酸基转移酶(3 sialyltransferase)」、「3-ST」或「3ST」可互换使用且是指催化唾液酸自供体CMP-Neu5Ac转移至α-2，3-键中的受体分子的糖基转移酶。如本发明中所用的术语「3′唾液酸基乳糖(3′sialyllactose)」、「3′-唾液酸基乳糖(3′-sialyllactose)」、「α-2，3-唾液酸基乳糖(alpha-2，3-sialyllactose)」、「α2，3唾液酸基乳糖(alpha 2，3 sialyllactose)」、「α-2，3-唾液酸基乳糖(α-2，3-sialyllactose)」、「α2，3唾液酸基乳糖(α2，3sialyllactose)」、「3SL」或「3′SL」可互换使用且是指借由α-2，3-岩藻糖基转移酶催化将唾液酸基自CMP-Neu5Ac移转至α-2，3-键中的乳糖获得的产物。如本发明中所用的术语「α-2，6-唾液酸基转移酶(alpha-2，6-sialyltransferase)」、「α2，6唾液酸基转移酶(alpha 2，6sialyltransferase)」、「6-唾液酸基转移酶(6-sialyltransferase)」、「α-2，6-唾液酸基转移酶(α-2，6-sialyltransferase)」、「α2，6唾液酸基转移酶(α2，6 sialyltransferase)」、「6唾液酸基转移酶(6 sialyltransferase)」、「6-ST」或「6ST」可互换使用且是指催化唾液酸自供体CMP-Neu5Ac转移至α-2，6-键中的受体分子的糖基转移酶。如本发明中所用的术语「6′唾液酸基乳糖(6′sialyllactose)」、「6′-唾液酸基乳糖(6′-sialyllactose)」、「α-2，6-唾液酸基乳糖(alpha-2，6-sialyllactose)」、「α2，6唾液酸基乳糖(alpha 2，6sialyllactose)」、「α-2，6-唾液酸基乳糖(α-2，6-sialyllactose)」、「α2，6唾液酸基乳糖(α2，6 sialyllactose)」、「6SL」或「6′SL」可互换使用且是指借由α-2，6-岩藻糖基转移酶催化将唾液酸基自CMP-Neu5Ac移转至α-2，6-键中的乳糖获得的产物。
如本发明中所用的术语「α-2，8-唾液酸基转移酶(alpha-2，8-sialyltransferase)」、「α2，8唾液酸基转移酶(alpha 2，8 sialyltransferase)」、「8-唾液酸基转移酶(8-sialyltransferase)」、「α-2，8-唾液酸基转移酶(α-2，8-sialyltransferase)」、「α2，8唾液酸基转移酶(α2，8 sialyltransferase)」、「8唾液酸基转移酶(8 sialyltransferase)」、「8-ST」或「8ST」可互换使用且是指催化唾液酸自供体CMP-Neu5Ac转移至α-2，8-键中的受体的糖基转移酶。
术语「经活化单糖(activated monosaccharide)」、「核苷酸活化糖(nucleotide-activated sugar)」、「核苷酸糖(nucleotide-sugar)」、「经活化糖(activated sugar)」、「核苷(nucleoside)」或「核苷酸供体(nucleotide donor)」在本文中可互换使用且是指单糖的活化形式。活化单糖的实例包括但不限于UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)、UDP-N-乙酰基半乳糖胺(UDP-GalNAc)、UDP-N-乙酰基甘露糖胺(UDP-ManNAc)、UDP-葡萄糖(UDP-Glc)、UDP-半乳糖(UDP-Gal)、GDP-甘露糖(GDP-Man)、UDP-葡萄糖醛酸、UDP-半乳糖醛酸、UDP-2-乙酰氨基-2，6-双去氧--L-阿拉伯-4-己酮糖、UDP-2-乙酰氨基-2，6-双去氧--L-来苏-4-己酮糖、UDP-N-乙酰基-L-鼠李糖胺(UDP-L-RhaNAc或UDP-2-乙酰氨基-2，6-双去氧-L-甘露糖)、dTDP-N-乙酰基岩藻糖胺、UDP-N-乙酰基岩藻糖胺(UDP-L-FucNAc或UDP-2-乙酰氨基-2，6-双去氧-L-半乳糖)、UDP-N-乙酰基-L-纽莫糖胺(pneumosamine)(UDP-L-PneNAC或UDP-2-乙酰氨基-2，6-双去氧-L-塔罗糖)、UDP-N-乙酰基胞壁酸、UDP-N-乙酰基-L-异鼠李糖胺(UDP-L-QuiNAc或UDP-2-乙酰氨基-2，6-双去氧-L-葡萄糖)、GDP-L-异鼠李糖、CMP-唾液酸(CMP-Neu5Ac或CMP-N-乙酰基神经氨酸)、CMP-N-羟乙酰基神经氨酸(CMP-Neu5Gc)、CMP-Neu4Ac、CMP-Neu5Ac9N3、CMP-Neu4，5Ac2、CMP-Neu5，7Ac2、CMP-Neu5，9Ac2、CMP-Neu5，7(8，9)Ac2、GDP-岩藻糖(GDP-Fuc)、GDP-鼠李糖及UDP-木糖。核苷酸糖在糖基化反应中充当糖基供体。糖基化反应为由糖基转移酶催化的反应。
如本文所用，术语「单糖(monosaccharide)」是指不可借由水解分解为更简单的糖的糖，分为醛糖或酮糖，且每分子含有一或多个羟基。单糖为仅含有一个简单糖的糖。单糖的实例包含己糖、D-葡萄哌喃糖、D-半乳呋喃糖、D-半乳哌喃糖、L-半乳哌喃糖、D-甘露哌喃糖、D-别哌喃糖、L-阿卓哌喃糖、D-古洛哌喃糖、L-艾杜哌喃糖、D-塔罗哌喃糖、D-核呋喃糖、D-核哌喃糖、D-阿拉伯呋喃糖、D-阿拉伯哌喃糖、L-阿拉伯呋喃糖、L-阿拉伯哌喃糖、D-木哌喃糖、D-来苏哌喃糖、D-赤藻呋喃糖、D-苏呋喃糖、庚糖、L-甘油-D-甘露-庚哌喃糖(LDmanHep)、D-甘油-D-甘露-庚哌喃糖(DDmanHep)、6-去氧-L-阿卓哌喃糖、6-去氧-D-古洛哌喃糖、6-去氧-D-塔罗哌喃糖、6-去氧-D-半乳哌喃糖、6-去氧-L-半乳哌喃糖、6-去氧-D-甘露哌喃糖、6-去氧-L-甘露哌喃糖、6-去氧-D-葡萄哌喃糖、2-去氧-D-阿拉伯-己糖、2-去氧-D-赤藻-戊糖、2，6-双去氧-D-阿拉伯-己哌喃糖、3，6-双去氧-D-阿拉伯-己哌喃糖、3，6-双去氧-L-阿拉伯-己哌喃糖、3，6-双去氧-D-木-己哌喃糖、3，6-双去氧-D-核-己哌喃糖、2，6-双去氧-D-核-己哌喃糖、3，6-双去氧-L-木-己哌喃糖、2-氨基-2-去氧-D-葡萄哌喃糖、2-氨基-2-去氧-D-半乳哌喃糖、2-氨基-2-去氧-D-甘露哌喃糖、2-氨基-2-去氧-D-别哌喃糖、2-氨基-2-去氧-L-阿卓哌喃糖、2-氨基-2-去氧-D-古洛哌喃糖、2-氨基-2-去氧-L-艾杜哌喃糖、2-氨基-2-去氧-D-塔罗哌喃糖、2-乙酰氨基-2-去氧-D-葡萄哌喃糖、2-乙酰氨基-2-去氧-D-半乳哌喃糖、2-乙酰氨基-2-去氧-D-甘露哌喃糖、2-乙酰氨基-2-去氧-D-别哌喃糖、2-乙酰氨基-2-去氧-L-阿卓哌喃糖、2-乙酰氨基-2-去氧-D-古洛哌喃糖、2-乙酰氨基-2-去氧-L-艾杜哌喃糖、2-乙酰氨基-2-去氧-D-塔罗哌喃糖、2-乙酰氨基-2，6-双去氧-D-半乳哌喃糖、2-乙酰氨基-2，6-双去氧-L-半乳哌喃糖、2-乙酰氨基-2，6-双去氧-L-甘露哌喃糖、2-乙酰氨基-2，6-双去氧-D-葡萄哌喃糖、2-乙酰氨基-2，6-双去氧-L-阿卓哌喃糖、2-乙酰氨基-2，6-双去氧-D-塔罗哌喃糖、D-葡萄哌喃糖醛酸、D-半乳哌喃糖醛酸、D-甘露哌喃糖醛酸、D-别哌喃糖醛酸、L-阿卓哌喃糖醛酸、D-古洛哌喃糖醛酸、L-古洛哌喃糖醛酸、L-艾杜哌喃糖醛酸、D-塔罗哌喃糖醛酸、唾液酸、5-氨基-3，5-双去氧-D-甘油-D-半乳糖-壬-2-酮糖酸、5-乙酰氨基-3，5-双去氧-D-甘油-D-半乳糖-壬-2-酮糖酸、5-羟乙酰基酰氨基-3，5-双去氧-D-甘油-D-半乳糖-壬-2-酮糖酸、赤藻糖醇、阿拉伯糖醇木糖醇、核糖醇、葡萄糖醇、半乳糖醇、甘露糖醇、D-核-己-2-酮哌喃糖、D-阿拉伯-己-2-酮呋喃糖(D-果呋喃糖)、D-阿拉伯-己-2-酮哌喃糖、L-木-己-2-酮哌喃糖、D-来苏-己-2-酮哌喃糖、D-苏-戊-2-酮哌喃糖、D-阿卓-庚-2-酮哌喃糖、3-C-(羟甲基)-D-赤藻呋喃糖、2，4，6-三去氧-2，4-二氨基-D-葡萄哌喃糖、6-去氧-3-O-甲基-D-葡萄糖、3-O-甲基-D-鼠李糖、2，6-双去氧-3-甲基-D-核-己糖、2-氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-去氧-D-葡萄哌喃糖、2-乙酰氨基-3-O-[(R)-羧乙基]-2-去氧-D-葡萄哌喃糖、2-羟乙酰基酰氨基-3-O-[(R)-1-羧乙基]-2-去氧-D-葡萄哌喃糖、3-去氧-D-来苏-庚-2-酮哌喃糖酸、3-去氧-D-甘露-辛-2-酮哌喃糖酸、3-去氧-D-甘油-D-半乳-壬-2-酮哌喃糖酸、5，7-二氨基-3，5，7，9-四去氧-L-甘油-L-甘露-壬-2-酮哌喃糖酸、5，7-二氨基-3，5，7，9-四去氧-L-甘油-L-阿卓-壬-2-酮哌喃糖酸、5，7-二氨基-3，5，7，9-四去氧-D-甘油-D-半乳-壬-2-酮哌喃糖酸、5，7-二氨基-3，5，7，9-四去氧-D-甘油-D-塔罗-壬-2-酮哌喃糖酸、2-乙酰氨基-2，6-双去氧--L-阿拉伯-4-己酮糖、2-乙酰氨基-2，6-双去氧--L-来苏-4-己酮糖、N-乙酰基-L-鼠李糖胺、N-乙酰基-D-岩藻糖胺、N-乙酰基-L-纽莫糖胺、N-乙酰基胞壁酸、N-乙酰基-L-异鼠李糖胺、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、N-乙酰基葡萄糖胺(GlcNAc)、葡萄糖胺(Glcn)、甘露糖(Man)、木糖(Xyl)、N-乙酰基甘露糖胺(ManNAc)、N-羟乙酰基神经氨酸、N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)、半乳胺糖(Galn)、岩藻糖(Fuc)、鼠李糖(Rha)、葡萄糖醛酸、葡萄糖酸、果糖(Fru)及多元醇。
术语多元醇意谓含有多个羟基的醇。举例而言，甘油、山梨糖醇或甘露糖醇。
如本文所用，术语「双糖(disaccharide)」是指含有两个简单糖，亦即单糖的糖聚合物。此类双糖含有单糖，其较佳选自如本文上文所用的单糖清单。双糖的实例包含乳糖(Gal-b1，4-Glc)、乳-N-二糖(Gal-b1，3-GlcNAc)、N-乙酰基乳糖胺(Gal-b1，4-GlcNAc)、LacDiNAc(GalNAc-b1，4-GlcNAc)、N-乙酰基半乳糖氨基葡萄糖(GalNAc-b1，4-Glc)。
如本文所用，术语「唾液酸化双糖」是指含有两个单糖的双糖，其中所述单糖中的一者为如本文所定义的唾液酸。唾液酸化双糖的实例包含Neu5Ac-a2，3-Gal、Neu5Ac-a2，6-Gal及岩藻哌喃糖基-(1-4)-N-羟乙酰基神经氨酸(Fuc-(1-4)-Neu5Gc)。
如本文所用的术语且如目前先进技术中通常所理解，「寡糖(Oligosaccharide)」是指含有少量、典型地三至二十个简单糖，亦即单糖的糖聚合物。较佳地，如本文所描述的寡糖含有选自如本文上文所用的清单的单糖。如本发明中所用的寡糖可为直链结构或可包括分支。两个糖单元之间的键(例如糖苷键、半乳糖苷键、葡萄糖苷键等)可表示为例如1，4、1-＞4或(1-4)，在本文中可互换使用。举例而言，术语「Gal-b1，4-Glc」、「β-Gal-(1-＞4)-Glc」、「Galβ1-4-Glc」及「Gal-b(1-4)-Glc」具有相同含义，亦即半乳糖(Gal)的碳-1与葡萄糖(Glc)的碳-4的β-糖苷键连接。各单糖可呈环状形式(例如哌喃糖或呋喃糖形式)。寡糖可含有α-糖苷键及β-糖苷键两者或可仅含有α-糖苷键或仅含有β-糖苷键。术语「多糖(polysaccharide)」是指由大量的(典型地大于二十个)经糖苷连接的单糖组成的化合物。
寡糖的实例包括但不限于路易斯(Lewis)型抗原寡糖、哺乳动物(包括人类)乳寡糖、O-抗原、肠内菌共同抗原(enterobacterial common antigen；ECA)、存在于脂多糖(lipopolysaccharide；LPS)中的聚糖链、存在于荚膜多糖中的寡糖重复、肽聚糖(peptidoglycan；PG)、氨基-糖及人类ABO血型系统的抗原。
如本文所用，术语「聚糖受体(glycan acceptor)」是指如本文所定义的单糖、双糖及寡糖。
如本文所用，「哺乳动物乳寡糖」(mammalian milk oligosaccharide；MMO)是指诸如但不限于以下寡糖：3-岩藻糖基乳糖、2′-岩藻糖基乳糖、6-岩藻糖基乳糖、2′，3-二岩藻糖基乳糖、2′，2-二岩藻糖基乳糖、3，4-二岩藻糖基乳糖、6′-唾液酸基乳糖、3′-唾液酸基乳糖、3，6-二唾液酸基乳糖、6，6′-二唾液酸基乳糖、8，3-二唾液酸基乳糖、3，6-二唾液酸基乳-N-四糖、乳二岩藻四糖、乳-N-丙糖II、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、乳-N-岩藻五糖II、乳-N-岩藻五糖I、乳-N-岩藻五糖III、乳-N-岩藻五糖V、乳-N-岩藻五糖VI、唾液酸基乳-N-四糖c、唾液酸基乳-N-四糖b、唾液酸基乳-N-四糖a、乳-N-二岩藻六糖I、乳-N-二岩藻六糖II、乳-N-六糖、乳-N-新六糖、对-乳-N-六糖、单岩藻糖基单唾液酸基乳-N-四糖c、单岩藻糖基对-乳-N-六糖、单岩藻糖基乳-N-六糖III、异构岩藻糖基化乳-N-六糖III、异构岩藻糖基化乳-N-六糖I、唾液酸基乳-N-六糖、唾液酸基乳-N-新六糖II、二岩藻糖基-对-乳-N-六糖、二岩藻糖基乳-N-六糖、二岩藻糖基乳-N-六糖a、二岩藻糖基乳-N-六糖c、半乳糖基化几丁聚糖、岩藻糖基化寡糖、中性寡糖及/或唾液酸化寡糖。
如本文所用且如目前先进技术中通常所理解，『岩藻糖基化寡糖(fucosylatedoligosaccharide)』为携带岩藻糖残基的寡糖。实例包含2′-岩藻糖基乳糖(2′FL)、3-岩藻糖基乳糖(3FL)、4-岩藻糖基乳糖(4FL)、6-岩藻糖基乳糖(6FL)、二岩藻糖基乳糖(diFL)、乳二岩藻四糖(LDFT)、乳-N-岩藻五糖I(LNF I)、乳-N-岩藻五糖II(LNF II)、乳-N-岩藻五糖III(LNF III)、乳-N-岩藻五糖V(LNF V)、乳-N-岩藻五糖VI(LNF VI)、乳-N-新岩藻五糖I、乳-N-岩藻六糖I(LDFH I)、乳-N-岩藻六糖II(LDFH II)、单岩藻糖基乳-N-六糖III(MFLNHIII)、二岩藻糖基乳-N-六糖(DFLNHa)、二岩藻糖基-乳-N-新六糖。哺乳动物乳寡糖包含在泌乳期间的任何阶段中发现的乳汁中所存在的寡糖，该乳汁包括来自人类及哺乳动物的初乳，所述哺乳动物包括但不限于牛(欧洲牛(Bos Taurus))、绵羊(绵羊(Ovis aries))、山羊(家畜山羊(Capra aegagrus hircus))、双峰骆驼(双峰驼(Camelus bactrianus))、马(欧洲野马(Equus ferus caballus))、猪(野猪(Sus scropha))、犬(家犬亚种(Canis lupusfamiliaris))、虾夷棕熊(ezo brown bear)(日本棕熊(Ursus arctos yesoensis))、北极熊(海熊(Ursus maritimus))、日本黑熊(亚洲黑熊(Ursus thibetanus japonicus))、条纹臭鼬(条纹臭鼬(Mephitis mephitis))、冠海豹(冠海豹(Cystophora cristata))、亚洲大象(亚洲象(Elephas maximus))、非洲大象(非洲象(Loxodonta africana))、巨食蚁兽(大食蚁兽(Myrmecophaga tridactyla))、真瓶鼻海豚(瓶鼻海豚(Tursiops truncates))、北极小须鲸(小须鲸(Balaenoptera acutorostrata))、尤金袋鼠(尤金袋鼠(Macropuseugenii))、红袋鼠(红袋鼠(Macropus rufus))、普通袋狐(帚尾袋貂(TrichosurusVulpecula))、无尾熊(考拉(Phascolarctos cinereus))、东袋鼬(细脚袋鼩(Dasyurusviverrinus))、鸭嘴兽(鸭嘴兽(Ornithorhynchus anatinus))。人乳寡糖(Human milkoligosaccharide；HMO)亦称为人类一致乳寡糖，其在化学上与人类母乳中发现的人乳寡糖一致，但为生物技术生产的(例如使用不含细胞的系统或细胞及包含细菌、真菌、酵母、植物、动物或原虫细胞的生物体，较佳经基因工程改造的细胞及生物体)。人类一致乳寡糖以名称HiMO出售。
如本文所用，『唾液酸化寡糖(sialylated oligosaccharide)』应被理解为含有带电唾液酸的寡糖，亦即具有唾液酸残基的寡糖。其具有酸性性质。一些实例为3-SL(3′-唾液酸基乳糖或3′-SL或Neu5Ac-a2，3-Gal-b1，4-Glc)、3′-唾液酸基乳糖胺、6-SL(6′-唾液酸基乳糖或6′-SL或Neu5Ac-a2，6-Gal-b1，4-Glc)、3，6-二唾液酸基乳糖(Neu5Ac-a2，3-(Neu5Ac-a2，6)-Gal-b1，4-Glc)、6，6′-二唾液酸基乳糖(Neu5Ac-a2，6-Gal-b1，4-(Neu5Ac-a2，6)-Glc)、8，3-二唾液酸基乳糖(Neu5Ac-a2，8-Neu5Ac-a2，3-Gal-b1，4-Glc)、6′-唾液酸基乳糖胺、包含6′-唾液酸基乳糖的寡糖、SGG六糖(Neu5Acα-2，3Galβ-1，3GalNacβ-1，3Galα-1，4Galβ-1，4Gal)、唾液酸化四糖(Neu5Acα-2，3Galβ-1，4GlcNacβ-14GlcNAc)、五糖LSTD(Neu5Acα-2，3Galβ-1，4GlcNacβ-1，3Galβ-1，4Gle)、唾液酸化乳-N-丙糖、唾液酸化乳-N-四糖、唾液酸基乳-N-新四糖、单唾液酸基乳-N-六糖、二唾液酸基乳-N-六糖I、单唾液酸基乳-N-新六糖I、单唾液酸基乳-N-新六糖II、二唾液酸基乳-N-新六糖、二唾液酸基乳-N-四糖、二唾液酸基乳-N-六糖II、唾液酸基乳-N-四糖a、二唾液酸基乳-N-六糖I、唾液酸基乳-N-四糖b、3′-唾液酸基-3-岩藻糖基乳糖、二唾液单岩藻糖基乳-N-新六糖、单岩藻糖基单唾液酸基乳-N-八糖(唾液酸基Lea)、唾液酸基乳-N-岩藻六糖II、二唾液酸基乳-N-岩藻五糖II、单岩藻糖基二唾液酸基乳-N-四糖及携带一或若干个唾液酸残基的寡糖，包括但不限于选自以下神经节苷脂的寡糖部分：GM3(3′唾液酸基乳糖，Neu5Acα-2，3Galβ-4Glc)及包含GM3模体的寡糖；GD3 Neu5Acα-2，8Neu5Acα-2，3Galβ-1，4Glc GT3(Neu5Acα-2，8Neu5Acα-2，8Neu5Acα-2，3Galβ-1，4Glc)；GM2GalNAcβ-1，4(Neu5Acα-2，3)Galβ-1，4Glc、GM1Galβ-1，3GalNAcβ-1，4(Neu5Acα-2，3)Galβ-1，4Glc、GDlaNeu5Acα-2，3Galβ-1，3GalNAcβ-1，4(Neu5Acα-2，3)Galβ-1，4Glc、GT1aNeu5Acα-2，8Neu5Acα-2，3Galβ-1，3GalNAcβ-1，4(Neu5Acα-2，3)Galβ-1，4Glc、GD2GalNAcβ-1，4(Neu5Acα-2，8Neu5Acα2，3)Galβ-1，4Glc、GT2GalNAcβ-1，4(Neu5Acα-2，8Neu5Acα-2，8Neu5Acα2，3)Galβ-1，4Glc、GDlb、Galβ-1，3GalNAcβ-1，4(Neu5Acα-2，8Neu5Acα2，3)Galβ-1，4Glc、GT1b Neu5Acα-2，3Galβ-1，3GalNAcβ-1，4(Neu5Acα-2，8Neu5Acα2，3)Galβ-1，4Glc、GQ1bNeu5Acα-2，8Neu5Acα-2，3Galβ-1，3GalNAcβ-1，4(Neu5Acα-2，8Neu5Acα2，3)Galβ-1，4Glc、GT1c Galβ-1，3GalNAcβ-1，4(Neu5Acα-2，8Neu5Acα-2，8Neu5Acα2，3)Galβ-1，4Glc、GQ1c Neu5Acα-2，3Galβ-1，3GalNAcβ-1，4(Neu5Acα-2，8Neu5Acα-2，8Neu5Acα2，3)Galβ-1，4Glc、GP1c Neu5Acα-2，8Neu5Acα-2，3Galβ-1，3GalNAcβ-1，4(Neu5Acα-2，8Neu5Acα-2，8Neu5Acα2，3)Galβ-1，4Glc、GD1a Neu5Acα-2，3Galβ-1，3(Neu5Acα-2，6)GalNAcβ-1，4Galβ-1，4Glc、岩藻糖基-GM1 Fucα-1，2Galβ-1，3GalNAcβ-1，4(Neu5Acα-2，3)Gal β-1，4Glc；其皆可借由使以上寡糖部分与神经酰胺反应或在神经酰胺上合成以上寡糖而扩展至相应神经节苷脂的生产。
如本文所用且如目前先进技术中通常所理解，『中性寡糖(neutraloligosaccharide)』为不具有源自羧酸基的负电荷的寡糖。此类中性寡糖的实例为2′-岩藻基乳糖(2′FL)、3-岩藻基乳糖(3FL)、2′，3-二岩藻基乳糖(diFL)、乳-N-丙糖II、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、乳-N-岩藻五糖I、乳-N-新岩藻五糖I、乳-N-岩藻五糖II、乳-N-岩藻五糖III、乳-N-岩藻五糖V、乳-N-岩藻五糖VI、乳-N-新岩藻五糖V、乳-N-二岩藻六糖I、乳-N-二岩藻六糖II、6′-半乳糖基乳糖、3′-半乳糖基乳糖、乳-N-六糖、乳-N-新六糖、对-乳-N-六糖、对-乳-N-新六糖、二岩藻基-乳-N-六糖及二岩藻基-乳-N-新六糖。
如本文所使用，术语「路易斯型抗原(Lewis-typeantigen)」包含以下寡糖：H1抗原，其为Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc，或简言之2′FLNB；Lewisa，其为三糖Galβ1-3[Fucα1-4]GlcNAc，或简言之4-FLNB；Lewisb，其为四糖Fucα1-2Galβ1-3[Fucα1-4]GlcNAc，或简言之DiF-LNB；唾液酸基Lewisa，其为5-乙酰基神经氨基-(2-3)-半乳糖基-(1-3)-(岩藻哌喃糖基-(1-4))-N-乙酰基葡萄糖胺，或简写为Neu5Acα2-3Galβ1-3[Fucα1-4]GlcNAc；H2抗原，其为Fucα1-2Galβ1-4GlcNAc，或另外称作2′岩藻糖基-N-乙酰基-乳糖胺，简言之2′FLacNAc；Lewisx，其为三糖Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAc，或另外称为3-岩藻糖基-N-乙酰基-乳糖胺，简言的3-FLacNAc；Lewisy，其为四糖Fucα1-2Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAc；及唾液酸基Lewisx，其为5-乙酰基神经氨基-(2-3)-半乳糖基-(1-4)-(岩藻哌喃糖基-(1-3))-N-乙酰基葡萄糖胺，或简写为Neu5Acα2-3Galβ1-4[Fucα1-3]GlcNAc。
如本文所用，术语「O-抗原(O-antigen)」是指革兰氏阴性细菌的表面脂多糖(LPS)的重复聚糖组分。术语「脂多糖(lipopolysaccharide)」或「LPS」是指在由脂质A、核心寡糖及O-抗原构成的革兰氏阴性细菌的外膜中发现的糖脂。术语「荚膜多糖(capsularpolysaccharides)」是指存在于细菌荚膜中的具有寡糖重复结构的长链多糖，所述细菌荚膜为位于细胞包膜外部的多糖层。术语「肽聚糖(peptidoglycan)」或「胞壁质(murein)」是指大部分细菌细胞壁中的基本结构元件，其由糖及氨基酸构成，其中糖组分由β-1，4连接的GlcNAc及N-乙酰基胞壁酸的交替残基组成。如本文所用，术语「氨基-糖(amino-sugar)」是指羟基已经氨基置换的糖分子。如本文所用，人类ABO血型系统的抗原为寡糖。人类ABO血型系统的此类抗原不限于人类结构。所述结构涉及存在于包含Gal-β1，3-GlcNAc、Gal-β1，4-GlcNAc、Gal-β1，3-GalNAc及Gal-β1，4-Glc的双糖核心结构上的A决定子GalNAc-α1，3(Fuc-α1，2)-Gal-、B决定子Gal-α1，3(Fuc-α1，2)-Gal-及H决定子Fuc-α1，2-Gal-。
如本发明中所用的术语「LNT II」、「LNT-II」、「LN3」、「乳-N-丙糖II(lacto-N-triose II)」、「乳-N-丙糖II(lacto-N-triose II)」、「乳-N-丙糖(lacto-N-triose)」、「乳-N-丙糖(lacto-N-triose)」或「GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc」可互换使用。
如本发明中所用的术语「LNT」、「乳-N-四糖(lacto-N-tetraose)」、「乳-N-四糖(lacto-N-tetraose)」或「Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc」可互换使用。
如本发明中所用的术语「LNnT」、「乳-N-新四糖(lacto-N-neotetraose)」、「乳-N-新四糖(lacto-N-neotetraose)」、「新-LNT(neo-LNT)」或「Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc」可互换使用。
如本发明中所用的术语「LSTa」、「LS-四糖a(LS-Tetrasaccharide a)」、「唾液酸基-乳-N-四糖a(Sialyl-lacto-N-tetraose a)」、「唾液酸基乳-N-四糖a(sialyllacto-N-tetraose a)」或「Neu5Ac-a2，3-Gal-b1，3-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc」可互换使用。
如本发明中所用的术语「LSTb」、「LS-四糖b(LS-Tetrasaccharide b)」、「唾液酸基-乳-N-四糖b(Sialyl-lacto-N-tetraose b)」、「唾液酸基乳-N-四糖b(sialyllacto-N-tetraoseb)」或「Gal-b1，3-(Neu5Ac-a2，6)-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc」可互换使用。
如本发明中所用的术语「LSTc」、「LS-四糖c(LS-Tetrasaccharide c)」、「唾液酸基-乳-N-四糖c(Sialyl-lacto-N-tetraose c)」、「唾液酸基乳-N-四糖c(sialyllacto-N-tetraose c)」、「唾液酸基乳-N-新四糖c(sialyllacto-N-neotetraose c)」或「Neu5Ac-a2，6-Gal-b1，4-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc」可互换使用。
如本发明中所用的术语「LSTd」、「LS-四糖d(LS-Tetrasaccharide d)」、「唾液酸基-乳-N-四糖d(Sialyl-lacto-N-tetraose d)」、「唾液酸基乳-N-四糖d(sialyllacto-N-tetraose d)」、「唾液酸基乳-N-新四糖d(sialyllacto-N-neotetraose d)」或「Neu5Ac-a2，3-Gal-b1，4-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc」可互换使用。
术语「DSLNnT」及「二唾液酸基乳-N-新四糖(Disialyllacto-N-neotetraose)」可互换使用且是指Neu5Ac-a2，6-[Neu5Ac-a2，6-Gal-b1，4-GlcNAc-b1，3]-Gal-b1，4-Glc。
术语「DSLNT」及「二唾液酸基乳-N-四糖(Disialyllacto-N-tetraose)」可互换使用且是指Neu5Ac-a2，6-[Neu5Ac-a2，3-Gal-b1，3-GlcNAc-b1，3]-Gal-b1，4-Glc。术语「LNFP-I」、「乳-N-岩藻五糖I(lacto-N-fucopentaose I)」、「LNFP I」、「LNF I OH I型决定子(LNF I OH type I determinant)」、「LNF I」、「LNF1」、「LNF 1」及「H血型抗原五糖第1型(Blood group H antigen pentaose type 1)」可互换使用且是指Fuc-al，2-Gal-b1，3-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc。
术语「LNB」及「乳-N-二糖(Lacto-N-biose)」可互换使用且是指双糖Gal-b1，3-GlcNAc。
术语「LacNAc」及「N-乙酰基乳糖胺(N-acetyllactosamine)」可互换使用且是指双糖Gal-b1，4-GlcNAc。
如本文所用，术语「膜运输蛋白(membrane transporter protein)」是指作为细胞膜的一部分或与细胞膜交互作用且控制分子及资讯跨越细胞的流动的蛋白质。因此，膜蛋白参与运输，不论其输入至细胞中或自细胞输出。
如本文所用，术语「螯铁蛋白(Siderophore)」是指各种微生物的次级代谢物，其主要为铁离子特异性螯合剂。此等分子已分类为儿茶酚盐(catecholate)、氧肟酸盐(hydroxamate)、羧酸盐及混合类型。螯铁蛋白一般借由非核糖体肽合成酶(nonribosomalpeptide synthetase；NRPS)依赖性途径或NRPS非依赖性途径(NRPS independentpathway；NIS)合成。NRPS依赖性螯铁蛋白生物合成途径中最重要的前驱物为分支酸(chorismate)。2，3-DHBA可借由异分支酸合酶、异分支酸酶及2，3-二羟基苯甲酸-2，3-脱氢酶催化的三步骤反应自分支酸形成。螯铁蛋白亦可由水杨酸形成，该水杨酸借由异分支酸丙酮酸解离酶自异分支酸形成。当鸟氨酸用作螯铁蛋白的前驱物时，生物合成取决于由L-鸟氨酸N5-单加氧酶催化的鸟氨酸的羟基化。在NIS途径中，螯铁蛋白生物合成中的重要步骤系N(6)-羟基离氨酸合酶。
需要运输蛋白以将螯铁蛋白输出至细胞外部。至此在此过程中鉴别出膜蛋白的四个超家族：主要易化子超家族(major facilitator superfamily；MFS)；多药/寡糖基脂质/多糖翻转酶超家族(Multidrug/Oligosaccharidyl-lipid/Polysaccharide FlippaseSuperfamily；MOP)；抗性、结节性及细胞分裂超家族(resistance，nodulation and celldivision superfamily；RND)；及ABC超家族。一般而言，参与螯铁蛋白输出的基因与螯铁蛋白生物合成基因簇聚在一起。如本文所用，术语「螯铁蛋白输出蛋白(siderophoreexporter)」是指将螯铁蛋白输出至细胞外部所需的此类运输蛋白。
ATP结合卡匣(ATP-binding cassette；ABC)超家族含有吸收及流出运输系统两者，且此两个搬运体(porter)组中的成员通常松散地簇聚在一起。无蛋白质磷酸化的ATP水解为运输供以能量。ABC超家族内存在数十个家族，且家族一般与受质特异性相关。成员根据如借由运输蛋白分类资料库所定义的类别3.A.1分类，该资料库借由Saier LabBioinformatics Group运作，可经由www.tcdb.org获得，且提供膜运输蛋白的功能性及系统发生分类。
主要易化子超家族(MFS)为膜运输蛋白的超家族，其催化单向运输蛋白、溶质：阳离子(H+，但几乎不为Na+)同向运输蛋白及/或溶质：H+或溶质：溶质反向运输蛋白。大多数长度为400-600个氨基酰基残基且具有12、14或偶尔24个跨膜α-螺旋扳手(transmembraneα-helical spanner；TMS)，如由Saier Lab Bioinformatics Group运作的运输蛋白分类资料库(wwwd.tcdb.org)所定义。
如本文所用，「SET」或「糖流出运输蛋白(Sugar Efflux Transporter)」是指SET家族的膜蛋白，其为具有InterPRO域IPR004750的蛋白质及/或为属于eggNOGv4.5家族ENOG410XTE9的蛋白质。InterPro域的鉴别可借由使用https：//www.ebi.ac.uk/interpro/上的线上工具或InterProScan的独立版本(https：//www.ebi.ac.uk/interpro/download.html)使用预设值进行。在eggNOGv4.5中鉴别直系同源家族可使用eggNOG-mapperv1(http：//eggnogdb.embl.de/#/app/home)的在线版本或独立版本进行。
所属技术领域中具有通常知识者应理解，对于本文所用的包含eggnogdb 4.5.1(发布于2016年9月)及InterPro 75.0(发布于2019年7月4日)的资料库，各资料库的内容在各发布版本中为固定的且不会改变。当特定资料库的内容改变时，此特定资料库接收具有新的发布日期的新的发布版本。各资料库的所有发布版本及其对应发布日期及如在此等特定发布日期标注的特定内容均为可获得的且为所属技术领域中具有通常知识者已知。
在本发明的上下文内，术语「经基因修饰以用于生产唾液酸化双糖及/或寡糖的细胞(cell genetically modified for the production of a sialylated di-and/oroligosaccharide)」是指经基因操纵以包含至少一种唾液酸基转移酶与以下者中的任何一或多者的组合的细胞：i)编码该唾液酸化双糖及/或寡糖的合成所必需的糖基转移酶的基因，ii)生产适于由该糖基转移酶转移至碳水化合物前驱物的核苷酸供体的生物合成途径及/或iii)生产前驱物的生物合成途径或前驱物自培养基内化至细胞中的机制，在细胞中前驱物经糖基化以生产唾液酸化双糖及/或寡糖。
如本文所用，「用于生产唾液酸化双糖及/或寡糖的途径(pathway forproduction of a sialylated di-and/or oligosaccharide)」是由参与如本文所定义的唾液酸化双糖及/或寡糖的合成的酶及其各别基因组成的生物化学途径。用于生产唾液酸化双糖及/或寡糖的该途径包含至少一种唾液酸基转移酶。此外，用于生产唾液酸化双糖及/或寡糖的该途径可包含但不限于参与核苷酸活化糖的合成及将该核苷酸活化糖转移至受体以产生本发明的唾液酸化双糖及/或寡糖的途径。此类途径的实例包含但不限于岩藻糖基化、唾液酸化、半乳糖基化、N-乙酰基葡萄糖氨基化、N-乙酰基半乳糖基化、甘露糖基化、N-乙酰基甘露糖氨基化途径。
如本文所用，『岩藻糖基化途径(fucosylation pathway)』是包含至少一种选自包含以下者的清单的酶及其各别基因的生化途径：甘露糖-6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶、GDP-甘露糖4，6-脱水酶、GDP-L-岩藻糖合酶、岩藻糖透过酶、岩藻糖激酶、岩藻糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶以及岩藻糖基转移酶，产生α1，2、α1，3、α1，4及/或α1，6岩藻糖基化寡糖。
『唾液酸化途径(sialylation pathway)』包含至少一种选自包含以下者的清单的酶及其各别基因的生化途径：N-酰基葡萄糖胺2-表异构酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶、UDP-GlcNAc 2-表异构酶/激酶水解、N-酰基神经氨酸-9-磷酸合成酶、磷酸酶、N-乙酰基神经氨酸合酶、N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶及唾液酸运输蛋白以及唾液酸基转移酶，产生α2，3、α2，6及/或α2，8唾液酸化寡糖。
如本文所用，『半乳糖基化途径(galactosylation pathway)』是包含至少一种选自包含以下者的清单的酶及其各别基因的生化途径：半乳糖-1-表异构酶、半乳糖激酶、葡萄糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、UDP-葡萄糖4-表异构酶、葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、葡萄糖磷酸变位酶以及半乳糖基转移酶，产生包含单糖、双糖或寡糖的半乳糖基化化合物，该化合物在该单糖、该双糖或该寡糖的2、3、4及6羟基中的一或多者上具有α或β结合半乳糖。
如本文所用，『N-乙酰基葡萄糖氨基化途径(N-acetylglucosaminylationpathway)』包含至少一种选自包含以下者的清单的酶及其各别基因的生化途径：L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸脱乙酰基酶、磷酸葡萄糖胺变位酶、N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰基转移酶/葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶以及糖基转移酶，产生包含单糖、双糖或寡糖的GlcNAc修饰的化合物，该化合物在该单糖、该双糖或该寡糖的3、4及6羟基中的一或多者上具有α或β结合N-乙酰基葡萄糖胺(GlcNAc)。
如本文所用，『N-乙酰基半乳糖基化途径(N-acetylgalactosylation pathway)』是包含至少一种选自包含以下者的清单的酶及其各别基因的生化途径：L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶、磷酸葡萄糖胺变位酶、N-乙酰基葡萄糖胺1-磷酸尿苷酰基转移酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺4-表异构酶、UDP-半乳糖4-表异构酶、N-乙酰基半乳糖胺激酶及/或UDP-GalNAc焦磷酸化酶以及糖基转移酶，产生包含单糖、双糖或寡糖的GalNAc修饰的化合物，该化合物在该单糖、该双糖或该寡糖上具有α或β结合N-乙酰基半乳糖胺。
如本文所用，『甘露糖基化途径(mannosylation pathway)』包含至少一种选自包含以下者的清单的酶及其各别基因的生化途径：甘露糖-6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶及/或甘露糖-1-磷酸甲脒基转移酶，以及糖基转移酶，产生包含单糖、双糖或寡糖的甘露糖基化化合物，该化合物在该单糖、该双糖或该寡糖上具有α或β结合甘露糖。
如本文所用，『N-乙酰基甘露糖氨基化途径(N-acetylmannosaminylationpathway)』包含至少一种选自包含以下者的清单的酶及其各别基因的生化途径：L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶、葡萄糖胺-6-磷酸脱胺酶、磷酸葡萄糖胺变位酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸脱乙酰基酶、葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰基转移酶、葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶、葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶、UDP-GlcNAc 2-表异构酶及/或ManNAc激酶，以及糖基转移酶，产生包含单糖、双糖或寡糖的ManNAc修饰的化合物，该化合物在该单糖、该双糖或该寡糖上具有α或β结合N-乙酰甘露糖胺。
术语「甘露糖-6-磷酸异构酶(mannose-6-phosphate isomerase)」、「磷酸甘露糖异构酶(phosphomannose isomerase)」、「甘露糖磷酸异构酶(mannose phosphateisomerase)」、「磷酸己糖异构酶(phosphohexoisomerase)」、「磷酸甘露糖异构酶(phosphomannoisomerase)」、「磷酸甘露糖-异构酶(phosphomannose-isomerase)」、「磷酸己糖变位酶(phosphohexomutase)」、「D-甘露糖-6-磷酸酮醇-异构酶(D-mannose-6-phosphate ketol-isomerase)」及「manA」可互换使用且是指催化D-果糖6-磷酸可逆地转化为D-甘露糖6-磷酸的酶。
术语「磷酸甘露糖变位酶(phosphomannomutase)」、「甘露糖磷酸变位酶(mannosephosphomutase)」、「磷酸甘露糖变位酶(phosphomannose mutase)」、「D-甘露糖1，6-磷酸变位酶(D-mannose 1，6-phosphomutase)」及「manB」可互换使用且是指催化D-甘露糖6-磷酸可逆地转化为D-甘露糖1-磷酸的酶。
术语「甘露糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶(mannose-1-phosphateguanylyltransferase)」、「GTP-甘露糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶(GTP-mannose-1-phosphate guanylyltransferase)」、「磷酸甘露糖异构酶-鸟苷5′-二磷酸-D-甘露糖焦磷酸化酶(phosphomannose isomerase-guanosine 5′-diphospho-D-mannosepyrophosphorylase；PIM-GMP)」、「GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GDP-mannosepyrophosphorylase)」、「鸟苷5′-二磷酸-D-甘露糖焦磷酸化酶(guanosine 5′-diphospho-D-mannose pyrophosphorylase)」、「鸟苷二磷酸甘露糖焦磷酸化酶(guanosinediphosphomannose pyrophosphorylase)」、「鸟苷三磷酸-甘露糖1-磷酸鸟苷酰基转移酶(guanosine triphosphate-mannose 1-phosphate guanylyltransferase)」、「甘露糖1-磷酸鸟苷酰基转移酶(鸟苷三磷酸)(mannose 1-phosphate guanylyltransferase(guanosine triphosphate))」及「manC」可互换使用且是指使用GTP将D-甘露糖-1-磷酸转化为GDP-甘露糖及二磷酸的酶。
术语「GDP-甘露糖4，6-脱水酶(GDP-mannose 4，6-dehydratase)」、「鸟苷5′-二磷酸-D-甘露糖氧化还原酶(guanosine 5′-diphosphate-D-mannose oxidoreductase)」、「鸟苷二磷酸甘露糖氧化还原酶(guanosine diphosphomannose oxidoreductase)」、「鸟苷二磷酸甘露糖4，6-脱水酶(guanosine diphosphomannose 4，6-dehydratase)」、「GDP-D-甘露糖脱水酶(GDP-D-mannose dehydratase)」、「GDP-D-甘露糖4，6-脱水酶(GDP-D-mannose 4，6-dehydratase)」、「GDP-甘露糖4，6-氢-解离酶(GDP-mannose 4，6-hydro-lyase)」、「GDP-甘露糖4，6-氢-解离酶(形成GDP-4-脱氢-6-去氧-D-甘露糖)(GDP-mannose 4，6-hydro-lyase(GDP-4-dehydro-6-deoxy-D-mannose-forming))」及「gmd」可互换使用且是指形成GDP-鼠李糖及GDP-岩藻糖的生物合成的第一步的酶。
术语「GDP-L-岩藻糖合酶(GDP-L-fucose synthase)」、「GDP-4-酮-6-去氧-D-甘露糖-3，5-表异构酶-4-还原酶(GDP-4-keto-6-deoxy-D-mannose-3，5-epimerase-4-reductase)」、「GDP-L-岩藻糖：NADP+4-氧化还原酶(3，5-表异构)(GDP-L-fucose：NADP+4-oxidoreductase(3，5-epimerizing))」及「fc1」可互换使用且是指形成GDP-岩藻糖的生物合成的第二步的酶。
术语「L-岩藻糖激酶/GDP-岩藻糖焦磷酸化酶(L-fucokinase/GDP-fucosepyrophosphorylase)」、「L-岩藻糖激酶/L-岩藻糖-1-P鸟苷酰基转移酶(L-fucokinase/L-fucose-1-P guanylyltransferase)」、「GDP-岩藻糖焦磷酸化酶(GDP-fucosepyrophosphorylase)」、「GDP-L-岩藻糖焦磷酸化酶(GDP-L-fucose pyrophosphorylase)」及「fkp」可互换使用且是指催化使用GTP将L-岩藻糖-1-磷酸转化为GDP-岩藻糖的酶。
术语「L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶(L-glutamine-D-fructose-6-phosphate aminotransferase)」、「麸酰氨酸---果糖-6-磷酸转胺酶(异构化)(glutamine---fructose-6-phosphate transaminase(isomerizing))」、「磷酸己糖氨基转移酶(hexosephosphate aminotransferase)」、「葡萄糖胺-6-磷酸异构酶(形成麸酰氨酸)(glucosamine-6-phosphate isomerase(glutamine-forming)」、「麸酰氨酸-果糖-6-磷酸转胺酶(异构化)(glutamine-fructose-6-phosphate transaminase(isomerizing))」、「D-果糖-6-磷酸酰胺转移酶(D-fructose-6-phosphate amidotransferase)」、「果糖-6-磷酸氨基转移酶(fructose-6-phosphate aminotransferase)」、「磷酸葡萄糖胺异构酶(glucosaminephosphate isomerase)」、「葡萄糖胺6-磷酸合酶(glucosamine 6-phosphatesynthase)」、「GlcN6P合酶(GlcN6P synthase)」、「GFA」、「glms」、「glmS」及「glmS*54」可互换使用且是指催化使用L-麸酰氨酸将D-果糖-6-磷酸转化为D-葡萄糖胺-6-磷酸的酶。
术语「葡萄糖胺-6-P脱胺酶(glucosamine-6-P deaminase)」、「葡萄糖胺-6-磷酸脱胺酶(glucosamine-6-phosphate deaminase)」、「GlcN6P脱胺酶(GlcN6P deaminase)」、「葡萄糖胺-6-磷酸异构酶(glucosamine-6-phosphate isomerase)」、「glmD」及「nagB」可互换使用且是指催化葡萄糖胺-6-磷酸(GlcN6P)的可逆异构化-脱胺作用以形成果糖-6-磷酸及铵离子的酶。
术语「磷酸葡萄糖胺变位酶(phosphoglucosamine mutase)」及「glmM」可互换使用且是指催化葡萄糖胺-6-磷酸转化成葡萄糖胺-1-磷酸的酶。磷酸葡萄糖胺变位酶亦可催化自葡萄糖-1-P形成葡萄糖-6-P，尽管速率要低1400倍。
术语「N-乙酰基葡萄糖胺-6-P脱乙酰基酶(N-acetylglucosamine-6-Pdeacetylase)」、「N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸脱乙酰基酶(N-acetylglucosamine-6-phosphate deacetylase)」及「nagA」可互换使用且是指催化N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸(GlcNAc-6-P)的N-乙酰基的水解以产生葡萄糖胺-6-磷酸(GlcN6P)及乙酸的酶。
N-酰基葡萄糖胺2-表异构酶为催化反应N-酰基-D-葡萄糖胺＝N-酰基-D-甘露糖胺的酶。此酶的替代名称包含N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶、N-乙酰基-D-葡萄糖胺2-表异构酶、GlcNAc 2-表异构酶、N-酰基-D-葡萄糖胺2-表异构酶及N-乙酰基葡萄糖胺表异构酶。
UDP-N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶为催化反应N-乙酰基-D-葡萄糖胺＝N-乙酰基甘露糖胺的酶。此酶的替代名称包含UDP-N-酰基葡萄糖胺2-表异构酶、UDP-GlcNAc-2-表异构酶及UDP-N-乙酰基-D-葡萄糖胺2-表异构酶。
N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶为催化反应N-乙酰基-D-葡萄糖胺6-磷酸＝N-乙酰基-D-甘露糖胺6-磷酸的酶。
双官能UDP-GlcNAc 2-表异构酶/激酶为催化反应UDP-N-乙酰基-D-葡萄糖胺＝N-乙酰基-D-甘露糖胺及反应N-乙酰基-D-甘露糖胺+ATP＝ADP+N-乙酰基-D-甘露糖胺6-磷酸的双官能酶。
葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶为催化乙酰基自乙酰基-CoA转移至D-葡萄糖胺-6-磷酸从而产生自由CoA及N-乙酰基-D-葡萄糖胺6-磷酸的酶。替代名称包含氨基去氧葡萄糖磷酸乙酰基转移酶、D-葡萄糖胺-6-PN-乙酰基转移酶、葡萄糖胺6-磷酸乙酰基酶、葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶、葡萄糖胺-磷酸N-乙酰基转移酶、葡萄糖胺-6-磷酸乙酰基酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸合酶、磷酸葡萄糖胺乙酰基酶、磷酸葡萄糖胺N-乙酰基酶磷酸葡萄糖胺N-乙酰基酶、磷酸葡萄糖胺转乙酰基酶、GNA及GNA1。
术语「N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸磷酸酶(N-acetylglucosamine-6-phosphatephosphatase)」是指使N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸(GlcNAc-6-P)去磷酸化由此合成N-乙酰基葡萄糖胺(GlcNAc)的酶。
术语「N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸磷酸酶(N-acetylmannosamine-6-phosphatephosphatase)」是指使N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸(ManNAc-6P)去磷酸化成N-乙酰基甘露糖胺(ManNAc)的酶。
术语「N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶(N-acetylmannosamine-6-phosphate 2-epimerase)」、「ManNAc-6-P异构酶(ManNAc-6-P isomerase)」、「ManNAc-6-P2-表异构酶(ManNAc-6-P 2-epimerase)」、「N-乙酰基葡萄糖胺-6P2-表异构酶(N-acetylglucosamine-6P 2-epimerase)」及「nanE」可互换使用且是指将ManNAc-6-P转化为N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸(GlcNAc-6-P)的酶。
术语「磷酸乙酰基葡萄糖胺变位酶(phosphoacetylglucosamine mutase)」、「乙酰基葡萄糖胺磷酸变位酶(acetylglucosamine phosphomutase)」、「乙酰基氨基去氧葡萄糖磷酸变位酶(acetylaminodeoxyglucosephosphomutase)」、「磷酸-N-乙酰基葡萄糖胺变位酶(phospho-N-acetylglucosamine mutase)」及「N-乙酰基-D-葡萄糖胺1，6-磷酸变位酶(N-acetyl-D-glucosamine 1，6-phosphomutase)」可互换使用且是指催化将N-乙酰基-葡萄糖胺1-磷酸转化成N-乙酰基葡萄糖胺6-磷酸的酶。
术语「N-乙酰基葡萄糖胺1-磷酸尿苷酰基转移酶(N-acetylglucosamine 1-phosphate utidylyltransferase)」、「N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰基转移酶(N-acetylglucosamine-1-phosphate uridyltransferase)」、「UDP-N-乙酰基葡萄糖胺二磷酸酶(UDP-N-acetylglucosamine diphosphorylase)」、「UDP-N-乙酰基葡萄糖胺焦磷酸化酶(UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase)」、「尿苷二磷酸乙酰基葡萄糖胺焦磷酸化酶(uridine diphosphoacetylglucosamine pyrophosphorylase)」、「UTP：2-乙酰氨基-2-去氧-α-D-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶(UTP：2-acetamido-2-deoxy-alpha-D-glucose-1-phosphate uridylyltransferase)」、「UDP-GlcNAc焦磷酸化酶(UDP-GlcNAcpyrophosphorylase)」、「GlmU尿苷酰基转移酶(GlmU uridylyltransferase)」、「乙酰基葡萄糖胺1-磷酸尿苷酰基转移酶(Acetylglucosamine 1-phosphateuridylyltransferase)」、「UDP-乙酰基葡萄糖胺焦磷酸化酶(UDP-acetylglucosaminepyrophosphorylase)」、「二磷酸尿苷-N-乙酰基葡萄糖胺焦磷酸化酶(uridinediphosphate-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase)」、「尿苷二磷酸乙酰基葡萄糖胺磷酸化酶(uridine diphosphoacetylglucosamine phosphorylase)」及「乙酰基葡萄糖胺1-磷酸尿苷酰基转移酶(acetylglucosamine 1-phosphate uridylyltransferase)」可互换使用且是指催化借由转移尿苷5-单磷酸(自尿苷5-三磷酸(uridine 5-triphosphate；UTP)转移)将N-乙酰基葡萄糖胺1-磷酸(GlcNAc-1-P)转化为UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)的酶。
术语葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶(glucosamine-1-phosphateacetyltransferase)是指催化乙酰基自乙酰剂辅酶A转移至葡萄糖胺-1-磷酸(GlcN-1-P)以生产N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸(GlcNAc-1-P)的酶。
术语「glmU」是指具有N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰基转移酶及葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶活性两者且催化UDP-GlcNAc的从头生物合成途径中的两个依序反应的双官能酶。C端域催化乙酰基自乙酰基辅酶A至GlcN-1-P的转移以生产GlcNAc-1-P，其借由尿苷5-单磷酸的转移而转化成UDP-GlcNAc，此为由N端域催化的反应。
如本文所用的术语「NeunAc合酶(NeunAc synthase)、「N-乙酰基神经氨酸合酶(N-acetylneuraminic acid synthase)」、「N-乙酰基神经氨酸合酶(N-acetylneuraminatesynthase)」、「唾液酸合酶(sialic acid synthase)」、「NeuAc合酶(NeuAc synthase)」、「NeuB」、「NeuB1」、「NeuNAc合酶(NeuNAc synthase)」、「NANA缩合酶(NANA condensingenzyme)」、「N-乙酰基神经氨酸解离酶合酶(N-acetylneuraminate lyase synthase)」、「N-乙酰基神经氨酸缩合酶(N-acetylneuraminic acid condensing enzyme)」可互换使用且是指能够在反应中使用磷酸烯醇丙酮酸(phosphoenolpyruvate；PEP)自N-乙酰基甘露糖胺(N-acetylmannosamine；ManNAc)合成唾液酸的酶。
术语「N-乙酰基神经氨酸解离酶(N-acety1neuraminate lyase)」、「Neu5Ac解离酶(Neu5Ac lyase)」、「N-乙酰基神经氨酸丙酮酸解离酶(N-acetylneuraminate pyruvate-lyase)」、「N-乙酰基神经氨酸醛缩酶(N-acetylneuraminic acid aldolase)」、「NAL酶(NALase)」、「唾液酸解离酶(sialate lyase)」、「唾液酸醛缩酶(sialic acidaldolase)」、「唾液酸解离酶(sialicacidlyase)」及「nanA」可互换使用且是指将N-乙酰基神经氨酸降解为N-乙酰基甘露糖胺(ManNAc)及丙酮酸的酶。
如本文所用的术语「N-酰基神经氨酸-9-磷酸合酶(N-acylneuraminate-9-phosphate synthase)」、「N-酰基神经氨酸-9-磷酸合成酶(N-acylneuraminate-9-phosphate synthetase)」、「NANA合酶(NANA synthase)」、「NANAS」、「NANS」、「NmeNANAS」、「N-乙酰基神经氨酸丙酮酸解离酶(丙酮酸磷酸化)(N-acetylneuraminate pyruvate-lyase(pyruvate-phosphorylating))」可互换使用且是指能够在反应中使用磷酸烯醇丙酮酸(PEP)自N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸(ManNAc-6-磷酸)合成N-酰基神经氨酸-9-磷酸的酶。
术语「N-酰基神经氨酸-9-磷酸酶(N-acylneuraminate-9-phosphatase)」是指能够使N-酰基神经氨酸-9-磷酸去磷酸化以合成N-酰基神经氨酸的酶。
如本文所用的术语「CMP--唾液酸合酶(CMP-sialic acid synthase)」、「N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶(N-acylneuraminate cytidylyltransferase)」、「CMP--唾液酸合酶(CMP-sialate synthase)」、「CMP-NeuAc合酶(CMP-NeuAc synthase)」、「NeuA」及「CMP-N-乙酰基神经氨酸合酶(CMP-N-acetylneuraminic acid synthase)」可互换使用且是指能够在反应中使用CTP自N-乙酰基神经氨酸合成CMP-N-乙酰基神经氨酸的酶。
术语「半乳糖-1-表异构酶(galactose-1-epimerase)」、「醛糖1-表异构酶(aldose1-epimerase)」、「变旋酶(mutarotase)」、「醛糖变旋酶(aldosemutarotase)」、「半乳糖变旋酶(galactose mutarotase)」、「半乳糖1-表异构酶(galactose 1-epimerase)」及「D-半乳糖1-表异构酶(D-galactose l-epimerase)」可互换使用且是指催化β-D-半乳糖转化为α-D-半乳糖的酶。
术语「半乳糖激酶(galactokinase)」、「半乳糖激酶(磷酸化)(galactokinase(phosphorylating))」及「ATP：D-半乳糖-1-磷酸转移酶(ATP：D-galactose-1-phosphotransferase)」可互换使用且是指催化使用ATP将α-D-半乳糖转化成α-D-半乳糖1-磷酸的酶。
术语葡萄糖激酶(glucokinase)及「葡萄糖激酶(磷酸化)(glucokinase(phosphorylating))」可互换使用且是指催化使用ATP将D-葡萄糖转化成D-葡萄糖6-磷酸的酶。
术语「半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶(galactose-1-phosphateuridylyltransferase)」、「Gal-1-P尿苷酰基转移酶(Gal-1-P uridylyltransferase)」、「UDP-葡萄糖---己糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶(UDP-glucose---hexose-1-phosphateuridylyltransferase)」、「尿苷酰基转移酶(uridyl transferas)」、「己糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶(hexose-1-phosphate uridylyltransferase)」、「尿苷酰基转移酶(uridyltransferase)」、「己糖1-磷酸尿苷酰基转移酶(hexose 1-phosphateuridyltransferase)」、「UDP-葡萄糖：α-D-半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶(UDP-glucose：alpha-D-galactose-1-phosphate uridylyltransferase)」、「galB」及「galT」可互换使用且是指催化反应D-半乳糖1-磷酸+UDP-D-葡萄糖＝D-葡萄糖1-磷酸+UDP-D-半乳糖的酶。
术语「UDP-葡萄糖4-表异构酶(UDP-glucose 4-epimerase)」、「UDP-半乳糖4-表异构酶(UDP-galactose 4-epimerase)」、「尿苷二磷酸葡萄糖表异构酶(uridinediphosphoglucose epimerase)」、「半乳糖瓦尔登转化酶(galactowaldenase)」、「UDPG-4-表异构酶(UDPG-4-epimerase)」、「尿苷二磷酸半乳糖4-表异构酶(uridine diphosphategalactose 4-epimerase)」、「尿苷二磷酸-半乳糖-4-表异构酶(uridine diphospho-galactose-4-epimerase)」、「UDP-葡萄糖表异构酶(UDP-glucose epimerase)」、「4-表异构酶(4-epimerase)」、「尿苷二磷酸葡萄糖4-表异构酶(uridine diphosphoglucose 4-epimerase)」、「尿苷二磷酸葡萄糖4-表异构酶(uridinediphosphate glucose4-epimerase)」及「UDP-D-半乳糖4-表异构酶(UDP-D-galactose 4-epimerase)」可互换使用且是指催化UDP-D-葡萄糖转化为UDP-半乳糖的酶。
术语「葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶(glucose-1-phosphateuridylyltransferase)」、「UTP---葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶(UTP---glucose-1-phosphate uridylyltransferase)」、「UDP葡萄糖焦磷酸化酶(UDP glucosepyrophosphorylase)」、「UDPG磷酸化酶(UDPG phosphorylase)」、「UDPG焦磷酸化酶(UDPGpyrophosphorylase)」、「尿苷5′-二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(uridine 5′-diphosphoglucose pyrophosphorylase)」、「尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(uridinediphosphoglucose pyrophosphorylase)」、「尿苷二磷酸-D-葡萄糖焦磷酸化酶(uridinediphosphate-D-glucose pyrophosphorylase)」、「尿苷-二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(uridine-diphosphate glucose pyrophosphorylase)」及「galU」可互换使用且是指催化使用UTP将D-葡萄糖-1-磷酸转化为UDP-葡萄糖的酶。
术语「磷酸葡萄糖变位酶(α-D-葡萄糖-1，6-二磷酸依赖型)(phosphoglucomutase(alpha-D-glucose-1，6-bisphosphate-dependent))」、「葡萄糖磷酸变位酶(不明确)(glucose phosphomutase(ambiguous))」及「磷酸葡萄糖变位酶(不明确)(phosphoglucosemutase(ambiguous))」可互换使用且是指催化D-葡萄糖1-磷酸转化为D-葡萄糖6-磷酸的酶。
术语「UDP-N-乙酰基葡萄糖胺4-表异构酶(UDP-N-acetylglucosamine 4-epimerase)」、「UDP乙酰基葡萄糖胺表异构酶(UDP acetylglucosamine epimerase)」、「尿苷二磷酸乙酰基葡萄糖胺表异构酶(uridine diphosphoacetylglucosamineepimerase)」、「尿苷二磷酸N-乙酰基葡萄糖胺-4-表异构酶(uridine diphosphate N-acetylglucosamine-4-epimerase)」、「尿苷5′-二磷酸-N-乙酰基葡萄糖胺-4-表异构酶(uridine 5′-diphospho-N-acetylglucosamine-4-epimerase)」及「UDP-N-乙酰基-D-葡萄糖胺4-表异构酶(UDP-N-acetyl-D-glucosamine4-epimerase)」可互换使用且是指催化UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)表异构化为UDP-N-乙酰基半乳糖胺(UDP-GalNAc)的酶。
术语「N-乙酰基半乳糖胺激酶(N-acetylgalactosamine kinase)」、「GALK2」、「GK2」、「GalNAc激酶(GalNAc kinase)」、「N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)-1-磷酸激酶(N-acetylgalactosamine(GalNAc)-1-phosphate kinase)」及「ATP：N-乙酰基-D-半乳糖胺1-磷酸转移酶(ATP：N-acetyl-D-galactosamine 1-phosphotransferase)」可互换使用且是指催化使用ATP自N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)合成N-乙酰基半乳糖胺1-磷酸(GalNAc-1-P)的酶。
术语「UDP-N-乙酰基半乳糖胺焦磷酸化酶(UDP-N-acetylgalactosaminepyrophosphorylase)」及「UDP-GalNAc焦磷酸化酶(UDP-GalNAc pyrophosphorylase)」可互换使用且是指使用UTP催化N-乙酰基半乳糖胺1-磷酸(GalNAc-1-P)转化为UDP-N-乙酰基半乳糖胺(UDP-GalNAc)的酶。
术语「N-乙酰基神经氨酸激酶(N-acetylneuraminate kinase)」、「ManNAc激酶(ManNAc kinase)」、「N-乙酰基-D-甘露糖胺激酶(N-acetyl-D-mannosamine kinase)」及「nank」可互换使用且是指使ManNAc磷酸化以合成N-乙酰基甘露糖胺-磷酸(ManNAc-6-P)的酶。
术语「乙酰基-辅酶A合成酶(acetyl-coenzyme A synthetase)」、「acs」、「乙酰基-CoA合成酶(acetyl-CoA synthetase)」、「AcCoA合成酶(AcCoA synthetase)」、「乙酸--CoA接合酶(acetate--CoA ligase)」、「酰基活化酶(acyl-activating enzyme)」及「yfaC」可互换使用且是指在ATP依赖性反应中催化乙酸转化为乙酰基-辅酶A(AcCoA)的酶。
术语「丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase)」、「丙酮酸氧化酶(pyruvateoxidase)」、「POX」、「poxB」及「丙酮酸：泛醌-8氧化还原酶(pyruvate：ubiquinone-8oxidoreductase)」可互换使用且是指催化丙酮酸的氧化去羧以生产乙酸及CO2的酶。
术语「乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase)、「D-乳酸脱氢酶(D-lactatedehydrogenase)」、[ldhA」、「hslI」、「htpH」、「D-LDH」、「发酵性乳酸脱氢酶(fermentativelactate dehydrogenase)」及「D-特异性2-羟基酸脱氢酶(D-specific 2-hydroxyaciddehydrogenase)」可互换使用且是指催化乳酸转化成丙酮酸由此生成NADH的酶。
术语「致能流出(enabled efflux)」意谓在细胞质膜及/或细胞壁上引入溶质的运输活性。该运输可借由引入及/或增加如本发明所描述的运输蛋白的表现来实现。术语「增强的流出(enhanced efflux)」意谓改良溶质在细胞质膜及/或细胞壁上的运输活性。可借由引入及/或增加如本发明所描述的膜运输蛋白的表现来增强溶质在细胞质膜及/或细胞壁上的运输。膜运输蛋白的「表现(expression)」定义为在编码该膜运输蛋白的基因为内源基因的情况下该基因的「过度表现(overexpression)」，或在编码该膜运输蛋白的基因为不存在于野生型菌株或细胞中的异源基因的情况下「表现(expression)」。
如本文所用，术语「细胞生产力指数(cell productivity index，CPI)」是指借由细胞生产的产物的质量除以培养物中生产的细胞的质量。
术语「纯化(purified)」是指实质上或基本上不含干扰生物分子活性的组分的物质。对于细胞、糖、核酸及多肽，术语「纯化」是指实质上或基本上不含通常伴随天然状态下发现的物质的组分的物质。典型地，如借由银染色凝胶上的条带强度或用于确定纯度的其他方法所量测，本发明的纯化糖、寡糖、蛋白质或核酸为至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％纯，通常至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％纯。纯度或均质性可借由所属技术领域中熟知的多种方式指示，所述方式诸如蛋白质或核酸样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳，之后在染色后进行观测。出于某些目的，将需要高解析度及采用HPLC或用于纯化的类似方式。关于双糖及寡糖，纯度可使用诸如但不限于薄层层析、气相层析、NMR、HPLC、毛细管电泳或质谱的方法测定。
术语「培养物(cultivation)」是指其中培养或发酵细胞的培养基、细胞本身及由细胞在全培养液中生产的唾液酸化双糖及/或寡糖，亦即在细胞内部(胞内)以及细胞外部(胞外)。
如本文所用，术语「前驱物(precursor)」是指借由细胞吸收及/或合成以用于特异性生产根据本发明的唾液酸化双糖及/或寡糖的物质。在此意义上，前驱物可为如本文所定义的受体，但亦可为另一物质，亦即代谢物，其首先在细胞内作为唾液酸化双糖及/或寡糖的生物化学合成途径的一部分经修饰。此类前驱物的实例包含如本文所定义的受体；及/或葡萄糖、半乳糖、果糖、甘油、唾液酸、岩藻糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、二羟基丙酮、葡萄糖胺、N-乙酰基-葡萄糖胺、甘露糖胺、N-乙酰基-甘露糖胺、半乳糖胺、N-乙酰基半乳糖胺；磷酸化糖，如例如但不限于葡萄糖-1-磷酸、半乳糖-1-磷酸、葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、果糖-1，6-二磷酸、甘露糖-6-磷酸、甘露糖-1-磷酸、甘油-3-磷酸、甘油醛-3-磷酸、二羟基丙酮-磷酸、葡萄糖胺-6-磷酸、N-乙酰基-葡萄糖胺-6-磷酸、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸、N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸、N-乙酰基-神经氨酸-9-磷酸；及/或如本文所定义的核苷酸活化糖，如例如UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺、CMP-唾液酸、GDP-甘露糖、GDP-4-脱氢-6-去氧-α-D-甘露糖、GDP-岩藻糖。
视情况，细胞经转形以包含及表现至少一种核酸序列，该核酸序列编码选自由以下者组成的群的蛋白质：乳糖运输蛋白；海藻糖运输蛋白；用于核苷酸活化糖的运输蛋白，其中该运输蛋白将a内化至添加前驱物以用于合成本发明的唾液酸化双糖及/或寡糖的培养基中。
如本文所用，术语「受体(acceptor)」是指可借由糖基转移酶修饰的单糖、双糖或寡糖。此类受体的实例包含葡萄糖、半乳糖、果糖、甘油、唾液酸、岩藻糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、乳-N-丙糖、乳-N-四糖(LNT)、乳-N-新四糖(LNnT)、乳-N-五糖(LNP)、乳-N-新五糖、对乳-N-五糖、对乳-N-新五糖、乳-N-新型五糖I、乳-N-六糖(LNH)、乳-N-新六糖(LNnH)、对乳-N-新六糖(pLNnH)、对乳-N-六糖(pLNH)、乳-N-七糖、乳-N-新七糖、对乳-N-新七糖、对乳-N-七糖、乳-N-八糖(LNO)、乳-N-新八糖、异乳-N-八糖、对乳-N-八糖、异乳-N-新八糖、新型乳-N-新八糖、对乳-N-新八糖、异乳-N-九糖、新型乳-N-九糖、乳-N-九糖、乳-N-十糖、异乳-N-十糖、新型乳-N-十糖、乳-N-新十糖及含有1或多个N-乙酰基乳糖胺单元及/或1或多个乳-N-二糖单元的寡糖或寡糖的中间物，其岩藻糖基化及唾液酸化形式。
具体实施方式
根据第一具体实例，本发明提供一种用于生产唾液酸化双糖及/或寡糖的代谢上经工程改造的细胞。在本文中，提供包含用于生产唾液酸化双糖及/或寡糖的途径的代谢上经工程改造的细胞，其经修饰以用于表现及/或过度表现编码一或多种催化相同化学反应的蛋白质的多个编码DNA序列。
根据第二具体实例，本发明提供一种借由代谢上经工程改造的细胞生产唾液酸化双糖及/或寡糖的方法。该方法包含以下步骤：
1)提供如本文所描述的细胞，及
2)在允许生产该唾液酸化双糖及/或寡糖的条件下培养该细胞。
较佳地，将唾液酸化双糖及/或寡糖按本文中所解释自培养物分离。
在本发明的范围内，允许条件应理解为与物理或化学参数相关的条件，所述参数包括但不限于温度、pH、压力、渗透压及产物/前驱物/受体浓度。
在一特定具体实例中，允许条件可包括30+/-20摄氏度的温度范围、7+/-3的pH范围。
根据本发明的方法及/或细胞的一个态样，借由表现及/或过度表现多个编码DNA序列在细胞中编码且催化相同化学反应的一或多种蛋白质为同功蛋白质。同功蛋白质为具有相同蛋白质活性的替代形式，其不同之处可在于氨基酸组成、序列、三维结构、多聚四级结构、蛋白质稳定性、调节特性及动力学参数，包含KM、kcat、催化效率、酶速率及速度中的任何一或多者。同功蛋白质可具有催化相同化学反应的不同催化效率。
根据本发明的方法及/或细胞的一替代态样，借由表现及/或过度表现多个编码DNA序列在细胞中编码且催化相同化学反应的一或多种蛋白质为参与待用于生产唾液酸化双糖及/或寡糖的核苷酸活化糖的合成的蛋白质。
根据本发明的方法及/或细胞的一替代态样，借由表现及/或过度表现多个编码DNA序列在细胞中编码且催化相同化学反应的一或多种蛋白质为膜运输蛋白。根据本发明的方法及/或细胞的一较佳具体实例，该一或多种膜运输蛋白选自包含如本文所定义的螯铁蛋白输出蛋白、ABC运输蛋白、MFS运输蛋白及糖流出运输蛋白的清单。
本发明提供借由用于用代谢上经工程改造的细胞生产唾液酸化双糖及/或寡糖的不同类型的细胞。
在本发明的方法及/或细胞的一较佳具体实例中，细胞表现由多个编码DNA序列表现的一种蛋白质。在本发明的方法及/或细胞的一替代及/或额外较佳具体实例中，细胞表现由多个编码DNA序列表现的两种同功蛋白质。在本发明的方法及/或细胞的一替代及/或额外较佳具体实例中，细胞表现由多个编码DNA序列表现的三种或更多种同功蛋白质。
在本发明的方法及/或细胞的一较佳具体实例中，细胞代谢上经工程改造以包含用于生产如本文所定义的唾液酸化双糖及/或寡糖的途径。在本发明的方法及/或细胞的一替代较佳具体实例中，细胞代谢上经工程改造以包含用于生产唾液酸化双糖及/或寡糖的途径且表现及/或过度表现催化相同化学反应的任何一或多种同功蛋白质。
根据本发明的方法及/或细胞的一较佳态样，借由在细胞中表现及/或过度表现多个编码DNA序列编码的蛋白质及/或两种或更多种同功蛋白质参与用于生产唾液酸化双糖及/或寡糖的途径。
在本发明的方法及/或细胞的一另外较佳态样中，用于生产唾液酸化双糖及/或寡糖的途径包含如本文所定义的唾液酸化途径。
根据本发明的方法及/或细胞的一较佳态样，细胞包含用于生产唾液酸化双糖及/或寡糖的途径，其中该途径包含至少一种选自包含以下者的清单的蛋白质：N-酰基葡萄糖胺2-表异构酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶、UDP-GlcNAc 2-表异构酶/激酶水解、N-乙酰基神经氨酸-9-磷酸合成酶、磷酸酶、N-乙酰基神经氨酸合酶、N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶、唾液酸基转移酶及唾液酸运输蛋白。
根据本发明的方法及/或细胞的一另外较佳态样，细胞表现至少一种选自包含以下者的清单的蛋白质：N-酰基葡萄糖胺2-表异构酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶、UDP-GlcNAc 2-表异构酶/激酶水解、N-乙酰基神经氨酸-9-磷酸合成酶、磷酸酶、N-乙酰基神经氨酸合酶、N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶、唾液酸基转移酶及唾液酸运输蛋白，其中该至少一种蛋白质由所述多个编码DNA序列编码。
根据本发明的方法及/或细胞的另一更佳态样，该N-酰基葡萄糖胺2-表异构酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶、UDP-GlcNAc2-表异构酶/激酶水解、N-乙酰基神经氨酸-9-磷酸合成酶、磷酸酶、N-乙酰基神经氨酸合酶、N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶、唾液酸基转移酶及唾液酸运输蛋白中的任一者为具有经修饰的表现或活性的细胞的内源蛋白，较佳该内源N-酰基葡萄糖胺2-表异构酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶、UDP-GlcNAc 2-表异构酶/激酶水解、N-乙酰基神经氨酸-9-磷酸合成酶、磷酸酶、N-乙酰基神经氨酸合酶、N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶、唾液酸基转移酶及唾液酸运输蛋白中的任一者经过度表现；或者，该N-酰基葡萄糖胺2-表异构酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶、UDP-GlcNAc 2-表异构酶/激酶水解、N-乙酰基神经氨酸-9-磷酸合成酶、磷酸酶、N-乙酰基神经氨酸合酶、N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶、唾液酸基转移酶及唾液酸运输蛋白中的任一者为异质引入且表现于该细胞中、较佳过度表现的异源蛋白。该内源N-酰基葡萄糖胺2-表异构酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶、UDP-GlcNAc 2-表异构酶/激酶水解、N-乙酰基神经氨酸-9-磷酸合成酶、磷酸酶、N-乙酰基神经氨酸合酶、N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶、唾液酸基转移酶及唾液酸运输蛋白中的任一者可在细胞中具有经修饰的表现，该细胞亦表现异源N-酰基葡萄糖胺2-表异构酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶、UDP-GlcNAc 2-表异构酶/激酶水解、N-乙酰基神经氨酸-9-磷酸合成酶、磷酸酶、N-乙酰基神经氨酸合酶、N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶、唾液酸基转移酶及唾液酸运输蛋白中的任一者。
在方法及/或细胞的一较佳具体实例中，细胞包含用于生产唾液酸化双糖及/或寡糖的途径，其中该细胞表现唾液酸运输蛋白，其例如搬运体或P-P键水解驱动运输蛋白，如可经由www.tcdb.org.获得的由Saier Lab Bioinformatics Group运作且管理的运输蛋白分类资料库所定义，如例如具有SEQ ID NO 08的来自大肠杆菌的nanT。唾液酸可添加至细胞中或可借由细胞中表现的酶提供或借由细胞机制提供，如本文所描述。
在方法及/或细胞的另一及/或额外较佳具体实例中，细胞包含用于生产唾液酸化双糖及/或寡糖的途径，其中该细胞表现选自包含α-2，3-唾液酸基转移酶、α-2，6-唾液酸基转移酶及α-2，8-唾液酸基转移酶的清单的唾液酸基转移酶，其将唾液酸自CMP-唾液酸转移至一或多个聚糖受体以生产唾液酸化双糖及/或寡糖。在方法及/或细胞的另一及/或额外较佳具体实例中，细胞表现多于一种唾液酸基转移酶，其合成如本文所定义的任何一或多种唾液酸化双糖及/或寡糖。CMP-唾液酸可添加至细胞中及/或可借由细胞中表现的酶提供或借由细胞机制提供。此类生产CMP-唾液酸的细胞描述于本文中。较佳地，如本文所描述，细胞经修饰以生产CMP-唾液酸。更佳地，如本文所描述，细胞经修饰以用于增强CMP-唾液酸的生产。
在一替代及/或额外较佳具体实例中，细胞包含用于生产唾液酸化双糖及/或寡糖的途径，其中该细胞表现如已知例如来自脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)、智人(Homosapiens)、褐鼠(R.norvegicus)、链霉菌属物种(Streptomyces sp.)、空肠弯曲杆菌(C.jejuni)的N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶，其将唾液酸转化成CMP-唾液酸，及唾液酸基转移酶，包括α-2，3-唾液酸基转移酶、α-2，6-唾液酸基转移酶及/或α-2，8-唾液酸基转移酶。唾液酸可添加至细胞中及/或可借由细胞中表现的酶提供或借由细胞机制提供。此类生产唾液酸的细胞可表现N-乙酰基神经氨酸合酶，如已知例如来自包括脑膜炎奈瑟氏菌及空肠弯曲杆菌的若干物种。较佳地，细胞经修饰以生产唾液酸。更佳地，细胞经修饰以用于增强唾液酸的生产。该修饰可为选自包含以下者的群组的任何一或多者：N-乙酰基神经氨酸解离酶的剔除、N-乙酰基神经氨酸合酶的过度表现及N-乙酰基神经氨酸运输蛋白的过度表现。
在一替代及/或额外较佳具体实例中，细胞包含用于生产唾液酸化双糖及/或寡糖的途径，其中该细胞表现如已知例如来自脑膜炎奈瑟氏菌、链霉菌属空肠弯曲杆菌的N-乙酰基神经氨酸合酶，其将N-乙酰基甘露糖胺(ManNAc)转化成N-乙酰基神经氨酸，N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶及唾液酸基转移酶，如本文所描述。ManNAc可添加至细胞中及/或可借由细胞中表现的酶提供或借由细胞机制提供。此类生产ManNAc的细胞可表现如本文所描述的UDP-N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶。较佳地，细胞经修饰以生产ManNAc。更佳地，细胞经修饰以用于增强ManNAc的生产。该修饰可为例如UDP-N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶的表现。
在一替代及/或额外较佳具体实例中，细胞包含用于生产唾液酸化双糖及/或寡糖的途径，其中该细胞表现磷酸酶，如例如大肠杆菌类HAD磷酸酶基因，包含aphA、Cof、HisB、OtsB、SurE、Yaed、YcjU、YedP、YfbT、YidA、YigB、YihX、YniC、YqaB、YrbL、AppA、Gph、SerB、YbhA、YbiV、YbjL、Yfb、YieH、YjgL、YjjG、YrfG及YbiU，来自恋臭假单胞菌(Pseudomonasputida)的PsMupP，来自酿酒酵母的ScDOG1，及来自枯草杆菌的BsAraL(如WO18122225中所描述)，其将N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸(GlcNAc-6P)转化成N-乙酰基葡萄糖胺(GlcNAc)，及/或磷酸酶，如例如来自候选种(Candidatus)趋磁桑葚状菌属物种(Magnetomorum sp.)HK-1或多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)的N-酰基神经氨酸-9-磷酸酶，其将N-酰基神经氨酸-9-磷酸转化成唾液酸，以及例如表现N-酰基葡萄糖胺2-表异构酶、N-乙酰基神经氨酸合酶、N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶及唾液酸基转移酶，如本文所描述。
在一替代及/或额外较佳具体实例中，细胞包含用于生产唾液酸化双糖及/或寡糖的途径，其中该细胞表现如已知例如来自包括空肠弯曲杆菌、大肠杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、枯草杆菌、鼠柠檬酸杆菌(Citrobacter rodentium)的若干物种的UDP-N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶，其将UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)转化成ManNAc，N-乙酰基神经氨酸合酶及唾液酸基转移酶，其中酶如本文所定义。UDP-GlcNAc可添加至细胞中及/或可借由细胞中表现的酶提供或借由细胞代谢提供。此类生产UDP-GlcNAc的细胞描述于本文中。较佳地，细胞经修饰以生产UDP-GlcNAc。更佳地，如本文所描述，细胞经修饰以用于增强UDP-GlcNAc生产。
在一替代及/或额外较佳具体实例中，细胞包含用于生产唾液酸化双糖及/或寡糖的途径，其中该细胞表现如已知例如来自包括智人、小鼠(Mus musculus)、褐鼠的若干物种的N-乙酰基神经氨酸-9-磷酸合成酶，其将N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸(ManNAc-6-P)转化成N-乙酰基神经氨酸-9-磷酸，磷酸酶、N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶及唾液酸基转移酶，如本文所描述。ManNAc-6-P可添加至细胞中及/或可借由细胞中表现的酶提供或借由细胞代谢提供。此类生产ManNAc-6-P的细胞可例如表现如本文所描述的双官能UDP-GlcNAc 2-表异构酶/激酶。较佳地，细胞经修饰以生产ManNAc-6-P。更佳地，细胞经修饰以用于增强ManNAc-6-P生产。
在一替代及/或额外较佳具体实例中，细胞包含用于生产唾液酸化双糖及/或寡糖的途径，其中该细胞表现如已知例如来自包括智人、褐鼠及小鼠的若干物种的双官能UDP-GlcNAc 2-表异构酶/激酶，其将UDP-GlcNAc转化成ManNAc-6-P，N-酰基神经氨酸-9-磷酸合成酶、N-酰基神经氨酸-9-磷酸磷酸酶、N-乙酰基神经氨酸合酶、N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶及唾液酸基转移酶，其中酶如本文所定义。UDP-GlcNAc可添加至细胞中及/或可借由细胞中表现的酶提供或借由细胞代谢提供。此类生产UDP-GlcNAc的细胞描述于本文中。较佳地，细胞经修饰以生产UDP-GlcNAc。更佳地，如本文所描述，细胞经修饰以用于增强UDP-GlcNAc生产。
在一替代及/或额外较佳具体实例中，细胞包含用于生产唾液酸化双糖及/或寡糖的途径，其中该细胞表现如已知例如来自包括大肠杆菌、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)、肠杆菌属物种(Enterobacter sp.)、链霉菌属的若干物种的N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶，其将N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸(GlcNAc-6P)转化成ManNAc-6-P，N-酰基神经氨酸-9-磷酸合成酶、N-酰基神经氨酸-9-磷酸磷酸酶、N-乙酰基神经氨酸N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶及唾液酸基转移酶e，其中酶如本文所定义。GleNAc-6P可添加至细胞中及/或可借由细胞中表现的酶提供或借由细胞代谢提供。此类生产GlcNAc-6P的细胞可表现将例如待添加至细胞中的中GlcN6P转化为GlcNAc-6P的酶。此酶可为来自包括酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、智人的若干物种的葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶。较佳地，细胞经修饰以生产GlcNAc-6P。更佳地，细胞经修饰以用于增强GlcNAc-6P生产。该修饰可为选自包含以下者的群组的任何一或多者：葡萄糖胺-6-磷酸脱胺酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸脱乙酰基酶的剔除及L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶及/或葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶的过度表现。
在一替代及/或额外较佳具体实例中，细胞包含用于生产唾液酸化双糖及/或寡糖的途径，其中该细胞表现如已知例如来自包括卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)、大肠杆菌、智人、褐鼠的若干物种的N-酰基葡萄糖胺2-表异构酶，其将GlcNAc转化成ManNAc，N-乙酰基神经氨酸合酶、N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶及唾液酸基转移酶，其中酶如本文所定义。GlcNAc可添加至细胞中及/或可借由细胞中表现的酶提供或借由细胞机制提供。此类生产GlcNAc的细胞可表现将GlcNAc-6-磷酸转化成GlcNAc的磷酸酶，如例如以下者中的任何一或多者：大肠杆菌类HAD磷酸酶基因，包含aphA、Cof、HisB、OtsB、SurE、Yaed、YcjU、YedP、YfbT、YidA、YigB、YihX、YniC、YqaB、YrbL、AppA、Gph、SerB、YbhA、YbiV、YbjL、Yfb、YieH、YjgL、YjjG、YrfG及YbiU，来自恋臭假单胞菌的PsMupP，来自酿酒酵母的ScDOG1，及来自枯草杆菌的BsAraL，如WO18122225中所描述。较佳地，细胞经修饰以生产GlcNAc。更佳地，细胞经修饰以用于增强GlcNAc生产。该修饰可为选自包含以下者的群组的任何一或多者：葡萄糖胺-6-磷酸脱胺酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸脱乙酰基酶及/或N-乙酰基-D-葡萄糖胺激酶的剔除及L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶及/或葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶的过度表现。
另外或可替代地，本文所用的宿主细胞视情况经基因修饰以借由引入及/或过度表现能够将各别前驱物及/或受体输入至细胞中的膜运输蛋白，将前驱物及/或受体输入至细胞中。此类运输蛋白为例如膜运输蛋白，其属干螯铁蛋白输出蛋白家族、主要易化子超家族(MFS)、ATP结合卡匣(ABC)运输蛋白家族、糖流出运输蛋白家族或参与例如单糖、双糖及/或寡糖的吸收的PTS系统。
另外或可替代地，本文所用的宿主细胞视情况经基因修饰以借由引入及/或过度表现乳糖透过酶来将乳糖输入至细胞中。该乳糖透过酶例如由lacY基因或lac12基因编码。
另外或可替代地，本文所用的宿主细胞视情况经基因修饰以在膜上输出唾液酸化双糖及/或寡糖。此类运输蛋白为例如膜运输蛋白，其属于螯铁蛋白输出蛋白家族、主要易化子超家族(MFS)、ATP结合卡匣(ABC)运输蛋白家族或糖流出运输蛋白家族。
在本发明的方法及/或细胞的一较佳具体实例中，细胞包含多个编码DNA序列，其中所述多个编码DNA序列包含编码一种蛋白质的相同编码DNA序列的多个复本。
在本发明的方法及/或细胞的另一及/或额外较佳具体实例中，细胞包含多个编码DNA序列，其中所述多个编码DNA序列包含编码一种蛋白质的多个不同编码DNA序列。
在本发明的方法及/或细胞的另一及/或额外较佳具体实例中，细胞包含多个编码DNA序列，其中所述多个编码DNA序列包含编码催化相同化学反应的多个同功蛋白质的多个不同编码DNA序列。
根据本发明的方法及/或细胞的一个态样，术语「多个(multiple)」是至少两个。在本发明的方法及/或细胞的一较佳具体实例中，术语「多个」为至少三个。在本发明的方法及/或细胞的一更佳具体实例中，术语「多个」为至少五个。
在本发明的方法及/或细胞的一例示性具体实例中，细胞包含编码相同蛋白质的两个相同编码DNA序列。在本发明的方法及/或细胞的另一例示性具体实例中，细胞包含编码相同蛋白质的两个不同编码DNA序列。在本发明的方法及/或细胞的另一例示性具体实例中，细胞包含编码催化相同化学反应的两种同功蛋白质的两个不同编码DNA序列。
在本发明的方法及/或细胞的另一例示性具体实例中，细胞包含编码相同蛋白质的三个相同编码DNA序列。在本发明的方法及/或细胞的另一例示性具体实例中，细胞包含两个相同编码DNA序列及一个不同于另外两个编码DNA序列的编码DNA序列，其中该三个编码DNA序列编码相同蛋白质。在本发明的方法及/或细胞的另一例示性具体实例中，细胞包含两个相同编码DNA序列及一个不同于另外两个编码DNA序列的编码DNA序列，其中该三个编码DNA序列编码催化相同化学反应的两种同功蛋白质。在本发明的方法及/或细胞的另一例示性具体实例中，细胞包含编码相同蛋白质的三个不同编码DNA序列。在本发明的方法及/或细胞的另一例示性具体实例中，细胞包含编码催化相同化学反应的三种同功蛋白质的三个不同编码DNA序列。
在本发明的方法及/或细胞的另一例示性具体实例中，细胞包含编码相同蛋白质的五个相同编码DNA序列。在本发明的方法及/或细胞的另一例示性具体实例中，细胞包含编码相同蛋白质的五个不同编码DNA序列。在本发明的方法及/或细胞的另一例示性具体实例中，细胞包含编码催化相同化学反应的两种同功蛋白质的五个不同编码DNA序列。在本发明的方法及/或细胞的另一例示性具体实例中，细胞包含编码催化相同化学反应的三种同功蛋白质的五个不同编码DNA序列。在本发明的方法及/或细胞的另一例示性具体实例中，细胞包含编码催化相同化学反应的四种同功蛋白质的五个不同编码DNA序列。在本发明的方法及/或细胞的另一例示性具体实例中，细胞包含编码催化相同化学反应的五种同功蛋白质的五个不同编码DNA序列。
在本发明的方法及/或细胞的一较佳态样中，代谢上经工程改造的细胞经一或多个包含多个编码DNA序列的基因表现模组修饰，其中由所述多个编码DNA序列中的任一者表现受一或多个调节序列调节。在本发明的方法及/或细胞的另一较佳态样中，表现模组中的任何一或多者的表现为持续性或可调的。
所述表现模组亦称为转录单元且包含用于表现重组基因的聚核苷酸，包括编码DNA序列及可操作地连接于编码基因的适当转录及/或转译控制信号。所述控制信号包含启动子序列、非转译区、核糖体结合位点、终止子序列。所述表现模组可含有用于表现一个单一重组基因的元件，但亦可含有用于表现更多重组基因的元件或可组织于用于整合表现两个或更多个重组基因的操纵子结构中。所述聚核苷酸可借由重组DNA技术，使用所属技术领域中熟知的技术来产生。所属技术领域中具有通常知识者熟知的构筑表现模组的方法包括例如试管内重组DNA技术、合成技术及活体内基因重组。参见例如描述于以下者中的技术：Sambrook等人(2001)Molecular Cloning：a laboratory manual，第3版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，CSH，New York或Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，N.Y(1989且每年更新)。
根据本发明的一较佳态样，细胞经一或多个表现模组修饰。表现模组可整合于该细胞的基因体中或可在载体上呈现至该细胞。该载体可以质体、黏接质体、噬菌体、脂质体或病毒形式存在，其将稳定转形/转染至该代谢上经工程改造的细胞中。此类载体包括尤其染色体、游离型及病毒衍生的载体，例如衍生自细菌质体、噬菌体、转位子、酵母游离基因体、插入元件、酵母染色体元件、病毒的载体及衍生自其组合的载体，诸如衍生自质体及噬菌体遗传元件的载体，诸如黏接质体及噬质体。此等载体可含有选择标记，诸如但不限于抗生素标记、营养缺陷型标记、毒素-抗毒素标记、RNA有义/反义标记。表现是统构筑体可含有调节以及产生表现的控制区。一般而言，就此而言，适用于在宿主中维持、扩增或表现聚核苷酸及/或表现多肽的任何系统或载体可用于表现。适当DNA序列可借由各种熟知及惯例技术，诸如阐述于Sambrook等人(参见上文)中的彼等技术中的任一者插入至表现系统中。对于重组生产，细胞可经基因工程改造以并入表现系统或其部分或本发明的聚核苷酸。向细胞中引入聚核苷酸可借由许多标准实验室手册，诸如Davis等人，Basic Methods inMolecular Biology，(1986)及Sambrook等人，1989，前述文献中所描述的方法来实现。
如本文所用，表现模组包含用于表现至少一种重组基因的聚核苷酸。该重组基因参与在该唾液酸化双糖及/或寡糖的合成中起作用的多肽的表现；或该重组基因连接至该宿主细胞中不参与该唾液酸化双糖及/或寡糖的合成的其他途径。所述重组基因编码具有经修饰的表现或活性的内源蛋白，较佳所述内源蛋白经过度表现；或所述重组基因编码异质引入且表现于该经修饰细胞中、较佳过度表现的异源蛋白。内源蛋白可在亦表现异源蛋白的细胞中具有经修饰的表现。
根据本发明的一较佳态样，所述表现模组中的各者的表现为持续性或可调的，如本文所定义。
根据本发明的方法及/或细胞的另一态样，由多个编码DNA序列编码的蛋白质及/或同功蛋白质参与核苷酸活化糖的合成。在本文中，核苷酸活化糖将用于生产该唾液酸化双糖及/或寡糖。在本发明的方法及/或细胞的一较佳具体实例中，核苷酸活化糖选自包含以下者的清单：UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)、UDP-N-乙酰基半乳糖胺(UDP-GalNAc)、UDP-N-乙酰基甘露糖胺(UDP-ManNAc)、UDP-葡萄糖(UDP-Glc)、UDP-半乳糖(UDP-Gal)、GDP-甘露糖(GDP-Man)、UDP-葡萄糖醛酸、UDP-半乳糖醛酸、UDP-2-乙酰氨基-2，6-双去氧--L-阿拉伯-4-己酮糖、UDP-2-乙酰氨基-2，6-双去氧--L-来苏-4-己酮糖、UDP-N-乙酰基-L-鼠李糖胺(UDP-L-RhaNAc或UDP-2-乙酰氨基-2，6-双去氧-L-甘露糖)、dTDP-N-乙酰基岩藻糖胺、UDP-N-乙酰基岩藻糖胺(UDP-L-FucNAc或UDP-2-乙酰氨基-2，6-双去氧-L-半乳糖)、UDP-N-乙酰基L-纽莫糖胺(UDP-L-PneNAC或UDP-2-乙酰氨基-2，6-双去氧-L-塔罗糖)、UDP-N-乙酰基胞壁酸、UDP-N-乙酰基-L-异鼠李糖胺(UDP-L-QuiNAc或UDP-2-乙酰氨基-2，6-双去氧-L-葡萄糖)、CMP-唾液酸(CMP-Neu5Ac)、CMP-Neu4Ac、CMP-Neu5Ac9N3、CMP-Neu4，5Ac2、CMP-Neu5，7Ac2、CMP-Neu5，9Ac2、CMP-Neu5，7(8，9)Ac2、CMP-N-羟乙酰基神经氨酸(CMP-Neu5Gc)、GDP-岩藻糖(GDP-Fuc)、GDP-鼠李糖及UDP-木糖。在本发明的方法及/或细胞的一更佳具体实例中，核苷酸活化糖选自包含以下者的清单：UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)、UDP-N-乙酰基甘露糖胺(UDP-ManNAc)、CMP-唾液酸(CMP-Neu5Ac)、CMP-Neu4Ac、CMP-Neu5Ac9N3、CMP-Neu4，5Ac2、CMP-Neu5，7Ac2、CMP-Neu5，9Ac2、CMP-Neu5，7(8，9)Ac2及CMP-N-羟乙酰基神经氨酸(CMP-Neu5Gc)。
根据本发明的方法及/或细胞的一较佳态样，由多个编码DNA序列编码且参与核苷酸活化糖的合成的蛋白质及/或同功蛋白质选自包含以下者的清单：甘露糖-6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶、GDP-甘露糖4，6-脱水酶、GDP-L-岩藻糖合酶、L-岩藻糖激酶/GDP-岩藻糖焦磷酸化酶、L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶、葡萄糖胺-6-磷酸脱胺酶、磷酸葡萄糖胺变位酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸脱乙酰基酶、N-乙酰基葡萄糖胺表异构酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6P 2-表异构酶、葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸磷酸酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸磷酸酶、N-乙酰基甘露糖胺激酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶、磷酸乙酰基葡萄糖胺变位酶、N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰基转移酶、葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶、唾液酸合酶、N-乙酰基神经氨酸解离酶、N-酰基神经氨酸-9-磷酸合酶、N-酰基神经氨酸-9-磷酸磷酸酶、CMP-唾液酸合成酶、半乳糖-1-表异构酶、半乳糖激酶、葡萄糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、UDP-葡萄糖4-表异构酶、葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、葡萄糖磷酸变位酶、N-乙酰基葡萄糖胺1-磷酸尿苷酰基转移酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺4-表异构酶、UDP-半乳糖4-表异构酶、N-乙酰基半乳糖胺激酶、UDP-GalNAc焦磷酸化酶、甘露糖-1-磷酸甲脒基转移酶、UDP-GlcNAc 2-表异构酶及ManNAc激酶。
在本发明的方法及/或细胞的另一态样中，细胞在参与核苷酸活化糖的合成的该蛋白质及/或同功蛋白质中的至少一者的表现或活性方面经修饰。在一较佳具体实例中，参与核苷酸活化糖的合成的该蛋白质及/或同功蛋白质为具有经修饰的表现或活性的细胞的内源蛋白，较佳参与核苷酸活化糖的合成的该内源蛋白及/或同功蛋白质经过度表现；或者，参与核苷酸活化糖的合成的该蛋白质及/或同功蛋白质为异质引入且表现于该细胞中、较佳过度表现的异源蛋白。参与核苷酸活化糖的合成的该内源蛋白及/或同功蛋白质可在细胞中具有经修饰的表现，该细胞亦表现参与核苷酸活化糖的合成的异源蛋白及/或同功蛋白质。
在本发明的方法及/或细胞的一较佳具体实例中，细胞经修饰以借由酶的表现自例如GlcNAc生产UDP-GlcNAc，所述酶如例如来自包括智人、大肠杆菌的若干物种的N-乙酰基-D-葡萄糖胺激酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸脱乙酰基酶、磷酸葡萄糖胺变位酶及N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰基转移酶/葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶。更佳地，细胞经修饰以用于增强UDP-GlcNAc生产。该修饰可为选自包含以下者的群组的任何一或多者：N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸脱乙酰基酶的剔除、L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶的过度表现、磷酸葡萄糖胺变位酶的过度表现以及N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰基转移酶/葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶的过度表现。
在本发明的方法及/或细胞的另一较佳具体实例中，细胞经修饰以表现CMP-唾液酸，如例如CMP-Neu5Ac或CMP-Neu5Gc的从头合成。
此类生产CMP-Neu5Ac的细胞可表现将例如唾液酸转化为CMP-Neu5Ac的酶。此酶可为CMP-唾液酸合成酶，如来自包括智人、脑膜炎奈瑟氏菌及多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)的若干物种的N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶。更佳地，细胞经修饰以用于增强CMP-Neu5Ac生产。该修饰可为选自包含以下者的群组的任何一或多者：N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸脱乙酰基酶的剔除、葡萄糖胺-6-磷酸脱胺酶的剔除、CMP-唾液酸合成酶的过度表现以及N-乙酰基-D-葡萄糖胺-2-表异构酶编码基因的过度表现。
CMP-Neu5Gc可经由借由脊椎动物CMP-Neu5Ac羟化酶(CMAH)酶进行的羟基化反应由CMP-Neu5Ac直接合成。更佳地，细胞经修饰以用于增强CMP-Neu5Ge生产。
在本发明的方法及/或细胞的另一较佳具体实例中，本文所用的宿主细胞视情况经基因修饰以表现GDP-岩藻糖的从头合成。GDP-岩藻糖可由细胞中表现的酶提供或借由细胞代谢提供。此类生产GDP-岩藻糖的细胞可表现将例如待添加至细胞中的岩藻糖转化为GDP-岩藻糖的酶。此酶可为例如双官能岩藻糖激酶/岩藻糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶，如来自脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)的Fkp，或一种单独岩藻糖激酶连同一种单独岩藻糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶的组合，如已知其来自若干物种，包括智人、野猪(Sus scrofa)及褐鼠。较佳地，细胞经修饰以生产GDP-岩藻糖。更佳地，细胞经修饰以用于增强GDP-岩藻糖生产。该修饰可为选自包含以下者的群组的任何一或多者：UDP-葡萄糖：十一异戊烯基-磷酸葡萄糖-1-磷酸转移酶编码基因的剔除、GDP-L-岩藻糖合酶编码基因的过度表现、GDP-甘露糖4，6-脱水酶编码基因的过度表现、甘露糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶编码基因的过度表现、磷酸甘露糖变位酶编码基因的过度表现及甘露糖-6-磷酸异构酶编码基因的过度表现。
在本发明的方法及/或细胞的另一较佳具体实例中，本文所用的宿主细胞视情况经基因修饰以表现UDP-Gal的从头合成。UDP-Gal可由细胞中表现的酶提供或借由细胞代谢提供。此类生产UDP-Gal的细胞可表现将例如UDP-葡萄糖转化为UDP-Gal的酶。此酶可例如为如自包括智人、大肠杆菌及褐鼠的若干物种已知的UDP-葡萄糖-4-表异构酶GalE。较佳地，细胞经修饰以生产UDP-Gal。更佳地，细胞经修饰以用于增强UDP-Gal生产。该修饰可为选自包含以下者的群组的任何一或多者：双官能5′-核苷酸酶/UDP-糖水解酶编码基因的剔除、半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶编码基因的剔除及UDP-葡萄糖-4-表异构酶编码基因的过度表现。
在本发明的方法及/或细胞的另一较佳具体实例中，本文所用的宿主细胞视情况经基因修饰以表现UDP-GalNAc的从头合成。可使用UDP-N-乙酰基葡萄糖胺4-表异构酶，如例如来自类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)的wbgU、来自小肠大肠炎耶氏杆菌(Yersinia enterocolitica)的gne或来自绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)血清型O6的wbpP，借由单步反应的作用由UDP-GlcNAc合成UDP-GalNAc。较佳地，细胞经修饰以生产UDP-GalNAc。更佳地，细胞经修饰以用于增强UDP-GalNAc生产。
在本发明的方法及/或细胞的另一较佳具体实例中，本文所用的宿主细胞视情况经基因修饰以表现UDP-ManNAc的从头合成。可经由借由UDP-GlcNAc 2-表异构酶(如例如来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的cap5P、来自大肠杆菌的RffE、来自肺炎链球菌(S.pneumoniae)的Cps19fK及来自肠沙门氏菌(S.enterica)的RfbC)进行表异构化反应，由UDP-GlcNAc直接合成UDP-ManNAc。较佳地，细胞经修饰以生产UDP-ManNAc。更佳地，细胞经修饰以用于增强UDP-ManNAc生产。
根据本发明的方法及/或细胞的另一态样，细胞表现至少一种选自包含以下者的清单的糖基转移酶：岩藻糖基转移酶、唾液酸基转移酶、半乳糖基转移酶、葡萄糖基转移酶、甘露糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶、N-乙酰基半乳糖氨基转移酶、N-乙酰基甘露糖氨基转移酶、木糖基转移酶、葡萄糖醛酸苷转移酶、半乳糖醛酸苷转移酶、葡萄糖氨基转移酶、N-羟乙酰基神经氨基转移酶、鼠李糖基转移酶、N-乙酰基鼠李糖基转移酶、UDP-4-氨基-4，6-双去氧-N-乙酰基-β-L-阿卓糖胺转胺酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺烯醇丙酮酰基转移酶及岩藻糖氨基转移酶。
在本发明的方法及/或细胞的一较佳具体实例中，岩藻糖基转移酶选自包含以下者的清单：α-1，2-岩藻糖基转移酶、α-1，3-岩藻糖基转移酶、α-1，4-岩藻糖基转移酶及α-1，6-岩藻糖基转移酶。
在本发明的方法及/或细胞的一替代及/或额外具体实例中，唾液酸基转移酶选自包含以下者的清单：α-2，3-唾液酸基转移酶、α-2，6-唾液酸基转移酶及α-2，8-唾液酸基转移酶。
在本发明的方法及/或细胞的一替代及/或额外具体实例中，半乳糖基转移酶选自包含以下者的清单：β-1，3-半乳糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺β-1，3-半乳糖基转移酶、β-1，4-半乳糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺β-1，4-半乳糖基转移酶、α-1，3-半乳糖基转移酶及α-1，4-半乳糖基转移酶。
在本发明的方法及/或细胞的一替代及/或额外具体实例中，葡萄糖基转移酶选自包含以下者的清单：α-葡萄糖基转移酶、β-1，2-葡萄糖基转移酶、β-1，3-葡萄糖基转移酶及β-1，4-葡萄糖基转移酶。
在本发明的方法及/或细胞的一替代及/或额外具体实例中，甘露糖基转移酶选自包含以下者的清单：α-1，2-甘露糖基转移酶、α-1，3-甘露糖基转移酶及α-1，6-甘露糖基转移酶。
在本发明的方法及/或细胞的一替代及/或额外具体实例中，N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶选自包含以下者的清单：半乳糖苷β-1，3-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶及β-1，6-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶。
在本发明的方法及/或细胞的一替代及/或额外具体实例中，N-乙酰基半乳糖氨基转移酶选自包含α-1，3-N-乙酰基半乳糖氨基转移酶的清单。
在本发明的方法及/或细胞的另一态样中，细胞在所述糖基转移酶中的至少一者的表现或活性方面经修饰。在一较佳具体实例中，该糖基转移酶为具有经修饰的表现或活性的细胞的内源蛋白，较佳该内源糖基转移酶经过度表现；或者，该糖基转移酶为异质引入且表现于该细胞中、较佳过度表现的异源蛋白。该内源糖基转移酶可在亦表现异源糖基转移酶的细胞中具有经修饰的表现。
在本发明的方法及/或细胞的额外及/或替代其他态样中，细胞经修饰以用于表现及/或过度表现编码两种或更多种催化相同化学反应的糖基转移酶的多个编码DNA序列。在本发明的方法及/或细胞的一较佳具体实例中，由多个编码DNA序列在细胞中表现的一或多种糖基转移酶为具有α-1，2-；α-1，3-；α-1，4-及/或α-1，6-岩藻糖基转移酶活性的酶。
在本发明的方法及/或细胞的一替代及/或额外具体实例中，由多个编码DNA序列在细胞中表现的一或多种糖基转移酶为具有α-2，3-；α-2，6-及/或α-2，8-唾液酸基转移酶活性的酶。
在本发明的方法及/或细胞的一替代及/或额外具体实例中，由多个编码DNA序列在细胞中表现的一或多种糖基转移酶为具有α-1，3-；α-1，4-；β-1，3-及/或β-1，4-半乳糖基转移酶活性的酶。
在本发明的方法及/或细胞的一替代及/或额外具体实例中，由多个编码DNA序列在细胞中表现的一或多种糖基转移酶为具有N-乙酰基葡萄糖胺β-1，3-及/或N-乙酰基葡萄糖胺β-1，4-半乳糖基转移酶活性的酶。
在本发明的方法及/或细胞的一替代及/或额外具体实例中，由多个编码DNA序列在细胞中表现的一或多种糖基转移酶为具有α-；β-1，2-；β-1，3-及/或β-1，4-葡萄糖基转移酶活性的酶。
在本发明的方法及/或细胞的一替代及/或额外具体实例中，由多个编码DNA序列在细胞中表现的一或多种糖基转移酶为具有α-1，2-；α-1，3-及/或α-1，6-甘露糖基转移酶活性的酶。
在本发明的方法及/或细胞的一替代及/或额外具体实例中，由多个编码DNA序列在细胞中表现的一或多种糖基转移酶为具有半乳糖苷β-1，3-及/或β-1，6-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶活性的酶。
在本发明的方法及/或细胞的一替代及/或额外具体实例中，由多个编码DNA序列在细胞中表现的一或多种糖基转移酶为具有α-1，3-N-乙酰基半乳糖氨基转移酶活性的酶。
根据本发明的方法及/或细胞的另一态样，由多个编码DNA序列编码的蛋白质为膜运输蛋白。根据本发明的方法及/或细胞的另一态样，该膜运输蛋白参与唾液酸化双糖及/或寡糖的生产。
根据本发明的方法及/或细胞的一较佳具体实例，细胞表现选自包含以下者的清单的膜运输蛋白的两个或更多个复本：螯铁蛋白输出蛋白、ABC运输蛋白、MFS运输蛋白及糖流出运输蛋白。在本发明的方法及/或细胞的一例示性具体实例中，细胞包含两个或更多个编码DNA序列，其编码相同螯铁蛋白输出蛋白，如例如包含具有SEQ ID NO 49的entS、具有SEQ ID NO 50的MdfA及具有SEQ ID NO 51的iceT的大肠杆菌基因。在本发明的方法及/或细胞的另一及/或额外例示性具体实例中，细胞包含两个或更多个编码DNA序列，其编码相同ABC运输蛋白，如例如具有SEQ ID NO 52的来自大肠杆菌的oppF、来自乳酸乳球菌乳酸亚种二乙酰基乳酸生物型(Lactococcus lactis subsp.lactis bv.diacetylactis)的lmrA及来自长双叉杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)的Blon_2475。在本发明的方法及/或细胞的另一及/或额外例示性具体实例中，细胞包含两个或更多个编码相同MFS运输蛋白的编码DNA序列，如例如包含具有SEQ ID NO 49的entS、具有SEQ ID NO50的MdfA及具有SEQ ID NO 51的iceT的大肠杆菌基因。在本发明的方法及/或细胞的另一及/或额外例示性具体实例中，细胞包含两个或更多个编码相同糖流出运输蛋白的编码DNA序列，如例如包含具有SEQ ID NO 55的setA、具有SEQ ID NO 56的setB及具有SEQ ID NO57的setC的大肠杆菌基因。
在本发明的方法及/或细胞的另一及/或额外例示性具体实例中，细胞包含螯铁蛋白输出蛋白的一个编码DNA序列与ABC运输蛋白、MFS运输蛋白及/或糖流出运输蛋白中的任何一或多者的两个或更多个编码DNA序列的组合。在本发明的方法及/或细胞的另一及/或额外例示性具体实例中，细胞包含ABC运输蛋白的一个编码DNA序列与螯铁蛋白运输蛋白、MFS运输蛋白及/或糖流出运输蛋白中的任何一或多者的两个或更多个编码DNA序列的组合。在本发明的方法及/或细胞的另一及/或额外例示性具体实例中，细胞包含MFS运输蛋白的一个编码DNA序列与螯铁蛋白运输蛋白、ABC运输蛋白及/或糖流出运输蛋白中的任何一或多者的两个或更多个编码DNA序列的组合。在本发明的方法及/或细胞的另一及/或额外例示性具体实例中，细胞包含糖流出运输蛋白的一个编码DNA序列与螯铁蛋白运输蛋白、ABC运输蛋白及/或MFS运输蛋白中的任何一或多者的两个或更多个编码DNA序列的组合。
在本发明的方法及/或细胞的另一及/或额外例示性具体实例中，细胞包含螯铁蛋白运输蛋白的一个编码DNA序列及ABC运输蛋白的一个编码DNA序列与MFS运输蛋白及/或糖流出运输蛋白中的任何一或多者的两个或更多个编码DNA序列的组合。在本发明的方法及/或细胞的另一及/或额外例示性具体实例中，细胞包含螯铁蛋白运输蛋白的一个编码DNA序列及MFS运输蛋白的一个编码DNA序列与ABC运输蛋白及/或糖流出运输蛋白中的任何一或多者的两个或更多个编码DNA序列的组合。在本发明的方法及/或细胞的另一及/或额外例示性具体实例中，细胞包含螯铁蛋白运输蛋白的一个编码DNA序列及糖流出运输蛋白的一个编码DNA序列与ABC运输蛋白及/或MFS运输蛋白中的任何一或多者的两个或更多个编码DNA序列的组合。在本发明的方法及/或细胞的另一及/或额外例示性具体实例中，细胞包含ABC运输蛋白的一个编码DNA序列及MFS运输蛋白的一个编码DNA序列与螯铁蛋白运输蛋白及/或糖流出运输蛋白中的任何一或多者的两个或更多个编码DNA序列的组合。在本发明的方法及/或细胞的另一及/或额外例示性具体实例中，细胞包含ABC运输蛋白的一个编码DNA序列及糖流出运输蛋白的一个编码DNA序列与螯铁蛋白运输蛋白及/或MFS运输蛋白中的任何一或多者的两个或更多个编码DNA序列的组合。在本发明的方法及/或细胞的另一及/或额外例示性具体实例中，细胞包含MFS运输蛋白的一个编码DNA序列及糖流出运输蛋白的一个编码DNA序列与螯铁蛋白运输蛋白及/或ABC运输蛋白中的任何一或多者的两个或更多个编码DNA序列的组合。
在本发明的方法及/或细胞的另一及/或额外例示性具体实例中，细胞包含螯铁蛋白运输蛋白的一个编码DNA序列、ABC运输蛋白的一个编码DNA序列及MFS运输蛋白的一个编码DNA序列与糖流出运输蛋白的两个或更多个编码DNA序列的组合。在本发明的方法及/或细胞的另一及/或额外例示性具体实例中，细胞包含螯铁蛋白运输蛋白的一个编码DNA序列、MFS运输蛋白的一个编码DNA序列及糖流出运输蛋白的一个编码DNA序列与ABC运输蛋白的两个或更多个编码DNA序列的组合。在本发明的方法及/或细胞的另一及/或额外例示性具体实例中，细胞包含ABC运输蛋白的一个编码DNA序列、MFS运输蛋白的一个编码DNA序列及糖流出运输蛋白的一个编码DNA序列与螯铁蛋白运输蛋白的两个或更多个编码DNA序列的组合。
在本发明的方法及/或细胞的另一态样中，细胞在该膜运输蛋白中的至少一者的表现或活性方面经修饰。在一较佳具体实例中，该膜运输蛋白为具有经修饰的表现或活性的细胞的内源蛋白，较佳该内源膜运输蛋白经过度表现；或者，该膜运输蛋白为异质引入且表现于该细胞中、较佳过度表现的异源蛋白。该内源膜运输蛋白可在亦表现异源膜运输蛋白的细胞中具有经修饰的表现。
根据本发明的方法及/或细胞的另一态样，唾液酸化双糖及/或寡糖选自包含以下者的清单：乳寡糖、O-抗原、肠内菌共同抗原(ECA)、存在于荚膜多糖中的寡糖重复、肽聚糖、氨基-糖及路易斯型抗原寡糖。在一较佳具体实例中，乳寡糖为哺乳动物乳寡糖。在一更佳具体实例中，乳寡糖为人乳寡糖。
根据本发明的方法及/或细胞的另一态样，细胞包含如本文所描述的岩藻糖基化途径。根据一较佳具体实例，至少一种编码作为岩藻糖基化途径的一部分的酶的蛋白质由编码一或多种催化相同化学反应的酶的多个编码DNA序列编码。根据一更佳具体实例，至少一种编码作为岩藻糖基化途径的一部分的酶的蛋白质由编码一或多种催化相同化学反应的酶的两个编码DNA序列编码。根据一甚至更佳具体实例，至少一种编码作为岩藻糖基化途径的一部分的酶的蛋白质由编码一或多种催化相同化学反应的酶的三个或更多个编码DNA序列编码。
根据本发明的方法及/或细胞的另一态样，细胞包含如本文所描述的半乳糖基化途径。根据一较佳具体实例，至少一种编码作为半乳糖基化途径的一部分的酶的蛋白质由编码一或多种催化相同化学反应的酶的多个编码DNA序列编码。根据一更佳具体实例，至少一种编码作为半乳糖基化途径的一部分的酶的蛋白质由编码一或多种催化相同化学反应的酶的两个编码DNA序列编码。根据一甚至更佳具体实例，至少一种编码作为半乳糖基化途径的一部分的酶的蛋白质由编码一或多种催化相同化学反应的酶的三个或更多个编码DNA序列编码。
根据本发明的方法及/或细胞的另一态样，细胞包含如本文所描述的N-乙酰基葡萄糖氨基化途径。根据一较佳具体实例，至少一种编码作为N-乙酰基葡萄糖氨基化途径的一部分的酶的蛋白质由编码一或多种催化相同化学反应的酶的多个编码DNA序列编码。根据一更佳具体实例，至少一种编码作为N-乙酰基葡萄糖氨基化途径的一部分的酶的蛋白质由编码一或多种催化相同化学反应的酶的两个编码DNA序列编码。根据一甚至更佳具体实例，至少一种编码作为N-乙酰基葡萄糖氨基化途径的一部分的酶的蛋白质由编码一或多种催化相同化学反应的酶的三个或更多个编码DNA序列编码。
根据本发明的方法及/或细胞的另一较佳态样，细胞能够合成N-乙酰基甘露糖胺(ManNAc)、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸(ManNAc-6-磷酸)及/或磷酸烯醇丙酮酸(PEP)。
在一较佳具体实例中，细胞包含用于生产唾液酸化双糖及/或寡糖的途径，其包含用于生产ManNAc的途径。ManNAc可由细胞中表现的酶提供或借由细胞机制提供。此类生产ManNAc的细胞可表现如已知例如来自包括卵形拟杆菌、大肠杆菌、智人、褐鼠的若干物种的N-酰基葡萄糖胺2-表异构酶，其将GlcNAc转化成ManNAc。可替代地及/或另外，生产ManNAc的细胞可表现如已知例如来自包括空肠弯曲杆菌、大肠杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、枯草杆菌、鼠柠檬酸杆菌的若干物种的UDP-N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶，其将UDP-GlcNAc转化成ManNAc。GlcNAc及/或UDP-GlcNAc可添加至细胞中及/或借由细胞中表现的酶提供或借由细胞机制提供，如本文所描述。
在一更佳具体实例中，细胞经修饰以用于增强ManNAc生产。该修饰可为选自包含以下者的群组的任何一或多者：N-乙酰基甘露糖胺激酶的剔除、N-乙酰基神经氨酸解离酶的过度表现。
在另一较佳具体实例中，细胞包含用于生产唾液酸化双糖及/或寡糖的途径，其包含用于生产ManNAc-6-磷酸的途径。ManNAc-6-磷酸可由细胞中表现的酶提供或借由细胞机制提供。此类生产ManNAc-6-磷酸的细胞可表现如已知例如来自包括智人、褐鼠及小鼠的若干物种的双官能UDP-GlcNAc 2-表异构酶/激酶，其将UDP-GlcNAc转化成ManNAc-6-磷酸。可替代地及/或另外，生产ManNAc-6-磷酸的细胞可表现将GlcNAc-6-磷酸转化成ManNAc-6-磷酸的N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶。UDP-GlcNAc及/或GlcNAc-6-磷酸可添加至细胞中及/或借由细胞中表现的酶提供或借由细胞机制提供，如本文所描述。在一更佳具体实例中，细胞经修饰以用于增强ManNAc-6-磷酸生产。该修饰可为选自包含以下者的群组的任何一或多者：N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸脱乙酰基酶的过度表现、N-乙酰基-D-葡萄糖胺激酶的过度表现、磷酸葡萄糖胺变位酶的过度表现、N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰基转移酶/葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶的过度表现。
在另一较佳具体实例中，细胞包含用于生产唾液酸化双糖及/或寡糖的途径，其包含用于生产磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的途径。
在另一较佳具体实例中，细胞包含用于生产唾液酸化双糖及/或寡糖的途径，其包含用于增强PEP的生产及/或供应的任何一或多种修饰。
在一较佳具体实例中及作为用于PEP的经增强生产及/或供应的手段，一或多种PEP依赖型、糖运输磷酸转移酶系统被破坏，诸如但不限于：1)N-乙酰基-D-葡萄糖胺Npi-磷酸转移酶(EC 2.7.1.193)，其举例而言由大肠杆菌或芽孢杆菌物种中的nagE基因(或簇nagABCD)编码，2)ManXYZ，其编码输入外源己糖(甘露糖、葡萄糖、葡萄糖胺、果糖、2-去氧葡萄糖、甘露糖胺、N-乙酰基葡萄糖胺等)及释放磷酸至细胞细胞质中的酶ll Man复合物(甘露糖PTS透过酶、蛋白质-Npi-磷酸组氨酸-D-甘露糖磷酸转移酶)，3)葡萄糖特异性PTS运输蛋白(举例而言由PtsG/Crr编码)，其在细胞质中吸收葡萄糖且形成葡萄糖-6-磷酸，4)蔗糖特异性PTS运输蛋白，其在细胞质中吸收蔗糖且形成蔗糖-6-磷酸，5)果糖特异性PTS运输蛋白(举例而言由基因fruA及fruB编码及激酶fruK编码，该激酶fruK在第一步骤中吸收果糖且形成果糖-1-磷酸且在第二步骤中形成果糖1，6二磷酸，6)乳糖PTS运输蛋白(举例而言由干酪乳球菌(Lactococcus casei)中的lacE编码)，其吸收乳糖且形成乳糖-6-磷酸，7)半乳糖醇特异性PTS酶，其吸收半乳糖醇及/或山梨糖醇且分别形成半乳糖醇-1-磷酸或山梨糖醇-6-磷酸，8)甘露糖醇特异性PTS酶，其吸收甘露糖醇及/或山梨糖醇且分别形成甘露糖醇-1-磷酸或山梨糖醇-6-磷酸，及9)海藻糖特异性PTS酶，其吸收海藻糖且形成海藻糖-6-磷酸。
在另一及/或额外较佳具体实例中及作为用于PEP的经增强生产及/或供应的手段，借由破坏PtsIH/Crr基因簇来破坏完整PTS系统。PtsI(酶I)为充当大肠杆菌K-12的磷酸烯醇丙酮酸：糖磷酸转移酶系统(PTS糖)的闸道的细胞质蛋白。PtsI为PTS糖的两种(PtsI及PtsH)糖非特异性蛋白质成分中的一者，其与糖特异性内膜透过酶一起实现引起多种碳水化合物受质的偶合磷酸化及运输的磷酸转移级联。HPr(含有组氨酸的蛋白质)为PTS糖的两种糖非特异性蛋白质成分中的一者。其接受来自磷酸化酶I(PtsI-P)的磷酰基且接着将其转移至PTS糖的许多糖特异性酶(统称为酶II)中的任一者的EIIA域。在需要PtsH及PtsI的反应中，Crr或EIIAGlc由PEP磷酸化。
在另一及/或额外较佳具体实例中，细胞进一步修饰以借由对应透过酶的引入及/或过度表现来补偿碳源的PTS系统的缺失。此等为例如透过酶或ABC运输蛋白，其包含但不限于特异性地输入乳糖的运输蛋白，诸如由来自大肠杆菌的LacY基因编码的运输蛋白；输入蔗糖的运输蛋白，诸如由来自大肠杆菌的cscB基因编码的运输蛋白；输入葡萄糖的运输蛋白，诸如由来自大肠杆菌的galP基因编码的运输蛋白；输入果糖的运输蛋白，诸如由来自变形链球菌(Streptococcus mutans)的fruI基因编码的运输蛋白；或为山梨糖醇/甘露糖醇ABC运输蛋白，诸如由类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)的簇SmoEFGK编码的运输蛋白；海藻糖/蔗糖/麦芽糖运输蛋白，诸如由苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)的基因簇ThuEFGK编码的运输蛋白；及N-乙酰基葡萄糖胺/半乳糖/葡萄糖运输蛋白，诸如由奥奈达希瓦氏菌(Shewanella oneidensis)的NagP编码的运输蛋白。PTS缺失与替代运输蛋白的过度表现的组合的实例为：1)葡萄糖PTS系统(例如ptsG基因)的缺失与葡萄糖透过酶(例如glcP的galP)的引入及/或过度表现组合，2)果糖PTS系统(例如fruB、fruA、fruK基因中的一或多者)的缺失与果糖透过酶(例如fruI)的引入及/或过度表现组合，3)乳糖PTS系统的缺失与乳糖透过酶(例如LacY)的引入及/或过度表现组合，及/或4)蔗糖PTS系统的缺失与蔗糖透过酶(例如cscB)的引入及/或过度表现组合。
在另一较佳具体实例中，细胞经修饰以借由引入碳水化合物激酶，诸如葡萄糖激酶(EC 2.7.1.1、EC 2.7.1.2、EC 2.7.1.63)、半乳糖激酶(EC 2.7.1.6)及/或果糖激酶(EC2.7.1.3、EC 2.7.1.4)来补偿碳源的PTS系统的缺失。PTS缺失与替代运输蛋白及激酶的过度表现的组合的实例为：1)葡萄糖PTS系统(例如ptsG基因)的缺失，与葡萄糖透过酶(例如glcP的galP)的引入及/或过度表现组合，与葡萄糖激酶(例如glk)的引入及/或过度表现组合，及/或2)果糖PTS系统(例如fruB、fruA、fruK基因中的一或多者)的缺失，与果糖透过酶(例如fruI)的引入及/或过度表现组合，与果糖激酶(例如frk或mak)的引入及/或过度表现组合。
在另一及/或额外较佳具体实例中且作为用于PEP的经增强生产及/或供应的手段，细胞借由引入包含以下者的清单中的任何一或多者或在包含以下者的清单中的任何一或多者方面进行修饰来修饰：磷酸烯醇丙酮酸合酶活性(EC：2.7.9.2，举例而言在大肠杆菌中借由ppsA编码)、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性(EC 4.1.1.32或EC 4.1.1.49，举例而言分别在麸氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)中借由PCK编码或在大肠杆菌中借由pckA编码)；磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性(EC 4.1.1.31，举例而言在大肠杆菌中借由ppc编码)；草酰乙酸脱羧酶活性(EC 4.1.1.112，举例而言在大肠杆菌中借由eda编码)；丙酮酸激酶活性(EC 2.7.1.40，举例而言在大肠杆菌中借由pykA及pykF编码)；丙酮酸羧化酶活性(EC 6.4.1.1，举例而言在枯草杆菌中借由pyc编码)；及苹果酸脱氢酶活性(EC 1.1.1.38或EC 1.1.1.40，举例而言在大肠杆菌中分别借由maeA或maeB编码)。
在一更佳具体实例中，细胞经修饰以过度表现所述多肽中的任一或多者，所述多肽包含具有SEQ ID NO 41的来自大肠杆菌的ppsA、具有SEQ ID NO 42的来自麸氨酸棒状杆菌的PCK、具有SEQ ID NO 43的来自大肠杆菌的pcka、具有SEQ ID NO 44的来自大肠杆菌的eda、具有SEQ ID NO 45的来自大肠杆菌的maeA及具有SEQ ID NO 46的来自大肠杆菌的maeB。
在另一及/或额外较佳具体实例中，细胞经修饰以表现SEQ ID NO 41、42、43、44、45或46中的任一者的功能同源物、变异体或衍生物中的任何一或多者，其与具有SEQ ID NO41、42、43、44、45或46的该多肽中的任一者的全长具有至少80％整体序列一致性，且分别具有磷酸烯醇丙酮酸合酶活性、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性、草酰乙酸去脱羧酶活性或苹果酸脱氢酶活性。
在另一及/或额外较佳具体实例中且作为用于PEP的经增强生产及/或供应的手段，细胞借由磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性及/或丙酮酸激酶活性的降低活性，较佳缺失编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶活性及/或丙酮酸激酶的基因加以修饰。
在一例示性具体实例中，细胞借由不同调适经基因修饰，所述不同调适诸如磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与丙酮酸激酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与丙酮酸激酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、草酰乙酸脱羧酶的过度表现与丙酮酸激酶基因的缺失组合、草酰乙酸脱羧酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、草酰乙酸脱羧酶的过度表现与丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、苹果酸脱氢酶的过度表现与丙酮酸激酶基因的缺失组合、苹果酸脱氢酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合及/或苹果酸脱氢酶的过度表现与丙酮酸羧化酶基因的缺失组合。
在另一例示性具体实例中，细胞借由不同调适经基因修饰，所述不同调适诸如磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现组合、草酰乙酸脱羧酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及草酰乙酸脱羧酶的过度表现组合，磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现组合及/或磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现组合。
在另一例示性具体实例中，细胞借由不同调适经基因修饰，所述不同调适诸如磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因的缺失组合、草酰乙酸脱羧酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及草酰乙酸脱羧酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因的缺失组合。
在另一例示性具体实例中，细胞借由不同调适经基因修饰，所述不同调适诸如磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、草酰乙酸脱羧酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及草酰乙酸脱羧酶的过度表现以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合。
在另一例示性具体实例中，细胞借由不同调适经基因修饰，所述不同调适诸如磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现以及丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现以及丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现以及丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、草酰乙酸脱羧酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及草酰乙酸脱羧酶的过度表现以及丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸羧化酶基因的缺失组合。
在另一例示性具体实例中，细胞借由不同调适经基因修饰，所述不同调适诸如磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、草酰乙酸脱羧酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及草酰乙酸脱羧酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合。
在另一例示性具体实例中，细胞借由不同调适经基因修饰，所述不同调适诸如磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、草酰乙酸脱羧酶的过度表现与苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及草酰乙酸脱羧酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现及草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合、磷酸烯醇丙酮酸合酶的过度表现与草酰乙酸脱羧酶的过度表现及苹果酸脱氢酶的过度表现以及丙酮酸激酶基因及丙酮酸羧化酶基因及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的缺失组合。
根据本发明的方法及/或细胞的另一态样，细胞包含编码具有N-乙酰基神经氨酸合酶活性的蛋白质的至少一个编码DNA序列、编码2种或更多种具有N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶活性的同功蛋白质的两个或更多个编码DNA序列及α-2，3-唾液酸基转移酶、α-2，6-唾液酸基转移酶及/或α-2，8-唾液酸基转移酶的一或多个编码DNA序列的两个或更多个复本。在本发明的方法及/或细胞的一较佳具体实例中，具有N-乙酰基神经氨酸合酶活性的蛋白质为具有SEQ ID NO 01的来自脑膜炎奈瑟氏菌的N-乙酰基神经氨酸合酶(NmNeuB)。在本发明的方法及/或细胞的一替代较佳具体实例中，具有N-乙酰基神经氨酸合酶活性的蛋白质为具有SEQ ID NO 01的来自脑膜炎奈瑟氏菌的N-乙酰基神经氨酸合酶(NmNeuB)的功能同源物或功能片段。在本发明的方法及/或细胞的另一替代较佳具体实例中，具有N-乙酰基神经氨酸合酶活性的蛋白质为与具有SEQ ID NO 01的来自脑膜炎奈瑟氏菌的N-乙酰基神经氨酸合酶(NmNeuB)的全长序列具有至少80％序列一致性且具有N-乙酰基神经氨酸合酶活性的多肽序列。在本发明的方法及/或细胞的另一较佳具体实例中，具有N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶活性的同功蛋白质选自包含以下者的清单：具有SEQ ID NO 02的来自空肠弯曲杆菌的蛋白质(CjNeuA)、具有SEQ ID NO 03的来自流感螺旋杆菌(Helicobacterinfluenzae)的蛋白质(HiNeuA)及具有SEQ ID NO 04的来自多杀性巴氏杆菌的蛋白质(PmultNeuA)。在本发明的方法及/或细胞的一替代较佳具体实例中，具有N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶活性的同功蛋白质为具有SEQ ID NO 02、03或04的蛋白质中的任一者的功能同源物或功能片段。在本发明的方法及/或细胞的另一替代较佳具体实例中，具有N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶活性的同功蛋白质为与具有SEQ ID NO 02、03或04的所述蛋白质中的任一者的全长序列分别具有至少80％序列一致性，且具有N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶活性的多肽序列。
根据本发明的方法及/或细胞的另一态样，细胞包含编码具有L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶活性的酶的编码DNA序列的两个或更多个复本。在方法及/或细胞的一较佳具体实例中，细胞包含编码具有SEQ ID NO 05的来自大肠杆菌的酶(glmS*54)的编码DNA序列的两个或更多个复本。在方法及/或细胞的另一及/或额外较佳具体实例中，细胞包含编码具有SEQ ID NO 05的来自大肠杆菌的L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶(glmS*54)的功能同源物或功能片段的编码DNA序列的两个或更多个复本。在方法及/或细胞的另一及/或额外较佳具体实例中，细胞包含编码与具有SEQ ID NO 05的来自大肠杆菌的L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶(glmS*54)的全长序列具有至少80％序列一致性，且具有L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶活性的多肽序列的编码DNA序列的两个或更多个复本。
根据本发明的方法及/或细胞的另一及/或额外态样，细胞包含编码具有葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶活性的编码DNA序列的两个或更多个复本。在方法及/或细胞的一较佳具体实例中，细胞包含编码具有SEQ ID NO 06的来自酿酒酵母的酶(GNA1)的编码DNA序列的两个或更多个复本。在方法及/或细胞的另一及/或额外较佳具体实例中，细胞包含编码具有SEQ ID NO 06的来自酿酒酵母的葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶(GNA1)的功能同源物或功能片段的编码DNA序列的两个或更多个复本。在方法及/或细胞的另一及/或额外较佳具体实例中，细胞包含编码与具有SEQ ID NO 06的来自酿酒酵母的葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶(GNA1)的全长序列具有至少80％序列一致性，且具有葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶活性的多肽序列的编码DNA序列的两个或更多个复本。
根据本发明的方法及/或细胞的另一较佳态样，细胞包含用于减少乙酸生产的修饰。该修饰可为选自包含以下者的群组的任何一或多者：乙酰基-辅酶A合成酶的过度表现、完全或部分剔除丙酮酸脱氢酶或致使其功能较弱及完全或部分剔除乳酸脱氢酶或致使其功能较弱。
在本发明的方法及/或细胞的另一态样中，细胞在至少一种乙酰基-辅酶A合成酶，如例如来自大肠杆菌、酿酒酵母、智人、小鼠的acs的表现或活性方面经修饰。在一较佳具体实例中，该乙酰基-辅酶A合成酶为具有经修饰的表现或活性的细胞的内源蛋白，较佳该内源乙酰基-辅酶A合成酶经过度表现；或者，该乙酰基-辅酶A合成酶为异质引入且表现于该细胞中、较佳过度表现的异源蛋白。该内源乙酰基-辅酶A合成酶可在亦表现异源的细胞具有经修饰的表现，可在亦表现异源的细胞具有经修饰的表现。在一更佳具体实例中，细胞在具有SEQ ID NO 47的来自大肠杆菌的乙酰基-辅酶A合成酶acs的表现或活性方面经修饰。在另一及/或额外较佳具体实例中，细胞在与具有SEQ ID NO 47的该多肽的全长具有至少80％整体序列一致性且具有乙酰基-辅酶A合成酶活性的SEQ ID NO 47的功能同源物、变异体或衍生物的表现或活性方面经修饰。
在本发明的方法及/或细胞的一替代及/或额外其他态样中，细胞在至少一种如例如来自大肠杆菌、酿酒酵母、智人及褐鼠的丙酮酸脱氢酶的表现或活性方面经修饰。在一较佳具体实例中，细胞已借由所属技术领域中具有通常知识者通常已知的方式经修饰以具有至少一种部分或完全剔除或突变的丙酮酸脱氢酶编码基因，从而产生至少一种丙酮酸脱氢酶活性功能较弱或失能的蛋白质。在一更佳具体实例中，细胞在poxB编码基因中具有完全剔除，从而产生缺少丙酮酸脱氢酶活性的细胞。
在本发明的方法及/或细胞的一替代及/或额外其他态样中，细胞在至少一种如例如来自大肠杆菌、酿酒酵母、智人及褐鼠的乳酸脱氢酶的表现或活性方面经修饰。在一较佳具体实例中，细胞已借由所属技术领域中具有通常知识者通常已知的方式经修饰以具有至少一种部分或完全剔除或突变的乳酸脱氢酶编码基因，从而产生至少一种乳酸脱氢酶活性功能较弱或失能的蛋白质。在一更佳具体实例中，细胞在ldhA编码基因中具有完全剔除，从而产生缺少乳酸脱氢酶活性的细胞。
根据本发明的方法及/或细胞的另一较佳态样，该细胞包含包括以下蛋白质中的任何一或多者的较低或降低表现及/或消除、减弱、降低或延迟活性：β-半乳糖苷酶、半乳糖苷O-乙酰基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸脱乙酰基酶、葡萄糖胺-6-磷酸脱胺酶、N-乙酰基葡萄糖胺抑制因子、核糖核苷酸单磷酸酶、EIICBA-Nag、UDP-葡萄糖：十一异戊烯基-磷酸葡萄糖-1-磷酸转移酶、L-墨角藻糖激酶、L-岩藻糖异构酶、N-乙酰基神经氨酸解离酶、N-乙酰基甘露糖胺激酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶、EIIAB-Man、EIIC-Man、EIID-Man、ushA、半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、葡萄糖-1-磷酸腺苷酰基转移酶、葡萄糖-1-磷酸酶、ATP依赖型6-磷酸果糖激酶同功酶1、ATP依赖型6-磷酸果糖激酶同功酶2、葡萄糖-6-磷酸异构酶、有氧呼吸控制蛋白、转录抑制因子IclR、lon蛋白酶、葡萄糖特异性易位磷酸转移酶IIBC组分ptsG、葡萄糖特异性易位磷酸转移酶(PTS)IIBC组分malX、酶IIAGlc、β-葡萄糖苷特异性PTS酶II、果糖特异性PTS多磷酰基转移蛋白FruA及FruB、乙醇脱氢酶醛脱氢酶、丙酮酸-甲酸解离酶、乙酸激酶、磷酰基转移酶、磷酸乙酰基转移酶、丙酮酸脱羧酶。
根据本发明的方法及/或细胞的另一较佳态样，细胞包含用于所选单糖、双糖或寡糖的分解代谢途径，该分解代谢途径至少部分不活化，所述单糖、双糖或寡糖参与唾液酸化双糖及/或寡糖的合成及/或为该合成所需。
根据本发明的方法及/或细胞的另一较佳态样，细胞使用用于合成唾液酸化双糖及/或寡糖的前驱物。在本文中，前驱物自培养基进料至细胞中。在另一较佳具体实例中，细胞生产用于合成该唾液酸化双糖及/或寡糖的前驱物。
根据本发明的方法及/或细胞的另一较佳态样，细胞在全培养液及/或上清液中生产90g/L或更多唾液酸化双糖及/或寡糖。在一更佳具体实例中，根据全培养液及/或上清液中由细胞生产的唾液酸化双糖及/或寡糖及其前驱物的总量量测，全培养液及/或上清液中生产的唾液酸化双糖及/或寡糖的纯度分别为至少80％。
本发明的另一态样提供一种方法及一种细胞，其中唾液酸化双糖及/或寡糖在如本文所描述的细菌、真菌、酵母、昆虫、植物、动物或原虫表现系统或细胞中生产及/或由其生产。表现系统或细胞选自包含细菌、真菌或酵母的清单，或是指植物、动物或原虫细胞。后者的细菌较佳属于变形菌(Proteobacteria)门或厚壁菌(Firmicutes)门或蓝菌(Cyanobacteria)门或异常球菌-栖热菌(Deinococcus-Thermus)门。属于变形菌门之后者的细菌较佳属于肠细菌科，较佳属于大肠杆菌种。后者的细菌较佳是指属于大肠杆菌种的任何菌株，诸如但不限于大肠杆菌B、大肠杆菌C、大肠杆菌W、大肠杆菌K12、大肠杆菌Nissle。更特定言之，后者的术语是指经培养的大肠杆菌菌株(命名为大肠杆菌K12菌株)，其良好适于实验室环境，且不同于野生型菌株，已损失其在肠中茁壮成长的能力。大肠杆菌K12菌株的熟知实例为K12野生型、W3110、MG1655、M182、MC1000、MC1060、MC1061、MC4100、JM101、NZN111及AA200。因此，较佳地，本发明特定关于如上文所指示的突变及/或转形的大肠杆菌菌株，其中该大肠杆菌菌株为K12菌株。更特定言之，本发明关于如上文所指示的突变及/或转形的大肠杆菌菌株，其中该K12菌株为大肠杆菌MG1655。属于厚壁菌门之后者的细菌较佳属于杆菌纲(Bacilli)，较佳来自杆菌属物种。后者的真菌较佳属于根霉菌属(Rhizopus)、网柄菌属(Dictyostelium)、青霉菌属(Penicillium)、白霉菌属(Mucor)或曲菌属(Aspergillus)。后者的酵母较佳属于子囊菌(Ascomycota)门或担子菌(Basidiomycota)门或半知菌(Deuteromycota)门或接合菌(Zygomycetes)门。后者的酵母较佳属于以下属：酵母菌属(Saccharomyces)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、驹形氏酵母属(Komagataella)、汉森酵母属(Hansenula)、亚罗酵母属(Yarrowia)、球拟假丝酵母属(Starmerella)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)或德巴利酵母属(Debaromyces)。植物细胞包括开花及非开花植物的细胞，以及藻类细胞，例如衣藻属(Chlamydomonas)、绿球藻属(Chlorella)等。较佳地，该植物为烟草、苜蓿、水稻、番茄、棉花、菜籽、大豆、玉蜀黍或玉米植物。后者的动物细胞较佳衍生自非人类哺乳动物(例如牛、水牛、猪、绵羊、小鼠、大鼠)、鸟类(例如鸡、鸭、鸵鸟、火鸡、野鸡)、鱼类(例如剑鱼、鲑鱼、鲔鱼、海鲈、鳟鱼、鲶鱼)、无脊椎动物(例如龙虾、蟹、虾、蚌蛤、牡蛎、贻贝、海胆)、爬虫类(例如蛇、鳄鱼、龟)、两栖动物(例如蛙)或昆虫(例如蝇、线虫)或为衍生自不包括胚胎干细胞的人类细胞的经基因修饰的细胞系。人类及非人类哺乳动物细胞均较佳选自包含以下者的清单：上皮细胞(如例如乳腺上皮细胞)、胚胎肾细胞、纤维母细胞、COS细胞、中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary；CHO)细胞、鼠类骨髓瘤细胞(如例如N20、SP2/0或YB2/0细胞)、NIH-3T3细胞、非乳腺成体干细胞或其衍生物，诸如WO21067641中所描述。后者的昆虫细胞较佳衍生自：草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)如例如Sf9或Sf21细胞、家蚕(Bombyxmori)、甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)如例如BTI-TN-5B1-4细胞或黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)如例如果蝇属S2细胞。后者的原虫细胞较佳为蜥蜴利什曼原虫(Leishmania tarentolae)细胞。
在本发明的方法及/或细胞的一较佳具体实例中，该细胞为活的革兰氏阴性细菌，与未经修饰的先驱细胞相比，其包含减少或消除的聚-N-乙酰基-葡萄糖胺(poly-N-acetyl-glucosamine；PNAG)、肠内菌共同抗原(ECA)、纤维素、可拉酸(colanic acid)、核心寡糖、渗透调节周质葡聚糖(Osmoregulated Periplasmic Glucan；OPG)、甘油葡萄糖苷、聚糖及/或海藻糖的合成。
在方法及/或细胞的一更佳具体实例中，聚-N-乙酰基-葡萄糖胺(PNAG)、肠内菌共同抗原(ECA)、纤维素、可拉酸、核心寡糖、渗透调节周质葡聚糖(OPG)、甘油葡萄糖苷、聚糖及/或海藻糖的该经减少或消除的合成系借由参与该聚-N-乙酰基-葡萄糖胺(PNAG)、肠内菌共同抗原(ECA)、纤维素、可拉酸、核心寡糖、渗透调节周质葡聚糖(OPG)、甘油葡萄糖苷、聚糖及/或海藻糖中的任一者的合成中的任何一或多种糖基转移酶的突变提供，其中该突变提供所述糖基转移酶中的任一者的缺失或较低表现。所述糖基转移酶包含编码聚-N-乙酰基-D-葡萄糖胺合酶次单元的糖基转移酶基因、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺-十一异戊烯基-磷酸N-乙酰基葡萄糖胺磷酸转移酶、Fuc4NAc(4-乙酰氨基-4，6-双去氧-D-半乳糖)转移酶、UDP-N-乙酰基-D-甘露糖胺醛酸转移酶、编码纤维素合酶催化次单元的糖基转移酶基因、纤维素生物合成蛋白、可拉酸生物合成葡萄糖醛酸基转移酶、可拉酸生物合成半乳糖基转移酶、可拉酸生物合成岩藻糖基转移酶、UDP-葡萄糖：十一异戊烯基-磷酸葡萄糖-1-磷酸转移酶、推定可拉生物合成糖基转移酶、UDP-葡萄糖醛酸：LPS(HepIII)糖基转移酶、ADP-庚糖-LPS庚糖基转移酶2、ADP-庚糖：LPS庚糖基转移酶1、推定ADP-庚糖：LPS庚糖基转移酶4、脂多糖核心生物合成蛋白、UDP-葡萄糖：(葡萄糖基)LPSα-1，2-葡萄糖基转移酶、UDP-D-葡萄糖：(葡萄糖基)LPSα-1，3-葡萄糖基转移酶、UDP-D-半乳糖：(葡萄糖基)脂多糖-1，6-D-半乳糖基转移酶、脂多糖葡萄糖基转移酶I、脂多糖核心庚糖基转移酶3，β-1，6-半乳糖呋喃酮基转移酶、十一异戊烯基-磷酸4-去氧-4-甲酰氨基-L-阿拉伯糖转移酶、脂质IVA 4-氨基-4-去氧-L-阿拉伯糖基转移酶、细菌萜醇葡萄糖基转移酶、推定家族2糖基转移酶、渗透调节周质葡聚糖(OPG)生物合成蛋白G、OPG生物合成蛋白质H、葡萄糖基甘油酸磷酸化酶、肝糖合酶、1，4-α-葡聚糖分支酶、4-α-葡聚糖转移酶及海藻糖-6-磷酸合酶。在一例示性具体实例中，细胞在包含以下糖基转移酶中的任何一或多者中经突变：pgaC、pgaD、rfe、rffT、rffM、bcsA、bcsB、bcsC、wcaA、wcaC、wcaE、wcaI、wcaJ、wcaL、waaH、waaF、waaC、waaU、waaZ、waaJ、waaO、waaB、waaS、waaG、waaQ、wbbl、arnC、arnT、yfdH、wbbK、opgG、opgH、ycjM、glgA、glgB、malQ、otsA及yaiP，其中该突变提供所述糖基转移酶中的任一者的缺失或较低表现。
在方法及/或细胞的一替代及/或额外较佳具体实例中，聚-N-乙酰基-葡萄糖胺(PNAG)的该经减少或消除的合成借由碳储存调节子编码基因的过度表现、Na+/H+反向运输蛋白调节子编码基因的缺失及/或感测器组氨酸激酶编码基因的缺失提供。
另一态样提供待在培养基中稳定培养的细胞，其中该培养基可为任何类型的生长培养基，其包含基本培养基、复合培养基或富含某些化合物，如例如但不限于维生素、痕量元素、氨基酸的生长培养基。
如本文所用的细胞能够以单糖、双糖、寡糖、多糖、多元醇、甘油、复合培养基或其混合物作为主要碳源生长。术语主要(main)意谓细胞用于生产所关注唾液酸化双糖及/或寡糖、生物质形成、二氧化碳及/或副产物形成(诸如酸及/或醇，诸如乙酸、乳酸及/或乙醇)的最重要碳源，亦即所有所需碳的20、30、40、50、60、70、75、80、85、90、95、98、99％衍生自以上指定碳源。在本发明的一个具体实例中，该碳源为该生物体的唯一碳源，亦即所有所需碳的100％衍生自以上指定碳源。常见主要碳源包含但不限于葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、麦芽寡糖、麦芽三糖、山梨糖醇、木糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖、甲醇、乙醇、海藻糖、淀粉、纤维素、半纤维素、糖蜜、玉米浸液、高果糖糖浆、乙酸、柠檬酸、乳酸及丙酮酸。如本文所用，如本文所定义的前驱物无法用作用于生产唾液酸化双糖及/或寡糖的碳源。
根据本发明的方法及/或细胞的另一态样，细胞能够合成包含至少一种唾液酸化寡糖的寡糖的混合物。在一替代及/或额外态样中，细胞能够合成包含至少一种唾液酸化双糖及/或寡糖的双糖及/或寡糖的混合物；或者，细胞能够合成唾液酸、双糖及/或寡糖的混合物。
在另一较佳态样中，用于生产如本文所描述的唾液酸化双糖及/或寡糖的方法包含以下步骤中的至少一者：
i)向反应器中的培养基中添加至少一种前驱物及/或受体进料，其中总反应器体积在250mL(毫升)至10.000m3(立方米)范围内，较佳以连续方式添加，且较佳使得该培养基的最终体积不超过添加该前驱物及/或受体进料之前该培养基的体积的三倍、较佳不超过两倍、更佳小于2倍；
ii)历经1天、2天、3天、4天、5天的时程借助于进料溶液以连续方式向该培养基中添加至少一种前驱物及/或受体进料；
iii)历经1天、2天、3天、4天、5天的时程借助于进料溶液以连续方式向该培养基中添加至少一种前驱物及/或受体进料，且其中较佳地，该进料溶液的pH设定在3与7之间，且其中较佳地，该进料溶液的温度保持在20℃与80℃之间；
该方法在该培养基的该最终体积中产生浓度为至少50g/L、较佳至少75g/L、更佳至少90g/L、更佳至少100g/L、更佳至少125g/L、更佳至少150g/L、更佳至少175g/L、更佳至少200g/L的唾液酸化双糖及/或寡糖。
在另一及/或额外其他较佳态样中，用于生产如本文所描述的唾液酸化双糖及/或寡糖的方法包含以下步骤中的至少一者：
i)以一个脉冲或以不连续(脉冲)方式向培养基中添加至少一种前驱物及/或受体进料，其中总反应器体积在250mL(毫升)至10.000m3(立方米)范围内，较佳使得该培养基的最终体积不超过添加该(等)前驱物及/或受体进料脉冲之前该培养基的体积的三倍、较佳不超过两倍、更佳小于2倍；
ii)历经5分钟、10分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、10小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天的时程借助于进料溶液以不连续(脉冲)方式向该培养基中添加至少一种前驱物及/或受体进料；
iii)历经5分钟、10分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、10小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天的时程借助于进料溶液以不连续(脉冲)方式向该培养基中添加至少一种前驱物及/或受体进料，且其中较佳地，该进料溶液的pH设定在3与7之间，且其中较佳地，该进料溶液的温度保持在20℃与80℃之间；
该方法在该培养基的该最终体积中产生浓度为至少50g/L、较佳至少75g/L、更佳至少90g/L、更佳至少100g/L、更佳至少125g/L、更佳至少150g/L、更佳至少175g/L、更佳至少200g/L的唾液酸化双糖及/或寡糖。
在另一更佳态样中，用于生产如本文所描述的唾液酸化双糖及/或寡糖的方法包含以下步骤中的至少一者：
i)向培养基中添加包含每升初始反应器体积至少50、更佳至少75、更佳至少100、更佳至少120、更佳至少150克的乳糖的乳糖进料，其中总反应器体积在250mL(毫升)至10.000m3(立方米)范围内，较佳以连续方式添加，且较佳使得该培养基的最终体积不超过添加该乳糖进料之前该培养基的体积的三倍、较佳不超过两倍、更佳小于2倍；
ii)历经1天、2天、3天、4天、5天的时程借助于进料溶液以连续方式向该培养基中添加乳糖进料；
iii)历经1天、2天、3天、4天、5天的时程借助于进料溶液以连续方式向该培养基中添加乳糖进料，且其中该乳糖进料溶液的浓度为50g/L、较佳75g/L、更佳100g/L、更佳125g/L、更佳150g/L、更佳175g/L、更佳200g/L、更佳225g/L、更佳250g/L、更佳275g/L、更佳300g/L、更佳325g/L、更佳350g/L、更佳375g/L、更佳400g/L、更佳450g/L、更佳500g/L、甚至更佳550g/L、最佳600g/L；且其中较佳地，该溶液的pH设定在3与7之间，且其中较佳地，该进料溶液的温度保持在20℃与80℃之间；
该方法在该培养基的该最终体积中产生浓度为至少50g/L、较佳至少75g/L、更佳至少90g/L、更佳至少100g/L、更佳至少125g/L、更佳至少150g/L、更佳至少175g/L、更佳至少200g/L的由该乳糖生产的唾液酸化寡糖。
较佳地，乳糖进料借由自培养开始以至少5mM的浓度，较佳以30、40、50、60、70、80、90、100、150mM的浓度，更佳以＞300mM的浓度添加乳糖来实现。
在另一态样中，乳糖进料借由以一定浓度向培养基中添加乳糖，使得在培养的整个生产阶段中获得至少5mM、较佳10mM或30mM的乳糖浓度来实现。
在本文所描述的方法的另一具体实例中，宿主细胞培养至少约60、80、100或约120小时或以连续方式培养。
在一较佳具体实例中，在培养基中提供碳源，较佳蔗糖，持续3天或更多天，较佳至多7天；及/或在培养基中以连续方式提供每升初始培养物体积至少100、有利至少105、更有利至少110、甚至更有利至少120克蔗糖，使得培养基的最终体积不超过培养之前培养基的体积的三倍、有利不超过两倍、更有利小于两倍。
较佳地，当进行如本文所描述的方法时，指数式细胞生长的第一阶段借由将碳源、较佳葡萄糖或蔗糖添加至培养基中来提供，随后在第二阶段中将乳糖添加至培养基中。
在一替代较佳具体实例中，在如本文所描述的方法中，已在指数式生长的第一阶段中将乳糖与以碳为基础的基质一起添加。
根据本发明，如本文所描述的方法较佳包含自该培养物分离该唾液酸化双糖及/或寡糖的步骤。
术语「自该培养物分离(separating from said cultivation)」意谓自细胞及/或其生长培养基收获、收集或撷取该唾液酸化双糖及/或寡糖。
唾液酸化双糖及/或寡糖可以习知方式自水性培养基分离，细胞在该水性培养基中生长。在该唾液酸化双糖及/或寡糖仍存在于生产唾液酸化双糖及/或寡糖的细胞中的情况下，可使用自细胞中释放或萃取该唾液酸化双糖及/或寡糖的习知方式，诸如使用高pH、热休克、音波处理、法式压碎机(French press)、均质化、酶水解、化学水解、溶剂水解、清洁剂、水解……破坏细胞。培养基及/或细胞萃取物一起且分别可接着进一步用于分离该唾液酸化双糖及/或寡糖。
此较佳涉及澄清该唾液酸化双糖及/或寡糖以移除悬浮粒子及污染物，尤其细胞、细胞组分、不可溶代谢物及由培养经基因修饰的细胞产生的碎片。在此步骤中，该唾液酸化双糖及/或寡糖可以习知方式澄清。较佳地，该唾液酸化双糖及/或寡糖借由离心、絮凝、倾析及/或过滤澄清。分离该唾液酸化双糖及/或寡糖的第二步骤较佳涉及自该唾液酸化双糖及/或寡糖移除实质上所有蛋白质、肽、氨基酸、RNA及DNA，及可干扰后续分离步骤的任何内毒素及糖脂，较佳在该唾液酸化双糖及/或寡糖已澄清之后进行。在此步骤中，可以习知方式自该唾液酸化双糖及/或寡糖移除蛋白质及相关杂质。较佳地，蛋白质、盐、副产物、染料、内毒素及其他相关杂质自该唾液酸化双糖及/或寡糖借由超过滤、纳米过滤、二相分配、逆渗透、微过滤、活性炭或碳处理、用非离子界面活性剂处理、酶消化、切向流高效过滤、切向流超过滤、电泳(例如使用平板(slab)-聚丙烯酰胺或十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis；PAGE))、亲和层析(使用亲和配位体，包括例如DEAE-琼脂糖凝胶、聚-L-离氨酸及多黏菌素-B、内毒素-选择性吸附剂基质)、离子交换层析(诸如但不限于阳离子交换、阴离子交换、混合床离子交换、由内而外配位体连接)、疏水性交互作用层析及/或凝胶过滤(亦即粒径排阻层析)，特定言之借由层析，更特定言之借由离子交换层析或疏水性交互作用层析或配位体交换层析移除。除粒径排阻层析的外，剩余蛋白质及相关杂质由层析介质或所选膜保留。
在另一较佳具体实例中，如本文所描述的方法亦提供本发明的唾液酸化双糖及/或寡糖的进一步纯化。该唾液酸化双糖及/或寡糖的进一步纯化例如借由使用(活性)炭或碳、纳米过滤、超过滤、电泳、酶处理或离子交换以移除任何剩余DNA、蛋白质、LPS、内毒素或其他杂质。亦可使用醇(诸如乙醇)及水醇混合物。另一纯化步骤借由该唾液酸化双糖及/或寡糖的结晶、蒸发或沉淀实现。另一纯化步骤为对所生产的唾液酸化双糖及/或寡糖进行干燥，例如喷雾干燥、冻干、喷雾冷冻干燥、冷冻喷雾干燥、条带式干燥(band dry)、带式干燥(belt dry)、真空条带式干燥、真空带式干燥、转筒干燥、滚筒干燥、真空转筒干燥或真空滚筒干燥。
在一例示性具体实例中，在一种方法中进行唾液酸化双糖及/或寡糖的分离及纯化，该方法按任何次序包含以下步骤：
a)使培养物或其澄清形式与截留分子量(molecular weight cut-off；MWCO)为600-3500Da的纳米过滤膜接触，确保保留所生产的唾液酸化双糖及/或寡糖且使蛋白质、盐、副产物、染料及其他相关杂质中的至少一部分通过，
b)使用该膜，用无机电解质的水溶液对来自步骤a)的保留物进行透滤程序，接着视情况用纯水进行透滤以移除过量电解质，
c)及收集呈来自该电解质的阳离子的盐形式的该唾液酸化双糖及/或寡糖中富集的保留物。
在一替代例示性具体实例中，在一种方法中进行该唾液酸化双糖及/或寡糖的分离及纯化，该方法按任何次序包含以下步骤：使用不同膜使培养物或其澄清形式经受两个膜过滤步骤，其中
一个膜具有约300至约500道尔顿(Dalton)之间的截留分子量，及
作为在约600至约800道尔顿之间的分子量截留的另一膜。
在一替代例示性具体实例中，在一种方法中进行该唾液酸化双糖及/或寡糖的分离及纯化，该方法按任何次序包含以下步骤：用呈H+形式的强阳离子交换树脂及呈自由碱形式的弱阴离子交换树脂处理培养物或其澄清形式。
在一替代例示性具体实例中，该唾液酸化双糖及/或寡糖的分离及纯化按以下方式进行。将包含所生产的唾液酸化双糖及/或寡糖、生物质、培养基组分及污染物的培养物施加至以下纯化步骤：
i)自培养物分离生物质，
ii)进行阳离子交换剂处理以便移除带正电物质，
iii)进行阴离子交换剂处理以便移除带负电物质，
iv)进行纳米过滤步骤及/或电渗析步骤，
其中提供包含纯度大于或等于80％的所生产的唾液酸化双糖及/或寡糖的纯化溶液。视情况，纯化溶液借由选自包含以下者的清单的任何一或多个干燥步骤干燥：喷雾干燥、冻干、喷雾冷冻干燥、冷冻喷雾干燥、条带式干燥、带式干燥、真空条带式干燥、真空带式干燥、转筒干燥、滚筒干燥、真空转筒干燥及真空滚筒干燥。
在一替代例示性具体实例中，在一种方法中进行唾液酸化双糖及/或寡糖的分离及纯化，该方法按任何次序包含以下步骤：对培养物进行酶处理；自培养物移除生物质；超过滤；纳米过滤；及管柱层析步骤。较佳地，此类管柱层析为单个管柱或多个管柱。更佳地，管柱层析步骤为模拟移动床层析。此类模拟移动床层析较佳包含i)至少4个管柱，其中至少一个管柱包含弱或强阳离子交换树脂；及/或ii)具有不同流速的四个区域I、II、III及IV；及/或iii)包含水的洗提剂；及/或iv)15至60摄氏度的操作温度。
在一特定具体实例中，本发明提供所生产的唾液酸化双糖及/或寡糖，其借由选自包含以下者的清单的任何一或多个干燥步骤干燥成粉末：喷雾干燥、冻干、喷雾冷冻干燥、冷冻喷雾干燥、条带式干燥、带式干燥、真空条带式干燥、真空带式干燥、转筒干燥、滚筒干燥、真空转筒干燥及真空滚筒干燥，其中干燥粉末含有＜15wt.％水、较佳＜10wt.％水、更佳＜7wt.％水、最佳＜5wt.％水。
本发明的另一态样提供如本文所定义的细胞在用于生产唾液酸化双糖及/或寡糖的方法中的用途。本发明的另一态样提供如本文所定义的方法用于生产唾液酸化双糖及/或寡糖的用途。
此外，本发明亦关于借由根据本发明的方法获得的唾液酸化双糖及/或寡糖，以及关于如上文所描述的聚核苷酸、载体、宿主细胞或多肽用于生产该唾液酸化双糖及/或寡糖的用途。该唾液酸化双糖及/或寡糖可用作食品添加剂、益生质、共生物，用于婴儿食品、成人食品或饲料的补充，或用作治疗或医药活性化合物或用于化妆品应用。利用新颖方法，可容易且有效地提供唾液酸化双糖及/或寡糖，而无需复杂、耗时且耗费成本的合成方法。
为鉴别如本文所描述的细胞中生产的唾液酸化双糖及/或寡糖，单体建构嵌段(例如单糖或聚糖单元组成物)、侧链的变旋异构组态、取代基的存在及位置、聚合度/分子量及键联模式可借由所属技术领域中已知的标准方法鉴别，所述标准方法诸如甲基化分析、还原裂解、水解、气相层析-质谱法(gas chromatography-mass spectrometry；GC-MS)、基质辅助雷射脱附/离子化-质谱法(Matrix-assisted laser desorption/ionization-massspectrometry；MALDI-MS)、电洒离子化-质谱法(Electrospray ionization-massspectrometry；ESI-MS)、具有紫外线或折射率侦测的高效液相层析(HPLC)、具有脉冲安培侦测的高效阴离子交换层析(High-Performance Anion-Exchange chromatography withPulsed Amperometric Detection；HPAEC-PAD)、毛细管电泳(capillaryelectrophoresis；CE)、红外(infrared；IR)/拉曼光谱法及核磁共振(Nuclear magneticresonance；NMR)波谱技术。可使用例如固态NMR、傅立叶变换红外光谱法(Fouriertransform infrared spectroscopy；FT-IR)及广角X射线散射(wide-angle X-rayscattering；WAXS)来解析晶体结构。聚合度(degree of polymerization；DP)、DP分布及多分散性可借由例如黏度测定法及SEC(SEC-HPLC，高效粒径排阻层析(high performancesize-exclusion chromatography))确定。为鉴别唾液酸化双糖及/或寡糖的单体组分，可使用方法诸如酸催化的水解、高效液相层析(high performance liquid chromatography；HPLC)或气液层析(gas-liquid chromatography；GLC)(在转化成醛糖醇乙酸酯之后)。为了确定糖苷键，将唾液酸化双糖及/或寡糖在DMSO中用碘甲烷及强碱甲基化，进行水解，达成还原为部分甲基化醛糖醇，进行乙酰化为甲基化醛糖醇乙酸酯，且借由气液层析联合质谱(GLC/MS)进行分析。为了确定聚糖序列，使用酸或酶进行部分解聚合以确定结构。为了鉴别变旋异构组态，使唾液酸化双糖及/或寡糖经受酶分析，例如使其与对特定类型键联具特异性的酶，例如β-半乳糖苷酶或α-葡萄糖苷酶等接触，且可使用NMR来分析产物。
将如本文所描述的分离且较佳亦纯化的唾液酸化双糖及/或寡糖并入至食品(例如人类食品或饲料)、膳食补充剂、医药成分、化妆品成分或医药中。在一些具体实例中，唾液酸化双糖及/或寡糖与一或多种适用于食品、饲料、膳食补充剂、医药成分、化妆品成分或医药的成分混合。
在一些具体实例中，膳食补充剂包含至少一种益生质成分及/或至少一种益生菌成分。
「益生质(prebiotic)」为促进有益于宿主的微生物，尤其胃肠道中的微生物生长的物质。在一些具体实例中，膳食补充剂提供多种益生质，包括唾液酸化双糖及/或寡糖，其为借由本说明书中所揭示的方法生产及/或纯化的纯化益生质，以促进一或多种有益微生物的生长。膳食补充剂的益生质成分的实例包括其他益生质分子(诸如HMO)及植物多糖(诸如菊糖、果胶、b-葡聚糖及木寡糖)。「益生菌(probiotic)」产品典型地含有置换或添加至胃肠道微生物群以便接受体受益的活微生物。此类微生物的实例包括乳杆菌属物种(例如嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)及保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus))、双叉杆菌属物种(例如动物双叉杆菌(B.animalis)、长双叉杆菌(B.longum)及婴儿双叉杆菌(B.infantis)(例如Bi-26))及布拉氏酵母菌(Saccharomyces boulardii)。在一些具体实例中，借由此说明书的方法生产及/或纯化的唾液酸化双糖及/或寡糖与此类微生物组合经口投予。
用于膳食补充剂的其他成分的实例包括寡糖(诸如2′-岩藻基乳糖、3-岩藻基乳糖、3′-唾液酸基乳糖、6′-唾液酸基乳糖)、双糖(诸如乳糖)、单糖(诸如葡萄糖、半乳糖、L-岩藻糖、唾液酸、葡萄糖胺及N-乙酰基葡萄糖胺)、增稠剂(诸如阿拉伯胶)、酸度调节剂(诸如柠檬酸三钠)、水、脱脂乳及调味剂。
在一些具体实例中，唾液酸化寡糖并入至人类婴儿食品(例如婴儿乳(infantformula))中。婴儿乳通常为用于作为人类母乳的完整或部分替代物向婴儿喂养的制造食品。在一些具体实例中，婴儿乳以粉末形式出售，且借由与水混合制备以用于向婴儿瓶喂或杯喂。婴儿乳的组成典型地经设计以大致模拟人类母乳。在一些具体实例中，借由此说明书的方法生产及/或纯化的唾液酸化寡糖包括于婴儿乳中，以提供与由人类母乳中的寡糖提供的营养益处类似的营养益处。在一些具体实例中，将唾液酸化寡糖与婴儿乳的一或多种成分混合。婴儿乳成分的实例包括脱脂乳、碳水化合物源(例如乳糖)、蛋白质源(例如乳清蛋白浓缩物及酪蛋白)、脂肪源(例如植物油，诸如棕榈油、高油酸红花油、菜籽油、椰子油及/或葵花油；及鱼油)、维生素(诸如维生素A、Bb、Bi2、C及D)、矿物质(例如柠檬酸钾、柠檬酸钙、氯化镁、氯化钠、柠檬酸钠及磷酸钙)及可能人乳寡糖(HMO)。此类HMO可包括例如DiFL、乳-N-丙糖II、LNT、LNnT、乳-N-岩藻五糖I、乳-N-新岩藻五糖、乳-N-岩藻五糖II、乳-N-岩藻五糖III、乳-N-岩藻五糖V、乳-N-新岩藻五糖V、乳-N-二岩藻六糖I、乳-N-二岩藻六糖II、6′-半乳糖基乳糖、3′-半乳糖基乳糖、乳-N-六糖及乳-N-新六糖。
在一些具体实例中，一或多种婴儿乳成分包含脱脂乳、碳水化合物源、蛋白质源、脂肪源及/或维生素及矿物质。
在一些具体实例中，一或多种婴儿乳成分包含乳糖、乳清蛋白浓缩物及/或高油酸红花油。
在一些具体实例中，婴儿乳中唾液酸化寡糖的浓度与通常存在于人类母乳中的唾液酸化寡糖的浓度为大致相同浓度。
在一些具体实例中，唾液酸化寡糖并入至饲料制剂中，其中该饲料选自包含宠物食品、动物代乳品、兽医学产品、断奶后饲料或教槽饲料的清单。
如将在本文中的实施例中展示，本发明的方法及细胞较佳提供以下出人意料的优点中的至少一者：
-较高唾液酸化双糖及/或寡糖滴定度(g/L)，
-较高生产速率r(g唾液酸化双糖及/或寡糖/L/h)，
-较高细胞性能指数(cell performance index)CPI(g唾液酸化双糖及/或寡糖/gX)，
-较高比生产率Qp(g唾液酸化双糖及/或寡糖/g X/h)，
-较高基于蔗糖的产率Ys(g唾液酸化双糖及/或寡糖/g蔗糖)，
-较高蔗糖吸收/转化速率Qs(g蔗糖/g X/h)，
-较高乳糖转化/消耗速率rs(g乳糖/h)，
-较高唾液酸化双糖及/或寡糖分泌，及/或
-较高生产宿主生长速度，
相比于用于生产唾液酸化双糖及/或寡糖的宿主，该宿主缺少编码一或多种催化相同化学反应的蛋白质的多个编码DNA序列的表现及/或过度表现。
除非另外规定，否则本文中所用的所有技术及科学术语一般具有与本发明所属技术领域中具有通常知识者通常所理解相同的含义。一般而言，本文所用的命名法及上文及下文所描述的细胞培养中的实验步骤、分子遗传学、有机化学及核酸化学及杂合为所属技术领域中熟知且常用的命名法、细胞培养中的实验步骤、分子遗传学、有机化学及核酸化学及杂合。使用标准技术进行核酸及肽合成。一般而言，纯化步骤根据制造商说明书进行。
其他优点来自特定具体实例及实施例。不言而喻，以上提及的特征及仍有待下文阐述的特征，在不脱离本发明的范围的情况下，不仅可以分别指定的组合使用而且可以其他组合或独立地使用。
此外，本发明关于以下特定具体实例：
1.一种用于生产唾液酸化双糖及/或寡糖的代谢上经工程改造的细胞，该细胞包含用于生产该唾液酸化双糖及/或寡糖的途径，其特征在于该细胞经修饰以用于表现及/或过度表现编码一或多种催化相同化学反应的蛋白质的多个编码DNA序列。
2.如具体实例1的细胞，其中该蛋白质参与用于生产该唾液酸化双糖及/或寡糖的该途径。
3.如具体实例1或2中任一项的细胞，其中用于生产该唾液酸化双糖及/或寡糖的该途径包含唾液酸化途径。
4.如具体实例3的细胞，其中该唾液酸化途径包含至少一种选自包含以下者的清单的蛋白质：N-酰基葡萄糖胺2-表异构酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶、UDP-GlcNAc 2-表异构酶/激酶水解、N-乙酰基神经氨酸-9-磷酸合成酶、磷酸酶、N-乙酰基神经氨酸合酶、N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶、唾液酸基转移酶及唾液酸运输蛋白，
较佳地，其中所述蛋白质中的至少一者由所述多个编码DNA序列编码。
5.如前述具体实例中任一项的细胞，其中所述多个编码DNA序列编码包含以下者中的任何一或多者：
-编码一种蛋白质的相同编码DNA序列的多个复本，
-编码一种蛋白质的多个编码DNA序列，及
-编码催化相同化学反应的多种同功蛋白质的多个编码DNA序列。
6.如前述具体实例中任一项的细胞，其中多个为至少2个、较佳至少3个、更佳至少5个。
7.如前述具体实例中任一项的细胞，其中所述编码DNA序列在一或多个基因表现模组中呈现至该细胞，其中表现受一或多个调节序列调节。
8.如具体实例7的细胞，其中所述表现模组整合于宿主细胞的基因体中及/或在包含质体、黏接质体、噬菌体、脂质体或病毒的载体上呈现至该细胞，该载体将稳定转形至该宿主细胞中。
9.如前述具体实例中任一项的细胞，其中该蛋白质参与核苷酸活化糖的合成，其中该核苷酸活化糖将用于生产该唾液酸化双糖及/或寡糖。
10.如具体实例9的细胞，其中该核苷酸活化糖选自包含以下者的清单：UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)、UDP-N-乙酰基半乳糖胺(UDP-GalNAc)、UDP-N-乙酰基甘露糖胺(UDP-ManNAc)、UDP-葡萄糖(UDP-Glc)、UDP-半乳糖(UDP-Gal)、GDP-甘露糖(GDP-Man)、UDP-葡萄糖醛酸、UDP-半乳糖醛酸、UDP-2-乙酰氨基-2，6-双去氧--L-阿拉伯-4-己酮糖、UDP-2-乙酰氨基-2，6-双去氧--L-来苏-4-己酮糖、UDP-N-乙酰基-L-鼠李糖胺(UDP-L-RhaNAc或UDP-2-乙酰氨基-2，6-双去氧-L-甘露糖)、dTDP-N-乙酰基岩藻糖胺、UDP-N-乙酰基岩藻糖胺(UDP-L-FucNAc或UDP-2-乙酰氨基-2，6-双去氧-L-半乳糖)、UDP-N-乙酰基-L-纽莫糖胺(UDP-L-PneNAC或UDP-2-乙酰氨基-2，6-双去氧-L-塔罗糖)、UDP-N-乙酰基胞壁酸、UDP-N-乙酰基-L-异鼠李糖胺(UDP-L-QuiNAc或UDP-2-乙酰氨基-2，6-双去氧-L-葡萄糖)、CMP-唾液酸(CMP-Neu5Ac)、CMP-Neu4Ac、CMP-Neu5Ac9N3、CMP-Neu4，5Ac2、CMP-Neu5，7Ac2、CMP-Neu5，9Ac2、CMP-Neu5，7(8，9)Ac2、CMP-N-羟乙酰基神经氨酸(CMP-Neu5Gc)、GDP-岩藻糖(GDP-Fuc)、GDP-鼠李糖及UDP-木糖，
较佳地，该核苷酸活化糖选自包含以下者的清单：UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)、UDP-N-乙酰基甘露糖胺(UDP-ManNAc)、CMP-唾液酸(CMP-Neu5Ac)、CMP-Neu4Ac、CMP-Neu5Ac9N3、CMP-Neu4，5Ac2、CMP-Neu5，7Ac2、CMP-Neu5，9Ac2、CMP-Neu5，7(8，9)Ac2及CMP-N-羟乙酰基神经氨酸(CMP-Neu5Gc)。
11.如具体实例9或10中任一项的细胞，其中参与核苷酸活化糖的合成的该蛋白质选自包含以下者的清单：甘露糖-6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶、GDP-甘露糖4，6-脱水酶、GDP-L-岩藻糖合酶、L-岩藻糖激酶/GDP-岩藻糖焦磷酸化酶、L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶、葡萄糖胺-6-磷酸脱胺酶、磷酸葡萄糖胺变位酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸脱乙酰基酶、N-乙酰基葡萄糖胺表异构酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6P 2-表异构酶、葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸磷酸酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸磷酸酶、N-乙酰基甘露糖胺激酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶、磷酸乙酰基葡萄糖胺变位酶、N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰基转移酶、葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶、唾液酸合酶、N-乙酰基神经氨酸解离酶、N-酰基神经氨酸-9-磷酸合酶、N-酰基神经氨酸-9-磷酸磷酸酶、CMP-唾液酸合成酶、半乳糖-1-表异构酶、半乳糖激酶、葡萄糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、UDP-葡萄糖4-表异构酶、葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、葡萄糖磷酸变位酶、N-乙酰基葡萄糖胺1-磷酸尿苷酰基转移酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺4-表异构酶、UDP-半乳糖4-表异构酶、N-乙酰基半乳糖胺激酶、UDP-GalNAc焦磷酸化酶、甘露糖-1-磷酸甲脒基转移酶、UDP-GlcNAc 2-表异构酶及ManNAc激酶。
12.如前述具体实例中任一项的细胞，其中该细胞进一步表现至少一种选自包含以下者的清单的糖基转移酶：岩藻糖基转移酶、唾液酸基转移酶、半乳糖基转移酶、葡萄糖基转移酶、甘露糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶、N-乙酰基半乳糖氨基转移酶、N-乙酰基甘露糖氨基转移酶、木糖基转移酶、葡萄糖醛酸苷转移酶、半乳糖醛酸苷转移酶、葡萄糖氨基转移酶、N-羟乙酰基神经氨基转移酶、鼠李糖基转移酶、N-乙酰基鼠李糖基转移酶、UDP-4-氨基-4，6-双去氧-N-乙酰基-β-L-阿卓糖胺转胺酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺烯醇丙酮酰基转移酶及岩藻糖氨基转移酶，
-较佳地，其中该细胞在所述糖基转移酶中的至少一者的表现或活性方面经修饰，
-较佳地，该岩藻糖基转移酶选自包含以下者的清单：α-1，2-岩藻糖基转移酶、α-1，3-岩藻糖基转移酶、α-1，4-岩藻糖基转移酶及α-1，6-岩藻糖基转移酶，
-较佳地，该唾液酸基转移酶选自包含以下者的清单：α-2，3-唾液酸基转移酶、α-2，6-唾液酸基转移酶及α-2，8-唾液酸基转移酶，
-较佳地，该半乳糖基转移酶选自包含以下者的清单：β-1，3-半乳糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺β-1，3-半乳糖基转移酶、β-1，4-半乳糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺β-1，4-半乳糖基转移酶、α-1，3-半乳糖基转移酶及α-1，4-半乳糖基转移酶，
-较佳地，该葡萄糖基转移酶选自包含以下者的清单：α-葡萄糖基转移酶、β-1，2-葡萄糖基转移酶、β-1，3-葡萄糖基转移酶及β-1，4-葡萄糖基转移酶，
-较佳地，该甘露糖基转移酶选自包含以下者的清单：α-1，2-甘露糖基转移酶、α-1，3-甘露糖基转移酶及α-1，6-甘露糖基转移酶，
-较佳地，该N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶选自包含以下者的清单：半乳糖苷β-1，3-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶及β-1，6-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶，
-较佳地，该N-乙酰基半乳糖氨基转移酶选自包含α-1，3-N-乙酰基半乳糖氨基转移酶的清单。
13.如前述具体实例中任一项的细胞，其中该蛋白质选自包含以下者的清单的膜运输蛋白：螯铁蛋白输出蛋白、ABC运输蛋白、MFS运输蛋白及糖流出运输蛋白。
14.如前述具体实例中任一项的细胞，其中该唾液酸化双糖及/或寡糖选自包含以下者的清单：乳寡糖、O-抗原、肠内菌共同抗原(ECA)、存在于荚膜多糖中的寡糖重复、肽聚糖、氨基-糖及路易斯型抗原寡糖，较佳该乳寡糖为哺乳动物乳寡糖，更佳该乳寡糖为人乳寡糖。
15.如前述具体实例中任一项的细胞，其中该细胞包含岩藻糖基化途径，该途径包含至少一种选自包含以下者的清单的蛋白质：甘露糖-6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶、GDP-甘露糖4，6-脱水酶、GDP-L-岩藻糖合酶、岩藻糖透过酶、岩藻糖激酶、岩藻糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶、岩藻糖基转移酶，
较佳地，其中所述蛋白质中的至少一者由编码一或多种催化相同化学反应的酶的所述多个编码DNA序列编码，其中多个较佳为两个、更佳三个或更多个。
16.如前述具体实例中任一项的细胞，其中该细胞包含半乳糖基化途径，该途径包含至少一种选自包含以下者的清单的蛋白质：半乳糖-1-表异构酶、半乳糖激酶、葡萄糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、UDP-葡萄糖4-表异构酶、葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、葡萄糖磷酸变位酶、半乳糖基转移酶，
较佳地，其中所述蛋白质中的至少一者由编码一或多种催化相同化学反应的酶的所述多个编码DNA序列编码，其中多个较佳为两个、更佳三个或更多个。
17.如前述具体实例中任一项的细胞，其中该细胞包含N-乙酰基葡萄糖氨基化途径，该途径包含至少一种选自包含以下者的清单的蛋白质：L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸脱乙酰基酶、磷酸葡萄糖胺变位酶、N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰基转移酶/葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶、N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶，
较佳地，其中所述蛋白质中的至少一者由编码一或多种催化相同化学反应的酶的所述多个编码DNA序列编码，其中多个较佳为两个、更佳三个或更多个。
18.如前述具体实例中任一项的细胞，其中该细胞经修饰以用于增强磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的合成及/或供应。
19.如前述具体实例中任一项的细胞，其中该细胞包含：
-至少一个编码选自包含以下者的清单的蛋白质的编码DNA序列：i)具有SEQ IDNO 01且具有N-乙酰基神经氨酸合酶活性的来自脑膜炎奈瑟氏菌的酶(NmNeuB)，ii)具有SEQ ID NO 01的该酶的功能同源物或功能片段，及iii)与具有SEQ ID NO 01的该酶的全长序列具有至少80％序列一致性且具有N-乙酰基神经氨酸合酶活性的多肽序列，
-两个或更多个编码选自包含以下者的清单的蛋白质的编码DNA序列：i)具有SEQID NO 02的来自空肠弯曲杆菌的酶(CjNeuA)、具有SEQ ID NO 03的来自流感螺旋杆菌的酶(HiNeuA)及具有SEQ ID NO 04的来自多杀性巴氏杆菌的酶(PmultNeuA)，其中具有SEQ IDNO 02、03及04的所述酶具有N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶活性，ii)具有SEQ ID NO 02、03或04的所述酶中的任一者的功能同源物或功能片段，及iii)与具有SEQ ID NO 02、03或04的所述酶中的任一者的全长序列分别具有至少80％序列一致性，且具有N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶活性的多肽序列，及
-一或多个以下编码DNA序列的两个或更多个复本：α-2，3-唾液酸基转移酶、α-2，6-唾液酸基转移酶及/或α-2，8-唾液酸基转移酶。
20.如前述具体实例中任一项的细胞，其中该细胞包含：
-编码DNA序列的两个或更多个复本，该编码DNA序列编码具有L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶活性且较佳选自包含以下者的清单的酶：i)具有SEQ ID NO 05的来自大肠杆菌的酶(glmS*54)，及ii)具有SEQ ID NO 05的该酶的功能同源物或功能片段，及iii)与具有SEQ ID NO 05的该酶的全长序列具有至少80％序列一致性，且具有L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶活性的多肽序列，及/或
-编码DNA序列的两个或更多个复本，该编码DNA序列编码具有葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶活性且较佳选自包含以下者的清单的酶：i)具有SEQ ID NO 06的来自酿酒酵母的酶(GNA1)，ii)具有SEQ ID NO 06的该酶的功能同源物或功能片段，及iii)与具有SEQID NO 06的该酶的全长序列具有至少80％序列一致性，且具有葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶活性的多肽序列。
21.如前述具体实例中任一项的细胞，其中该细胞包含用于减少乙酸的生产的修饰。
22.如前述具体实例中任一项的细胞，其中该细胞进一步包含包括以下者的蛋白质中的任何一或多者的较低或降低表现及/或消除、减弱、降低或延迟活性：β-半乳糖苷酶、半乳糖苷O-乙酰基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸脱乙酰基酶、葡萄糖胺-6-磷酸脱胺酶、N-乙酰基葡萄糖胺抑制因子、核糖核苷酸单磷酸酶、EIICBA-Nag、UDP-葡萄糖：十一异戊烯基-磷酸葡萄糖-1-磷酸转移酶、L-墨角藻糖激酶、L-岩藻糖异构酶、N-乙酰基神经氨酸解离酶、N-乙酰基甘露糖胺激酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶、EIIAB-Man、EIIC-Man、EIID-Man、ushA、半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、葡萄糖-1-磷酸腺苷酰基转移酶、葡萄糖-1-磷酸酶、ATP依赖型6-磷酸果糖激酶同功酶1、ATP依赖型6-磷酸果糖激酶同功酶2、葡萄糖-6-磷酸异构酶、有氧呼吸控制蛋白、转录抑制因子IclR、lon蛋白酶、葡萄糖特异性易位磷酸转移酶IIBC组分ptsG、葡萄糖特异性易位磷酸转移酶(PTS)IIBC组分malX、酶IIAGlc、β-葡萄糖苷特异性PTS酶II、果糖特异性PTS多磷酰基转移蛋白FruA及FruB、乙醇脱氢酶醛脱氢酶、丙酮酸-甲酸解离酶、乙酸激酶、磷酰基转移酶、磷酸乙酰基转移酶、丙酮酸脱羧酶。
23.如前述具体实例中任一项的细胞，其中该细胞包含用于所选单糖、双糖或寡糖的分解代谢途径，该分解代谢途径至少部分不活化，所述单糖、双糖或寡糖参与该唾液酸化双糖及/或寡糖的合成及/或为该合成所需。
24.如前述具体实例中任一项的细胞，其中该细胞使用用于合成该唾液酸化双糖及/或寡糖的前驱物，该前驱物自培养基进料至该细胞中。
25.如前述具体实例中任一项的细胞，其中该细胞生产用于合成该唾液酸化双糖及/或寡糖的前驱物。
26.如前述具体实例中任一项的细胞，其中该细胞在全培养液及/或上清液中生产90g/L或更多的该唾液酸化双糖及/或寡糖，及/或其中根据该全培养液及/或上清液中由该细胞生产的唾液酸化双糖及/或寡糖及其前驱物的总量量测，该全培养液及/或上清液中该唾液酸化双糖及/或寡糖的纯度分别为至少80％。
27.如前述具体实例中任一项的细胞，其中该细胞为细菌、真菌、酵母、植物细胞、动物细胞或原虫细胞，
-较佳地，该细菌为大肠杆菌菌株，更佳为K-12菌株的大肠杆菌菌株，甚至更佳该大肠杆菌K-12菌株为大肠杆菌MG1655，
-较佳地，该真菌属于选自包含以下者的群组的属：根霉菌属、网柄菌属、青霉菌属、白霉菌属或曲菌属，
-较佳地，该酵母属于选自包含以下者的群组的属：酵母菌属、接合酵母属、毕赤酵母属、驹形氏酵母属、汉森酵母属、亚罗酵母属、球拟假丝酵母属、克鲁维酵母属或德巴利酵母属，
-较佳地，该植物细胞为藻类细胞或衍生自烟草、苜蓿、水稻、番茄、棉花、菜籽、大豆、玉蜀黍或玉米植物，
-较佳地，该动物细胞衍生自非人类哺乳动物、鸟类、鱼类、无脊椎动物、爬虫类、两栖动物或昆虫，或为衍生自不包括胚胎干细胞的人类细胞的经基因修饰的细胞系，更佳该人类及非人类哺乳动物细胞为上皮细胞、胚胎肾细胞、纤维母细胞、COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、鼠类骨髓瘤细胞、NIH-3T3细胞、非乳腺成体干细胞或其衍生物，更佳该昆虫细胞衍生自草地贪夜蛾、家蚕、甘蓝夜蛾、粉纹夜蛾或黑腹果蝇，
-较佳地，该原虫细胞为蜥蜴利什曼原虫细胞。
28.如具体实例27的细胞，其中该细胞为活的革兰氏阴性细菌，与未经修饰的先驱细胞相比，其包含减少或消除的聚-N-乙酰基-葡萄糖胺(PNAG)、肠内菌共同抗原(ECA)、纤维素、可拉酸、核心寡糖、渗透调节周质葡聚糖(OPG)、甘油葡萄糖苷、聚糖及/或海藻糖的合成。
29.如前述具体实例中任一项的细胞，其中该细胞在培养基中稳定培养。
30.如前述具体实例中任一项的细胞，其中该细胞能够合成包含至少一种唾液酸化寡糖的寡糖的混合物。
31.如前述具体实例中任一项的细胞，其中该细胞能够合成包含至少一种唾液酸化双糖及/或寡糖的双糖及寡糖的混合物。
32.一种借由细胞生产唾液酸化双糖及/或寡糖的方法，该方法包含以下步骤：
i)提供如具体实例1至31中任一项的细胞，及
ii)在允许生产该唾液酸化双糖及/或寡糖的条件下培养该细胞，
iii)较佳地，自该培养物分离该唾液酸化双糖及/或寡糖。
33.如具体实例32的方法，该方法进一步包含以下步骤中的至少一者：
i)向反应器中的培养基中添加至少一种前驱物及/或受体进料，其中总反应器体积在250mL(毫升)至10.000m3(立方米)范围内，较佳以连续方式添加，且较佳使得该培养基的最终体积不超过添加该前驱物及/或受体进料之前该培养基的体积的三倍、较佳不超过两倍、更佳小于2倍；
ii)历经1天、2天、3天、4天、5天的时程借助于进料溶液以连续方式向该培养基中添加至少一种前驱物及/或受体进料；
iii)历经1天、2天、3天、4天、5天的时程借助于进料溶液以连续方式向该培养基中添加至少一种前驱物及/或受体进料，且其中较佳地，该进料溶液的pH设定在3与7之间，且其中较佳地，该进料溶液的温度保持在20℃与80℃之间；
该方法在该培养基的该最终体积中产生浓度为至少50g/L、较佳至少75g/L、更佳至少90g/L、更佳至少100g/L、更佳至少125g/L、更佳至少150g/L、更佳至少175g/L、更佳至少200g/L的唾液酸化双糖及/或寡糖。
34.如具体实例32的方法，该方法进一步包含以下步骤中的至少一者：
i)向培养基中添加包含每升初始反应器体积至少50、更佳至少75、更佳至少100、更佳至少120、更佳至少150克的乳糖的乳糖进料，其中反应器体积在250mL至10.000m3(立方米)范围内，较佳以连续方式添加，且较佳使得该培养基的最终体积不超过添加该乳糖进料之前该培养基的体积的三倍、较佳不超过两倍、更佳小于2倍；
ii)历经1天、2天、3天、4天、5天的时程借助于进料溶液以连续方式向该培养基中添加乳糖进料；
iii)历经1天、2天、3天、4天、5天的时程借助于进料溶液以连续方式向该培养基中添加乳糖进料，且其中该乳糖进料溶液的浓度为50g/L、较佳75g/L、更佳100g/L、更佳125g/L、更佳150g/L、更佳175g/L、更佳200g/L、更佳225g/L、更佳250g/L、更佳275g/L、更佳300g/L、更佳325g/L、更佳350p/L、更佳375g/L、更佳400g/L、更佳450g/L、更佳500g/L、甚至更佳550g/L、最佳600g/L；且其中较佳地，该溶液的pH设定在3与7之间，且其中较佳地，该进料溶液的温度保持在20℃与80℃之间；
该方法在该培养基的该最终体积中产生浓度为至少50g/L、较佳至少75g/L、更佳至少90g/L、更佳至少100g/L、更佳至少125g/L、更佳至少150g/L、更佳至少175g/L、更佳至少200g/L的由该乳糖生产的唾液酸化寡糖。
35.如具体实例34的方法，其中该乳糖进料、借由自培养开始以至少5mM的浓度，较佳以30、40、50、60、70、80、90、100、150mM的浓度，更佳以＞300mM的浓度添加乳糖来实现。
36.如具体实例34或35中任一项的方法，其中该乳糖进料借由以一定浓度向培养基中添加乳糖，使得在培养的整个生产阶段中获得至少5mM、较佳10mM或30mM的乳糖浓度来实现。
37.如具体实例32至36中任一项的方法，其中所述宿主细胞培养至少约60、80、100或约120小时或以连续方式培养。
38.如具体实例32至37中任一项的方法，其中该细胞培养于包含碳源的培养基中，该碳源包含单糖、双糖、寡糖、多糖、多元醇、甘油，包括糖蜜、玉米浸液、蛋白胨、胰胨或酵母萃取物的复合培养基；较佳地，其中该碳源选自包含以下者的清单：葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、麦芽寡糖、麦芽三糖、山梨糖醇、木糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖、甲醇、乙醇、海藻糖、淀粉、纤维素、半纤维素、糖蜜、玉米浸液、高果糖糖浆、乙酸、柠檬酸、乳酸及丙酮酸。
39.如具体实例32至38中任一项的方法，其中该细胞使用至少一种用于合成该唾液酸化双糖及/或寡糖的前驱物，较佳该细胞使用两种或更多种用于合成该唾液酸化双糖及/或寡糖的前驱物。
40.如具体实例32至39中任一项的方法，其中该培养基含有至少一种选自包含以下者的群组的化合物：乳糖、半乳糖、唾液酸、岩藻糖、GlcNAc、GalNAc、乳-N-二糖(LNB)、N-乙酰基乳糖胺(LacNAc)。
41.如具体实例32至40中任一项的方法，其中指数式细胞生长的第一阶段借由将较佳葡萄糖或蔗糖的以碳为基础的基质添加至该培养基中来提供，随后在第二阶段中将乳糖添加至培养基中。
42.如具体实例32至41中任一项的方法，其中该细胞生产至少一种用于合成该唾液酸化双糖及/或寡糖的前驱物。
43.如具体实例32至42中任一项的方法，其中用于合成该唾液酸化双糖及/或寡糖的该前驱物完全转化成该唾液酸化双糖及/或寡糖。
44.如具体实例32至43中任一项的方法，其中将该唾液酸化双糖及/或寡糖与该培养基及/或该细胞分离。
45.如具体实例32至44中任一项的方法，其中该分离包含以下步骤中的至少一者：澄清、超过滤、纳米过滤、二相分配、逆渗透、微过滤、活性炭或碳处理、用非离子界面活性剂处理、酶消化、切向流高效过滤、切向流超过滤、电泳、亲和层析、离子交换层析、疏水性交互作用层析及/或凝胶过滤、配位体交换层析。
46.如具体实例32至45中任一项的方法，其中该方法进一步包含纯化该唾液酸化双糖及/或寡糖。
47.如具体实例46的方法，其中该纯化包含以下步骤中的至少一者：使用活性炭或碳、使用木炭、纳米过滤、超过滤、电泳、酶处理或离子交换、使用醇、使用水醇混合物、结晶、蒸发、沉淀、干燥、喷雾干燥、冻干、喷雾冷冻干燥、冷冻喷雾干燥、条带式干燥、带式干燥、真空条带式干燥、真空带式干燥、转筒干燥、滚筒干燥、真空转筒干燥或真空滚筒干燥。
48.一种如具体实例1至29中任一项的细胞的用途，其用于生产唾液酸化双糖及/或寡糖。
49.一种如具体实例30的细胞的用途，其用于生产包含至少一种唾液酸化寡糖的寡糖的混合物。
50.一种如具体实例31的细胞的用途，其用于生产包含至少一种唾液酸化双糖及/或寡糖的双糖及寡糖的混合物。
51.一种如具体实例32至47中任一项的方法的用途，其用于生产唾液酸化双糖及/或寡糖。
本发明将在实施例中更详细地描述。以下实施例将充当本发明的进一步说明及阐明，且并不意欲为限制性的。
实施例
实施例1.计算多肽序列之间的一致性百分比
用于比较的序列比对方法为所属技术领域中熟知的，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA及TFASTA。GAP使用尼德曼及翁施的算法(J.Mol.Biol.(1970)48：443-453)寻找使匹配数达至最大且使空位数使减至最小的两个序列的全局(亦即跨越全长序列)比对。BLAST算法(Altschul等人，J.Mol.Biol.(1990)215：403-10)计算全局序列一致性百分比(亦即在全长序列上进行)且对两个序列之间的相似度进行统计分析。用于进行BLAST分析的软件可经由国家生物技术资讯中心(NCBI)公开获得。可使用例如ClustalW多重序列比对算法(1.83版)用预设成对比对参数及百分比评分法容易地鉴别同源物。亦可使用MatGAT软件包(Campanella等人，BMC Bioinformatics(2003)4：29)中可获得的一种方法来确定全局相似性及一致性百分比(亦即跨越全长序列)。如所属技术领域中具有通常知识者将显而易见，可进行轻微手动编辑以使保守模体之间的比对最佳化。此外，亦可使用特定域而非使用全长序列来鉴别同源物，以确定所谓的局部序列一致性。可使用上文所提及的程序使用预设参数，在整个核酸或氨基酸序列上确定序列一致性值(＝在全长序列上进行局部序列一致性搜寻，产生全局序列一致性评分)，或在所选域或保守模体上确定序列一致性值(＝在部分序列上进行局部序列一致性搜寻，产生局部序列一致性评分)。对于局部比对，史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman algorithm)尤其适用(Smith TF，Waterman MS(1981)J.Mol.Biol 147(1)；195-7)。
实施例2.大肠杆菌材料及方法
培养基
鲁利亚培养液(Luria Broth；LB)培养基由1％胰胨蛋白胨(Difco，Erembodegem，Belgium)、0.5％酵母萃取物(Difco)及0.5％氯化钠(VWR，Leuven，Belgium)组成。培养实验中在96孔盘或摇瓶中使用的基本培养基含有2.00g/L NH4Cl、5.00g/L(NH4)2SO4、2.993g/LKH2PO4、7.315g/LK2HPO4、8.372g/L MOPS、0.5g/L NaCl、0.5g/L MgSO4.7H2O、30g/L蔗糖或30g/L甘油、1ml/L维生素溶液、100μl/L钼酸盐溶液及1mL/L硒溶液。如各别实施例中所指定，另外将0.30g/L唾液酸、20g/L乳糖、20g/L LacNAc及/或20g/L LNB作为前驱物添加至培养基中。使用1M KOH将基本培养基设定为pH 7。维生素溶液由3.6g/L FeCl2.4H2O、5g/LCaCl2.2H2O、1.3g/L MnCl2.2H2O、0.38g/L CuCl2.2H2O、0.5g/L CoCl2.6H2O、0.94g/LZnCl2、0.0311g/L H3BO4、0.4g/L Na2EDTA.2H2O及1.01g/L硫胺.HCl组成。钼酸盐溶液含有0.967g/L NaMoO4.2H2O。硒溶液含有42g/L Seo2。
用于发酵的基本培养基含有6.75g/L NH4Cl、1.25g/L(NH4)2SO4、2.93g/L KH2PO4及7.31g/L KH2PO4、0.5g/L NaCl、0.5g/L MgSO4.7H2O、30g/L蔗糖或30g/L甘油、1mL/L维生素溶液、100μL/L钼酸盐溶液及1mL/L硒溶液，其组成与上文所描述相同。如各别实施例中所指定，另外将0.30g/L唾液酸、20g/L乳糖、20g/L LacNAc及/或20g/L LNB作为前驱物添加至培养基中。
借由高压处理(121℃，21分钟)对复合培养基进行灭菌且借由过滤(0.22μmSartorius)对基本培养基进行灭菌。必要时，借由添加抗生素使培养基具有选择性：例如氯霉素(20mg/L)、卡本西林(100mg/L)、观霉素(40mg/L)及/或康霉素(50mg/L)。
质体
pKD46(Red辅助质体，安比西林抗性)、pKD3(含有FRT侧接氯霉素抗性(cat)基因)、pKD4(含有FRT侧接康霉素抗性(kan)基因)及pCP20(表现FLP重组酶活性)质体获自R.Cunin教授(比利时布鲁塞尔自由大学(Vrije Universiteit Brussel，Belgium)，2007)。将质体保持在购自Invitrogen的宿主大肠杆菌DH5α(F-、phi80dlacZΔM15、Δ(lacZYA-argF)U169、deoR、recA1、endA1、hsdR17(rk-，mk+)、phoA、supE44、λ-、thi-1、gyrA96、relA1)中。
菌株及突变
大肠杆菌K12 MG1655[λ-、F-、rph-1]于2007年3月获自大肠杆菌基因储备中心(Coli Genetic Stock Center)(美国)，CGSC菌株编号：7740。基因破坏、基因引入及基因置换使用由Datsenko及Wanner(PNAS 97(2000)，6640-6645)公开的技术进行。此技术基于借由λRed重组酶进行同源重组之后的抗生素选择。翻转酶重组酶之后续催化确保在最终生产菌株中移除抗生素选择卡匣。携带Red辅助质体pKD46的转形体在30℃下在10mL含安比西林(100mg/L)及L-阿拉伯糖(10mM)的LB培养基中生长至OD600nm为0.6。借由第一次用50mL冰冷水且第二次用1mL冰冷水洗涤细胞使其电胜任。接着，将细胞再悬浮于50μL冰冷水中。用50μL细胞及10-100ng线性双股DNA产物，借由使用GenePulserTM(BioRad)(600Ω，25μFD及250伏)进行电穿孔。在电穿孔之后，将细胞添加至1mLLB培养基中，在37℃下培育1小时，且最后涂敷至含有25mg/L氯霉素或50mg/L康霉素的LB琼脂上以选择抗生素抗性转形体。借由PCR用在经修饰区上游及下游的引子验证所选突变体，且使其在42℃下生长于LB琼脂中以使辅助质体损失。测试突变体的安比西林敏感性。借由PCR使用pKD3、pKD4及其衍生物作为模板获得线性ds-DNA扩增子。所用引子具有与模板互补的序列的一部分及与染色体DNA上必须发生重组之侧互补的另一部分。对于基因体剔除，同源区经设计在所关注基因的起始及终止密码子上游50-nt及下游50-nt。对于基因体嵌入，必须考虑转录起始点(+1)。将PCR产物进行PCR纯化，用Dpnl消化，自琼脂糖凝胶再纯化，且悬浮于洗提缓冲液(5mM Tris，pH 8.0)中。用pCP20质体转形所选突变体，该质体为显示温度敏感性复制及FLP合成的热诱导的安比西林及氯霉素抗性质体。在30℃下选择安比西林抗性转形体，其后将一些转形体在42℃下在LB中群落纯化，且接着测试所有抗生素抗性及FLP辅助质体的损失。用对照引子检查基因剔除及基因嵌入。
在唾液酸生产的一实施例中，突变菌株衍生自大肠杆菌K12MG1655，其包含持续型转录单元的基因体嵌入，所述持续型转录单元含有葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶，如例如具有SEQ ID NO 7的来自酿酒酵母的GNA1的一或多个复本；N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶，如例如具有SEQ ID NO 9的来自卵形拟杆菌的AGE；及N-乙酰基神经氨酸合酶，如例如具有SEQ ID NO 01的来自脑膜炎奈瑟氏菌的NeuB或具有SEQ ID NO 02的来自空肠弯曲杆菌的NeuB的一或多个复本。
可替代地及/或另外，唾液酸生产可借由持续型转录单元的基因体嵌入获得，所述持续型转录单元含有UDP-N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶，如例如具有SEQ ID NO 12的来自空肠弯曲杆菌的NeuC；及N-乙酰基神经氨酸合酶，如例如具有SEQ ID NO 01的来自脑膜炎奈瑟氏菌的NeuB或具有SEQ ID NO 02的来自空肠弯曲杆菌的NeuB的一或多个复本。
可替代地及/或另外，唾液酸生产可借由持续型转录单元的基因体嵌入获得，所述持续型转录单元含有磷酸葡萄糖胺变位酶，如例如具有SEQ ID NO 10的来自大肠杆菌的glmM；N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰基转移酶/葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶，如例如具有SEQ ID NO 11的来自大肠杆菌的glmU；UDP-N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶，如例如具有SEQ ID NO 12的来自空肠弯曲杆菌的NeuC；及N-乙酰基神经氨酸合酶，如例如具有SEQID NO 01的来自脑膜炎奈瑟氏菌的NeuB或具有SEQ ID NO 02的来自空肠弯曲杆菌的NeuB的一或多个复本。
可替代地及/或另外，唾液酸生产可借由持续型转录单元的基因体嵌入获得，所述持续型转录单元含有双官能UDP-GlcNAc 2-表异构酶/N-乙酰基甘露糖胺激酶，如例如来自小鼠(C57BL/6J品系)具有SEQ ID NO 13；N-酰基神经氨酸-9-磷酸合成酶，如例如来自互养棍状菌属(Syntrophorhabdus)PtaU1.Bin058具有SEQ ID NO 14；及N-酰基神经氨酸-9-磷酸酶，如例如来自候选种趋磁桑葚状菌属HK-1具有SEQ ID NO 15及/或来自多形拟杆菌(ATCC 29148菌株)具有SEQ ID NO 16。
可替代地及/或另外，唾液酸生产可借由持续型转录单元的基因体嵌入获得，所述持续型转录单元含有磷酸葡萄糖胺变位酶，如例如具有SEQ ID NO 10的来自大肠杆菌的glmM；N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰基转移酶/葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶，如例如具有SEQ ID NO 11的来自大肠杆菌的glmU；双官能UDP-GlcNAc 2-表异构酶/N-乙酰基甘露糖胺激酶，如例如来自小鼠(C57BL/6J品系)具有SEQ ID NO 13；N-酰基神经氨酸-9-磷酸合成酶，如例如来自互养棍状菌属PtaU1.Bin058具有SEQ ID NO 14；及N-酰基神经氨酸-9-磷酸酶，如例如来自候选种趋磁桑葚状菌属HK-1具有SEQ ID NO 15及/或来自多形拟杆菌(ATCC 29148菌株)具有SEQ ID NO 16。
唾液酸生产可进一步在突变大肠杆菌菌株中最佳化，该菌株具有包含以下者中的任何一或多者的大肠杆菌基因的基因体剔除：nagA、nagB、nagC、nagD、nagE、nanA、nanE、nanK、manX、manY及manZ，如WO18122225中所描述；及/或包含以下者中的任何一或多者的大肠杆菌基因的基因体剔除：nanT、poxB、ldhA、adhE、aldB、pflA、pflC、ybiY、ackA及/或pta；且具有包含以下者中的任何一或多者的持续型转录单元的基因体嵌入：唾液酸运输蛋白，如例如具有SEQ ID NO 08的来自大肠杆菌的nanT的一或多个复本；膜运输蛋白，如例如具有SEQ ID NO 49的来自大肠杆菌的entS、具有SEQ ID NO 50的来自大肠杆菌的MdfA、具有SEQ ID NO 51的来自大肠杆菌的iceT、具有SEQ ID NO 52的来自大肠杆菌的oppF、具有SEQID NO 53的来自乳酸乳球菌乳酸亚种二乙酰基乳酸生物型的lmrA、具有SEQ ID NO 54的来自长双叉杆菌婴儿亚种的Blon_2475、具有SEQ ID NO 55的来自大肠杆菌的SetA、具有SEQID NO 56的来自大肠杆菌的SetB及具有SEQ ID NO 57的来自大肠杆菌的SetC或其任何组合的一或多个复本；L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶，如例如具有SEQ ID NO 06的来自大肠杆菌的突变glmS*54(与野生型大肠杆菌glmS的不同之处在于A39T、R250C及G472S突变)的一或多个复本；较佳如例如以下者中的任何一或多者的磷酸酶：包含aphA、Cof、HisB、OtsB、SurE、Yaed、YcjU、YedP、YfbT、YidA、YigB、YihX、YniC、YqaB、YrbL、AppA、Gph、SerB、YbhA、YbiV、YbjL、Yfb、YieH、YjgL、YjjG、YrfG及YbiU的大肠杆菌基因，或来自恋臭假单胞菌的PsMupP，来自酿酒酵母的ScDOG1，及来自枯草杆菌的BsAraL，如WO18122225中所描述；及具有SEQ ID NO 47的来自大肠杆菌的乙酰基-CoA合成酶acs。
对于唾液酸化寡糖生产，所述唾液酸生产菌株经进一步修饰以表现两种或更多种具有N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶活性的同功蛋白质，如例如具有SEQ ID NO 03的来自空肠弯曲杆菌的NeuA酶、具有SEQ ID NO 04的来自流感嗜血杆菌的NeuA酶及具有SEQ IDNO 05的来自多杀性巴氏杆菌的NeuA酶；且表现以下者的一或多个复本：β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸基转移酶，如例如来自多杀性巴氏杆菌的SEQ ID NO 17(PmultST3)、来自脑膜炎奈瑟氏菌的SEQ ID NO 18(NmeniST3)或来自多杀性巴氏杆菌多杀性亚种Pm70菌株的SEQ IDNO 48(PmultST2)，β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸基转移酶，如例如来自美人鱼发光菌(Photobacterium damselae)的SEQ ID NO 19(PdST6)或来自发光菌属JT-ISH-224的SEQID NO 20(P-JT-ISH-224-ST6)及/或α-2，8-唾液酸基转移酶，如例如来自小鼠具有SEQ IDNO 21。
N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶及唾液酸基转移酶的持续型转录单元可经由基因体嵌入或经由表现质体递送至突变菌株。若生产唾液酸及CMP-唾液酸的突变菌株意欲构造唾液酸化乳糖结构，则菌株另外经大肠杆菌LacZ、LacY及LacA基因的基因体剔除及经乳糖透过酶，如例如具有SEQ ID NO 22的大肠杆菌LacY的持续型转录单元的基因体嵌入修饰。生产唾液酸、CMP-唾液酸及/或唾液酸化寡糖的所有突变菌株可视情况经由含有以下持续型转录单元的基因体嵌入而适用于在蔗糖上生长：蔗糖运输蛋白，如例如具有SEQ ID NO23的来自大肠杆菌W的CscB；果糖激酶，如例如具有SEQ ID NO 24的源自运动发酵单胞菌(Zmobilis)的Frk；及蔗糖磷酸化酶，如例如来自青春双叉杆菌(B.adolescentis)具有SEQ IDNO 25。
可替代地及/或另外，唾液酸及/或唾液酸化寡糖生产可进一步用持续型转录单元的基因体嵌入在突变大肠杆菌菌株中最佳化，该持续型转录单元包含膜运输蛋白，如例如唾液酸运输蛋白，如例如来自大肠杆菌K-12 MG1655的nanT(UniProt ID P41036)、来自大肠杆菌O6：H1的nanT(UniProt ID Q8FD59)、来自大肠杆菌O157：H7的nanT(UniProt IDQ8X9G8)或来自艾伯特氏埃希氏菌(E.albertii)的nanT(UniProt ID B1EFH1)；或搬运体，如例如来自大肠杆菌的EntS(UniProt ID P24077)、来自抗坏血酸克吕沃尔氏菌(Kluyveraascorbata)的EntS(UniProt ID A0A378GQ13)或来自肠沙门氏菌亚利桑那亚种(Salmonella enterica subsp.arizonae)的EntS(UniProt ID A0A6Y2K4E8)、来自莫金斯克罗诺杆菌(Cronobacter muytjensii)的MdfA(UniProt ID A0A2T7ANQ9)、来自杨氏柠檬酸杆菌(Citrobacter youngae)的MdfA(UniProt ID D4BC23)、来自大肠杆菌的MdfA(UniProt ID P0AEY8)、来自雷金斯堡预研菌(Yokenella regensburgei)的MdfA(UniProtID G9Z5F4)、来自大肠杆菌的iceT(UniProt ID A0A024L207)、来自杨氏柠檬酸杆菌的iceT(UniProt ID D4B8A6)、来自大肠杆菌的SerA(UniProt ID P31675)、来自大肠杆菌的SetB(UniProt ID P33026)或来自大肠杆菌的SetC(UniProt ID P31436)；或ABC运输蛋白，如例如来自大肠杆菌的oppF(UniProt ID P77737)、来自乳酸乳球菌乳酸亚种二乙酰基乳酸生物型的lmrA(UniProt ID A0A1V0NEL4)或来自长双叉杆菌婴儿亚种的Blon_2475(UniProtID B7GPD4)。
在生产唾液酸的大肠杆菌菌株中GDP-岩藻糖生产的一实施例中，此等实施例中的突变菌株经进一步修饰，包含大肠杆菌wcaJ及thyA基因的剔除及持续型转录单元的基因体嵌入，所述持续型转录单元含有蔗糖运输蛋白，如例如具有SEQ ID NO 23的来自大肠杆菌W的CscB；果糖激酶，如例如具有SEQ ID NO 24的源自运动发酵单胞菌的Frk；及蔗糖磷酸化酶(sucrose phosphorylase；SP)，如例如来自青春双叉杆菌具有SEQ ID NO 25。为生产岩藻糖基化寡糖，突变GDP-岩藻糖生产菌株另外经表现质体修饰，表现质体包含α-1，2-岩藻糖基转移酶，如例如具有SEQ ID NO 26的来自幽门螺旋杆菌(H.pylori)的HpFutC及/或α-1，3-岩藻糖基转移酶，如例如具有SEQ ID NO 27的来自幽门螺旋杆菌的HpFucT的持续型转录单元，及经作为选择性标记的具有SEQ ID NO 28的大肠杆菌thyA的持续型转录单元修饰。岩藻糖基转移酶基因的持续型转录单元亦可经由基因体嵌入存在于突变大肠杆菌菌株中。如WO2016075243及WO2012007481中所描述，GDP-岩藻糖生产可进一步借由包含glgC、agp、pfkA、pfkB、pgi、arcA、iclR、pgi及lon的大肠杆菌基因中的任何一或多者的基因体剔除在突变大肠杆菌菌株中最佳化。GDP-岩藻糖生产可另外经最佳化，包含以下者的持续型转录单元的基因体嵌入：甘露糖-6-磷酸异构酶，如例如具有SEQ ID NO 29的来自大肠杆菌的manA；磷酸甘露糖变位酶，如例如具有SEQ ID NO 30的来自大肠杆菌的manB；甘露糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶，如例如具有SEQ ID NO 31的来自大肠杆菌的manC；GDP-甘露糖4，6-脱水酶，如例如具有SEQ ID NO 32的来自大肠杆菌的gmd；及GDP-L-岩藻糖合酶，如例如具有SEQ ID NO 33的来自大肠杆菌的fcl。GDP-岩藻糖生产亦可借由大肠杆菌fucK及fucI基因的基因体剔除及持续型转录单元的基因体嵌入获得，所述持续型转录单元含有岩藻糖透过酶，如例如具有SEQ ID NO 34的来自大肠杆菌的fucP，及双官能岩藻糖激酶/岩藻糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶，如例如具有SEQ NO ID 35的来自脆弱拟杆菌的fkp。若生产唾液酸及CMP-岩藻糖的突变菌株意欲构造岩藻糖基化乳糖结构，则菌株另外经大肠杆菌LacZ、LacY及LacA基因的基因体剔除及经乳糖透过酶，如例如具有SEQ ID NO 22的大肠杆菌LacY的持续型转录单元的基因体嵌入修饰。此外，若突变菌株亦意欲构造唾液酸化结构，则菌株另外经包含以下者的一或多个复本的持续型转录单元的基因体嵌入或表现质体修饰：N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶，如例如具有SEQ ID NO 03的来自空肠弯曲杆菌的NeuA、具有SEQID NO 04的来自流感嗜血杆菌的NeuA及/或具有SEQ ID NO 05的来自多杀性巴氏杆菌的NeuA；且表现以下者的一或多个复本：β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸基转移酶，如例如来自多杀性巴氏杆菌的SEQ ID NO 17(PmultST3)、来自脑膜炎奈瑟氏菌的SEQ ID NO 18(NmeniST3)或来自多杀性巴氏杆菌多杀性亚种Pm70菌株的SEQ ID NO 48(PmultST2)，β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸基转移酶，如例如来自美人鱼发光菌的SEQ ID NO 19(PdST6)及/或来自发光菌属JT-ISH-224的SEQ ID NO 20(P-JT-ISH-224-ST6)及/或α-2，8-唾液酸基转移酶，如例如来自小鼠具有SEQ ID NO 21。
可替代地及/或另外，GDP-岩藻糖及/或岩藻糖基化结构的生产可进一步经持续型转录单元的基因体嵌入在突变大肠杆菌菌株中最佳化，该持续型转录单元包含膜运输蛋白，如例如来自莫金斯克罗诺杆菌的MdfA(UniProt ID A0A2T7ANQ9)、来自杨氏柠檬酸杆菌的MdfA(UniProt ID D4BC23)、来自大肠杆菌的MdfA(UniProt ID P0AEY8)、来自雷金斯堡预研菌的MdfA(UniProt ID G9Z5F4)、来自大肠杆菌的iceT(UniProt ID A0A024L207)或来自杨氏柠檬酸杆菌的iceT(UniProt ID D4B8A6)。
在生产唾液酸的大肠杆菌菌株中生产LN3(GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)的一实施例中，此等实施例中的突变菌株经进一步修饰，包含大肠杆菌LacZ、LacY及LacA基因的剔除及以下者的持续型转录单元的基因体嵌入：乳糖透过酶，如例如具有SEQ ID NO 22的大肠杆菌LacY，及半乳糖苷β-1，3-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶，如例如具有SEQ ID NO 36的来自脑膜炎奈瑟氏菌的LgtA。
在用于生产LN-3衍生的寡糖，如乳-N-四糖(LNT)及乳-N-新四糖(LNnT)的一实施例中，生产突变LN3的菌株进一步用经由基因体嵌入或自表现质体递送至菌株的以下者的持续型转录单元修饰：N-乙酰基葡萄糖胺β-1，3-半乳糖基转移酶，如例如具有SEQ ID NO37的来自大肠杆菌O55：H7的WbgO以生产LNT，或N-乙酰基葡萄糖胺β-1，4-半乳糖基转移酶，如例如具有SEQ ID NO 38的来自脑膜炎奈瑟氏菌的LgtB以生产LNnT。视情况，可将半乳糖苷β-1，3-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺β-1，3-半乳糖基转移酶及/或N-乙酰基葡萄糖胺β-1，4-半乳糖基转移酶编码基因的多个复本添加至突变大肠杆菌菌株中。另外，菌株可视情况经大肠杆菌ushA及galT基因的基因体剔除修饰以增强UDP-半乳糖生产。突变大肠杆菌菌株亦可视情况经UDP-葡萄糖-4-表异构酶，如例如具有SEQ ID NO39的来自大肠杆菌的galE的持续型转录单元的基因体嵌入调适。此外，若突变菌株亦意欲构造唾液酸化结构，则菌株另外经包含以下者的一或多个复本的持续型转录单元的基因体嵌入或表现质体修饰：N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶，如例如具有SEQ ID NO 03的来自空肠弯曲杆菌的NeuA、具有SEQ ID NO 04的来自流感嗜血杆菌的NeuA及/或具有SEQ ID NO 05的来自多杀性巴氏杆菌的NeuA；且表现以下者的一或多个复本：β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸基转移酶，如例如来自多杀性巴氏杆菌的SEQ ID NO 17(PmultST3)、来自脑膜炎奈瑟氏菌的SEQ ID NO 18(NmeniST3)或来自多杀性巴氏杆菌多杀性亚种Pm70菌株的SEQ ID NO 48(PmultST2)，β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸基转移酶，如例如来自美人鱼发光菌的SEQ ID NO19(PdST6)及/或来自发光菌属JT-ISH-224的SEQ ID NO 20(P-JT-ISH-224-ST6)及/或α-2，8-唾液酸基转移酶，如例如来自小鼠具有SEQ ID NO 21。突变大肠杆菌菌株亦可视情况经由持续型转录单元的基因体嵌入而适用于在蔗糖上生长，所述持续型转录单元含有蔗糖运输蛋白，如例如具有SEQ ID NO 23的来自大肠杆菌W的CscB；果糖激酶，如例如具有SEQ IDNO 24的源自运动发酵单胞菌的Frk；及蔗糖磷酸化酶，如例如来自青春双叉杆菌具有SEQID NO 25。
可替代地及/或另外，LN3、LNT、LNnT及其衍生的寡糖的生产可进一步经持续型转录单元的基因体嵌入在突变大肠杆菌菌株中最佳化，该持续型转录单元包含膜运输蛋白，如例如来自莫金斯克罗诺杆菌的MdfA(UniProt ID A0A2T7ANQ9)、来自杨氏柠檬酸杆菌的MdfA(UniProt ID D4BC23)、来自大肠杆菌的MdfA(UniProt ID P0AEY8)、来自雷金斯堡预研菌的MdfA(UniProt ID G9Z5F4)、来自大肠杆菌的iceT(UniProt ID A0A024L207)或来自杨氏柠檬酸杆菌的iceT(UniProt ID D4B8A6)。较佳但未必，糖基转移酶、参与核苷酸活化糖合成的蛋白质及/或膜运输蛋白经N端及/或C端融合至如例如以下者的溶解度强化子标签：SUMO标签、MBP标签、His、FLAG、Strep-II、Halo标签、NusA、硫氧还原蛋白、GST及/或Fh8标签以增强其溶解度(Cost等人，Front.Microbiol.2014，https：//doi.org/10.3389/fmicb.2014.00063；Fox等人，Protein Sci.2001，10(3)，622-630；Jia及Jeaon，OpenBiol.2016，6：160196)。
视情况，突变大肠杆菌菌株经编码伴随蛋白，如例如DnaK、DnaJ、GrpE或GroEL/ES伴随蛋白系统的持续型转录单元的基因体嵌入修饰(Baneyx F.，Palumbo J.L.(2003)Improving Heterologous Protein Folding via Molecular Chaperone and FoldaseCo-Expression.在：Vaillancourt P.E.(编)E.coliGene Expression Protocols.Methodsin Molecular BiologyTM，第205卷.Humana Press中)。
视情况，突变大肠杆菌菌株经修饰以产生糖基最小化的大肠杆菌菌株，其包含非必需糖基转移酶基因中的任何一或多者的基因体剔除，所述非必需糖基转移酶基因包含pgaC、pgaD、rfe、rffT、rffM、bcsA、bcsB、bcsC、wcaA、wcaC、wcaE、wcaI、wcaJ、wcaL、waaH、waaF、waaC、waaU、waaZ、waaJ、waaO、waaB、waaS、waaG、waaQ、wbbl、arnC、amT、yfdH、wbbK、opgG、opgH、ycjM、glgA、gkgB、malQ、otsA及yaiP。
所有持续型启动子、UTR及终止子序列源自Cambray等人(Nucleic AcidsRes.2013，41(9)，5139-5148)、Dunn等人(Nucleic Acids Res.1980，8，2119-2132)、Edens等人(Nucleic Acids Res.1975，2，1811-1820)、Kim及Lee(FEBS Letters 1997，407，353-356)及Mutalik等人(Nat.Methods 2013，第10期，354-360)所描述的库。
所有基因在Twist Bioscience(twistbioscience.com)或IDT(eu.idtdna.com)处合成订购，且使用供应商的工具调适密码子使用。
所有菌株在-80℃下储存于冷冻小瓶中(隔夜LB培养物以1∶1的比与70％甘油混合)。
表1：本发明中所描述的SEQ ID NO的概述
Figure BPA0000334655460001271
Figure BPA0000334655460001281
Figure BPA0000334655460001291
培养条件
96孔微量滴定盘实验的预培养始于冷冻小瓶，于150μL LB中，且在37℃下在定轨振荡器上以800rpm培育隔夜。此培养物用作96孔正方形微量滴定盘的接种物，在400μL基本培养基情况下借由稀释400倍。此等最终96孔培养盘接着在37℃下在定轨振荡器上以800rpm培育72小时或更短或更长。为量测培养实验结束时的糖浓度，借由使培养液在60℃下沸腾15分钟，之后使细胞短暂离心而自各孔获取全培养液样品(＝细胞内及细胞外糖浓度的平均值)。
生物反应器的预培养始于某一菌株的整个1mL冷冻小瓶，在1L或2.5L摇瓶中的250mL或500mL基本培养基中接种，且在37℃下在定轨振荡器上以200rpm培育24小时。接着接种5L生物反应器(具有5L工作体积)(2L分批培养基中的250mL接种物)；该方法受MFCS控制软件(Sartorius Stedim Biotech，德国梅尔松根(Melsungen，Germany))控制。培养条件设定为37℃及最大搅拌；压力气体流动速率视菌株及生物反应器而定。使用0.5M H2S04及20％NH4OH将pH控制在6.8。冷却废气。在发酵期间起泡产生时，添加10％聚硅氧消泡剂溶液。
光密度
培养物的细胞密度通常借由量测600nm下的光密度(Implen NanophotometerNP80，Westburg，比利时，或用Spark 10M微量盘读取器，Tecan，瑞士)来监测。
解析型分析
标准品，诸如但不限于蔗糖、乳糖、N-乙酰基乳糖胺(LacNAc，Gal-b1，4-GlcNAc)、乳-N-二糖(LNB，Gal-b1，3-GlcNAc)、岩藻糖基化LacNAc(2′FLacNAc、3-FLacNAc)、唾液酸化LacNAc(3′SLacNAc、6′SLacNAc)、岩藻糖基化LNB(2′FLNB、4′FLNB)、乳-N-丙糖II(LN3)、乳-N-四糖(LNT)、乳-N-新-四糖(LNnT)、LNFP-I、LNFP-II、LNFP-III、LNFP-V、LNFP-VI、LSTa、LSTc及LSTd购自Carbosynth(英国)、Elicityl(法国)及IsoSep(瑞典)。用内部制造的标准品分析其他化合物。
在Waters Acquity H级UPLC上用折射率(Refractive Index；RI)侦测分析唾液酸化寡糖。在Waters Acquity UPLC BEH Amide管柱(2.1×100mm；
Figure BPA0000334655460001301
1.7μm)上注射0.5μL体积的样品。管柱温度为50℃。移动相由添加0.05％吡咯啶的70％乙腈、26％乙酸铵缓冲液(150mM)及4％甲醇的混合物组成。该方法以0.150mL/min的流速等度。RI侦测器的温度设定为35℃。在Waters Acquity H级UPLC上用蒸发光散射侦测器(Evaporative LightScattering Detector；ELSD)或折射率(RI)侦测分析中性寡糖。在Waters Acquity UPLCBEH Amide管柱(2.1×100mm；
Figure BPA0000334655460001303
Figure BPA0000334655460001302
1.7μm)管柱及Acquity UPLC BEH Amide VanGuard管柱(
Figure BPA0000334655460001304
2.1×5mm)上注射0.7μL体积的样品。管柱温度为50℃。移动相由添加0.2％三乙胺的1/4水及3/4乙腈溶液组成。该方法以0.130mL/min的流速等度。ELS侦测器的漂移管温度为50℃，且N2气体压力为50psi，增益为200且资料速率为10pps。RI侦测器的温度设定为35℃。在Waters Acquity H级UPLC上用折射率(RI)侦测分析中性糖及唾液酸化糖两者。在Waters Acquity UPLC BEH Amide管柱(2.1×100mm；
Figure BPA0000334655460001311
1.7μm)上注射0.5μL体积的样品。管柱温度为50℃。移动相由添加0.1％三乙胺的72％乙腈与28％乙酸铵缓冲液(100mM)的混合物组成。该方法以0.260mL/min的流速等度。RI侦测器的温度设定为35℃。
对于质谱仪上的分析，使用具有电洒离子化(ESI)的Waters Xevo TQ-MS，去溶剂化温度为450℃，氮气去溶剂化气体流速为650L/h且锥电压为20V。对于所有寡糖，MS在选择离子监测(selected ion monitoring；SIM)中在负模式下操作。在具有Thermo Hypercarb管柱(2.1×100mm；3μm)的Waters Acquity UPLC上在35℃下进行分离。使用梯度，其中洗提剂A为含0.1％甲酸的超纯水且其中洗提剂B为含0.1％甲酸的乙腈。寡糖在55分钟内使用以下梯度分离：在21分钟内自2％至12％洗提剂B初始增加，在11分钟内自12％至40％洗提剂B第二增加，及在5分钟内自40％至100％洗提剂B第三增加。作为洗涤步骤，使用100％洗提剂B 5分钟。对于管柱平衡，2％洗提剂B的起始条件在1分钟内恢复且维持12分钟。
在Dionex HPAEC系统上用脉冲安培侦测(PAD)分析低浓度(低于50mg/L)下的中性糖及唾液酸化糖两者。在Dionex CarboPac PA200管柱4×250mm及Dionex CarboPac PA200保护管柱4×50mm上注射5μL体积的样品。管柱温度设定为30℃。使用梯度，其中洗提剂A为去离子水，其中洗提剂B为200mM氢氧化钠且其中洗提剂C为500mM乙酸钠。寡糖在60分钟内分离，同时使用以下梯度维持25％的洗提剂B的恒定比率：75％洗提剂A的初始等度步骤维持10分钟，0％至4％洗提剂C在8分钟内的初始增加，71％洗提剂A及4％洗提剂C的第二等度步骤维持6分钟，4％至12％洗提剂C在2.6分钟内的第二增加，63％洗提剂A及12％洗提剂C的第三等度步骤维持3.4分钟，及12％至48％洗提剂C在5分钟内的第三增加。作为洗涤步骤，使用48％洗提剂C 3分钟。对于管柱平衡，75％洗提剂A及0％洗提剂C的初始条件在1分钟内恢复且维持11分钟。应用的流速为0.5mL/min。
实施例3.酿酒酵母材料及方法
培养基
在具有完整补充混合物(SD CSM)或CSM缺陷型(drop-out)(SD CSM-Ura，SD CSM-Trp，SD CSM-His)的合成限定酵母培养基上生长菌株，该培养基含有6.7g/L的不含氨基酸的酵母氮源基础(不含AA的YNB，Difco)、20g/L琼脂(Difco)(固体培养物)、22g/L葡萄糖单水合物或20g/L乳糖及0.79g/L CSM或0.77g/L CSM-Ura、0.77g/L CSM-Trp或0.77g/L CSM-His(MP Biomedicals)。
菌株
使用由Brachmann等人(Yeast(1998)14：115-32)产生的酿酒酵母BY4742，可获自Euroscarf培养物收集。所有突变菌株借由使用Gietz方法(Yeast 11：355-360，1995)的同源重组或质体转形产生。
质体
在生产唾液酸及CMP-唾液酸的一实施例中，酵母表现质体可衍生自pRS420质体系列(Christianson等人，1992，Gene 110：119-122)，其含有TRP1选择标记及以下者的持续型转录单元：L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶，如例如具有SEQ ID NO 06的来自大肠杆菌的突变glmS*54的一或多个复本；如例如以下者中的任何一或多者的磷酸酶：包含aphA、Cof、HisB、OtsB、SurE、Yaed、YcjU、YedP、YfbT、YidA、YigB、YihX、YniC、YqaB、YrbL、AppA、Gph、SerB、YbhA、YbiV、YbjL、Yfb、YieH、YjgL、YjjG、YrfG及YbiU的大肠杆菌基因，或来自恋臭假单胞菌的PsMupP，来自酿酒酵母的ScDOG1，及来自枯草杆菌的BsAraL，如WO18122225中所描述；N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶，如例如具有SEQ ID NO 09的来自卵形拟杆菌的AGE；N-乙酰基神经氨酸合酶，如例如具有SEQ ID NO 01的脑膜炎奈瑟氏菌的NeuB或具有SEQ ID NO 02的来自空肠弯曲杆菌的NeuB的一或多个复本；及N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶，如例如具有SEQ ID NO 03的来自空肠弯曲杆菌的NeuA、具有SEQ ID NO04的来自流感嗜血杆菌的NeuA及/或具有SEQ ID NO 05的来自多杀性巴氏杆菌的NeuA的一或多个复本。视情况，亦添加包含葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶，如例如具有SEQ ID NO07的来自酿酒酵母的GNA1的一或多个复本的持续型转录单元。
为了生产唾液酸化寡糖，质体进一步包含以下者的持续型转录单元：乳糖透过酶，如例如具有SEQ ID NO 40的乳酸克鲁维酵母的LAC12；及以下者的一或多个复本：β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸基转移酶，如例如来自多杀性巴氏杆菌的SEQ ID NO 17(PmultST3)、来自脑膜炎奈瑟氏菌的SEQ ID NO 18(NmeniST3)或来自多杀性巴氏杆菌多杀性亚种Pm70菌株的SEQ ID NO 48(PmultST2)，β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸基转移酶，如例如来自美人鱼发光菌的SEQ ID NO 19(PdST6)及/或来自发光菌属JT-ISH-224的SEQ ID NO 20(P-JT-ISH-224-ST6)及/或α-2，8-唾液酸基转移酶，如例如来自小鼠具有SEQ ID NO 21。
在生产GDP-岩藻糖的一实施例中，如p2a_2μ_Fuc(Chan 2013，Plasmid 70，2-17)的酵母表现质体可用于在酿酒酵母中表现外来基因。此质体含有安比西林抗性基因及细菌复制起点以允许在大肠杆菌中进行选择及维持，且含有2μ酵母ori及Ura3选择标记用于在酵母中进行选择及维持。此质体进一步经以下者的持续型转录单元修饰：乳糖透过酶，如例如具有SEQ ID NO 40的来自乳酸克鲁维酵母的LAC12；GDP-甘露糖4，6-脱水酶，如例如具有SEQ ID NO 32的来自大肠杆菌的gmd；及GDP-L-岩藻糖合酶，如例如具有SEQ ID NO 33的来自大肠杆菌的fcl。酵母表现质体p2a_2μ_Fuc2可用作p2a_2μ_Fuc质体的替代表现质体，该质体包含紧接于安比西林抗性基因、细菌ori、2μ酵母ori及Ura3选择标记的以下者的持续型转录单元：乳糖透过酶，如例如具有SEQ ID NO 40的来自乳酸克鲁维酵母的LAC12；岩藻糖透过酶，如例如具有SEQ ID NO 34的来自大肠杆菌的fucP；及双官能岩藻糖激酶/岩藻糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶，如例如具有SEQ NO ID 35的来自脆弱拟杆菌的fkp。为进一步生产岩藻糖基化寡糖，p2a_2μ_Fuc及其变异体p2a_2μ_Fuc2另外含有一或多种海藻糖基转移酶，如SEQ ID NO 26及27的持续型转录单元。
在生产UDP-半乳糖的一实施例中，酵母表现质体可衍生自pRS420-质体系列(Christianson等人，1992，Gene 110：119-122)，其含有HIS3选择标记及如例如具有SEQ IDNO 39的来自大肠杆菌的galE的UDP-葡萄糖-4-表异构酶的持续型转录单元。此质体进一步经以下者的持续型转录单元修饰以生产LN3：乳糖透过酶，如例如具有SEQ ID NO 40的来自乳酸克鲁维酵母的LAC12；半乳糖苷β-1，3-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶，如例如具有SEQ IDNO 36的来自脑膜炎奈瑟氏菌的lgtA。为进一步生产LN3衍生的寡糖，如LNT或LNnT，亦在质体上分别添加N-乙酰基葡萄糖胺β-1，3-半乳糖基转移酶，如例如具有SEQ ID NO 37的来自大肠杆菌O55：H7的WbgO，或N-乙酰基葡萄糖胺β-1，4-半乳糖基转移酶，如例如具有SEQ IDNO 38的来自脑膜炎奈瑟氏菌的lgtB。
较佳但未必，糖基转移酶经N端融合至SUMOstar标签(例如获自pYSUMOstar，LifeSensors，Malvern，PA)以增强其溶解度。
将质体保持在购自Invitrogen的宿主大肠杆菌DH5α(F-、phi80dlacZdeltaM15、Δ(lacZYA-argF)U169、deoR、recA1、endA1、hsdR17(rk-，mk+)、phoA、supE44、λ-、thi-1、gyrA96、relA1)中。
异源及同源表现
需要表现的基因，无论其来自质体或来自基因体，均以合成方式经以下公司中的一者合成：DNA2.0、Gen9、IDT或TwistBioscience。可借由使密码子使用最佳化为表现宿主的密码子使用来进一步促进表现。使用供应商的工具使基因最佳化。
培养条件
一般而言，酵母菌株最初在SD CSM盘上生长以获得单一菌落。使此等盘在30℃下生长2-3天。始于单一菌落，使预培养物在30℃下在5mL中生长隔夜，以200rpm振荡。后续的125mL摇瓶实验以25mL培养基中2％的此预培养物接种。在30℃下以200rpm定轨振荡下培育此等摇瓶。
基因表现启动子
使用合成持续型启动子表现基因，如由Blazeck(Biotechnology andBioengineering，第109卷，第11期，2012)所描述。
实施例4.用经修饰的大肠杆菌菌株生产6′-唾液酸基乳糖(6′-SL)
如实施例2中所描述，大肠杆菌K-12菌株MG1655经修饰用于唾液酸及6′-唾液酸基乳糖生产，包含大肠杆菌nagA、nagB、nanA、nanT、nanE、hanK、LacZ、LacY及LacA基因的剔除及含有以下者的持续型转录单元的基因体嵌入：具有SEQ ID NO 22的来自大肠杆菌的乳糖透过酶(LacY)、具有SEQ ID NO 08的来自大肠杆菌的唾液酸运输蛋白(nanT)、具有SEQ IDNO 06的来自大肠杆菌的L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶(glmS*54)、具有SEQ IDNO 07的来自酿酒酵母的葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶(GNA1)、具有SEQ ID NO 09的来自卵形拟杆菌的N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶(AGE)、具有SEQ ID NO 02的来自空肠弯曲杆菌的N-乙酰基神经氨酸合酶(NeuB)、具有SEQ ID NO 23的来自大肠杆菌W的蔗糖运输蛋白(CscB)、具有SEQ ID NO 24的来自运动发酵单胞菌的果糖激酶(Frk)及具有SEQ ID NO25的来自青春双叉杆菌的蔗糖磷酸化酶。由此获得的突变大肠杆菌菌株S0进一步经具有持续型转录单元的基因体嵌入及/或表现质体修饰以表现
a)一种具有SEQ ID NO 03的来自空肠弯曲杆菌的N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶，及一种具有SEQ ID NO 19的来自美人鱼发光菌的β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸基转移酶PdbST，
b)两种N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶同功蛋白质，其由具有SEQ ID NO 03的来自空肠弯曲杆菌的NeuA酶及具有SEQ ID NO 04的来自流感嗜血杆菌的NeuA酶组成，及具有SEQ ID NO 19的来自美人鱼发光菌的β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸基转移酶PdbST的两个复本，或
c)三种N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶同功蛋白质，其由具有SEQ ID NO 03的来自空肠弯曲杆菌的NeuA酶、具有SEQ ID NO 04的来自流感嗜血杆菌的NeuA酶及具有SEQ IDNO 05的来自多杀性巴氏杆菌的NeuA酶组成，及具有SEQ ID NO 19的来自美人鱼发光菌的β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸基转移酶PdbST的三个复本，
分别产生如表2中所概述的突变大肠杆菌菌株S1、S2及S3。用于表现所述NeuA酶或PdbST的启动子、UTR及终止子序列的细节概述于表3中。根据实施例2中所提供的培养条件在生长实验中评估新颖菌株，其中培养基含有30g/L蔗糖及20g/L乳糖。各菌株在96孔盘中以四个生物学重复生长。培育72小时之后，收集培养液，且在UPLC上分析糖。
实验证明所有新颖菌株生产6′-SL。在本文中，与表现一种具有SEQ ID NO03的来自空肠弯曲杆菌的NeuA酶及具有SEQ ID NO 19的来自美人鱼发光菌的PdbST酶的一个复本的菌株S1相比，表现两种具有N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶活性的同功蛋白质(亦即SEQID NO 03及04)及具有SEQ ID NO 19的来自美人鱼发光菌的PdbST酶的两个复本的菌株S2的6′-SL产量高2.60倍。在相同实验中，与表现一种具有SEQ ID NO 03的来自空肠弯曲杆菌的NeuA酶及具有SEQ ID NO 19的来自美人鱼发光菌的PdbST酶的一个复本的菌株S1相比，表现三种具有N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶活性的同功蛋白质(亦即SEQ ID NO 03、04及05)及具有SEQ ID NO 19的来自美人鱼发光菌的PdbST酶的三个复本的菌株S3的6′-SL产量高11.50倍。实验进一步证明所有突变菌株具有相似生长速率且在培养期间不遭受任何基因体或质体DNA不稳定性或重组(结果未示出)。
表2：与亲本大肠杆菌菌株S0相比，大肠杆菌菌株S1、S2及S3中存在的额外转录单元
Figure BPA0000334655460001371
*参见表3
表3：用于在如表2中给出的突变大肠杆菌菌株S 1、S2及S3中表现neuA同功蛋白质或α-2，6-唾液酸基转移酶PdbST的启动子、UTR及终止子序列
Figure BPA0000334655460001381
实施例5.用经修饰的大肠杆菌菌株生产3′-唾液酸基乳糖(3′-SL)
如实施例2中所描述，大肠杆菌K-12菌株MG1655经修饰用于唾液酸及3′-唾液酸基乳糖生产，包含大肠杆菌nagA、nagB、nanA、nanT、nanE、nanK、LacZ、LacY及LacA基因的剔除及含有以下者的持续型转录单元的基因体嵌入：具有SEQ ID NO 22的来自大肠杆菌的乳糖透过酶(LacY)、具有SEQ ID NO 08的来自大肠杆菌的唾液酸运输蛋白(nanT)、具有SEQ IDNO 06的来自大肠杆菌的L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶(glmS*54)的两个复本、具有SEQ ID NO 07的来自酿酒酵母的葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶(GNA1)的两个复本、具有SEQ ID NO 09的来自卵形拟杆菌的N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶(AGE)、具有SEQ ID NO01的来自脑膜炎奈瑟氏菌的N-乙酰基神经氨酸合酶(NeuB)、具有SEQ ID NO 23的来自大肠杆菌W的蔗糖运输蛋白(CscB)、具有SEQ ID NO 24的来自运动发酵单胞菌的果糖激酶(Frk)及具有SEQ ID NO 25的来自青春双叉杆菌的蔗糖磷酸化酶。由此获得的突变大肠杆菌菌株S30进一步经持续型转录单元的基因体嵌入修饰以表现
a)具有SEQ ID NO 05的来自多杀性巴氏杆菌的N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶的一个复本，及具有SEQ ID NO 17的来自多杀性巴氏杆菌的β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸基转移酶PmultST3的一个复本，或
b)具有SEQ ID NO 05的来自多杀性巴氏杆菌的NeuA酶的两个复本，及具有SEQ IDNO 17的来自多杀性巴氏杆菌的PmultST3唾液酸基转移酶的两个复本，
分别产生如表4中所概述的突变大肠杆菌菌株S4及S5。用于表现所述NeuA酶或PmultST3的启动子、UTR及终止子序列的细节概述于表5中。根据实施例2中所提供的培养条件在生长实验中评估新颖菌株，其中培养基含有30g/L蔗糖及20g/L乳糖。各菌株在96孔盘中以四个生物学重复生长。培育72小时之后，收集培养液，且在UPLC上分析糖。
实验证明新颖菌株S4及S5两者生产3′-SL。在本文中，与表现具有SEQ ID NO05的来自多杀性巴氏杆菌的NeuA酶的一个复本及具有SEQ ID NO 17的来自多杀性巴氏杆菌的PmultST3酶的一个复本的菌株S30相比，表现具有SEQ ID NO 05的来自多杀性巴氏杆菌的NeuA酶的两个复本及具有SEQ ID NO 17的来自多杀性巴氏杆菌的PmultST3酶的两个复本的菌株S4的3′-SL产量高3.70倍。实验进一步证明突变菌株S4及S5两者具有相似生长速率且在培养期间不遭受任何基因体或质体DNA不稳定性或重组。
表4：与亲本大肠杆菌菌株S30相比，大肠杆菌菌株S4及S5中存在的额外转录单元
Figure BPA0000334655460001391
Figure BPA0000334655460001401
*参见表5
表5：用于在如表4中所给出的突变大肠杆菌菌株S4及S5中表现PmultNeuA或α-2，3-唾液酸基转移酶PmultST3的启动子、UTR及终止子序列
Figure BPA0000334655460001402
实施例6.用经修饰的大肠杆菌菌株生产6′-唾液酸基乳糖(6′-SL)
在第一步骤中，大肠杆菌K-12菌株MG1655经修饰，包含大肠杆菌nagA、nagB、nanA、nanT、nanE、hanK、LacZ、LacY、LacA、ackA-pta、ldhA及poxB基因及包含wbbK与wcaN之间的所有基因且包括wbbK及wcaN的O-抗原簇的剔除。在下一步骤中，突变菌株进一步经含有以下者的持续型转录单元的基因体嵌入修饰：具有SEQ ID NO 22的来自大肠杆菌的乳糖透过酶(LacY)、具有SEQ ID NO 08的来自大肠杆菌的唾液酸运输蛋白(nanT)、具有SEQ ID NO 06的来自大肠杆菌的L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶(glmS*54)的两个复本、具有SEQID NO 07的来自酿酒酵母的葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶(GNA1)的两个复本、具有SEQID NO 09的来自卵形拟杆菌的N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶(AGE)、具有SEQ ID NO 01的来自脑膜炎奈瑟氏菌的N-乙酰基神经氨酸合酶(NeuB)、具有SEQ ID NO47的来自大肠杆菌的乙酰基-辅酶A合成酶(acs)、具有SEQ ID NO 23的来自大肠杆菌W的蔗糖运输蛋白(CscB)、具有SEQ ID NO 24的来自运动发酵单胞菌的果糖激酶(Frk)及具有SEQ ID NO 25的来自青春双叉杆菌的蔗糖磷酸化酶。由此获得的突变大肠杆菌菌株进一步经持续型转录单元的基因体嵌入及表现质体修饰以表现三种N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶同功蛋白质，其由具有SEQ ID NO 03的来自空肠弯曲杆菌的NeuA酶、具有SEQ ID NO04的来自流感嗜血杆菌的NeuA酶及具有SEQ ID NO 05的来自多杀性巴氏杆菌的NeuA酶组成，及具有SEQ IDNO 19的来自美人鱼发光菌的β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸基转移酶PdbST的三个复本。根据实施例2中所提供的培养条件在生长实验中评估新颖菌株，其中培养基含有30g/L蔗糖及20g/L乳糖。菌株在96孔盘中以四个生物学重复生长。培育72小时之后，收集培养液，且在UPLC上分析糖。实验证明，新颖菌株生产唾液酸(Neu5Ac)及6′-SL且在培养期间不遭受任何基因体或质体DNA不稳定性或重组。
实施例7.用经修饰的大肠杆菌菌株生产3′-唾液酸基乳糖(3′-SL)
如实施例2中所描述，大肠杆菌K-12菌株MG1655经修饰用于唾液酸及3′-唾液酸基乳糖生产，包含大肠杆菌nagA、nagB、nanA、nanT、nanE、nanK、LacZ、LacY及LacA基因的剔除及含有以下者的持续型转录单元的基因体嵌入：具有SEQ ID NO 22的来自大肠杆菌的乳糖透过酶(LacY)、具有SEQ ID NO 08的来自大肠杆菌的唾液酸运输蛋白(nanT)、具有SEQ IDNO 06的来自大肠杆菌的L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶(glmS*54)的两个复本、具有SEQ ID NO 07的来自酿酒酵母的葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶(GNA1)的两个复本、具有SEQ ID NO 09的来自卵形拟杆菌的N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶(AGE)、具有SEQ ID NO01的来自脑膜炎奈瑟氏菌的N-乙酰基神经氨酸合酶(NeuB)、具有SEQ ID NO 23的来自大肠杆菌W的蔗糖运输蛋白(CscB)、具有SEQ ID NO 24的来自运动发酵单胞菌的果糖激酶(Frk)及具有SEQ ID NO 25的来自青春双叉杆菌的蔗糖磷酸化酶。由此获得的突变大肠杆菌菌株进一步经持续型转录单元的基因体嵌入及表现质体修饰以表现三种N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶同功蛋白质，其由具有SEQ ID NO 03的来自空肠弯曲杆菌的NeuA酶、具有SEQID NO 04的来自流感嗜血杆菌的NeuA酶及具有SEQ ID NO 05的来自多杀性巴氏杆菌的NeuA酶组成，及具有SEQ ID NO 17的来自多杀性巴氏杆菌的β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸基转移酶PmultST3的三个复本。根据实施例2中所提供的培养条件在生长实验中评估新颖菌株，其中培养基含有30g/L蔗糖及20g/L乳糖。菌株在96孔盘中以四个生物学重复生长。培育72小时之后，收集培养液，且在UPLC上分析糖。
实施例8.用经修饰的大肠杆菌菌株生产3′-唾液酸基乳糖(3′-SL)
如实施例2中所描述，大肠杆菌K-12菌株MG1655经修饰用于唾液酸及3′-唾液酸基乳糖生产，包含大肠杆菌nagA、nagB、nanA、nanT、nanE、nanK、LacZ、LacY及LacA基因的剔除及含有以下者的持续型转录单元的基因体嵌入：具有SEQ ID NO 22的来自大肠杆菌的乳糖透过酶(LacY)、具有SEQ ID NO 08的来自大肠杆菌的唾液酸运输蛋白(nanT)、具有SEQ IDNO 06的来自大肠杆菌的L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶(glmS*54)的两个复本、具有SEQ ID NO 07的来自酿酒酵母的葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶(GNA1)的两个复本、具有SEQ ID NO 09的来自卵形拟杆菌的N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶(AGE)、具有SEQ ID NO01的来自脑膜炎奈瑟氏菌的N-乙酰基神经氨酸合酶(NeuB)、具有SEQ ID NO 23的来自大肠杆菌W的蔗糖运输蛋白(CscB)、具有SEQ ID NO 24的来自运动发酵单胞菌的果糖激酶(Frk)及具有SEQ ID NO 25的来自青春双叉杆菌的蔗糖磷酸化酶。由此获得的突变大肠杆菌菌株进一步经具有持续型转录单元的基因体嵌入修饰，以表现具有SEQ ID NO 05的来自多杀性巴氏杆菌的N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶NeuA的两个复本，及具有SEQ ID NO 17的来自多杀性巴氏杆菌的β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸基转移酶PmultST3的两个复本。根据实施例2中所提供的培养条件在生长实验中评估新颖菌株，其中培养基含有30g/L蔗糖及20g/L乳糖。菌株在96孔盘中以四个生物学重复生长。培育72小时之后，收集培养液，且在UPLC上分析糖。实验证明，新颖菌株生产0.64g/L 3′-SL且在培养期间不遭受任何基因体或质体DNA不稳定性或重组。
实施例9.分批补料发酵中突变大肠杆菌6′-SL生产菌株的评估
在分批补料发酵程序中评估如实施例4及6中所描述的突变大肠杆菌菌株。如实施例2中所描述，在生物反应器规模下进行分批补料发酵。蔗糖用作碳源且乳糖作为前驱物添加至分批培养基中。未将唾液酸(Neu5Ac)添加至发酵程序中。与本文所描述且其中仅在培养结束时(亦即如本文所描述的72小时)获取最终样品的培养实验形成对比，在发酵程序期间的若干时间点处获取常规培养液样品，且如实施例2中所描述，使用UPLC来量测所述时间点中的各者处唾液酸(Neu5Ac)及6′-唾液酸基乳糖的生产。实验证明，例如在分批阶段结束时及在分批补料阶段期间获取的培养液样品包含唾液酸生产以及6′-唾液酸基乳糖及未经修饰的乳糖。在分批补料阶段结束时获取的培养液样品包含6′-唾液酸基乳糖，且几乎不包含或包含极低浓度的Neu5Ac，且几乎不包含或包含极低浓度的未经修饰的乳糖，证明几乎所有或所有前驱物乳糖经生产6′-SL的突变细胞的发酵期间生产的几乎所有或所有Neu5Ac修饰。实验进一步显示突变菌株在培养期间不遭受任何基因体或质体DNA不稳定性或重组。
实施例10.分批补料发酵中突变大肠杆菌3′-SL生产菌株的评估
在分批补料发酵程序中评估如实施例5、7及8中所描述的突变大肠杆菌菌株。如实施例2中所描述，在生物反应器规模下进行分批补料发酵。蔗糖用作碳源且乳糖作为前驱物添加至分批培养基中。未将唾液酸(Neu5Ac)添加至发酵程序中。与本文所描述且其中仅在培养结束时(亦即如本文所描述的72小时)获取最终样品的培养实验形成对比，在发酵程序期间的若干时间点处获取常规培养液样品，且如实施例2中所描述，使用UPLC来量测所述时间点中的各者处唾液酸(Neu5Ac)及3′-唾液酸基乳糖的生产。
实施例11.用经修饰的大肠杆菌宿主生产包含6′-SL、LN3、唾液酸化LN3、LNnT及LSTc的寡糖混合物
如实施例6中所描述经修饰用于唾液酸生产(Neu5Ac)及6′-唾液酸基乳糖的大肠杆菌宿主进一步经包含以下者的持续型转录单元的基因体嵌入修饰：具有SEQ ID NO 36的来自脑膜炎奈瑟氏菌的半乳糖苷β-1，3-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶(LgtA)及具有SEQ IDNO 38的来自脑膜炎奈瑟氏菌的N-乙酰基葡萄糖胺β-1，4-半乳糖基转移酶(LgtB)，以生产包含6′-SL、LN3、LNnT及LSTc(Neu5Ac-a2，6-Gal-b1，4-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)的寡糖混合物。根据实施例2中所提供的培养条件在生长实验中评估新颖菌株，其中培养基含有蔗糖及乳糖。菌株在96孔盘中以四个生物学重复生长。培育72小时之后，收集培养液，且在UPLC上分析糖。
实施例12.用经修饰的大肠杆菌宿主生产寡糖混合物LN3、唾液酸化LN3、LNT、3′-SL及LSTa
如实施例8中所描述经修饰用于唾液酸生产(Neu5Ac)及3′-唾液酸基乳糖的大肠杆菌宿主进一步经包含以下者的持续型转录单元的基因体嵌入修饰：具有SEQ ID NO 36的来自脑膜炎奈瑟氏菌的半乳糖苷β-1，3-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶(LgtA)及具有SEQ IDNO 37的来自大肠杆菌O55：H7的N-乙酰基葡萄糖胺β-1，3-半乳糖基转移酶(wbgO)，以生产包含LN3、3′-唾液酸化LN3(Neu5Ac-a2，3-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)LNT、3′-SL及LSTa(Neu5Ac-a2，3-Gal-b1，3-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)的寡糖混合物。根据实施例2中所提供的培养条件在生长实验中评估新颖菌株，其中培养基含有蔗糖及乳糖。菌株在96孔盘中以四个生物学重复生长。培育72小时之后，收集培养液，且在UPLC上分析糖。
实施例13.用经修饰的大肠杆菌宿主生产包含LN3、唾液酸化LN3、LNnT、3′-SL及LSTd的寡糖混合物
如实施例8中所描述经修饰用于唾液酸生产(Neu5Ac)及3′-唾液酸基乳糖的大肠杆菌宿主进一步经包含以下者的持续型转录单元的基因体嵌入修饰：具有SEQ ID NO 36的来自脑膜炎奈瑟氏菌的半乳糖苷β-1，3-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶(LgtA)及具有SEQ IDNO 38的来自脑膜炎奈瑟氏菌的N-乙酰基葡萄糖胺β-1，4-半乳糖基转移酶(LgtB)，以生产包含3′-SL、LN3、3′-唾液酸化LN3(Neu5Ac-a2，3-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)、LNnT及LSTd(Neu5Ac-a2，3-Gal-b1，4-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)的寡糖混合物。根据实施例2中所提供的培养条件在生长实验中评估新颖菌株，其中培养基含有蔗糖及乳糖。菌株在96孔盘中以四个生物学重复生长。培育72小时之后，收集培养液，且在UPLC上分析糖。
实施例14.用经修饰的大肠杆菌菌株生产6′-唾液酸基乳糖(6′-SL)
如实施例2中所描述，大肠杆菌K-12菌株MG1655经修饰用于唾液酸及6′-唾液酸基乳糖生产，包含大肠杆菌nagA、nagB、nanA、nanT、nanE、nanK、LacZ、LacY及LacA基因的剔除及含有以下者的持续型转录单元的基因体嵌入：具有SEQ ID NO 22的来自大肠杆菌的乳糖透过酶(LacY)、具有SEQ ID NO 08的来自大肠杆菌的唾液酸运输蛋白(nanT)、具有SEQ IDNO 06的来自大肠杆菌的L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶(glmS*54)的两个复本、具有SEQ ID NO 10的来自大肠杆菌的磷酸葡萄糖胺变位酶(glmM)、具有SEQ ID NO 11的来自大肠杆菌的N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰基转移酶/葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶(glmU)、具有SEQ ID NO 12的来自空肠弯曲杆菌的UDP-N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶(NeuC)、具有SEQ ID NO 01的来自脑膜炎奈瑟氏菌的N-乙酰基神经氨酸合酶(NeuB)、具有SEQ ID NO 23的来自大肠杆菌W的蔗糖运输蛋白(CscB)、具有SEQ ID NO 24的来自运动发酵单胞菌的果糖激酶(Frk)及具有SEQ ID NO 25的来自青春双叉杆菌的蔗糖磷酸化酶。由此获得的突变大肠杆菌菌株进一步经持续型转录单元的基因体嵌入及表现质体修饰以表现三种N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶同功蛋白质，其由具有SEQ ID NO 03的来自空肠弯曲杆菌的NeuA酶、具有SEQ ID NO 04的来自流感嗜血杆菌的NeuA酶及具有SEQ ID NO 05的来自多杀性巴氏杆菌的NeuA酶组成，及具有SEQ ID NO 19的来自美人鱼发光菌的β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸基转移酶PdbST的三个复本。根据实施例2中所提供的培养条件在生长实验中评估新颖菌株，其中培养基含有30g/L蔗糖及20g/L乳糖。菌株在96孔盘中以四个生物学重复生长。培育72小时之后，收集培养液，且在UPLC上分析糖。
实施例15.用经修饰的大肠杆菌菌株生产6′-唾液酸基乳糖(6′-SL)
如实施例2中所描述，大肠杆菌K-12菌株MG1655经修饰用于唾液酸及6′-唾液酸基乳糖生产，包含大肠杆菌nagA、nagB、nanA、nanT、nanE、nanK、LacZ、LacY及LacA基因的剔除及含有以下者的持续型转录单元的基因体嵌入：具有SEQ ID NO 22的来自大肠杆菌的乳糖透过酶(LacY)、具有SEQ ID NO 08的来自大肠杆菌的唾液酸运输蛋白(nanT)、具有SEQ IDNO 06的来自大肠杆菌的L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶(glmS*54)的两个复本、具有SEQ ID NO 10的来自大肠杆菌的磷酸葡萄糖胺变位酶(glmM)、具有SEQ ID NO 11的来自大肠杆菌的N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰基转移酶/葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶(glmU)、具有SEQ ID NO 13的来自小鼠(C57BL/6J品系)的双官能UDP-GlcNAc 2-表异构酶/N-乙酰基甘露糖胺激酶、具有SEQ ID NO 14的来自互养棍状菌属PtaU1.Bin058的N-酰基神经氨酸-9-磷酸合成酶、具有SEQ ID NO 15的来自候选种趋磁桑葚状菌属HK--1的N-酰基神经氨酸-9-磷酸酶、具有SEQ ID NO 23的来自大肠杆菌W的蔗糖运输蛋白(CscB)、具有SEQID NO 24的来自运动发酵单胞菌的果糖激酶(Frk)及具有SEQ ID NO 25的来自青春双叉杆菌的蔗糖磷酸化酶。由此获得的突变大肠杆菌菌株进一步经持续型转录单元的基因体嵌入及表现质体修饰以表现三种N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶同功蛋白质，其由具有SEQ IDNO 03的来自空肠弯曲杆菌的NeuA酶、具有SEQ ID NO 04的来自流感嗜血杆菌的NeuA酶及具有SEQ ID NO 05的来自多杀性巴氏杆菌的NeuA酶组成，及具有SEQ ID NO 19的来自美人鱼发光菌的β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸基转移酶PdbST的三个复本。根据实施例2中所提供的培养条件在生长实验中评估新颖菌株，其中培养基含有30g/L蔗糖及20g/L乳糖。菌株在96孔盘中以四个生物学重复生长。培育72小时之后，收集培养液，且在UPLC上分析糖。
实施例16.用经修饰的酿酒酵母菌株生产6′-唾液酸基乳糖(6′-SL)
如实施例3中所描述，酿酒酵母菌株经pRS420衍生酵母表现质体调适用于唾液酸(Neu5Ac)及唾液酸化乳糖生产，该质体包含TRP1选择标记及以下者的持续型转录单元：具有SEQ ID NO 06的来自大肠杆菌的L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶(glmS*54)的两个复本；如例如以下者中的任何一或多者的磷酸酶：包含aphA、Cof、HisB、OtsB、SurE、Yaed、YcjU、YedP、YfbT、YidA、YigB、YihX、YniC、YqaB、YrbL、AppA、Gpb、SerB、YbhA、YbiV、YbjL、Yfb、YieH、YjgL、YjjG、YrfG及YbiU的大肠杆菌基因，或来自恋臭假单胞菌的PsMupP，来自酿酒酵母的ScDOGl，及来自枯草杆菌的BsAraL，如WO18122225中所描述；具有SEQ ID NO 09的来自卵形拟杆菌的N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶(AGE)；具有SEQ ID NO 01的来自脑膜炎奈瑟氏菌的N-乙酰基神经氨酸合酶(NeuB)；三种N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶同功蛋白质，其由具有SEQ ID NO 03的来自空肠弯曲杆菌的NeuA酶、具有SEQ ID NO 04的来自流感嗜血杆菌的NeuA酶及具有SEQ ID NO 05的来自多杀性巴氏杆菌的NeuA酶组成；具有SEQ IDNO 19的来自美人鱼发光菌的β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸基转移酶PdbST的三个复本；及具有SEQ ID NO 40的乳酸克鲁维酵母的乳糖透过酶(LAC12)。根据实施例3中所提供的培养条件，在生长实验中在包含乳糖作为前驱物的SD CSM-Trp缺陷型培养基上评估新颖菌株。培育72小时之后，收集培养液，且在UPLC上分析糖。
实施例17.用经修饰的酿酒酵母宿主生产包含6′-SL、LN3、唾液酸化LN3、LNnT及LSTc的寡糖混合物
如实施例16中所描述的突变酿酒酵母宿主进一步经包含HIS3选择标记及以下者的持续型转录单元的第二pRS420衍生酵母表现质体修饰：具有SEQ ID NO39的来自大肠杆菌的galE、具有SEQ ID NO 36的来自脑膜炎奈瑟氏菌的半乳糖苷β-1，3-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶(lgtA)及具有SEQ ID NO 38的来自脑膜炎奈瑟氏菌的N-乙酰基葡萄糖胺β-1，4-半乳糖基转移酶(lgtB)，以生产包含6′-SL、LN3、LNnT及LSTc(Neu5Ac-a2，6-Gal-b1，4-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)的寡糖混合物。根据实施例3中所提供的培养条件，在生长实验中在包含乳糖作为前驱物的SD CSM-Trp-His缺陷型培养基上评估新颖菌株。培育72小时之后，收集培养液，且在UPLC上分析糖。
实施例18.用经修饰的酿酒酵母菌株生产3′-唾液酸基乳糖(3′-SL)
如实施例3中所描述，酿酒酵母菌株经pRS420衍生酵母表现质体调适用于唾液酸(Neu5Ac)及唾液酸化乳糖生产，该质体包含TRP1选择标记及以下者的持续型转录单元：具有SEQ ID NO 06的来自大肠杆菌的L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶(glmS*54)的两个复本；如例如以下者中的任何一或多者的磷酸酶：包含aphA、Cof、HisB、OtsB、SurE、Yaed、YcjU、YedP、YfbT、YidA、YigB、YihX、YniC、YqaB、YrbL、AppA、Gph、SerB、YbhA、YbiV、YbjL、Yfb、YieH、YjgL、YjjG、YrfG及YbiU的大肠杆菌基因，或来自恋臭假单胞菌的PsMupP，来自酿酒酵母的ScDOG1，及来自枯草杆菌的BsAraL，如WO18122225中所描述；具有SEQ ID NO 09的来自卵形拟杆菌的N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶(AGE)；具有SEQ ID NO 01的来自脑膜炎奈瑟氏菌的N-乙酰基神经氨酸合酶(NeuB)；三种N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶同功蛋白质，其由具有SEQ ID NO 03的来自空肠弯曲杆菌的NeuA酶、具有SEQ ID NO 04的来自流感嗜血杆菌的NeuA酶及具有SEQ ID NO 05的来自多杀性巴氏杆菌的NeuA酶组成；具有SEQ IDNO 17的来自多杀性巴氏杆菌的β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸基转移酶PmultST3的三个复本；及具有SEQ ID NO 40的乳酸克鲁维酵母的乳糖透过酶(LAC12)。根据实施例3中所提供的培养条件，在生长实验中在包含乳糖作为前驱物的SD CSM-Trp缺陷型培养基上评估新颖菌株。培育72小时之后，收集培养液，且在UPLC上分析糖。
实施例19.用经修饰的酿酒酵母宿主生产包含LN3、唾液酸化LN3、LNT、3′-SL及LSTa的寡糖混合物
如实施例18中所描述的突变酿酒酵母宿主进一步经包含HIS3选择标记及以下者的持续型转录单元的第二pRS420衍生酵母表现质体修饰：具有SEQ ID NO39的来自大肠杆菌的galE、具有SEQ ID NO 36的来自脑膜炎奈瑟氏菌的半乳糖苷β-1，3-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶(1gtA)及具有SEQ ID NO 37的来自大肠杆菌O55：H7的N-乙酰基葡萄糖胺β-1，3-半乳糖基转移酶(wbgO)，以生产包含LN3，3′-唾液酸化LN3(Neu5Ac-a2，3-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)、LNT、3′-SL及LSTa(Neu5Ac-a2，3-Gal-b1，3-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)的寡糖混合物。根据实施例3中所提供的培养条件，在生长实验中在包含乳糖作为前驱物的SD CSM-Trp-His缺陷型培养基上评估新颖菌株。培育72小时之后，收集培养液，且在UPLC上分析糖。
实施例20.用经修饰的酿酒酵母宿主生产包含LN3、唾液酸化LN3、LNnT、3′-SL及LSTd的寡糖混合物
如实施例18中所描述的突变酿酒酵母宿主进一步经包含HIS3选择标记及以下者的持续型转录单元的第二pRS420衍生酵母表现质体修饰：具有SEQ ID NO 39的来自大肠杆菌的galE、具有SEQ ID NO 36的来自脑膜炎奈瑟氏菌的半乳糖苷β-1，3-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶(lgtA)及具有SEQ ID NO 38的来自脑膜炎奈瑟氏菌的N-乙酰基葡萄糖胺β-1，4-半乳糖基转移酶(lgtB)，以生产包含3′-SL、LN3、3′-唾液酸化LN3(Neu5Ac-a2，3-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)、LNnT及LSTd(Neu5Ac-a2，3-Gal-b1，4-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)的寡糖混合物。根据实施例3中所提供的培养条件，在生长实验中在包含乳糖作为前驱物的SDCSM-Trp-His缺陷型培养基上评估新颖菌株。培育72小时之后，收集培养液，且在UPLC上分析糖。
实施例21.用经修饰的大肠杆菌菌株生产6′-唾液酸基乳糖(6′-SL)
在第一步骤中，大肠杆菌K-12菌株MG1655如实施例2中所描述经修饰，包含大肠杆菌nagA、nagB、nanA、nanT、nanE、hanK、LacZ、LacY及LacA基因的剔除及含有以下者的持续型转录单元的基因体嵌入：具有SEQ ID NO 22的来自大肠杆菌的乳糖透过酶(LacY)、具有SEQID NO 08的来自大肠杆菌的唾液酸运输蛋白(nanT)、具有SEQ ID NO 06的来自大肠杆菌的L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶(glmS*54)的两个复本、具有SEQ ID NO 07的来自酿酒酵母的葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶(GNA1)的两个复本、具有SEQ ID NO 09的来自卵形拟杆菌的N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶(AGE)、具有SEQ ID NO 01的来自脑膜炎奈瑟氏菌的N-乙酰基神经氨酸合酶(NeuB)、具有SEQ ID NO 47的来自大肠杆菌的乙酰基-辅酶A合成酶(acs)、具有SEQ ID NO 23的来自大肠杆菌W的蔗糖运输蛋白(CscB)、具有SEQ ID NO24的来自运动发酵单胞菌的果糖激酶(Frk)、具有SEQ ID NO 25的来自青春双叉杆菌的蔗糖磷酸化酶及具有SEQ ID NO 49的来自大肠杆菌的膜运输蛋白entS的两个复本。由此获得的突变大肠杆菌菌株进一步经持续型转录单元的基因体嵌入及表现质体修饰以表现三种N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶同功蛋白质，其由具有SEQ ID NO 03的来自空肠弯曲杆菌的NeuA酶、具有SEQ ID NO 04的来自流感嗜血杆菌的NeuA酶及具有SEQ ID NO 05的来自多杀性巴氏杆菌的NeuA酶组成，及具有SEQ ID NO 19的来自美人鱼发光菌的β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸基转移酶PdbST的三个复本。根据实施例2中所提供的培养条件在生长实验中评估新颖菌株，其中培养基含有30g/L蔗糖及20g/L乳糖。菌株在96孔盘中以四个生物学重复生长。培育72小时之后，收集培养液，且在UPLC上分析糖。
实施例22.用经修饰的大肠杆菌菌株生产6′-唾液酸基乳糖(6′-SL)
在第一步骤中，大肠杆菌K-12菌株MG1655如实施例2中所描述经修饰，包含大肠杆菌nagA、nagB、nanA、nanT、nanE、nanK、LacZ、LacY及LacA基因的剔除及含有以下者的持续型转录单元的基因体嵌入：具有SEQ ID NO 22的来自大肠杆菌的乳糖透过酶(LacY)、具有SEQID NO 08的来自大肠杆菌的唾液酸运输蛋白(nanT)、具有SEQ ID NO 06的来自大肠杆菌的L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶(glmS*54)的两个复本、具有SEQ ID NO 07的来自酿酒酵母的葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶(GNA1)的两个复本、具有SEQ ID NO 09的来自卵形拟杆菌的N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶(AGE)、具有SEQ ID NO 01的来自脑膜炎奈瑟氏菌的N-乙酰基神经氨酸合酶(NeuB)、具有SEQ ID NO 47的来自大肠杆菌的乙酰基-辅酶A合成酶(acs)、具有SEQ ID NO 23的来自大肠杆菌W的蔗糖运输蛋白(CscB)、具有SEQ ID NO24的来自运动发酵单胞菌的果糖激酶(Frk)、具有SEQ ID NO 25的来自青春双叉杆菌的蔗糖磷酸化酶、具有SEQ ID NO 50的来自大肠杆菌的膜运输蛋白MdfA及具有SEQ ID NO 49的来自大肠杆菌的膜运输蛋白entS的两个复本。由此获得的突变大肠杆菌菌株进一步经持续型转录单元的基因体嵌入及表现质体修饰以表现三种N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶同功蛋白质，其由具有SEQ ID NO 03的来自空肠弯曲杆菌的NeuA酶、具有SEQ ID NO 04的来自流感嗜血杆菌的NeuA酶及具有SEQ ID NO 05的来自多杀性巴氏杆菌的NeuA酶组成，及具有SEQ ID NO 19的来自美人鱼发光菌的β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸基转移酶PdbST的三个复本。根据实施例2中所提供的培养条件在生长实验中评估新颖菌株，其中培养基含有30g/L蔗糖及20g/L乳糖。菌株在96孔盘中以四个生物学重复生长。培育72小时之后，收集培养液，且在UPLC上分析糖。
实施例23.用经修饰的大肠杆菌菌株生产3′-唾液酸基乳糖(3′-SL)
在第一步骤中，大肠杆菌K-12菌株MG1655如实施例2中所描述经修饰，包含大肠杆菌nagA、nagB、nanA、nanT、nanE、hanK、LacZ、LacY及LacA基因的剔除及含有以下者的持续型转录单元的基因体嵌入：具有SEQ ID NO 22的来自大肠杆菌的乳糖透过酶(LacY)、具有SEQID NO 08的来自大肠杆菌的唾液酸运输蛋白(nanT)、具有SEQ ID NO 06的来自大肠杆菌的L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶(glmS*54)的两个复本、具有SEQ ID NO 07的来自酿酒酵母的葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶(GNA1)的两个复本、具有SEQ ID NO 09的来自卵形拟杆菌的N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶(AGE)、具有SEQ ID NO 01的来自脑膜炎奈瑟氏菌的N-乙酰基神经氨酸合酶(NeuB)、具有SEQ ID NO 47的来自大肠杆菌的乙酰基-辅酶A合成酶(acs)、具有SEQ ID NO 23的来自大肠杆菌W的蔗糖运输蛋白(CscB)、具有SEQ ID NO24的来自运动发酵单胞菌的果糖激酶(Frk)、具有SEQ ID NO 25的来自青春双叉杆菌的蔗糖磷酸化酶、具有SEQ ID NO 50的来自大肠杆菌的膜运输蛋白MdfA的两个复本及具有SEQID NO 49的来自大肠杆菌的膜运输蛋白entS的两个复本。由此获得的突变大肠杆菌菌株进一步经持续型转录单元的基因体嵌入及表现质体修饰以表现三种N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶同功蛋白质，其由具有SEQ ID NO 03的来自空肠弯曲杆菌的NeuA酶、具有SEQ IDNO 04的来自流感嗜血杆菌的NeuA酶及具有SEQ ID NO 05的来自多杀性巴氏杆菌的NeuA酶组成，及具有SEQ ID NO 48的来自多杀性巴氏杆菌多杀性亚种Pm70菌株的β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸基转移酶的三个复本。根据实施例2中所提供的培养条件在生长实验中评估新颖菌株，其中培养基含有30g/L蔗糖及20g/L乳糖。菌株在96孔盘中以四个生物学重复生长。培育72小时之后，收集培养液，且在UPLC上分析糖。
实施例24.枯草杆菌材料及方法
培养基
使用两种不同培养基，亦即富鲁利亚培养液(LB)及摇瓶用基本培养基(minimalmedium for shake flask；MMsf)。基本培养基使用痕量元素混合物。
痕量元素混合物由0.735g/L CaCl2.2H2O、0.1g/L MnCl2.2H2O、0.033g/LCuCl2.2H2O、0.06g/L CoCl2.6H2O、0.17g/L ZnCl2、0.0311g/L H3BO4、0.4g/LNa2EDTA.2H2O及0.06g/L Na2MoO4组成。柠檬酸铁溶液含有0.135g/L FeCl3.6H2O、1g/L柠檬酸钠(Hoch 1973 PMC1212887)。
鲁利亚培养液(LB)培养基由1％胰胨蛋白胨(Difco，Erembodegem，Belgium)、0.5％酵母萃取物(Difco)及0.5％氯化钠(VWR，Leuven，Belgium)组成。鲁利亚培养液琼脂(Luria Broth agar；LBA)盘由LB培养基组成，其中添加12g/L琼脂(Difco，Erembodegem，Belgium)。
摇瓶用基本培养基(MMsf)实验含有2.00g/L(NH4)2SO4、7.5g/L KH2PO4、17.5g/LK2HPO4、1.25g/L柠檬酸钠、0.25g/L MgSO4.7H2O、0.05g/L色氨酸、10至30g/L葡萄糖或另一碳源(包括但不限于实施例中指定的果糖、麦芽糖、蔗糖、甘油及麦芽三糖)、10ml/L痕量元素混合物及10ml/L柠檬酸铁溶液。用1M KOH将培养基设定为pH 7。视实验而定，可添加乳糖、LNB或LacNAc。
借由高压处理(121℃，21′)对复合培养基(例如LB)进行灭菌及借由过滤(0.22μmSartorius)对基本培养基进行灭菌。必要时，借由添加抗生素(例如吉欧霉素(zeocin)(20mg/L))使培养基具有选择性。
菌株、质体及突变
枯草杆菌168，可获自于芽孢杆菌基因储备中心(美国俄亥俄州(Ohio，USA))。
经由Cre/lox的基因缺失的质体如由Yan等人(Appl.&Environm.Microbial.，2008年9月，第5556-5562页)所描述进行构筑。基因破坏经由与线性DNA同源重组及经由电穿孔转形进行，如Xue等人(J.Microb.Meth.34(1999)183-191)所描述。基因剔除的方法由Liu等人(Metab.Engine.24(2014)61-69)描述。此方法使用目标基因的上游及下游的1000bp同源性。
如由Popp等人(Sci.Rep.，2017，7，15158)所描述的整合载体用作表现载体且必要时可进一步用于基因体整合。适用于表现的启动子可衍生自部分储存库(iGem)：序列id：Bba_K143012、Bba_K823000、Bba_K823002或Bba_K823003。选殖可使用吉布森组装(GibsonAssembly)、金门组装(Golden Gate assembly)、Cliva组装、LCR或限制接合来进行。
在生产基于乳糖的寡糖的一实施例中，产生枯草杆菌突变菌株以含有编码乳糖输入体(importer)的基因(诸如具有SEQ ID NO 22的大肠杆菌lacY)。在2′FL、3FL及/或diFL生产的一实施例中，将α-1，2-及/或α-1，3-岩藻糖基转移酶表现构筑体另外添加至菌株。在LN3生产的一实施例中，将包含半乳糖苷β-1，3-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶(如例如来自脑膜炎奈瑟氏菌的lgtA(SEQ ID NO 236))的持续型转录单元另外添加至菌株。在LNT生产的一实施例中，生产LN3的菌株进一步经包含N-乙酰基葡萄糖胺β-1，3-半乳糖基转移酶(如例如来自大肠杆菌O55：H7的WbgO(SEQ ID NO 37))的持续型转录单元修饰。在LNnT生产的一实施例中，生产LN3的菌株进一步经包含N-乙酰基葡萄糖胺β-1，4-半乳糖基转移酶(如例如来自脑膜炎奈瑟氏菌的lgtB(SEQ ID NO 38))的持续型转录单元修饰。
在唾液酸生产的一实施例中，突变枯草杆菌菌株借由过度表现果糖-6-P-氨基转移酶如天然果糖-6-P-氨基转移酶(UniProtID P0CI73)以增强胞内葡萄糖胺-6-磷酸池来产生。另外，基因nagA、nagB及gamA的酶活性借由基因剔除破坏且如例如酿酒酵母的葡萄糖胺-6-P-氨基转移酶(SEQ ID NO 07)、如例如来自卵形拟杆菌的N-乙酰基葡萄糖胺-2-表异构酶(SEQ ID NO 09)及一或多种N-乙酰基神经氨酸合酶，如例如来自脑膜炎奈瑟氏菌(SEQID NO 01)、空肠弯曲杆菌(SEQ ID NO 02)的一或两个复本过度表现于基因体上。为允许唾液酸化寡糖生产，生产唾液酸的菌株进一步经持续型转录单元修饰，该持续型转录单元包含N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶，如例如来自空肠弯曲杆菌的NeuA酶(SEQ ID NO 03)、来自流感嗜血杆菌的NeuA酶(SEQ ID NO 04)及来自多杀性巴氏杆菌的NeuA酶(SEQ ID NO05)；及β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸基转移酶，如例如来自多杀性巴氏杆菌的PmultST3(UniProt ID Q9CLP3)或由UniProt ID Q9CLP3的氨基酸残基1至268组成具有β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸基转移酶活性的类PmultST3多肽(SEQ ID NO 17)，或来自脑膜炎奈瑟氏菌的NmeniST3(SEQ ID NO 18)或来自多杀性巴氏杆菌多杀性亚种Pm70菌株的PmultST2(GenBank NO.AAK02592.1)的一或多个复本；β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸基转移酶，如例如来自美人鱼发光菌的PdST6(UniProt ID O66375)或由UniProt ID O66375的氨基酸残基108至497组成具有β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸基转移酶活性的类PdST6多肽(SEQ ID NO 19)或来自发光菌属JT-ISH-224的P-JT-ISH-224-ST6(UniProt ID A8QYL1)或由UniProt IDA8QYL1的氨基酸残基18至514组成具有β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸基转移酶活性的类P-JT-ISH-224-ST6多肽(SEQ ID NO 20)及/或如例如来自小鼠的α-2，8-唾液酸基转移酶(SEQ IDNO 21)。
异源及同源表现
需要表现的基因，无论其来自质体或来自基因体，均以合成方式经以下公司中的一者合成：DNA2.0、Gen9、Twist Biosciences或IDT。
可借由使密码子使用最佳化为表现宿主的密码子使用来进一步促进表现。使用供应商的工具使基因最佳化。
培养条件
96孔微量滴定盘实验的预培养始于冷冻小瓶或始于LB盘的单一菌落，于150μL LB中进行，且在37℃下在定轨振荡器上以800rpm培育隔夜。此培养物用作96孔正方形微量滴定盘的接种物，在400μL MMsf培养基情况下借由稀释400倍。使各菌株在96孔盘的多个孔中作为生物学重复生长。此等最终96孔培养盘接着在37℃下在定轨振荡器上以800rpm培育72小时或更短或更长。在培养实验结束时，自各孔获取样品以量测上清液浓度(胞外糖浓度，在短暂离心细胞5分钟后)，或在短暂离心细胞前借由使培养液在90℃下沸腾15分钟或在60℃下沸腾60分钟(＝全培养液浓度，胞内及胞外糖浓度，如本文所定义)。
此外，对培养物进行稀释以量测600nm下的光密度。借由寡糖浓度除以生物质(以与参考菌株相比的相对百分比)来确定细胞性能指数或CPI。凭经验确定生物质为在600nm下量测的光密度的大致1/3。
实施例25.使用经修饰的枯草杆菌宿主生产包含2′FL、3-FL、DiFL、3′SL、6′SL、3′S-2′FL、3′S-3-FL、6′S-2′FL、6′S-3-FL的寡糖混合物
如实施例24中所描述，枯草杆菌菌株经nagA、nagB、glmS及gamA基因的基因体剔除及以下者的持续型转录单元的基因体嵌入修饰：具有SEQ ID NO 22的来自大肠杆菌的乳糖透过酶(LacY)；来自大肠杆菌W的蔗糖运输蛋白(CscB)(SEQ ID NO 23)；来自运动发酵单胞菌的果糖激酶(Frk)(SEQ ID NO 24)；来自青春双叉杆菌的蔗糖磷酸化酶(BaSP)(SEQ IDNO 25)；天然果糖-6-P-氨基转移酶(UniProt ID P0CI73)；来自酿酒酵母的葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶GNA1(SEQ ID NO 07)的两个复本；来自大肠杆菌的突变L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶(glmS*54)(SEQ ID NO 06)；磷酸酶，如例如选自以下者的磷酸酶：包含aphA、Cof、HisB、OtsB、SurE、Yaed、YcjU、YedP、YfbT、YidA、YigB、YihX、YniC、YqaB、YrbL、AppA、Gph、SerB、YbhA、YbiV、YbjL、Yfb、YieH、YjgL、YjjG、YrfG及YbiU的大肠杆菌基因，或来自恋臭假单胞菌的PsMupP，来自酿酒酵母的ScDOG1，及来自枯草杆菌的BsAraL，如WO18122225中所描述；来自卵形拟杆菌的N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶(AGE)(SEQ ID NO09)；来自脑膜炎奈瑟氏菌的N-乙酰基神经氨酸合酶(NeuB)(SEQ ID NO 01)；及N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶来自空肠弯曲杆菌的NeuA(SEQ ID NO 03)、来自流感嗜血杆菌的NeuA(SEQ ID NO 04)及来自多杀性巴氏杆菌的NeuA(SEQ ID NO 05)。在下一步骤中，菌株用表现质体转形，该表现质体包含以下者的持续型转录单元：由UniProtIDQ9CLP3的氨基酸残基1至268组成具有β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸基转移酶活性的类PmultST3多肽(如SEQ ID NO17)的三个复本；及由UniProt ID O66375的氨基酸残基108至497组成具有β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸基转移酶活性的类PdST6多肽(SEQ ID NO 19)的三个复本。在另一步骤中，突变菌株经第二相容性表现质体转形，该第二相容性表现质体包含具有SEQ ID NO 26的α-1，2-岩藻糖基转移酶HpFutC及具有SEQ ID NO 27的α-1，3-岩藻糖基转移酶HpFucT的持续型转录单元。在生长实验中在包含乳糖的MMsf培养基上根据实施例24中所提供的培养条件，针对生产2′FL、3-FL、DiFL、3′SL、6′SL、3′S-2′FL、3′S-3-FL、6′S-2′FL、6′S-3-FL评估新颖菌株。培育72小时之后，收集培养液，且在UPLC上分析糖。
实施例26.用经修饰的枯草杆菌宿主生产包含3′SL、LN3、LNT、唾液酸化LN3及LSTa的寡糖混合物
如实施例24中所描述，枯草杆菌菌株借由nagA、nagB、glmS及gamA基因的基因体剔除及包含基因的持续型转录单元的基因体嵌入修饰以用于LN3生产及在蔗糖上的生长，所述基因编码来自大肠杆菌的乳糖透过酶(LacY)(SEQ ID NO 22)、天然果糖-6-P-氨基转移酶(UniProt ID P0CI73)、来自脑膜炎奈瑟氏菌的半乳糖苷β-1，3-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶LgtA(SEQ ID NO 36)、来自大肠杆菌W的蔗糖运输蛋白(CscB)(SEQ ID NO 23)、来自运动发酵单胞菌的果糖激酶(Frk)(SEQ ID NO24)及来自青春双叉杆菌的蔗糖磷酸化酶(BaSP)(SEQ ID NO 25)。在下一步骤中，突变菌株进一步经包含来自大肠杆菌O55：H7的N-乙酰基葡萄糖胺β-1，3-半乳糖基转移酶WbgO(SEQ ID NO 37)的持续型转录单元的基因体嵌入修饰以生产LNT。突变枯草杆菌菌株进一步经包含以下者的持续型转录单元的基因体嵌入修饰：来自酿酒酵母的葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶GNA1(SEQ ID NO 07)的两个复本；来自大肠杆菌的突变L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶(glmS*54)(SEQ ID NO06)的两个复本；磷酸酶，如例如选自以下者的磷酸酶：包含aphA、Cof、HisB、OtsB、SurE、Yaed、YcjU、YedP、YfbT、YidA、YigB、YihX、YniC、YqaB、YrbL、AppA、Gph、SerB、YbhA、YbiV、YbjL、Yfb、YieH、YjgL、YjjG、YrfG及YbiU的大肠杆菌基因，或来自恋臭假单胞菌的PsMupP，来自酿酒酵母的ScDOG1，及来自枯草杆菌的BsAraL，如WO18122225中所描述；来自卵形拟杆菌的N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶(AGE)(SEQ ID NO 09)；来自脑膜炎奈瑟氏菌的N-乙酰基神经氨酸合酶(NeuB)(SEQ ID NO 01)；N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶来自空肠弯曲杆菌的NeuA(SEQ ID NO 03)、来自流感嗜血杆菌的NeuA(SEQ ID NO 04)及来自多杀性巴氏杆菌的NeuA(SEQ ID NO 05)；及由UniProtID Q9CLP3的氨基酸残基1至268组成具有β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸基转移酶活性的类PmultST3多肽(如SEQ ID NO 17)的三个复本。在生长实验中在包含乳糖作为前驱物的MMsf培养基上根据实施例24中提供的培养条件，针对生产包含3′SL、LN3、唾液酸化LN3、LNT及LSTa(Neu5Ac-a2，3-Gal-b1，3-GlcNAc-b1，3-Gal-b1，4-Glc)的混合物评估新颖菌株。培育72小时之后，收集培养液，且在UPLC上分析糖。
实施例27.麸氨酸棒状杆菌材料及方法
培养基
使用两种不同培养基，亦即富胰胨-酵母萃取物(tryptone-yeast extract；TY)培养基及摇瓶用基本培养基(MMsf)。基本培养基使用1000×储备痕量元素混合物。
痕量元素混合物由10g/L CaCl2、10g/L FeSO4.7H2O、10g/L MnSO4.H2O、1g/LZnSO4.7H2O、0.2g/L CuSO4、0.02g/L NiCl2.6H2O、0.2g/L生物素(pH 7.0)及0.03g/L原儿茶酸组成。
摇瓶用基本培养基(MMsf)实验含有20g/L(NH4)2SO4、5g/L尿素、1g/L KH2PO4、1g/L K2HPO4、0.25g/L MgSO4.7H2O、42g/L MOPS、10至30g/L葡萄糖或另一碳源(包括但不限于实施例中指定的果糖、麦芽糖、蔗糖、甘油及麦芽三糖)及1ml/L痕量元素混合物。视实验而定，可将乳糖、LNB及/或LacNAc添加至培养基中。
TY培养基由1.6％胰胨(Difco，Erembodegem，Belgium)、1％酵母萃取物(Difco)及0.5％氯化钠(VWR，Leuven，Belgium)组成。TY琼脂(TY agar；TYA)盘由TY培养基组成，其中添加12g/L琼脂(Difco，Erembodegem，Belgium)。
借由高压处理(121℃，21′)对复合培养基(例如TY)进行灭菌及借由过滤(0.22μmSartorius)对基本培养基进行灭菌。必要时，借由添加抗生素(例如康霉素、安比西林)使培养基具有选择性。
菌株及突变
麸氨酸棒状杆菌ATCC 13032可获自于美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)。
如借由Suzuki等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.，2005年4月，67(2)：225-33)所描述基于Cre/loxP技术的整合质体载体及如借由Okibe等人(Journal ofMicrobiological Methods 85，2011，155-163)所描述的温度敏感穿梭载体经构筑用于基因缺失、突变及插入。用于(异源)基因表现的适合启动子可衍生自Yim等人(Biotechnol.Bioeng.，2013年11月，110(11)：2959-69)。选殖可使用吉布森组装、金门组装、Cliva组装、LCR或限制接合来进行。
在生产基于乳糖的寡糖的一实施例中，产生麸氨酸棒状杆菌突变菌株以含有编码乳糖输入体的基因(诸如具有SEQ ID NO 22的大肠杆菌lacY)。在2′FL、3FL及/或diFL生产的一实施例中，将α-1，2-及/或α-1，3-岩藻糖基转移酶表现构筑体另外添加至菌株。
在LN3生产的一实施例中，将包含半乳糖苷β-1，3-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶(如例如来自脑膜炎奈瑟氏菌的lgtA(SEQ ID NO 36))的持续型转录单元另外添加至菌株。在LNT生产的一实施例中，生产LN3的菌株进一步经包含N-乙酰基葡萄糖胺β-1，3-半乳糖基转移酶(如例如来自大肠杆菌O55：H7的WbgO(SEQ ID NO 37))的持续型转录单元修饰。在LNnT生产的一实施例中，生产LN3的菌株进一步经包含N-乙酰基葡萄糖胺β-1，4-半乳糖基转移酶(如例如来自脑膜炎奈瑟氏菌的lgtB(SEQ ID NO 38))的持续型转录单元修饰。
在唾液酸生产的一实施例中，麸氨酸棒状杆菌菌株借由过度表现果糖-6-P-氨基转移酶如天然果糖-6-P-氨基转移酶(UniProt ID Q8NND3)以增强胞内葡萄糖胺-6-磷酸池来产生。另外，基因nagA、nagB及gamA的酶活性借由基因剔除破坏且如例如酿酒酵母的葡萄糖胺-6-P-氨基转移酶(SEQ ID NO 07)、如例如来自卵形拟杆菌的N-乙酰基葡萄糖胺-2-表异构酶(SEQ ID NO 09)及如例如来自脑膜炎奈瑟氏菌的N-乙酰基神经氨酸合酶(SEQ IDNO 01)的一或两个复本过度表现于基因体上。为允许唾液酸化寡糖生产，生产唾液酸的菌株进一步经持续型转录单元修饰，该持续型转录单元包含两种或更多种N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶，如例如来自空肠弯曲杆菌的NeuA(SEQ ID NO 03)、来自流感嗜血杆菌的NeuA(SEQ ID NO 04)及来自多杀性巴氏杆菌的NeuA酶(SEQ ID NO 05)；及β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸基转移酶，如例如来自多杀性巴氏杆菌的PmultST3(UniProt ID Q9CLP3)或由UniProt ID Q9CLP3的氨基酸残基1至268组成具有β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸基转移酶活性的类PmultST3多肽(SEQ ID NO 17)，或来自脑膜炎奈瑟氏菌的NmeniST3(SEQ ID NO 18)或来自多杀性巴氏杆菌多杀性亚种Pm70菌株的PmultST2(GenBank NO.AAK02592.1)的一或多个复本；β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸基转移酶，如例如来自美人鱼发光菌的PdST6(UniProtID O66375)或由UniProt ID O66375的氨基酸残基108至497组成具有β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸基转移酶活性的类PdST6多肽(SEQ ID NO 19)或来自发光菌属JT-ISH-224的P-JT-ISH-224-ST6(UniProt ID A8QYL1)或由UniProt ID A8QYL1的氨基酸残基18至514组成具有β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸基转移酶活性的类P-JT-ISH-224-ST6多肽(SEQ ID NO 20)及/或如例如来自小鼠的α-2，8-唾液酸基转移酶(SEQ ID NO 21)。
异源及同源表现
需要表现的基因，无论其来自质体或来自基因体，均以合成方式经以下公司中的一者合成：DNA2.0、Gen9、Twist Biosciences或IDT。
可借由使密码子使用最佳化为表现宿主的密码子使用来进一步促进表现。使用供应商的工具使基因最佳化。
培养条件
96孔微量滴定盘实验的预培养始于冷冻小瓶或始于TY盘的单一菌落，于150μL TY中进行，且在37℃下在定轨振荡器上以800rpm培育隔夜。此培养物用作96孔正方形微量滴定盘的接种物，在400μL MMsf培养基情况下借由稀释400倍。使各菌株在96孔盘的多个孔中作为生物学重复生长。此等最终96孔培养盘接着在37℃下在定轨振荡器上以800rpm培育72小时或更短或更长。在培养实验结束时，自各孔获取样品以量测上清液浓度(胞外糖浓度，在短暂离心细胞5分钟后)，或在短暂离心细胞前借由使培养液在60℃下沸腾15分钟(＝全培养液浓度，胞内及胞外糖浓度，如本文所定义)。
此外，对培养物进行稀释以量测600nm下的光密度。借由完全培养液中量测的寡糖浓度除以生物质(以与参考菌株相比的相对百分比)来确定细胞性能指数或CPI。凭经验确定生物质为在600nm下量测的光密度的大致1/3。
实施例28.用经修饰的麸氨酸棒状杆菌宿主生产包含LN3、唾液酸化LN3、6′SL、LNnT及LSTc的寡糖混合物
如实施例27中所描述，麸氨酸棒状杆菌菌株借由ldh、cgl2645、nagB、gamA及nagA基因的基因体剔除及包含基因的持续型转录单元的基因体嵌入修饰以用于LN3生产及在蔗糖上的生长，所述基因编码来自大肠杆菌的乳糖透过酶(LacY)(SEQ ID NO 22)、天然果糖-6-P-氨基转移酶(UniProt ID Q8NND3)、来自脑膜炎奈瑟氏菌的半乳糖苷β-1，3-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶LgtA(SEQ ID NO 36)、来自大肠杆菌W的蔗糖运输蛋白(CscB)(SEQ IDNO 23)、来自运动发酵单胞菌的果糖激酶(Frk)(SEQ ID NO 24)及来自青春双叉杆菌的蔗糖磷酸化酶(BaSP)(SEQ ID NO 25)。在下一步骤中，突变菌株进一步经包含来自脑膜炎奈瑟氏菌的N-乙酰基葡萄糖胺β-1，4-半乳糖基转移酶LgtB(SEQ ID NO 38)的持续型转录单元的基因体嵌入修饰以生产LNnT。在下一步骤中，突变菌株进一步经包含以下者的持续型转录单元的基因体嵌入修饰以生产唾液酸：天然果糖-6-P-氨基转移酶(UniProt IDQ8NND3)、来自酿酒酵母的葡萄糖胺-6-P-氨基转移酶(SEQ ID NO 07)、来自卵形拟杆菌的乙酰基葡萄糖胺乙酰基葡萄糖胺-2-表异构酶(SEQ ID NO 09)及来自脑膜炎奈瑟氏菌的N-乙酰基神经氨酸合酶(SEQ ID NO 01)。在下一步骤中，新颖菌株经包含以下者的持续型转录单元的表现质体转形：来自空肠弯曲杆菌的NeuA(SEQ ID NO 03)、来自流感嗜血杆菌的NeuA(SEQ ID NO 04)及来自多杀性巴氏杆菌的NeuA酶(SEQ ID NO 05)及来自美人鱼发光菌的β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸基转移酶PdST6(UniProt ID O66375)。在生长实验中在包含乳糖的MMsf培养基上根据实施例27中提供的培养条件，针对生产包含LN3、6′-唾液酸化LN3(Neu5Ac-a2，6-(GlcNAc-b1，3)-Gal-b1，4-Glc)、6′SL、LNnT及LSTc的寡糖混合物评估新颖菌株。培育72小时之后，收集培养液，且在UPLC上分析糖。
实施例29.使用经修饰的麸氨酸棒状杆菌宿主生产包含3′SL、6′SL、LNB、3′-唾液酸化LNB及6′-唾液酸化LNB的的寡糖混合物
如实施例27中所描述，麸氨酸棒状杆菌菌株借由ldh、cgl2645、nagB、gamA及nagA基因的基因体剔除及包含基因的持续型转录单元的基因体嵌入修饰，所述基因编码来自大肠杆菌的乳糖透过酶(LacY)(SEQ ID NO 22)、来自大肠杆菌O55：H7具有SEQ ID NO 37的WbgO、来自大肠杆菌具有SEQ ID NO 39的galE、天然果糖-6-P-氨基转移酶(UniProt IDQ8NND3)、具有SEQ ID NO 06的glmS*54、来自酿酒酵母的葡萄糖胺-6-P-氨基转移酶(SEQID NO 07)、来自卵形拟杆菌的N-乙酰基葡萄糖胺-2-表异构酶(SEQ ID NO 09)及来自脑膜炎奈瑟氏菌的N-乙酰基神经氨酸合酶(SEQ ID NO 01)。在下一步骤中，新颖菌株用包含以下者的持续型转录单元的表现质体转形：来自空肠弯曲杆菌的NeuA酶(SEQ ID NO 03)、来自流感嗜血杆菌的NeuA酶(SEQ ID NO 04)及来自多杀性巴氏杆菌的NeuA酶(SEQ ID NO05)、来自多杀性巴氏杆菌的β-半乳糖苷α-2，3-唾液酸基转移酶PmultST3(UniProt IDQ9CLP3)及来自美人鱼发光菌的β-半乳糖苷α-2，6-唾液酸基转移酶PdST6(UniProt IDO66375)。在生长实验中在包含乳糖及葡萄糖的MMsf培养基上根据实施例27中所提供的培养条件，针对生产包含3′SL、6′SL、LNB、3′-唾液酸化LNB(3′SLNB)及6′-唾液酸化LNB(6′SLNB)的寡糖混合物评估新颖菌株。培育72小时之后，收集培养液，且在UPLC上分析糖。
实施例30.莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)材料及方法
培养基
将莱茵衣藻细胞在Tris-乙酸-磷酸(Tris-acetate-phosphate；TAP)培养基(pH7.0)中培养。TAP培养基使用1000×储备赫特纳氏(Hutner′s)痕量元素混合物。赫特纳氏痕量元素混合物由50g/L Na2EDTA.H2O(Titriplex III)、22g/L ZnSO4.7H2O、11.4g/LH3BO3、5g/L MnCl2.4H2O、5g/L FeSO4.7H2O、1.6g/L CoCl2.6H2O、1.6g/L CuSO4.5H2O及1.1g/L(NH4)6MoO3组成。
TAP培养基含有2.42g/L Tris(参(羟甲基)氨基甲烷)、25mg/L盐储备溶液、0.108g/L K2HPO4、0.054g/L KH2PO4及1.0mL/L冰醋酸。盐储备溶液由15g/L NH4CL、4g/LMgSO4.7H2O及2g/L CaCl2.2H2O组成。作为糖合成的前驱物及/或受体，可添加如例如半乳糖、葡萄糖、果糖、岩藻糖、乳糖、LacNAc、LNB的化合物。借由高压处理(121℃，21′)来对培养基进行灭菌。对于斜面琼脂上的培养物，使用含有1％琼脂(具有经纯化高强度，1000g/cm2)的TAP培养基。
菌株、质体及突变
莱茵衣藻野生型菌株21gr(CC-1690，野生型，mt+)、6145C(CC-1691，野生型，mt-)、CC-125(137c，野生型，mt+)、CC-124(137c，野生型，mt-)可购自美国明尼苏达大学(University of Minnesota，U.S.A.)的衣藻属资源中心(Chlamydomonas ResourceCenter)(https：//www.chlamycollection.org)。
表现质体源自pSI103，如可购自衣藻属资源中心。选殖可使用吉布森组装、金门组装、Cliva组装、LCR或限制接合来进行。用于(异源)基因表现的适合启动子可衍生自例如Scranton等人(Algal Res.2016，15：135-142)。靶向基因修饰(如基因剔除或基因置换)可使用如例如借由Jiang等人(Eukaryotic Cell 2014，13(11)：1465-1469)所描述的Crispr-Cas技术进行。
经由电穿孔的转形如借由Wang等人(Biosci.Rep.2019，39：BSR2018210)所描述进行。在恒定通气及光强度为8000Lx的连续光照下，使细胞在液体TAP培养基中生长，直至细胞密度达到1.0-2.0×107个细胞/毫升。接着，将细胞以1.0×106个细胞/毫升的浓度接种至新鲜液体TAP培养基中且在连续光照下生长18-20小时，直至细胞密度达到4.0×106个细胞/毫升。接下来，将细胞借由在室温下以1250g离心5分钟收集，洗涤且用含有60mM山梨糖醇(Sigma，美国)的预冷却液体TAP培养基再悬浮，且冰冻10分钟。接着，将250μL细胞悬浮液(对应于5.0×107个细胞)置放于具有100ng质体DNA(400ng/mL)的预冷却0.4cm电穿孔比色管中。使用BTXECM830电穿孔装置(1575Ω，50μFD)用6个500V脉冲进行电穿孔，各脉冲具有4ms的脉冲长度及100ms的脉冲间隔时间。在电穿孔之后，立即将比色管置放于冰上10分钟。最后，将细胞悬浮液转移至含有10mL含60mM山梨糖醇的新鲜液体TAP培养基的50ml锥形离心管中，以便在暗光下借由缓慢振荡隔夜恢复。在隔夜恢复之后，将细胞再收集且用淀粉包埋方法接种至含有安比西林(100mg/L)或氯霉素(100mg/L)的选择性1.5％(w/v)琼脂-TAP盘上。接着在23+-0.5℃下在光强度为8000Lx的连续照明下培育盘。5-7天后分析细胞。
在生产UDP-半乳糖的一实施例中，莱茵衣藻细胞经包含基因的转录单元修饰，所述基因编码如例如阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)的半乳糖激酶(KIN，UniProt IDQ9SEE5)及UDP-糖焦磷酸化酶，如例如来自阿拉伯芥的USP(UniProt ID Q9C5I1)。
在LN3生产的一实施例中，持续型转录包含半乳糖苷β-1，3-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶，如例如来自脑膜炎奈瑟氏菌的lgtA(SEQ ID NO 36)。在LNT生产的一实施例中，生产LN3的菌株进一步经包含N-乙酰基葡萄糖胺β-1，3-半乳糖基转移酶(如例如来自大肠杆菌O55：H7的WbgO(SEQ ID NO 37))的持续型转录单元修饰。在LNnT生产的一实施例中，生产LN3的菌株进一步经包含N-乙酰基葡萄糖胺β-1，4-半乳糖基转移酶(如例如来自脑膜炎奈瑟氏菌的lgtB(SEQ ID NO38))的持续型转录单元修饰。
在生产GDP-岩藻糖的一实施例中，莱茵衣藻细胞经用于如例如来自阿拉伯芥的GDP-岩藻糖合酶(GER1，UniProt ID O49213)的转录单元修饰。
在岩藻糖基化的一实施例中，莱茵衣藻细胞可经包含以下者的持续型转录单元的表现质体修饰：α-1，2-岩藻糖基转移酶，如例如来自幽门螺旋杆菌的HpFutC(SEQ ID NO26)及/或α-1，3-岩藻糖基转移酶，如例如来自幽门螺旋杆菌的HpFucT(SEQ ID NO 27)。
在CMP-唾液酸合成的一实施例中，莱茵衣藻细胞经以下者的持续型转录单元修饰：一或多种UDP-N-乙酰基葡萄糖胺-2-表异构酶/N-乙酰基甘露糖胺激酶，如例如来自智人的GNE(UniProt ID Q9Y223)或包含R263L突变的人类GNE多肽的突变形式，或来自小鼠的GNE(UniProt ID Q91WG8)；一或多种N-酰基神经氨酸-9-磷酸合成酶，如例如来自智人的NANS(UniProtID Q9NR45)、来自假单胞菌属UW4的NANS(UniProt ID K9NPH9)；及一或多种N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶，如例如来自智人的CMAS(UniProt ID Q8NFW8)。在生产唾液酸化寡糖的一实施例中，莱茵衣藻细胞经CMP-唾液酸运输蛋白修饰，该运输蛋白如例如来自小鼠的CST(UniProt ID Q61420)及选自如例如智人、小鼠、褐鼠的物种的高尔基体定位的唾液酸基转移酶。
异源及同源表现
需要表现的基因，无论其来自质体或来自基因体，均以合成方式经以下公司中的一者合成：DNA2.0、Gen9、Twist Biosciences或IDT。
可借由使密码子使用最佳化为表现宿主的密码子使用来进一步促进表现。使用供应商的工具使基因最佳化。
培养条件
在23+/-0.5℃下，在14/10h光/暗循环下以8000Lx的光强度，在选择性TAP-琼脂盘中培养莱茵衣藻细胞。在培养5至7天之后分析细胞。
对于高密度培养，细胞可在封闭系统中培养，封闭系统如例如Chen等人(Bioresour.Technol.2011，102：71-81)及Johnson等人(Biotechnol.Prog.2018，34：811-827)所描述的竖直或水平管光生物反应器、搅拌槽光生物反应器或平板光生物反应器。
实施例31.在突变莱茵衣藻细胞中生产包含唾液酸化LNB及唾液酸化LacNAc结构的寡糖混合物
莱茵衣藻细胞如实施例30中所描述经持续型转录单元的基因体嵌入工程改造以用于生产CMP-唾液酸，所述持续型转录单元包含来自小鼠的GNE(UniProt ID Q91WG8)及与天然人类GNE多肽的不同的处在于R263L突变的人类GNE(UniProt ID UniProt ID Q9Y223)的突变形式、来自智人的N-酰基神经氨酸-9-磷酸合成酶NANS(UniProt ID Q9NR45)及来自智人的N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶CMAS(UniProt ID Q8NFW8)。在下一步骤中，细胞经持续型转录单元的基因体嵌入修饰，所述持续型转录单元包含来自小鼠的CMP-唾液酸运输蛋白CST(UniProt ID Q61420)、来自褐鼠的α-2，3-唾液酸基转移酶(UniProt ID P61943及E9PSJ1)及来自褐鼠的α-2，6-唾液酸基转移酶(UniProt ID P13721)。在最终步骤中，细胞用包含阿拉伯芥基因的持续型转录单元的基因体嵌入转形，所述基因编码半乳糖激酶(KIN，UniProt ID Q9SEE5)及UDP-糖焦磷酸化酶(USP)(UniProt ID Q9C5I1)、以及具有SEQID NO 37的来自大肠杆菌O55：H7的N-乙酰基葡萄糖胺β-1，3-半乳糖基转移酶WbgO及具有SEQ ID NO 38的来自脑膜炎奈瑟氏菌的N-乙酰基葡萄糖胺β-1，4-半乳糖基转移酶LgtB。在培养实验中在包含半乳糖、葡萄糖及N-乙酰基葡萄糖胺作为前驱物的TAP琼脂盘上根据实施例30中提供的培养条件，针对生产包含3′-唾液酸基乳-N-二糖(3′SLNB)、6′-唾液酸基乳-N-二糖(6′SLNB)、3′-唾液酸基乳糖胺(3′SLacNAc)及6′-唾液酸基乳糖胺(6′SLacNAc)的寡糖混合物评估新颖菌株。培育5天之后，收集细胞，且在UPLC上分析糖生产。
实施例32.动物细胞材料及方法
自不同哺乳动物的脂肪组织分离间叶干细胞
新鲜脂肪组织是获自屠宰场(例如，牛、猪、绵羊、鸡、鸭、鲶鱼、蛇、蛙)或抽脂手术(例如，在人类的情况下，在签署知情同意书之后)且保持在补充有抗生素的磷酸盐缓冲盐水中。进行脂肪组织的酶消化，之后进行离心以分离间叶干细胞。将经分离之间叶干细胞转移至细胞培养烧瓶中且在标准生长条件(例如37℃，5％CO2)下生长。初始培养基包括DMEM-F12、RPMI及Alpha-MEM培养基(补充有15％胎牛血清)及1％抗生素。随后在第一次继代之后，培养基用补充有10％胎牛血清(fetal bovine serum；FBS)的培养基置换。举例而言，Ahmad及Shakoori(2013，Stem Cell Regen Med.9(2)：29-36)，其出于所有目的以全文引用的方式并入本文中，描述此实施例中所描述的方法的某些变化形式。
自乳汁分离间叶干细胞
此实施例说明自在无菌条件下自人类或任何其他哺乳动物(诸如本文所描述)收集的乳汁分离间叶干细胞。将等体积的磷酸盐缓冲生理食盐水添加至稀释乳汁中，接着离心20分钟。将细胞沉淀用磷酸盐缓冲生理食盐水洗涤三次，且在标准培养条件下将细胞接种于细胞培养烧瓶中补充有10％胎牛血清及1％抗生素的DMEM-F12、RPMI及Alpha-MEM培养基中。举例而言，Hassiotou等人(2012，Stem Cells.30(10)：2164-2174)，其出于所有目的以全文引用的方式并入本文中，描述此实施例中所描述的方法的某些变化形式。
使用2D及3D培养系统分化干细胞
经分离之间叶细胞可在2D及3D培养系统中分化成类乳腺上皮细胞及腔细胞。参见例如Huynh等人.1991.Exp Cell Res.197(2)：191-199；Gibson等人.1991，In Vitro CellDev Biol Anim.27(7)：585-594；Blatchford等人.1999；Animal Cell Technology′：Basic&Applied Aspects，Springer，Dordrecht.141-145；Williams等人.2009，BreastCancer Res 11(3)：26-43；及Arevalo等人.2015，Am J Physiol Cell Physiol.310(5)：C348-C356；其中的各者出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。
对于2D培养，经分离细胞最初接种于培养盘中补充有10ng/ml上皮生长因子及5pg/ml胰岛素的生长培养基中。在汇合时，将细胞用补充有2％胎牛血清、1％青霉素-链霉素(100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素)及5pg/ml胰岛素的生长培养基喂饲48小时。为诱发分化，将细胞用含有5pg/ml胰岛素、1pg/ml皮质醇、0.65ng/ml三碘甲状腺素、100nM地塞米松(dexamethasone)及1pg/ml促乳素的完整生长培养基喂饲。24小时后，自完全诱导培养基移除血清。
对于3D培养，将经分离细胞用胰蛋白酶消化且在基质胶、玻尿酸或超低附着表面培养盘中培养六天，且借由添加补充有10ng/ml上皮生长因子及5pg/ml胰岛素的生长培养基诱导以分化及泌乳。在汇合时，将细胞用补充有2％胎牛血清、1％青霉素-链霉素(100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素)及5pg/ml胰岛素的生长培养基喂饲48小时。为诱发分化，将细胞用含有5pg/ml胰岛素、1pg/ml皮质醇、0.65ng/ml三碘甲状腺素、100nM地塞米松及1pg/ml促乳素的完整生长培养基喂饲。24小时后，自完全诱导培养基移除血清。
制造类乳腺细胞的方法
哺乳动物细胞借由用编码Oct4、Sox2、Klf4及c-Myc的病毒载体再程序化来诱导多能性。接着将所得再程序化细胞在Mammocult培养基(可获自Stem Cell Technologies)或乳腺细胞富集培养基(DMEM、3％FBS、雌激素、孕酮、肝素、皮质醇、胰岛素、EGF)中培养以使其类乳腺，可自其诱导所选乳组分的表现。或者，使用诸如CRISPR/Cas9的重构系统进行表观遗传重构以活化所关注的所选基因，诸如酪蛋白、α-乳白蛋白持续性启动，允许其各别蛋白质表现，及/或下调及/或剔除所选内源基因，如例如WO21067641中所描述，其出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。
培养
完全生长培养基包括高葡萄糖DMEM/F12、10％FBS、1％NEAA、1％青霉素-链霉素、1％ITS-X、1％F-Glu、10ng/ml EGF及5pg/ml皮质醇。完全泌乳培养基包括高葡萄糖DMEM/F12、1％NEAA、1％青霉素-链霉素、1％ITS-X、1％F-Glu、10ng/ml EGF、5pg/ml皮质醇及1pg/ml促乳素(5μg/ml，在Hyunh 1991中)。细胞以20,000个细胞/cm2的密度接种于经胶原蛋白涂布的培养瓶上完全生长培养基中，且在完全生长培养基中静置以黏附及扩增48小时，其后将培养基换为完全泌乳培养基。在暴露于泌乳培养基后，细胞开始分化且停止生长。在约一周内，细胞开始分泌泌乳产物，诸如乳脂质、乳糖、酪蛋白及乳清至培养基中。可借由超过滤借由浓缩或稀释来达成所需浓度的泌乳培养基。可借由透析，例如以自培养基移除非所需代谢产物来达成泌乳培养基的所需盐平衡。可借由树脂纯化，例如使用镍树脂以移除HIS标记的生长因子来选择性萃取激素及所使用的其他生长因子，以进一步减少泌乳产物中的污染物含量。
实施例33.评估非乳腺成体干细胞中的LacNAc、唾液酸化LacNAc及唾液酸基-路易斯x生产
如实施例32中所描述的经分离间叶细胞及经再程序化成类乳腺细胞经由CRISPR-CAS修饰以过度表现来自智人的β-1，4-半乳糖基转移酶4 B4GalT4(UniProt ID O60513)、来自智人的GDP-岩藻糖合酶GFUS(UniProt ID Q13630)、来自智人的半乳糖苷α-1，3-海藻糖基转移酶FUT3(UniProt ID P21217)、来自小鼠的N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶(UniProt ID Q99KK2)及来自智人的N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶(UniProt IDQ8NFW8)，及来自智人的CMP-N-乙酰基神经氨酸-β-1，4-半乳糖苷α-2，3-唾液酸基转移酶ST3GAL3(UniProt ID Q11203)及来自褐鼠的α-2，6-唾液酸基转移酶(UniProt IDP13721)。引入细胞中的所有基因针对宿主经密码子最佳化。细胞以20,000个细胞/cm2的密度接种于经胶原蛋白涂布的培养瓶上完全生长培养基中，且在完全生长培养基中静置以黏附及扩增48小时，其后将培养基换为完全泌乳培养基，持续约7天。在如实施例32中所描述培养之后，对细胞进行UPLC以分析LacNAc、3′-唾液酸化LacNAc、6′-唾液酸化LacNAc及唾液酸基-路易斯x的生产。
Figure IPA0000334655420000011
Figure IPA0000334655420000021
Figure IPA0000334655420000031
Figure IPA0000334655420000041
Figure IPA0000334655420000051
Figure IPA0000334655420000061
Figure IPA0000334655420000071
Figure IPA0000334655420000081
Figure IPA0000334655420000091
Figure IPA0000334655420000101
Figure IPA0000334655420000111
Figure IPA0000334655420000121
Figure IPA0000334655420000131
Figure IPA0000334655420000141
Figure IPA0000334655420000151
Figure IPA0000334655420000161
Figure IPA0000334655420000171
Figure IPA0000334655420000181
Figure IPA0000334655420000191
Figure IPA0000334655420000201
Figure IPA0000334655420000211
Figure IPA0000334655420000221
Figure IPA0000334655420000231
Figure IPA0000334655420000241
Figure IPA0000334655420000251
Figure IPA0000334655420000261
Figure IPA0000334655420000271
Figure IPA0000334655420000281
Figure IPA0000334655420000291
Figure IPA0000334655420000301
Figure IPA0000334655420000311
Figure IPA0000334655420000321
Figure IPA0000334655420000331
Figure IPA0000334655420000341
Figure IPA0000334655420000351
Figure IPA0000334655420000361
Figure IPA0000334655420000371
Figure IPA0000334655420000381
Figure IPA0000334655420000391
Figure IPA0000334655420000401
Figure IPA0000334655420000411
Figure IPA0000334655420000421
Figure IPA0000334655420000431
Figure IPA0000334655420000441
Figure IPA0000334655420000451
Figure IPA0000334655420000461
Figure IPA0000334655420000471
Figure IPA0000334655420000481
Figure IPA0000334655420000491
Figure IPA0000334655420000501
Figure IPA0000334655420000511
Figure IPA0000334655420000521
Figure IPA0000334655420000531
Figure IPA0000334655420000541
Figure IPA0000334655420000551
Figure IPA0000334655420000561
Figure IPA0000334655420000571
Figure IPA0000334655420000581
Figure IPA0000334655420000591
Figure IPA0000334655420000601
Figure IPA0000334655420000611
Figure IPA0000334655420000621
Figure IPA0000334655420000631
Figure IPA0000334655420000641
Figure IPA0000334655420000651
Figure IPA0000334655420000661
Figure IPA0000334655420000671
Figure IPA0000334655420000681
Figure IPA0000334655420000691
Figure IPA0000334655420000701
Figure IPA0000334655420000711
Figure IPA0000334655420000721
Figure IPA0000334655420000731
Figure IPA0000334655420000741
Figure IPA0000334655420000751
Figure IPA0000334655420000761
Figure IPA0000334655420000771
Figure IPA0000334655420000781
Figure IPA0000334655420000791
Figure IPA0000334655420000801
Figure IPA0000334655420000811
Figure IPA0000334655420000821
Figure IPA0000334655420000831
Figure IPA0000334655420000841
Figure IPA0000334655420000851
Figure IPA0000334655420000861
Figure IPA0000334655420000871
Figure IPA0000334655420000881
Figure IPA0000334655420000891
Figure IPA0000334655420000901
Figure IPA0000334655420000911
Figure IPA0000334655420000921
Figure IPA0000334655420000931
Figure IPA0000334655420000941
Figure IPA0000334655420000951
Figure IPA0000334655420000961
Figure IPA0000334655420000971
Figure IPA0000334655420000981
Figure IPA0000334655420000991
Figure IPA0000334655420001001
Figure IPA0000334655420001011
Figure IPA0000334655420001021
Figure IPA0000334655420001031
Figure IPA0000334655420001041
Figure IPA0000334655420001051
Figure IPA0000334655420001061
Figure IPA0000334655420001071
Figure IPA0000334655420001081
Figure IPA0000334655420001091
Figure IPA0000334655420001101
Figure IPA0000334655420001111
Figure IPA0000334655420001121
Figure IPA0000334655420001131
Figure IPA0000334655420001141
Figure IPA0000334655420001151
Figure IPA0000334655420001161
Figure IPA0000334655420001171
Figure IPA0000334655420001181
Figure IPA0000334655420001191
Figure IPA0000334655420001201
Figure IPA0000334655420001211
Figure IPA0000334655420001221
Figure IPA0000334655420001231
Figure IPA0000334655420001241
Figure IPA0000334655420001251
Figure IPA0000334655420001261
Figure IPA0000334655420001271
Figure IPA0000334655420001281
Figure IPA0000334655420001291
Figure IPA0000334655420001301
Figure IPA0000334655420001311
Figure IPA0000334655420001321
Figure IPA0000334655420001331
Figure IPA0000334655420001341
Figure IPA0000334655420001351
Figure IPA0000334655420001361
Figure IPA0000334655420001371
Figure IPA0000334655420001381
Figure IPA0000334655420001391
Figure IPA0000334655420001401
Figure IPA0000334655420001411
Figure IPA0000334655420001421
Figure IPA0000334655420001431
Figure IPA0000334655420001441
Figure IPA0000334655420001451
Figure IPA0000334655420001461
Figure IPA0000334655420001471
Figure IPA0000334655420001481

Claims (51)

1.一种用于生产唾液酸化(sialylated)双糖及/或寡糖的代谢上经工程改造的细胞，该细胞包含用于生产该唾液酸化双糖及/或寡糖的途径，其特征在于该细胞经修饰以用于表现及/或过度表现编码一或多种催化相同化学反应的蛋白质的多个编码DNA序列。
2.如权利要求1的细胞，其中该蛋白质参与该用于生产该唾液酸化双糖及/或寡糖的途径。
3.如权利要求1或2中任一项的细胞，其中该用于生产该唾液酸化双糖及/或寡糖的途径包含唾液酸化途径。
4.如权利要求3的细胞，其中该唾液酸化途径包含至少一种选自包含以下者的清单的蛋白质：N-酰基葡萄糖胺2-表异构酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶、UDP-GlcNAc 2-表异构酶/激酶水解、N-乙酰基神经氨酸-9-磷酸合成酶(N-aceylneuraminate-9-phosphate synthetase)、磷酸酶(phosphatase)、N-乙酰基神经氨酸合酶、N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶(N-acylneuraminatecytidylyltransferase)、唾液酸基转移酶(sialyltransferase)及唾液酸运输蛋白，
较佳地，其中所述蛋白质中的至少一者由所述多个编码DNA序列编码。
5.如前述权利要求中任一项的细胞，其中所述多个编码DNA序列包含以下者中的任何一或多者：
编码一种蛋白质的相同编码DNA序列的多个复本，
编码一种蛋白质的多个编码DNA序列，及
编码催化相同化学反应的多种同功蛋白质(isoprotein)的多个编码DNA序列。
6.如前述权利要求中任一项的细胞，其中多个为至少2个、较佳至少3个、更佳至少5个。
7.如前述权利要求中任一项的细胞，其中所述编码DNA序列在一或多个基因表现模组中呈现至该细胞，其中表现受一或多个调节序列调节。
8.如权利要求7的细胞，其中所述表现模组整合于宿主细胞的基因体中及/或在包含质体、黏接质体、噬菌体、脂质体或病毒的载体上呈现至该细胞，该载体将稳定转形至该宿主细胞中。
9.如前述权利要求中任一项的细胞，其中该蛋白质参与核苷酸活化糖的合成，其中该核苷酸活化糖将用于生产该唾液酸化双糖及/或寡糖。
10.如权利要求9的细胞，其中该核苷酸活化糖选自包含以下者的清单：UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)、UDP-N-乙酰基半乳糖胺(UDP-GalNAc)、UDP-N-乙酰基甘露糖胺(UDP-ManNAc)、UDP-葡萄糖(UDP-Glc)、UDP-半乳糖(UDP-Gal)、GDP-甘露糖(GDP-Man)、UDP-葡萄糖醛酸、UDP-半乳糖醛酸、UDP-2-乙酰氨基-2，6-双去氧--L-阿拉伯(arabino)-4-己酮糖、UDP-2-乙酰氨基-2，6-双去氧--L-来苏(lyxo)-4-己酮糖、UDP-N-乙酰基-L-鼠李糖胺(rhamnosamine)(UDP-L-RhaNAc或UDP-2-乙酰氨基-2，6-双去氧-L-甘露糖)、dTDP-N-乙酰基岩藻糖胺(acetylfucosamine)、UDP-N-乙酰基岩藻糖胺(UDP-L-FucNAc或UDP-2-乙酰氨基-2，6-双去氧-L-半乳糖)、UDP-N-乙酰基-L-纽莫糖胺(pneumosamine)(UDP-L-PneNAC或UDP-2-乙酰氨基-2，6-双去氧-L-塔罗糖)、UDP-N-乙酰基胞壁酸(acetylmuramic acid)、UDP-N-乙酰基-L-异鼠李糖胺(quinovosamine)(UDP-L-QuiNAc或UDP-2-乙酰氨基-2，6-双去氧-L-葡萄糖)、CMP-唾液酸(CMP-Neu5Ac)、CMP-Neu4Ac、CMP-Neu5Ac9N3、CMP-Neu4，5Ac2、CMP-Neu5，7Ac2、CMP-Neu5，9Ac2、CMP-Neu5，7(8，9)Ac2、CMP-N-羟乙酰基神经氨酸(CMP-Neu5Gc)、GDP-岩藻糖(GDP-Fuc)、GDP-鼠李糖及UDP-木糖，
较佳地，该核苷酸活化糖选自包含以下者的清单：UDP-N-乙酰基葡萄糖胺(UDP-GlcNAc)、UDP-N-乙酰基甘露糖胺(UDP-ManNAc)、CMP-唾液酸(CMP-Neu5Ac)、CMP-Neu4Ac、CMP-Neu5Ac9N3、CMP-Neu4，5Ac2、CMP-Neu5，7Ac2、CMP-Neu5，9Ac2、CMP-Neu5，7(8，9)Ac2及CMP-N-羟乙酰基神经氨酸(CMP-Neu5Gc)。
11.如权利要求9或10中任一项的细胞，其中该参与核苷酸活化糖的合成的蛋白质选自包含以下者的清单：甘露糖-6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶(phosphomannomutase)、甘露糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶(guanylyltransferase)、GDP-甘露糖4，6-脱水酶、GDP-L-岩藻糖合酶、L-岩藻糖激酶(fucokinase)/GDP-岩藻糖焦磷酸化酶、L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶、葡萄糖胺-6-磷酸脱胺酶、磷酸葡萄糖胺变位酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸脱乙酰基酶、N-乙酰基葡萄糖胺表异构酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺2-表异构酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6P2-表异构酶、葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸磷酸酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸磷酸酶、N-乙酰基甘露糖胺激酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶、磷酸乙酰基葡萄糖胺变位酶、N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰基转移酶(uridylyltransferase)、葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶、唾液酸合酶、N-乙酰基神经氨酸解离酶、N-酰基神经氨酸-9-磷酸合酶、N-酰基神经氨酸-9-磷酸磷酸酶、CMP-唾液酸合成酶、半乳糖-1-表异构酶、半乳糖激酶、葡萄糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、UDP-葡萄糖4-表异构酶、葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、葡萄糖磷酸变位酶、N-乙酰基葡萄糖胺1-磷酸尿苷酰基转移酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺4-表异构酶、UDP-半乳糖4-表异构酶、N-乙酰基半乳糖胺激酶、UDP-GalNAc焦磷酸化酶、甘露糖-1-磷酸甲脒基转移酶(guanyltransferase)、UDP-GlcNAc 2-表异构酶及ManNAc激酶。
12.如前述权利要求中任一项的细胞，其中该细胞进一步表现至少一种选自包含以下者的清单的糖基转移酶(glycosyltransferase)：岩藻糖基转移酶、唾液酸基转移酶、半乳糖基转移酶、葡萄糖基转移酶、甘露糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶、N-乙酰基半乳糖氨基转移酶、N-乙酰基甘露糖氨基转移酶、木糖基转移酶(xylosyltransferase)、葡萄糖醛酸苷转移酶、半乳糖醛酸苷转移酶、葡萄糖氨基转移酶、N-羟乙酰基神经氨基转移酶(N-glycolylneuraminyltransferase)、鼠李糖基转移酶、N-乙酰基鼠李糖基转移酶、UDP-4-氨基-4，6-双去氧-N-乙酰基-β-L-阿卓糖胺(altrosamine)转胺酶、UDP-N-乙酰基葡萄糖胺烯醇丙酮酰基转移酶及岩藻糖氨基转移酶，
较佳地，其中该细胞在所述糖基转移酶中的至少一者的表现或活性方面经修饰，
较佳地，该岩藻糖基转移酶选自包含以下者的清单：α-1，2-岩藻糖基转移酶、α-1，3-岩藻糖基转移酶、α-1，4-岩藻糖基转移酶及α-1，6-岩藻糖基转移酶，
较佳地，该唾液酸基转移酶选自包含以下者的清单：α-2，3-唾液酸基转移酶、α-2，6-唾液酸基转移酶及α-2，8-唾液酸基转移酶，
较佳地，该半乳糖基转移酶选自包含以下者的清单：β-1，3-半乳糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺β-1，3-半乳糖基转移酶、β-1，4-半乳糖基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺β-1，4-半乳糖基转移酶、α-1，3-半乳糖基转移酶及α-1，4-半乳糖基转移酶，
较佳地，该葡萄糖基转移酶选自包含以下者的清单：α-葡萄糖基转移酶、β-1，2-葡萄糖基转移酶、β-1，3-葡萄糖基转移酶及β-1，4-葡萄糖基转移酶，
较佳地，该甘露糖基转移酶选自包含以下者的清单：α-1，2-甘露糖基转移酶、α-1，3-甘露糖基转移酶及α-1，6-甘露糖基转移酶，
较佳地，该N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶选自包含以下者的清单：半乳糖苷β-1，3-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶及β-1，6-N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶，
较佳地，该N-乙酰基半乳糖氨基转移酶选自包含α-1，3-N-乙酰基半乳糖氨基转移酶的清单。
13.如前述权利要求中任一项的细胞，其中该蛋白质选自包含以下者的清单的膜运输蛋白：螯铁蛋白输出蛋白、ABC运输蛋白、MFS运输蛋白及糖流出运输蛋白。
14.如前述权利要求中任一项的细胞，其中该唾液酸化双糖及/或寡糖选自包含以下者的清单：乳寡糖、O-抗原、肠内菌共同抗原(ECA)、存在于荚膜多糖中的寡糖重复、肽聚糖、氨基-糖及路易斯(Lewis)型抗原寡糖，较佳该乳寡糖为哺乳动物乳寡糖，更佳该乳寡糖为人乳寡糖。
15.如前述权利要求中任一项的细胞，其中该细胞包含岩藻糖基化途径，该途径包含至少一种选自包含以下者的清单的蛋白质：甘露糖-6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶、GDP-甘露糖4，6-脱水酶、GDP-L-岩藻糖合酶、岩藻糖透过酶、岩藻糖激酶、岩藻糖-1-磷酸鸟苷酰基转移酶、岩藻糖基转移酶，
较佳地，其中所述蛋白质中的至少一者由所述编码一或多种催化相同化学反应的酶的多个编码DNA序列编码，其中多个较佳为两个、更佳三个或更多个。
16.如前述权利要求中任一项的细胞，其中该细胞包含半乳糖基化途径，该途径包含至少一种选自包含以下者的清单的蛋白质：半乳糖-1-表异构酶、半乳糖激酶、葡萄糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、UDP-葡萄糖4-表异构酶、葡萄糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、葡萄糖磷酸变位酶、半乳糖基转移酶，
较佳地，其中所述蛋白质中的至少一者由所述编码一或多种催化相同化学反应的酶的多个编码DNA序列编码，其中多个较佳为两个、更佳三个或更多个。
17.如前述权利要求中任一项的细胞，其中该细胞包含N-乙酰基葡萄糖氨基化途径，该途径包含至少一种选自包含以下者的清单的蛋白质：L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸脱乙酰基酶、磷酸葡萄糖胺变位酶、N-乙酰基葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰基转移酶/葡萄糖胺-1-磷酸乙酰基转移酶、N-乙酰基葡萄糖氨基转移酶，
较佳地，其中所述蛋白质中的至少一者由所述编码一或多种催化相同化学反应的酶的多个编码DNA序列编码，其中多个较佳为两个、更佳三个或更多个。
18.如前述权利要求中任一项的细胞，其中该细胞经修饰以用于增强磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的合成及/或供应。
19.如前述权利要求中任一项的细胞，其中该细胞包含：
至少一个编码选自包含以下者的清单的蛋白质的编码DNA序列：i)具有SEQ ID NO 01且具有N-乙酰基神经氨酸合酶活性的来自脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)的酶(NmNeuB)，ii)该具有SEQ ID NO 01的酶的功能同源物或功能片段，及iii)与该具有SEQID NO 01的酶的全长序列具有至少80％序列一致性且具有N-乙酰基神经氨酸合酶活性的多肽序列，
两个或更多个编码选自包含以下者的清单的蛋白质的编码DNA序列：i)具有SEQ ID NO02的来自空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)的酶(CjNeuA)、具有SEQ ID NO 03的来自流感螺旋杆菌(Helicobacter influenzae)的酶(HiNeuA)及具有SEQ ID NO 04的来自多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)的酶(PmultNeuA)，其中所述具有SEQ ID NO 02、03及04的酶具有N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶活性，ii)所述具有SEQ ID NO 02、03或04的酶中的任一者的功能同源物或功能片段，及iii)与所述具有SEQ ID NO 02、03或04的酶中的任一者的全长序列分别具有至少80％序列一致性，且具有N-酰基神经氨酸胞苷酰基转移酶活性的多肽序列，及
一或多个以下的编码DNA序列的两个或更多个复本：α-2，3-唾液酸基转移酶、α-2，6-唾液酸基转移酶及/或α-2，8-唾液酸基转移酶。
20.如前述权利要求中任一项的细胞，其中该细胞包含：
编码DNA序列的两个或更多个复本，该编码DNA序列编码具有L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶活性且较佳选自包含以下者的清单的酶：i)具有SEQ ID NO 05的来自大肠杆菌(Escherichia coli)的酶(glmS*54)，及ii)该具有SEQ ID NO 05的酶的功能同源物或功能片段，及iii)与该具有SEQ ID NO 05的酶的全长序列具有至少80％序列一致性，且具有L-麸酰氨酸-D-果糖-6-磷酸氨基转移酶活性的多肽序列，及/或
编码DNA序列的两个或更多个复本，该编码DNA序列编码具有葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶活性的酶，该酶较佳选自包含以下者的清单：i)具有SEQ ID NO 06的来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的酶(GNA1)，ii)该具有SEQ ID NO 06的酶的功能同源物或功能片段，及iii)与该具有SEQ ID NO 06的酶的全长序列具有至少80％序列一致性，且具有葡萄糖胺6-磷酸N-乙酰基转移酶活性的多肽序列。
21.如前述权利要求中任一项的细胞，其中该细胞包含用于减少乙酸的生产的修饰。
22.如前述权利要求中任一项的细胞，其中该细胞进一步包含包括以下者的蛋白质中的任何一或多者的较低或降低表现及/或消除、减弱、降低或延迟活性：β-半乳糖苷酶、半乳糖苷O-乙酰基转移酶、N-乙酰基葡萄糖胺-6-磷酸脱乙酰基酶、葡萄糖胺-6-磷酸脱胺酶、N-乙酰基葡萄糖胺抑制因子、核糖核苷酸单磷酸酶、EIICBA-Nag、UDP-葡萄糖：十一异戊烯基(undecaprenyl)-磷酸葡萄糖-1-磷酸转移酶、L-墨角藻糖激酶(L-fuculokinase)、L-岩藻糖异构酶、N-乙酰基神经氨酸解离酶、N-乙酰基甘露糖胺激酶、N-乙酰基甘露糖胺-6-磷酸2-表异构酶、EIIAB-Man、EIIC-Man、EIID-Man、ushA、半乳糖-1-磷酸尿苷酰基转移酶、葡萄糖-1-磷酸腺苷酰基转移酶、葡萄糖-1-磷酸酶、ATP依赖型6-磷酸果糖激酶同功酶1、ATP依赖型6-磷酸果糖激酶同功酶2、葡萄糖-6-磷酸异构酶、有氧呼吸控制蛋白、转录抑制因子IclR、lon蛋白酶、葡萄糖特异性易位磷酸转移酶IIBC组分ptsG、葡萄糖特异性易位磷酸转移酶(PTS)IIBC组分malX、酶HAGlc、β-葡萄糖苷特异性PTS酶II、果糖特异性PTS多磷酰基转移蛋白FruA及FruB、乙醇脱氢酶醛脱氢酶、丙酮酸-甲酸解离酶、乙酸激酶、磷酰基转移酶(phosphoacyltransferase)、磷酸乙酰基转移酶、丙酮酸脱羧酶。
23.如前述权利要求中任一项的细胞，其中该细胞包含对于所选单糖、双糖或寡糖的分解代谢途径，该分解代谢途径至少部分不活化，所述单糖、双糖或寡糖参与该唾液酸化双糖及/或寡糖的合成及/或为该合成所需。
24.如前述权利要求中任一项的细胞，其中该细胞使用用于合成该唾液酸化双糖及/或寡糖的前驱物，该前驱物自培养基进料至该细胞。
25.如前述权利要求中任一项的细胞，其中该细胞生产用于合成该唾液酸化双糖及/或寡糖的前驱物。
26.如前述权利要求中任一项的细胞，其中该细胞在全培养液及/或上清液中生产90g/L或更多的该唾液酸化双糖及/或寡糖，及/或其中根据该全培养液及/或上清液中由该细胞生产的唾液酸化双糖及/或寡糖及其前驱物的总量量测，该全培养液及/或上清液中该唾液酸化双糖及/或寡糖的纯度分别为至少80％。
27.如前述权利要求中任一项的细胞，其中该细胞为细菌、真菌、酵母、植物细胞、动物细胞或原虫细胞，
较佳地，该细菌为大肠杆菌菌株，更佳为K-12菌株的大肠杆菌菌株，甚至更佳该大肠杆菌K-12菌株为大肠杆菌MG1655，
较佳地，该真菌属于选自包含以下者的群组的属：根霉菌属(Rhizopus)、网柄菌属(Dictyostelium)、青霉菌属(Penicillium)、白霉菌属(Mucor)或曲菌属(Aspergillus)，
较佳地，该酵母属于选自包含以下者的群组的属：酵母菌属(Saccharomyces)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、驹形氏酵母属(Komagataella)、汉森酵母属(Hansenula)、亚罗酵母属(Yarrowia)、球拟假丝酵母属(Starmerella)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)或德巴利酵母属(Debaromyces)，
较佳地，该植物细胞为藻类细胞或衍生自烟草、苜蓿、水稻、番茄、棉花、菜籽、大豆、玉蜀黍或玉米植物，
较佳地，该动物细胞衍生自非人类哺乳动物、鸟类、鱼类、无脊椎动物、爬虫类、两栖动物或昆虫，或为衍生自排除胚胎干细胞的人类细胞的经基因修饰的细胞系，更佳该人类及非人类哺乳动物细胞为上皮细胞、胚胎肾细胞、纤维母细胞、COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、鼠类骨髓瘤细胞、NIH-3T3细胞、非乳腺成体干细胞或其衍生物，更佳该昆虫细胞衍生自草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、家蚕(Bombyx mori)、甘蓝夜蛾(Mamestrabrassicae)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)或黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)，
较佳地，该原虫细胞为蜥蜴利什曼原虫(Leishmania tarentolae)细胞。
28.如具体实例27的细胞，其中该细胞为活的革兰氏阴性细菌，与未经修饰的先驱细胞相比，其包含减少或消除的聚-N-乙酰基-葡萄糖胺(PNAG)、肠内菌共同抗原(ECA)、纤维素、可拉酸(colanic acid)、核心寡糖、渗透调节周质葡聚糖(OPG)、甘油葡萄糖苷(glucosylglycerol)、聚糖及/或海藻糖(trehalose)的合成。
29.如前述权利要求中任一项的细胞，其中该细胞在培养基中稳定培养。
30.如前述权利要求中任一项的细胞，其中该细胞能够合成包含至少一种唾液酸化寡糖的寡糖的混合物。
31.如前述权利要求中任一项的细胞，其中该细胞能够合成包含至少一种唾液酸化双糖及/或寡糖的双糖及寡糖的混合物。
32.一种借由细胞生产唾液酸化双糖及/或寡糖的方法，该方法包含以下步骤：
i)提供如权利要求1至31中任一项的细胞，及
ii)在允许生产该唾液酸化双糖及/或寡糖的条件下培养该细胞，
iii)较佳地，自该培养物分离该唾液酸化双糖及/或寡糖。
33.如权利要求32的方法，该方法进一步包含以下步骤中的至少一者：
i)向反应器中的培养基中添加至少一种前驱物及/或受体进料(acceptor feed)，其中总反应器体积在250mL(毫升)至10.000m3(立方米)范围内，较佳以连续方式添加，且较佳使得该培养基的最终体积不超过添加该前驱物及/或受体进料之前该培养基的体积的三倍、较佳不超过两倍、更佳小于2倍；
ii)历经1天、2天、3天、4天、5天的时程借助于进料溶液以连续方式向该培养基中添加至少一种前驱物及/或受体进料；
iii)历经1天、2天、3天、4天、5天的时程借助于进料溶液以连续方式向该培养基中添加至少一种前驱物及/或受体进料，且其中较佳地，该进料溶液的pH设定在3到7之间，且其中较佳地，该进料溶液的温度保持在20℃与80℃之间；
该方法在该培养基的最终体积中产生浓度为至少50g/L、较佳至少75g/L、更佳至少90g/L、更佳至少100g/L、更佳至少125g/L、更佳至少150g/L、更佳至少175g/L、更佳至少200g/L的唾液酸化双糖及/或寡糖。
34.如权利要求32的方法，该方法进一步包含以下步骤中的至少一者：
i)向培养基中添加包含每升初始反应器体积至少50、更佳至少75、更佳至少100、更佳至少120、更佳至少150克的乳糖的乳糖进料，其中反应器体积在250mL至10.000m3(立方米)范围内，较佳以连续方式添加，且较佳使得该培养基的最终体积不超过添加该乳糖进料之前该培养基的体积的三倍、较佳不超过两倍、更佳小于2倍；
ii)历经1天、2天、3天、4天、5天的时程借助于进料溶液以连续方式向该培养基中添加乳糖进料；
iii)历经1天、2天、3天、4天、5天的时程借助于进料溶液以连续方式向该培养基中添加乳糖进料，且其中该乳糖进料溶液的浓度为50g/L、较佳75g/L、更佳100g/L、更佳125g/L、更佳150g/L、更佳175g/L、更佳200g/L、更佳225g/L、更佳250g/L、更佳275g/L、更佳300g/L、更佳325g/L、更佳350g/L、更佳375g/L、更佳400g/L、更佳450g/L、更佳500g/L、甚至更佳550g/L、最佳600g/L；且其中较佳地，该溶液的pH设定在3到7之间，且其中较佳地，该进料溶液的温度保持在20℃与80℃之间；
该方法在该培养基的最终体积中产生浓度为至少50g/L、较佳至少75g/L、更佳至少90g/L、更佳至少100g/L、更佳至少125g/L、更佳至少150g/L、更佳至少175g/L、更佳至少200g/L的从该乳糖生产的唾液酸化寡糖。
35.如权利要求34的方法，其中该乳糖进料借由自培养开始以至少5mM的浓度，较佳以30、40、50、60、70、80、90、100、150mM的浓度，更佳以＞300mM的浓度添加乳糖来实现。
36.如权利要求34或35中任一项的方法，其中该乳糖进料借由以使得在培养的整个生产阶段中获得至少5mM、较佳10mM或30mM的乳糖浓度的浓度向培养基中添加乳糖来实现。
37.如权利要求32至36中任一项的方法，其中宿主细胞培养至少约60、80、100或约120小时或以连续方式培养。
38.如权利要求32至37中任一项的方法，其中该细胞培养于包含碳源的培养基中，该碳源包含单糖、双糖、寡糖、多糖、多元醇、甘油，包括糖蜜、玉米浸液、蛋白胨、胰胨或酵母萃取物的复合培养基；较佳地，其中该碳源选自包含以下者的清单：葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、阿拉伯糖、麦芽寡糖、麦芽三糖、山梨糖醇、木糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖、甲醇、乙醇、海藻糖、淀粉、纤维素、半纤维素、糖蜜、玉米浸液、高果糖糖浆、乙酸、柠檬酸、乳酸及丙酮酸。
39.如权利要求32至38中任一项的方法，其中该细胞使用至少一种用于合成该唾液酸化双糖及/或寡糖的前驱物，较佳该细胞使用两种或更多种用于合成该唾液酸化双糖及/或寡糖的前驱物。
40.如权利要求32至39中任一项的方法，其中该培养基含有至少一种选自包含以下者的群组的化合物：乳糖、半乳糖、唾液酸、岩藻糖、GlcNAc、GalNAc、乳-N-二糖(LNB)、N-乙酰基乳糖胺(LacNAc)。
41.如权利要求32至40中任一项的方法，其中指数式细胞生长的第一阶段是借由将较佳葡萄糖或蔗糖的以碳为基础的基质添加至该培养基中来提供，随后在第二阶段中将乳糖添加至培养基中。
42.如权利要求32至41中任一项的方法，其中该细胞生产至少一种用于合成该唾液酸化双糖及/或寡糖的前驱物。
43.如权利要求32至42中任一项的方法，其中该用于合成该唾液酸化双糖及/或寡糖的前驱物完全转化成该唾液酸化双糖及/或寡糖。
44.如权利要求32至43中任一项的方法，其中将该唾液酸化双糖及/或寡糖与该培养基及/或该细胞分离。
45.如权利要求32至44中任一项的方法，其中该分离包含以下步骤中的至少一者：澄清、超过滤、纳米过滤、二相分配、逆渗透、微过滤、活性炭或碳处理、用非离子界面活性剂处理、酶消化、切向流高效过滤、切向流超过滤、电泳、亲和层析、离子交换层析、疏水性交互作用层析及/或凝胶过滤、配位体交换层析。
46.如权利要求32至45中任一项的方法，其中该方法进一步包含纯化该唾液酸化双糖及/或寡糖。
47.如权利要求46的方法，其中该纯化包含以下步骤中的至少一者：使用活性炭或碳、使用木炭、纳米过滤、超过滤、电泳、酶处理或离子交换、使用醇、使用水醇(aqueousalcohol)混合物、结晶、蒸发、沉淀、干燥、喷雾干燥、冻干、喷雾冷冻干燥、冷冻喷雾干燥、条带式干燥(band drying)、带式干燥(belt drying)、真空条带式干燥、真空带式干燥、转筒(drum)干燥、滚筒(roller)干燥、真空转筒干燥或真空滚筒干燥。
48.一种如权利要求1至29中任一项的细胞的用途，其用于生产唾液酸化双糖及/或寡糖。
49.一种如权利要求30的细胞的用途，其用于生产包含至少一种唾液酸化寡糖的寡糖的混合物。
50.一种如权利要求31的细胞的用途，其用于生产包含至少一种唾液酸化双糖及/或寡糖的双糖及寡糖的混合物。
51.一种如权利要求32至47中任一项的方法的用途，其用于生产唾液酸化双糖及/或寡糖。
CN202180050169.6A 2020-08-10 2021-08-10 唾液酸化双糖及/或寡糖的细胞生产 Pending CN116323930A (zh)

Applications Claiming Priority (15)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP20190203.8 2020-08-10
EP20190200.4 2020-08-10
EP20190201.2 2020-08-10
EP20190198 2020-08-10
EP20190198.0 2020-08-10
EP20190205.3A EP3954769A1 (en) 2020-08-10 2020-08-10 Production of oligosaccharide mixtures by a cell
EP20190203.8A EP3954778B1 (en) 2020-08-10 2020-08-10 Production of a mixture of neutral non-fucosylated oligosaccharides by a cell
EP20190202 2020-08-10
EP20190201 2020-08-10
EP20190205.3 2020-08-10
EP20190200 2020-08-10
EP20190202.0 2020-08-10
EP21168997 2021-04-16
EP21168997.1 2021-04-16
PCT/EP2021/072274 WO2022034080A1 (en) 2020-08-10 2021-08-10 Cellular production of sialylated di- and/or oligosaccharides

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116323930A true CN116323930A (zh) 2023-06-23

Family

ID=80246996

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180050169.6A Pending CN116323930A (zh) 2020-08-10 2021-08-10 唾液酸化双糖及/或寡糖的细胞生产

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20230313252A1 (zh)
EP (1) EP4192945A1 (zh)
CN (1) CN116323930A (zh)
TW (1) TW202221130A (zh)
WO (1) WO2022034080A1 (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114507649B (zh) * 2022-02-16 2023-11-21 吉林大学 嗜热酶及一锅法高效合成udp-葡萄糖和udp-葡萄糖醛酸的方法
WO2023187109A1 (en) * 2022-04-01 2023-10-05 Inbiose N.V. Sialyltransferases for the production of sialylated oligosaccharides
WO2024017987A1 (en) * 2022-07-20 2024-01-25 Inbiose N.V. Production of oligosaccharides in host cells
WO2024192016A1 (en) * 2023-03-13 2024-09-19 Recombia Biosciences, Inc. Bioproduction of gangliosides in recombinant host cells
CN118147105B (zh) * 2024-05-09 2024-08-02 西宝生物科技（上海）股份有限公司 一种蔗糖磷酸化酶的高效制备方法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2665332A1 (en) * 2006-10-03 2008-04-10 Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) High yield production of sialic acid (neu5ac) by fermentation
EP4242320A3 (en) 2010-07-12 2023-11-29 Inbiose N.V. Metabolically engineered organisms for the production of added value bio-products
WO2012112777A2 (en) * 2011-02-16 2012-08-23 Glycosyn LLC Biosynthesis of human milk oligosaccharides in engineered bacteria
DK3467100T3 (da) * 2013-03-14 2022-11-14 Glycosyn LLC Mikroorganismer og fremgangsmåder til fremstilling af sialylerede og n-acetylglucosamin-holdige oligosaccharider
SG10201707607PA (en) * 2013-03-15 2017-10-30 Glycobia Inc Polysialic acid, blood group antigens and glycoprotein expression
RU2021109889A (ru) 2014-11-14 2021-05-06 Инбиос Н.В. Мутантные микроорганизмы, устойчивые к гибели под действием лактозы
AU2017385601B2 (en) 2016-12-27 2022-08-25 Inbiose N.V. In vivo synthesis of sialylated compounds
EP3473644A1 (en) 2017-10-17 2019-04-24 Jennewein Biotechnologie GmbH Fermentative production of n-acetylneuraminic acid
PL3575404T3 (pl) 2018-05-28 2023-02-06 Chr. Hansen HMO GmbH Fermentacyjna produkcja sacharydów sialilowanych
EP4038178A4 (en) 2019-10-03 2023-11-01 TurtleTree Labs Pte. Ltd. NUTRIENT COMPOSITIONS AND METHODS, KITS AND CELLULAR COMPOSITIONS FOR THE PRODUCTION THEREOF

Also Published As

Publication number Publication date
TW202221130A (zh) 2022-06-01
WO2022034080A1 (en) 2022-02-17
EP4192945A1 (en) 2023-06-14
US20230313252A1 (en) 2023-10-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240209405A1 (en) Production of a sialylated oligosaccharide mixture by a cell
CN116323927A (zh) 双糖及/或寡糖的细胞生产
CN116323930A (zh) 唾液酸化双糖及/或寡糖的细胞生产
CN117157396A (zh) 唾液酸化的二糖和/或寡糖的细胞生产
CN117157394A (zh) 发酵生产
CN117222736A (zh) 生物产物的细胞生产
TW202219275A (zh) 在細胞中之含有ＧｌｃＮＡｃ的生物產品的產生
CN117957316A (zh) 转化乳糖-n-二糖的岩藻糖基转移酶
CN116472346A (zh) 借由细胞的唾液酸化寡糖混合物的生产
US20240327888A1 (en) Lacto-n-biose converting fucosyltransferases
TW202221131A (zh) 藉由細胞製造寡醣混合物
TW202212572A (zh) 藉由細胞製造中性岩藻糖基化寡醣之混合物
TW202221138A (zh) 藉由細胞之唾液酸化寡醣混合物的生產
TW202221133A (zh) 藉由細胞生產中性未岩藻醣化寡醣的混合物
CN118401655A (zh) 用于产生唾液酸化寡糖的唾液酸转移酶
CN118765317A (zh) 用于产生唾液酸化寡糖的唾液酸转移酶

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination