CN105683387B - 寡糖的发酵生产 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了通过利用乳糖培养具有编码单个岩藻糖基转移酶的重组基因的遗传修饰的细胞，以高产量制备2′‑FL和DFL的混合物的方法。可以将得到的2′‑FL和DFL的混合物进行用酸起始的或由岩藻糖苷酶介导的水解，从而以高产量产生岩藻糖。

Description

寡糖的发酵生产
发明领域
本发明涉及通过发酵制备2′-FL(2′-O-岩藻糖基乳糖，Fuc(α1-2)Gal(β1-4)Glc)和DFL(二岩藻糖基-乳糖，Fuc(α1-2)Gal(β1-4)[Fuc(α1-3)]Glc)的混合物的方法和所述混合物用于制备岩藻糖(6-脱氧-半乳糖)的用途。
发明背景
岩藻糖是所谓的稀有单糖中的一种。其在来自很多不同来源的多种天然产物中被发现为D-和L-型两种。哺乳动物细胞可以制备岩藻糖基化的多糖，如ABO血型抗原和多种人乳寡糖。在海胆卵和青蛙卵中存在岩藻糖。岩藻糖存在于来自植物如海藻(褐藻糖胶(fucoidan)，硫酸盐化的岩藻糖聚合物的形式)，黄蓍胶，马铃薯，猕猴桃，大豆，翅豆品种，加拿大油菜等的多糖中。在植物中，岩藻糖通常与植物多糖相关，所述植物多糖常常是高度分支的结构，在多糖链的末端或多糖链内具有L-吡喃岩藻糖基单位。人或动物糖蛋白的N-和O-糖基二者都可以含有结合于碳水化合物链的末端的岩藻糖。此外，来自细菌、真菌和微藻的细胞外多糖也含有岩藻糖。在所有天然活细胞中的岩藻糖基化过程具有两个常见特征：其由岩藻糖基转移酶介导，所述岩藻糖基转移酶将岩藻糖基残基携带到适当的接受者上，并且其形成活化的岩藻糖核苷酸，即，GDP-岩藻糖，不是游离形式的岩藻糖。
最近对游离形式的岩藻糖，特别是L-岩藻糖的兴趣增加，因为其可能用于治疗各种疾病，炎性病况和与人免疫系统相关的病症。岩藻糖也已经用于化妆品，用于皮肤保湿、皮肤再生、作为抗衰老剂以及用于预防皮肤炎症。
岩藻糖已经从天然来源获得，从单糖化学或酶学合成和通过微生物辅助的过程产生。
从天然来源，已经从生物量，如藻，通过提取分离含有岩藻糖的寡糖，并且随后已经将寡糖水解以提供岩藻糖和相关糖和衍生物的复合体混合物。岩藻糖的回收通常需要复复杂的分离技术如利用阴离子或阳离子交换树脂的色谱，透析，级分结晶等，着取决于附随的糖或糖相关化合物的性质(例如WO 2005/040430，P.Saari等人J.LiquidChrom.Rel.Technol.32，2050(2009))。
岩藻糖的化学合成涉及常见单糖如L-半乳糖，D-半乳糖，L-阿拉伯糖，D-葡萄糖，D-甘露糖和L-鼠李糖的化学修饰(参见综述：P.T.Vanhooren等人J.Chem.Technol.Biotechnol.74，479(1999)，WO 2011/144213，WO2013/046180，WO 2013/046181)。岩藻糖和其类似物的酶合成使用多酶体系从墨角藻糖(fuculose)-6-磷酸盐进行(参见WO 97/15683)。
也已经培养了来自产碱菌属物种(Alcaligenes sp.)的细菌来产生富含岩藻糖的细胞外多糖，岩藻糖通过酸性水解被从其中释放(参见EP-A-102535)。类似地，已经发现来自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的细菌株在有氧发酵条件下能够产生含有L-岩藻糖的多糖，已经通过酸性水解和很多纯化步骤从其中分开和分离岩藻糖(参见WO 2012/034996)。
近期已经通过冗长的化学方法步骤顺序合成了岩藻糖基化的乳糖，特别是2′-FL和DFL(参见WO 2010/070616，WO 2010/115934，WO 2010/115935，Takeo等人Carbohydr.Res.141，159(1985)，Fernandez-Mayoralas等人Carbohydr.Res.154，93(1986))。然而，已经寻求产生岩藻糖基化的乳糖的较低成本方式，如通过利用转化的大肠杆菌发酵(参见Drouillard等人Angew.Chem.Int.Ed.45，1778(2006)；M.Randriantsoa：Synthèse microbiologique des antigènes glucidiques des groupes sanguins，Thèsede Doctorat soutenue le 30/09/2008a l’Université Joseph Fourier，Grenoble，France；WO 2010/070104；WO 2010/142305；WO 2012/097950WO 2012/112777；Lee等人Microb.Cell Fact.11：48(2012)；
Figure BDA0000934862520000021
等人Microb.Cell Fact.12：40(2013))。
然而，已经继续寻找低成本制造岩藻糖基化的乳糖的更好方法，所述岩藻糖基化的乳糖可以被水解，从而以低成本产生岩藻糖。
发明概述
本发明的第一个方面涉及以高产量获得2'-FL和DFL的混合物(任选地含有FLU(2′-O-岩藻糖基-半乳糖苷果糖)和/或FFL((Fuc(α1-2)Fuc(α1-2)Gal(β1-4)Glc))的方法，其包括在含有乳糖的水性培养或发酵培养基中培养或发酵，具有编码单个岩藻糖基转移酶，有利地是1，2-岩藻糖基转移酶的重组基因的遗传修饰的细胞，有利地是大肠杆菌，更有利地是LacZ-Y+大肠杆菌细胞的步骤，所述岩藻糖基转移酶能够修饰乳糖或在从乳糖生物合成2'-FL的途径中的中间体，并且其对于从乳糖合成2'-FL是必需的；该方法特征在于：
-在培养基中提供乳糖达多于4天，有利地多至7天；和/或有利地以连续的方式，在培养基中提供，至少50，有利地是至少75，更有利地是至少100，甚至更有利地是至少125克的乳糖/1升的初始培养体积，以致培养基的最终体积不大于培养前的培养基体积的三倍，有利地是不大于其两倍，更有利地是小于其两倍。
有利地，得到的培养基中的2'-FL和DFL的混合物为每升的培养基中至少75，更有利地是至少100，特别是至少115克。更有利地，得到的混合物中的DFL的重量包括有利地是至少2.5％，更有利地是至少5％，甚至更有利地是至少10％，特别是至少20％的2′-FL的重量。
此外有利地是，在培养步骤之前在培养基中提供碳基底物，更有利地是葡萄糖，以产生遗传修饰的细胞的指数细胞生长。此外有利地是，将碳源和能源，更有利地是甘油，与乳糖一起加入培养基中。此外有利地是，在培养步骤期间，遗传修饰的细胞将2'-FL和DFL的混合物分泌到培养基的细胞外空间中。
本发明的第二方面涉及以高产量获得岩藻糖，特别是L-岩藻糖的方法，其包括将下述物质进行由酸起始的或由岩藻糖苷酶介导的水解的步骤：
-2'-FL和/或DFL，优选至少DFL，从包含2'-FL和DFL的混合物中分离，所述混合物通过本发明的第一方面的方法获得，并且其中DFL的重量包括有利地至少2.5％，更有利地至少5％，甚至更有利地至少10％，特别是至少20％的2'-FL的重量。
有利地，水解利用强酸，更有利地是利用硫酸进行。
本发明的第三个方面涉及以高产量从乳糖获得2′-FL的方法，其包括以下步骤：在含有乳糖的水性培养基中培养具有编码岩藻糖基转移酶，有利地是1，2-岩藻糖基转移酶的重组基因的遗传修饰的细胞，优选大肠杆菌，有利地是大肠杆菌LacZ-Y+细胞，所述岩藻糖基转移酶有利地是1，2-岩藻糖基转移酶能够修饰乳糖或在从乳糖生物合成2′-FL的途径中的中间体，并且其对于从乳糖合成2′-FL是必需的；该方法特征在于
-在培养基中提供乳糖达多于4天，有利地是多至7天；和/或
-有利地是以连续的方式，在培养基中提供，至少50，有利地是至少75，更有利地是至少100，甚至更有利地是至少125克的乳糖/1升的初始培养体积，以致培养基的最终体积不大于培养前的培养基体积的三倍，有利地是不大于其两倍，更有利地是小于其两倍。
有利地是，得到的培养基中的2′-FL是每升的培养基中至少65，更有利地是至少80，特别是至少90克。此外有利地是，在培养步骤期间，遗传修饰的细胞将2′-FL分泌到培养基的细胞外空间中。此外有利地是，在培养步骤前在培养基中提供碳基底物，有利地是葡萄糖，从而产生遗传修饰的细胞的指数细胞生长。此外有利地是，将碳源和能源，更有利地是甘油，与乳糖一起加入培养基中。
本发明的第四个方面涉及可以通过本发明第一方面的方法获得的混合物，并且其包含2′-FL和
-DFL+FLU或
-DFL+FFL或
-DFL+FLU+FFL。
本发明的第五个方面涉及提供FFL。
附图简述
在下文将参考附图进一步详细描述本发明，其中：
图1显示FFL的1H NMR谱(300MHz，D2O，TSS参考)。
图2显示FFL的13C NMR谱(75MHz，D2O，岩藻糖的甲基设置为20.4ppm)。
发明详述
根据本发明，出人意料地发现，具有是岩藻糖基转移酶，优选1，2-岩藻糖基转移酶的单个糖基转移酶的遗传修饰的细胞，在含有乳糖的水性发酵液或培养基中，可以：
-产生含有非常显著量的2′-FL和DFL二者的混合物并且随后
-将混合物分泌到培养基的细胞外空间，随后可以容易地从其中分离混合物。
随后可以以简单的方式通过用酸或岩藻糖苷酶处理混合物水解该2′-FL+DFL混合物，从而以相对低的成本提供高产量的岩藻糖。
在本发明中，术语“遗传修饰的细胞”优选意为已经在其基因组中添加、缺失或改变至少一种DNA序列，以致其具有改变的表型的细胞。该表型的改变从野生型细胞的特征改变为遗传修饰的细胞的特征。因此，当被培养或发酵时，由于添加或改变的编码至少一种在野生型细胞中不存在的酶的表达的DNA，所述遗传修饰的细胞可以进行至少另外的化学转化，或者由于编码野生型细胞中不存在的酶的表达的缺失、添加或改变的DNA，所述遗传修饰的细胞不能进行化学转化。所述遗传修饰的细胞可以通过公知的常规遗传工程技术产生。遗传修饰的细胞可以是细菌或酵母，但优选为细菌。优选的细菌包括大肠杆菌(Escherichia coli)，芽孢杆菌属物种(Bacillus spp.)(例如枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis))，幽门弯曲杆菌(Campylobacter pylori)，幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)，根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，水生嗜热链球菌(Thermophilus aquaticus)，茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobiumcaulinodans)，豆科根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)，淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae)，脑膜炎奈氏球菌(Neisseria meningitis)，乳杆菌属物种(Lactobacillusspp.)，乳酸菌属物种(Lactococcus spp.)，肠球菌属物种(Enterococcus spp.)，双歧杆菌属物种(Bifidobacterium spp.)，芽孢乳杆菌属物种(Sporolactobacillus spp.)，Micromomospora spp.，微球菌属物种(Micrococcus spp.)，红球菌属物种(Rhodococcusspp.)，假单胞菌(Pseudomonas)，特别是大肠杆菌。
在进行本发明第一方面的方法从而以高产量制备2′-FL和DFL时，将具有单个能够修饰外源乳糖接受者或从乳糖生物合成2'-FL和DFL的途径中的必需中间体的重组糖基转移酶(其是1，2-岩藻糖基转移酶，优选为α1，2-岩藻糖基转移酶)的遗传修饰的细胞，在含有乳糖的培养基中培养。用于本发明的方法的遗传修饰的细胞能够将活化的糖核苷酸的岩藻糖基残基转移至内化的乳糖，并且，在DFL生产的情况下，还能够将第二岩藻糖基残基转移至之前形成岩藻糖基乳糖，优选为2'-FL。如果其是重组的，造成上述功能的基因或其相当的DNA序列通过已知技术，使用表达载体引入所述细胞中。异源核酸序列的来源可以是任何动物(包括人)或植物，例如人FUT1或FUT2基因，来自脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)的wcfW基因，来自幽门螺杆菌的futC基因或来自大肠杆菌的wbsJ基因，其全部编码α1，2-岩藻糖基转移酶。
当进行该方法时，优选发生岩藻糖基转移酶介导的岩藻糖基化反应，其中活化的糖核苷酸，GDP-Fuc，充当供体。遗传修饰的细胞能够通过从头合成途径产生GDP-Fuc。就这点而言，GDP-Fuc在参与GDP-Fuc的从头生物合成途径的酶的作用下，以逐步的反应顺序，从简单碳源如甘油、果糖或葡萄糖开始，由细胞制备(对于单糖代谢的综述，参见例如H.H.Freeze和A.D.Elbein：第4章：Glycosylation precursors，于：Essentials ofGlycobiology，第2版(编辑A.Varki等人)，Cold Spring Harbour Laboratory Press(2009)。参与GDP-Fuc的从头生物合成途径的酶可以天然存在于细胞中或通过基因技术或重组DNA技术的方式引入细胞，它们全部是技术人员的普通知识的部分。
应该强调的是，与体外版本的转移岩藻糖基化相比，通过遗传修饰的细胞从头合成GDP-Fuc是有利的，因为其避免使用非常昂贵的外源添加的GDP-Fuc，而是，该供体由细胞原位形成，并且磷脂酰基核苷离去基团在细胞中循环。
优选地，在进行本发明第一方面的方法时，遗传修饰的细胞在碳基底物如甘油，葡萄糖，糖原，果糖，麦芽糖，淀粉，纤维素，果胶，几丁质，蔗糖等的存在下培养，以内化加入细胞中的乳糖接受者，在所述细胞中发生岩藻糖基化。优选地，利用甘油和/或葡萄糖和/或果糖，优选甘油培养细胞。
本发明第一方面的方法还包括初始将作为接受者的外源乳糖从培养基转运到遗传修饰的细胞中，在那里，其可以被岩藻糖基化以产生2'-FL和/或DFL。可以以常规方式将乳糖外源加入培养基中，其可以随后从培养基转运到细胞中。当然，乳糖的内化不应该影响基本和重要功能或破坏细胞的完整性。在一个实施方案中，内化可以通过被动转运机制发生，在此期间乳糖被动扩散跨过细胞的质膜。通过关于要内化的乳糖的细胞外和细胞内空间的浓度差异引导流动，所述乳糖应该是从较高浓度的地方通过至较低浓度的区域，趋于平衡。在其他实施方案中，可以借助主动转运机制的将乳糖内化入细胞，在此期间，在细胞的转运蛋白或通透酶的影响下，乳糖扩散跨过细胞的质膜。乳糖通透酶(LacY)对乳糖具有特异性。优选地，外源乳糖的内化通过主动转运机制发生。
第一方面的方法特征在于，使用的遗传修饰的细胞缺少可能降解乳糖，2′-FL，DFL，和在细胞中制备2'-FL和DFL所需的代谢中间体的酶活性。就这一点，将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖的LacZ基因编码的β-半乳糖苷酶被缺失(LacZ-基因型)。备选地，LacZ-基因型的遗传修饰的细胞还可以含有外源LacZ基因编码的，表达低的但可检测水平的β-半乳糖苷酶活性的功能性β-半乳糖苷酶，从而在发酵的最后去除任选的残留的乳糖(参见WO 2012/112777)。
优选使用大肠杆菌菌株，特别是大肠杆菌LacZ-Y+株，其仅具有一种重组糖基转移酶，其是α1，2-岩藻糖基转移酶，优选为由来自幽门螺杆菌的futC基因编码的α1，2-岩藻糖基转移酶。为了以高产量制备2'-FL和DFL的混合物，所述方法优选包括：a)基于1升的初始培养体积，向培养基中提供碳源和能源以及至少50，优选至少75，更优选至少100，甚至更优选至少125克的乳糖。所述方法还优选包括：b)优选以连续的方式，向培养基中提供乳糖达多于4天，优选多至7天。特别优选的是，所述方法包括步骤a)和b)二者。还特别优选的是，培养基的最终体积不大于向培养基中提供乳糖以及碳源和能源，优选甘油之前的培养基体积的三倍，更优选不大于其两倍，特别是小于其两倍。
在培养基中产生的任选地含有FLU(2′-O-岩藻糖基-半乳糖苷果糖)和任选地含有FFL(Fuc(α1-2)Fuc(α1-2)Gal(β1-4)Glc)的2'-FL+DFL混合物，优选每升的培养基中包含至少75克，更优选至少100克，特别是多至115克。
优选地，如上文公开的仅具有一种重组糖基转移酶(其是α1，2-岩藻糖基转移酶，优选由来自幽门螺旋杆菌的futC基因编码)从而以高产量生产2′-FL和DFL的混合物的遗传修饰的大肠杆菌LacZ-Y+株，以以下方式培养：
(a)通过碳基底物保证的第一阶段的指数细胞生长，和
(b)由与连续加入的乳糖一起连续加入的碳源和能源限制的第二阶段的细胞生长。
此外优选的是在允许具有高细胞密度的培养物的生产的条件下培养大肠杆菌。此外优选地，还向培养基中加入诱导剂，优选异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。
优选连续培养大肠杆菌，优选达至少4天，特别是多至7天，但不多于约9-10天，优选在30至35℃的温度，并且优选伴有连续搅拌，连续通气和连续进料碳源和能源以及乳糖。在这样在培养基中产生的2′-FL和DFL的混合物中，DFL优选包含至少2.5m/m％，更优选至少5m/m％，甚至更优选至少10m/m％，特别是至少20m/m％的2′-FL的重量。
根据以高产量制备2′-FL和DFL的混合物的另一途径，大肠杆菌菌株，优选大肠杆菌LacZ-Y+株，其仅具有一种重组糖基转移酶(其是α1，2-岩藻糖基转移酶，优选由来自幽门螺旋杆菌的futC基因编码)，用于发酵，所述发酵包括：
-优选以连续的方式，提供碳源和能源，优选甘油，以及乳糖，达多
于4天，优选多至7天。
这样在培养基中生产的任选地含有FLU和任选地含有FFL的2′-FL+DFL混合物，优选每升的培养基中包含至少75克，更优选至少100克，特别是多至115克。
优选地，如上文公开的仅具有一种重组糖基转移酶(其是α1，2-岩藻糖基转移酶，优选由来自幽门螺旋杆菌的futC基因编码)从而以高产量生产2′-FL和DFL的混合物的遗传修饰的大肠杆菌LacZ-Y+株，以以下方式培养：
(a)通过碳基底物保证的第一阶段的指数细胞生长，和
(b)由与连续加入的乳糖一起连续加入的碳源和能源限制的第二阶段的细胞生长。
此外优选的是在允许具有高细胞密度的培养物的生产的条件下培养大肠杆菌。此外优选地，还向培养基中加入诱导剂，优选异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。
在30至35℃的温度培养大肠杆菌达至少4天，特别是多至7天，但不多于约9-10天，并且优选伴有连续搅拌，连续通气和连续进料碳源和能源以及乳糖。在这样在培养基中产生的2′-FL和DFL的混合物中，DFL优选包含至少2.5m/m％，更优选至少5m/m％，甚至更优选至少10m/m％，特别是至少20m/m％的2′-FL的重量。
根据更优选的以高产量制备2′-FL和DFL的混合物的途径，大肠杆菌菌株，优选大肠杆菌LacZ-Y+株，其仅具有一种重组糖基转移酶(其是α1，2-岩藻糖基转移酶，优选由来自幽门螺旋杆菌的futC基因编码)，用于发酵，所述发酵包括：
-基于1升的初始培养体积，优选以连续的方式，提供碳源和能源，优选甘油，和至少50，优选至少75，更优选至少100克的乳糖，优选达多于4天，更优选多至7天，优选以致培养基的最终体积不大于培养前的培养基体积的三倍，更优选不大于其两倍，甚至更优选小于其两倍。
在培养基中产生的任选地含有FLU和任选地含有FFL的2′-FL+DFL混合物优选每升的培养基中包含至少75克，更优选至少100克，特别是多至115克。
优选地，如上文公开的仅具有一种重组糖基转移酶(其是α1，2-岩藻糖基转移酶，优选由来自幽门螺旋杆菌的futC基因编码)从而以高产量生产2′-FL和DFL的混合物的遗传修饰的大肠杆菌LacZ-Y+株，以以下方式培养：
(a)通过碳基底物保证的第一阶段的指数细胞生长，和
(b)由与连续加入的乳糖一起连续加入的碳源和能源限制的第二阶段的细胞生长。
此外优选的是在允许具有高细胞密度的培养物的生产的条件下培养大肠杆菌。此外优选地，还向培养基中加入诱导剂，优选异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。
优选在30至35℃的温度培养大肠杆菌达至少4天，特别是多至7天，但不多于约9-10天，并且优选伴有连续搅拌，连续通气和连续进料碳源和能源以及乳糖。在这样在培养基中产生的2′-FL和DFL的混合物中，DFL优选包含至少2.5m/m％，更优选至少5m/m％，甚至更优选至少10m/m％，特别是至少20m/m％的2′-FL的重量。
在培养大肠杆菌的最后，不论按照何种途径，任选地含有FLU和任选地含有FFL的2′-FL+DFL混合物，可能积累在细胞内和细胞外基质中。混合物可能以被动方式被转运到上清中，即，其可以向外部扩散跨过细胞膜。转运可以由一种或多种糖流出转运蛋白促进，所述转运蛋白即促进来自细胞的糖衍生物外流至上清中的蛋白。糖外流转运蛋白可以外源或内源存在，并且可以在发酵条件下过表达，从而增强产生的寡糖衍生物的输出。对要分泌的产物的糖部分的特异性可以通过已知的重组DNA技术的方式突变来改变。优选地，2′-FL+DFL混合物在细胞外基质中积累。
通过发酵制备的2′-FL+DFL混合物，可以随后以常规方式从水性培养基(在其中制备混合物)中分离。
从培养基中分离2′-FL+DFL混合物的第一步骤优选包括使培养基澄清，以去除悬浮的颗粒和污染物，特别是细胞，细胞成分，不可溶的代谢物和培养遗传修饰的细胞产生的碎片。在该步骤中，可以以常规方式使含有2′-FL和DFL的水性培养基澄清。优选地，通过离心和/或过滤使培养基澄清。
从培养基中分离2′-FL+DFL混合物的第二步骤优选包括，优选在将其澄清之后，从水性培养基中基本上去除所有蛋白，以及肽，氨基酸，RNA和DNA和可能干扰后续分离步骤的任何内毒素和糖脂。在该步骤中，可以以常规方式从培养基中去除蛋白和相关杂质。优选通过超滤，切向流高效过滤，切向流超滤，亲和色谱，离子交换色谱，疏水相互作用色谱和/或凝胶过滤(即，尺寸排阻色谱)，特别是通过色谱，更特别是通过离子交换色谱或疏水相互作用色谱从培养基去除蛋白和相关杂质。除了尺寸排阻色谱，通过色谱介质或选择的膜保留蛋白和相关杂质，而2′-FL+DFL混合物留在水性培养基中。
如果需要，在将蛋白和相关杂质从培养基去除后，可以随后将水性培养基中的2'-FL和DFL彼此分离和从培养基分离。这可以通过将培养基进行色谱分离来适当进行。该分离可以在填充有常规酸性阳离子交换树脂的色谱分离柱中进行。酸性阳离子交换树脂可以是单价的或双价的阳离子形式并且优选为H+，K+，Na+，Mg2+或Ca2+形式，特别是Ca2+。色谱分离可以以常规方式在2至9的溶液pH进行，以将2'-FL与DFL分开。色谱分离中使用的洗脱剂优选为水，特别是除盐的水，但也可以使用盐水溶液。也可以使用醇，如乙醇，和水醇混合物。分离的2'-FL可以用作婴儿配方奶粉中的补充成分或用于治疗新生婴儿中的多种疾病。
本发明的第二方面包括将优选由本发明第一方面的方法制备的包含2′-FL和DFL和任选地含有FLU和任选地含有FFL的混合物进行水解以产生岩藻糖。在水解前，优选从该混合物中去除蛋白和相关杂质，并且DFL优选包含至少2.5m/m％，更优选至少5m/m％，甚至更优选至少10m/m％，特别是至少20m/m％的2′-FL的重量。在制备岩藻糖时，将2′-FL和DFL的混合物进行由岩藻糖苷酶介导的或优选由酸起始的岩藻糖水解。
2′-FL+DFL混合物或分离的2′-FL和/或DFL和/或任何FLU和/或任何FFL可以用水溶液中的强酸，从室温高至回流，优选在约40-60℃，更优选在约50℃的温度，并且优选在不大于约3的pH水解。优选的强酸包括强无机酸，如硫酸、硝酸、氯酸、高氯酸、氢溴酸、氢碘酸和盐酸，以及强有机酸，如对甲苯磺酸或苯磺酸，特别是硫酸。水和在酸性条件下稳定并且完全或部分与水互溶的有机质子或非质子溶剂，如C1-C6醇，丙酮，THF，二烷，乙酸乙酯和MeCN的混合物，可以用作溶剂。可以在半乳糖和葡萄糖之间的糖苷内连接(interglycosidic linkage)裂开之前，选择性地从乳糖残基水解岩藻糖基团。
可以随后以常规方式通过加入等量的碱，将得到的含有游离岩藻糖的反应混合物中的酸中和，并且可以将得到的盐通过生物凝胶过滤来去除。备选地，加入用于中和的异源阴离子交换树脂可以通过简单过滤去除。从得到的中和和脱盐的反应混合物中，可以以常规方式从乳糖和其他副产物分离岩藻糖并且随后通过结晶、冷冻干燥、沉淀或喷雾干燥以固体形式分离，或以浆形式分离。
备选地，2′-FL+DFL混合物或分离的2′-FL和/或DFL和/或任何FLU和/或任何FFL可以酶水解。为此，优选使用可以从2′-FL和/或DFL和/或任何FLU和/或任何FFL释放岩藻糖基残基，优选所有岩藻糖基残基的岩藻糖苷酶。岩藻糖苷酶可以是任何常规岩藻糖苷酶，如属于以下糖苷水解酶家族之一的那些：GH29或GH95。优选的岩藻糖苷酶是α-L-岩藻糖苷酶(EC3.2.1.51)，特别是，公众可在以下GenBank数据库(GI)编号下获得的基因之一编码的α-L-岩藻糖苷酶中的一种：
Figure BDA0000934862520000121
如果需要，多于一种岩藻糖苷酶可以用于酶水解2′-FL+DFL混合物或分离的2'-FL和/或DFL和/或任何FLU和/或任何FFL。就这一点，利用1，2-α-L-岩藻糖苷酶，不预期3-O-岩藻糖基残基的割裂，并且利用1，3/4-α-L-岩藻糖苷酶，不预期2‘-O-岩藻糖基残基的割裂。因此，对于从2‘-FL岩藻糖解，优选仅使用1，2-α-L-岩藻糖苷酶，并且从任选地含有FLU和任选地含有FFL的2′-FL+DFL混合物或从分离的DFL，优选使用两种类型的岩藻糖苷酶。在双岩藻糖苷酶水解方法中，可以同时或顺序加入岩藻糖苷酶。在顺序加入时，如果首先加入1，3/4-α-L-岩藻糖苷酶，任选地含有FLU和任选地含有FFL的2′-FL+DFL混合物将转变为任选地含有FLU和任选地含有FFL的2'-FL和岩藻糖的混合物，随后将所述混合物用1，2-α-L-岩藻糖苷酶处理，获得任选地含有半乳糖苷果糖的岩藻糖和乳糖的混合物。同样，分离的DFL将转变为2'-FL和岩藻糖的混合物，随后将所述混合物用1，2-α-L-岩藻糖苷酶处理，获得岩藻糖和乳糖的混合物。在首先向任选地含有FLU和任选地含有FFL的2′-FL+DFL混合物中加入1，2-α-L-岩藻糖苷酶的情况下，将产生任选地含有半乳糖苷果糖的3-FL和乳糖的混合物，随后将向其中加入1，3/4-α-L-岩藻糖苷酶，获得任选地含有半乳糖苷果糖的岩藻糖和乳糖的混合物。同样，在用1，2-α-L-岩藻糖苷酶处理后，将从分离的DFL产生3-FL和乳糖的混合物，随后向其中加入1，3/4-α-L-岩藻糖苷酶，获得岩藻糖和乳糖的混合物。
酶水解后，可以将得到的含有岩藻糖和乳糖以及任选地半乳糖苷果糖的反应混合物中的岩藻糖苷酶变性并离心。随后可以将得到的溶液在减压下蒸发。冷冻干燥后，可以将干的残留物溶解在水中，并且可以将岩藻糖通过生物凝胶色谱用水或通过反相色谱纯化。可以从纯化的级分，通过结晶、冷冻干燥、沉淀或喷雾干燥以固体形式，或以浆形式分离岩藻糖。
如果需要，可以在从培养基中去除蛋白和相关杂质后，将通过本发明第一方面的方法产生的混合物中的2'-FL和DFL和/或任何FLU和/或任何FFL彼此分离。这可以通过将培养基进行色谱分离来适当进行。该分离可以在填充有常规酸性阳离子交换树脂的色谱分离柱中进行。酸性阳离子交换树脂可以是单价的或双价的阳离子形式并且优选为H+，K+，Na+，Mg2+或Ca2+形式，特别是Ca2+。色谱分离可以以常规方式在2至9的溶液pH进行，以将2′-FL与DFL分开。色谱分离中使用的洗脱剂优选为水，特别是除盐的水，但也可以使用盐水溶液。也可以使用醇，如乙醇，和水醇混合物。
根据怎样在水性培养基中进行2′-FL与任何碳水化合物型污染物的分离，分离的2′-FL还可以含有：
-DFL或
-DFL+FLU或
-DFL+FFL或
-DFL+FLU+FFL。
如上文所述，随后可以将得到的2′-FL和/或DFL和/或任何FLU和/或任何FFL各自分开水解，以产生岩藻糖。备选地，它们中的一种或全部可以以常规方式用作食品添加剂，特别是用于婴儿营养。
在本发明的第三个方面，提供通过在水性培养基中培养具有编码岩藻糖基转移酶，优选1，2-岩藻糖基转移酶的重组基因的遗传修饰的细胞，优选大肠杆菌，以高产量从乳糖获得2′-FL的方法，所述岩藻糖基转移酶能够修饰乳糖或在从乳糖生物合成2′-FL的途径中的中间体，并且其对于从乳糖合成2′-FL是必需的。该方法特征在于提供碳源和能源，优选甘油，和
-基于1升的初始培养体积，优选以连续的方式，加入至少50，优选至少75，更优选至少100甚至更优选至少125克的乳糖，优选以致培养基的最终体积不大于培养前的培养基体积的三倍，更优选不大于其两倍，甚至更优选小于其两倍，和/或
-优选以连续的方式，添加乳糖达多于4天，优选多至7天。
这样在培养基中产生的2′-FL优选每升的培养基中包含至少65克，更优选至少80克，特别是至少90。
在进行本发明的以高产量制备2′-FL的方法中，将具有能够修饰外源乳糖接受者或在从乳糖生物合成2′-FL的途径中的必需中间体的重组1，2-岩藻糖基转移酶，优选α1，2-岩藻糖基转移酶的遗传修饰的细胞，在含有乳糖的培养基中培养。本发明的方法中使用的遗传修饰的细胞能够将活化的糖核苷酸的岩藻糖基残基转移至内化的乳糖。如果其是重组的，通过已知技术将造成上述功能的基因或其相当的DNA序列，使用表达载体引入所述细胞中。异源核酸序列的来源可以是任何动物(包括人)或植物，例如人FUT1或FUT2基因，来自脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)的wcfW基因，来自幽门螺杆菌的futC基因或来自大肠杆菌的wbsJ基因，其全部编码α1，2-岩藻糖基转移酶。
当进行本发明的第三个方面时，优选发生岩藻糖基转移酶介导的岩藻糖基化反应，其中活化的糖核苷酸，GDP-Fuc，充当供体。遗传修饰的细胞能够通过从头合成途径产生GDP-Fuc。就这点而言，GDP-Fuc在参与GDP-Fuc的从头生物合成途径的酶的作用下，以逐步的反应顺序，从简单碳源如甘油、果糖或葡萄糖开始，由细胞制备(对于单糖代谢的综述，参见例如H.H.Freeze和A.D.Elbein：第4章：Glycosylation precursors，于：Essentials ofGlycobiology，第2版(编辑A.Varki等人)，Cold Spring Harbour Laboratory Press(2009)。参与GDP-Fuc的从头生物合成途径的酶可以天然存在于细胞中或通过基因技术或重组DNA技术的方式引入细胞，它们全部是技术人员的普通知识的部分。
应该强调的是，与体外版本的转移岩藻糖基化相比，通过遗传修饰的细胞从头合成GDP-Fuc是有利的，因为其避免使用非常昂贵的外源添加的GDP-Fuc，而是，该供体由细胞原位形成，并且磷脂酰基核苷离去基团在细胞中循环。
优选地，在进行本发明第三个方面时，遗传修饰的细胞在碳基底物如甘油，葡萄糖，糖原，果糖，麦芽糖，淀粉，纤维素，果胶，几丁质，蔗糖等的存在下培养，以内化加入细胞中的乳糖接受者，在所述细胞中发生岩藻糖基化。优选地，在碳源和能源，如甘油和/或葡萄糖和/或果糖，优选甘油上培养细胞。
本发明第三方面的方法还包括初始将作为接受者的外源乳糖从培养基转运到遗传修饰的细胞中，在那里，其可以被岩藻糖基化以产生2'-FL。可以以常规方式将乳糖外源加入培养基中，其可以随后从培养基转运到细胞中。当然，乳糖的内化不应该影响基本和重要功能或破坏细胞的完整性。在一个实施方案中，内化可以通过被动转运机制发生，在此期间乳糖被动扩散跨过细胞的质膜。通过关于要内化的乳糖的细胞外和细胞内空间的浓度差异引导流动，所述乳糖应该是从较高浓度的地方通过至较低浓度的区域，趋于平衡。在其他实施方案中，可以借助主动转运机制将乳糖内化入细胞，在此期间，在细胞的转运蛋白或通透酶的影响下，乳糖扩散跨过细胞的质膜。乳糖通透酶(LacY)对乳糖具有特异性。优选地，外源乳糖的内化通过主动转运机制发生。
本发明第三方面的方法特征在于，使用的遗传修饰的细胞缺少可能降解乳糖，2'-FL，和在细胞中制备2'-FL所需的代谢中间体的酶活性。就这一点，将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖的由LacZ基因编码的β-半乳糖苷酶被缺失(LacZ-基因型)。备选地，LacZ-基因型的遗传修饰的细胞还可以含有外源LacZ基因编码的，表达低的但可检测水平的β-半乳糖苷酶活性的功能性β-半乳糖苷酶，从而在发酵的最后去除任选的残留的乳糖(参见WO2012/112777)。
优选地，如上文公开的大肠杆菌，优选大肠杆菌LacZ-Y+株，其具有重组糖基转移酶(其是α1，2-岩藻糖基转移酶，优选由来自幽门螺旋杆菌的futC基因编码)从而以高产量生产2'-FL的遗传修饰，以以下方式培养：
(a)通过碳基底物保证的第一阶段的指数细胞生长，和
(b)由与连续加入的乳糖一起连续加入的碳源和能源限制的第二阶段的细胞生长。
此外优选的是在允许具有高细胞密度的培养物的生产的条件下培养大肠杆菌。此外优选地，还向培养基中加入诱导剂，优选异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。
优选，使用大肠杆菌菌株，特别是大肠杆菌LacZ-Y+株，其具有α1，2-岩藻糖基转移酶，优选α1，2-岩藻糖基转移酶，所述岩藻糖基转移酶由幽门螺旋杆菌的futC基因编码。为了以高产量制备2'-FL，所述方法优选包括：a)基于1升的初始培养体积，向培养基中提供，碳源和能源和至少50，优选至少75，更优选至少100，甚至更优选至少125克的乳糖。所述方法还优选包括：b)优选以连续的方式向培养基中提供乳糖达多于4天，优选多至7天。特别优选的是，所述方法包含步骤a)和b)二者。还特别优选的是，培养基的最终体积不大于向培养基中提供乳糖以及碳源和能源，优选甘油之前的培养基体积的三倍，更优选不大于其两倍，特别是小于其两倍。
在培养基中产生的2'-FL优选在每升的培养基中包含至少65克，更优选至少80克，特别是多至90克。
优选地，如上文公开的具有重组α1，2-岩藻糖基转移酶(优选由来自幽门螺旋杆菌的futC基因编码)从而以高产量生产2'-FL的遗传修饰的大肠杆菌LacZ-Y+株，以以下方式培养：
(a)通过碳基底物保证的第一阶段的指数细胞生长，和
(b)由与连续加入的乳糖一起连续加入的碳源和能源限制的第二阶段的细胞生长。
此外优选的是在允许具有高细胞密度的培养物的生产的条件下培养大肠杆菌。此外优选地，还向培养基中加入诱导剂，优选异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。
优选在30至35℃的温度优选连续培养大肠杆菌，并且优选伴有连续搅拌，连续通气和连续进料碳源和能源以及乳糖。
根据另一个以高产量制备2'-FL的方式，大肠杆菌菌株，优选大肠杆菌LacZ-Y+株，其具有由来自幽门螺旋杆菌的futC基因编码的α1，2-岩藻糖基转移酶，优选α1，2-岩藻糖基转移酶，用于发酵，所述发酵包括：
-优选以连续的方式，提供碳源和能源，优选甘油，以及乳糖，达多于4天，优选多至7天。
这样在培养基中产生的2'-FL优选每升的培养基包含至少65克，更优选至少80克，特别是多至90克。
优选地，如上文公开的具有α1，2-岩藻糖基转移酶(优选由来自幽门螺旋杆菌的futC基因编码)从而以高产量生产2'-FL的遗传修饰的大肠杆菌LacZ-Y+株，以以下方式培养：
(a)通过碳基底物保证的第一阶段的指数细胞生长，和
(b)由与连续加入的乳糖一起连续加入的碳源和能源限制的第二阶段的细胞生长。
此外优选的是在允许具有高细胞密度的培养物的生产的条件下培养大肠杆菌。此外优选地，还向培养基中加入诱导剂，优选异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。
在30至35℃的温度，将大肠杆菌培养达至少4天，特别是多至7天，但不多于约9-10天，并且优选伴有连续搅拌，连续通气和连续进料碳源和能源以及乳糖。
根据更优选的以高产量制备2'-FL的方式，大肠杆菌菌株，优选大肠杆菌LacZ-Y+株，其具有由来自幽门螺旋杆菌的futC基因编码的α1，2-岩藻糖基转移酶，优选α1，2-岩藻糖基转移酶，用于发酵，所述发酵包括：
-优选以连续的方式，提供碳源和能源，优选甘油，和基于1升的初始培养体积的至少50，优选至少75，更优选至少100克的乳糖，优选达多于4天，更优选多至7天，优选以致最终的培养基体积不大于培养前的培养基体积的三倍，更优选不大于其两倍，甚至更优选小于其两倍。
这样在培养基中产生的2'-FL优选每升的培养基包含至少65克，更优选至少80克，特别是多至90克。
优选地，如上文公开的具有α1，2-岩藻糖基转移酶(优选由来自幽门螺旋杆菌的futC基因编码)从而以高产量生产2'-FL的遗传修饰的大肠杆菌LacZ-Y+株，以以下方式培养：
(a)通过碳基底物保证的第一阶段的指数细胞生长，和
(b)由与连续加入的乳糖一起连续加入的碳源和能源限制的第二阶段的细胞生长。
此外优选的是在允许具有高细胞密度的培养物的生产的条件下培养大肠杆菌。此外优选地，还向培养基中加入诱导剂，优选异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。
优选在30至35℃的温度，将大肠杆菌培养达至少4天，特别是多至7天，但不多于约9-10天，并且优选伴有连续搅拌，连续通气和连续进料碳源和能源以及乳糖。
在培养大肠杆菌的最后，不论按照何种途径，2'-FL可能作为产物积累在细胞内和细胞外基质中。所述产物可能以被动方式被转运到上清中，即，其可以向外部扩散跨过细胞膜。转运可以由一种或多种糖流出转运蛋白促进，所述转运蛋白即促进来自细胞的糖衍生物外流至上清中的蛋白。糖外流转运蛋白可以外源或内源存在，并且可以在发酵条件下过表达，从而增强产生的2'-FL的输出。对要分泌的产物的糖部分的特异性可以通过已知的重组DNA技术的方式突变来改变。优选地，2'-FL在细胞外基质中积累。
可以随后以常规方式从水性培养基(在其中制备混合物)中分离2'-FL产物。
从培养基中分离2'-FL的第一步骤优选包括使培养基澄清，以去除悬浮的颗粒和污染物，特别是细胞，细胞成分，不可溶的代谢物和培养遗传修饰的细胞产生的碎片。在该步骤中，可以以常规方式使含有2'-FL的水性培养基澄清。优选地，通过离心和/或过滤使培养基澄清。
从培养基中分离2'-FL产物的第二步骤优选包括，优选在将其澄清之后，从水性培养基中基本上去除所有蛋白，以及肽，氨基酸，RNA和DNA和可能干扰后续分离步骤的任何内毒素和糖脂。在该步骤中，可以以常规方式从培养基中去除蛋白和相关杂质。优选通过超滤，切向流高效过滤，切向流超滤，亲和色谱，离子交换色谱，疏水相互作用色谱和/或凝胶过滤(即，尺寸排阻色谱)，特别是通过色谱，更特别是通过离子交换色谱或疏水相互作用色谱从培养基去除蛋白和相关杂质。除了尺寸排阻色谱，通过色谱介质或选择的膜保留蛋白和相关杂质，而2′-FL留在水性培养基中。
如果需要，在将蛋白和相关杂质从培养基去除后，可以随后将水性培养基中的2'-FL与任何碳水化合物型污染物分离。这可以通过将培养基进行色谱分离来适当进行。该分离可以在填充有常规酸性阳离子交换树脂的色谱分离柱中进行。酸性阳离子交换树脂可以是单价的或双价的阳离子形式并且优选为H+，K+，Na+，Mg2+或Ca2+形式，特别是Ca2+。色谱分离可以以常规方式在2至9的溶液pH进行，以将2'-FL与碳水化合物型杂质分开。色谱分离中使用的洗脱剂优选为水，特别是除盐的水，但也可以使用盐水溶液。也可以使用醇，如乙醇，和水醇混合物。分离的2'-FL可以用作婴儿配方奶粉中的补充成分和用于治疗新生婴儿中的多种疾病。
实施例
以高产量产生2'-FL和DFL
细菌菌株和接种物制备：
根据WO 01/04341和Drouillard等人Angew.Chem.Iht.Ed.Eng.45，1778(2006)，通过缺失可能降解乳糖，寡糖产物和它们的代谢中间体的基因，和其他的lacZ，lacA和wcaJ基因，维持参与GDP-岩藻糖生物合成的manB，manC，gmd和wcaG基因，并且插入幽门螺旋杆菌(H.pylori)futC基因用于α-1，2-岩藻糖基转移酶，作为仅有的糖基转移酶，从大肠杆菌K株构建改造的大肠杆菌。
一般发酵步骤：
在120℃将葡萄糖，甘油，异丙基硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)和乳糖分别灭菌。
在含有1.5l的矿质培养基的3l发酵罐中进行培养(Samain等人J.Biotechnol.72，33(1999))。将温度保持在33℃并且用28％NH4OH将pH调至6.8。接种物(基础培养基体积的1％)存在于LB培养基和生产菌株的培养物中。指数生长阶段从接种开始，并且直到最初加入到培养基中的碳源(葡萄糖17.5g/l)耗尽终止。在指数期的最后加入诱导剂(异丙基硫代-β-D-吡喃半乳糖苷，IPTG，1-2ml的50mg/ml溶液)。随后使用1l的含有溶解于水中的500g甘油和160-200g乳糖的进料溶液获得分批补料(fed-batch)，将其在4-7天期间加至培养物中。在发酵的最后，产生在68-114g/l变化的2′-FL浓度，并且2'FL+DFL混合物中在80∶20至88∶12之间变化的2′-FL∶DFL比例。在该混合物中岩藻糖基化的半乳糖苷果糖FLU(2′-O-岩藻糖基-半乳糖苷果糖)不大于1％，并且在该混合物中FFL(Fuc(α1-2)Fuc(α1-2)Gal(β1-4)Glc)也不多于1％。
纯化：
在发酵的最后，将培养物在20-25℃在4500-6000rpm离心25-40min。使用H+型树脂将上清保持并酸化至pH 3。这导致蛋白沉淀。将树脂通过倾析(decantation)回收，并且将沉淀的蛋白通过在4500-6000rpm在20-25℃离心25-40min来去除。将上清通过H+型离子交换树脂柱并且立即通过游离碱型阴离子交换树脂柱来中和。将化合物用水或乙醇水溶液洗脱。收集含有产物的级分，浓缩并冷冻干燥/结晶/沉淀。
化合物的鉴定：
与WO 2010/115935中公开的那些十分一致，通过HPLC，使用参考化合物和其1H和13C NMR谱鉴定2′-FL。
通过LC-MS和NMR鉴定DFL。基于标准一维(1H，13C)和二维同源相关和异源相关(gDQCOSY，2D-TOCSY，2DNOESY，1H-13C gHSQCAD，1H-13C gHMBCAD)测量的详细分析分配其1H和13C共振。在实验误差内，谱数据(参见表1)与文献(Ishizuka等人J.Carbohydr.Chem.18，523(1999))中报道的那些一致。
Figure BDA0000934862520000211
表1.对于DFL在D2O中的1H和13C共振分配，25℃，在400MHz(α/β比是9/11)
通过LC-MS和NMR鉴定FLU(2′-O-岩藻糖基-半乳糖苷果糖)。通过使用标准一维和二维1H-1H和1H-13C关联实验(gCOSY，2DTOCSY，1H-13C-gHSQCAD，1H-13C-gHMBCAD)进行共振分配。在25℃在DMSO中的平衡同分异构比为β-呋喃糖/β-吡喃糖/α-呋喃糖＝55/40/5。
Figure BDA0000934862520000221
表2.对2′-O-岩藻糖基-半乳糖苷果糖在DMSO中的1H和13C共振分配，25℃，在400MHz(β-呋喃糖异构体)
同样，通过LC-MS和NMR，使用标准的一维和二维1H-1H和1H-13C关联实验(gCOSY，1H-13C-gHSQCAD)鉴定FFL(Fuc(α1-2)Fuc(α1-2)Gal(β1-4)Glc)。图1和2分别显示其1H和13CNMR谱。

Claims (33)

1.获得2'-FL和DFL的混合物的方法，其包括以下步骤：在含有乳糖的水性培养基中，培养具有单个重组糖基转移酶的遗传修饰的LacZ-Y+大肠杆菌细胞，所述糖基转移酶是1,2-岩藻糖基转移酶，其能够修饰乳糖或在从乳糖生物合成2'-FL或DFL的途径中的中间体，并且其对于从乳糖合成2'-FL或DFL是必需的；所述方法特征在于：
-以连续的方式，向培养基中加入至少75克的乳糖/1升的初始培养体积，多于4天，以致培养基的最终体积不大于培养前的培养基的体积的三倍。
2.权利要求1所述的方法，其中乳糖添加进行多至7天。
3.权利要求1所述的方法，其中向培养基中加入至少100克的乳糖/1升的初始培养体积。
4.权利要求1所述的方法，其中向培养基中加入至少125克的乳糖/1升的初始培养体积。
5.权利要求1所述的方法，其中培养基的最终体积不大于培养前的培养基的体积的两倍。
6.权利要求1所述的方法，其中培养基的最终体积小于培养前的培养基的体积的两倍。
7.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中还将碳源和能源加入培养基中。
8.权利要求7所述的方法，其中所述碳源是甘油。
9.权利要求7所述的方法，其中将碳源和能源连续地加入培养基中。
10.权利要求7所述的方法，其中将碳源和能源与乳糖一起加入培养基中。
11.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中在第二阶段将乳糖加入培养基中之前，通过将碳基底物加入培养基中以提供第一阶段的指数细胞生长。
12.权利要求11所述的方法，其中所述碳基底物是葡萄糖。
13.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，在培养步骤期间，所述遗传修饰的细胞将2'-FL和DFL的混合物分泌到培养基的细胞外空间中。
14.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中每升的所述培养基获得至少75克的2'-FL和DFL的混合物。
15.权利要求14所述的方法，其中每升的所述培养基获得至少100克的2'-FL和DFL的混合物。
16.权利要求14所述的方法，其中每升的所述培养基获得至少115克的2'-FL和DFL的混合物。
17.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述2'-FL和DFL的混合物还含有FLU(2'-O-岩藻糖基-半乳糖苷果糖)或FFL(Fuc(α1-2)Fuc(α1-2)Gal(β1-4)Glc)，或FLU和FFL二者。
18.从乳糖获得2'-FL的方法，其包括以下步骤：在水性培养基中培养具有编码1,2-岩藻糖基转移酶的重组基因的遗传修饰的LacZ-Y+大肠杆菌细胞，所述1,2-岩藻糖基转移酶能够修饰乳糖或在从乳糖生物合成2'-FL的途径中的中间体，并且对于从乳糖合成2'-FL是必需的；所述方法特征在于：
-以连续的方式，向培养基中加入至少75克的乳糖/1升的初始培养体积，多于4天，以致培养基的最终体积不大于培养前的培养基体积的三倍。
19.权利要求18所述的方法，其中乳糖添加进行多至7天。
20.权利要求18所述的方法，其中向培养基中加入至少100克的乳糖/1升的初始培养体积。
21.权利要求18所述的方法，其中向培养基中加入至少125克的乳糖/1升的初始培养体积。
22.权利要求18所述的方法，其中培养基的最终体积不大于培养前的培养基的体积的两倍。
23.权利要求18所述的方法，其中培养基的最终体积小于培养前的培养基的体积的两倍。
24.权利要求18-23中任一项所述的方法，其中还将碳源和能源加入培养基中。
25.权利要求24所述的方法，其中所述碳源是甘油。
26.权利要求24所述的方法，其中将碳源和能源连续地加入培养基中。
27.权利要求24所述的方法，其中将碳源和能源与乳糖一起加入培养基中。
28.权利要求18-23中任一项所述的方法，其中在第二阶段将乳糖加入培养基中之前，通过将碳基底物加入培养基中以提供第一阶段的指数细胞生长。
29.权利要求28所述的方法，其中所述碳基底物是葡萄糖。
30.权利要求18-23中任一项所述的方法，其中在培养步骤期间，所述遗传修饰的细胞将2'-FL分泌到培养基的细胞外空间中。
31.权利要求18-23中任一项所述的方法，其中每升的培养基获得至少65克的2'-FL。
32.权利要求31所述的方法，其中每升的培养基获得至少80克的2'-FL。
33.权利要求31所述的方法，其中每升的培养基获得至少90克的2'-FL。
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