JPH11500921A - ＧＤＰ−α−Ｄ−マンノースの酵素による生成方法、これに適する酵素及びその生成方法並びに酵素テスト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はＧＤＰ- マンノース- ピロホスホリラーゼに関する。本発明の目的は経済的に妥当な費用で特にその単官能性のゆえにより長い時間にわたる連続多段階処理で問題を生じないＧＤＰ- マンノース- ピロホスホリラーゼを生成することにある。この目的のために、微生物から単離されるＧＤＰ- マンノース- ピロホスホリラーゼ（比活性＞２Ｕ／ｍｇ）が生成される。

Description

【発明の詳細な説明】 ＧＤＰ- α -Ｄ- マンノースの酵素による生成方法、これに適する酵素 及びその生成方法並びに酵素テスト 本発明の対象は、ヘキソース基に関して単官能性の新規ＧＤＰ- マンノース- れをＧＤＰ- マンノースの生成に使用する方法である。 ＧＤＰ- マンノースは、グリコシルトランスフエラーゼによってオリゴ糖に変 換される、現在広い範囲にわたって研究されている活性化された糖に属する。更 に、これはＧＤＰ- フコースの生成の出発化合物である。 ＧＤＰ- マンノース- ピロホスホリラーゼは、長い間知られている。これは種 々の起源から単離される。すなわち１９６４年にすでに Preiss 等（J．Biol．C hem．239（1964）3119-26）にはアントロベクターsp．からの酵素の単離が報告 されている。D．Shinabarger等(J．Biol．Chem．266（1991）2080-88)には、ホ スホマンノース- イソメラーゼ- 及びピロホスホリラーゼ- 活性を有するシュー ドモナスアエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)（緑膿菌）からの多官能性Ｇ ＤＰ- Ｍａｎ- ＰＰの単離が記載されている。 哺乳動物- 腺から単離されたＧＤＰ- Ｍａｎ- ＰＰは、ＧＤＰマンノース及び ＧＤＰ- グルコースの合成を触媒する。ブタ甲状腺から70,000倍純粋なＣＤＰ- Ｍａｎ- ＰＰが得られる。これは全くＧＤＰ- グルコース- 合成- 活性を示さな い。 T．Szumilo等（J．Biol．Chem．268（1993）17943-50）にはブタ肝臓からＧＤ Ｐの単離及び5000- 倍の精製が報告されている。この際、肝臓１ｋｇから多段階 精製で比活性９．２５Ｕ／ｍｇを有する酵素４ｍｇが得られる。この酵素もＣＤ Ｐ- マンノース及びＧＤＰ- グルコースの生成を触媒する。 近頃、ＧＤＰ- Ｍａｎ- ＰＰ- 源として主に酵母(S．cerevisiae)が使用され 、そして酵素は一般に特に精製されない(P．Wang 等、J．Org．Chem．58（1993 ）3985-90)。WO93/0820 A1中に酵母からのＧＤＰ- Ｍａｎ- ＰＰの精製について 報告されている。その方法によれば酵母細胞- 抽出物から分別される（ＮＨ₄）₂ ＳＯ₄-沈澱によって及び透析によって活性０．１Ｕ／ｍｌを有する酵素溶液が得 られる。要約すると、市場で入手できないＧＤＰ- Ｍａｎ- ＰＰは極めて多大な 費用をかけて単離されるかあるいは全く又はほんの一部しか精製されない形で生 じることが確認され、この際一部多官能性の種々の形が存在する。 したがって本発明の目的は、経済的に妥当な費用で得られるＧＤＰ- Ｍａｎ- ＰＰにあり、これは特にその単官能性のゆえにより長い時間にわたる連続的多段 階処理に問題を生じない。 この目的にかなうＧＤＰ- Ｍａｎ- ＰＰは請求の範囲１の記載に相当する。本 発明の他の要件は、従属項から明らかである。 ＧＤＰ- Ｍａｎ- ＰＰを微生物、たとえば酵母、B．subtilis-及び大腸菌株の 学修飾に適し、遺伝子工学的に操作されたそれ自体公知の種類のプラスミド中に 成し、この粗抽出物中に酵素がかなりの濃度ですでに存在するので、工業的規模 での後処理及び精製の費用は、全く僅かである。 次表に、種々の酵素源中に存在する酵素含有量（粗抽出物中）、後処理後に得 られる比活性（公知でない限り）及び得られた酵素の官能性を示す。 この表から単官能性（“マンノース- 特異性”）酵素に対して、本発明による 効果的な酵素源の供給が優れていることが明らかである。 これらの酵素を、ＧＤＰ- マンノースを多量に得るために使用することができ る。この際より安価なマンノース -６- リン酸から出発するのが有利であり、こ れを先ずホスホマンノムターゼによってマンノース -１- リン酸に変える。 ＧＤＰ- Ｍａｎ- ＰＰ及びホスホマンノムターゼは、特に、対応する遺伝子（ ｒｆｂＭ又はｒｆｂＫ）をプラスミド中に挿入し、夫々の産生菌株中にこのプラ スミドを入れることによって上記遺伝子を有する産生菌株から出発して得られる 。このことを次の工程で示す： １．ＰＣＲ（Vent- ポリメラーゼ）を用いて遺伝子を増幅 メラードを有するＰＣＲで増幅する。 ２．プラスミド（酵素 Sma Iを有する平滑末端）中に遺伝子をクローニングする 。大腸菌ＤＨ５α中で増殖。 した後、遺伝子を夫々ベクターｐＵＣ１８で連結（結合）する。このベクターを 予め Sma I（制限酵素）で加水分解して、平滑末端(blunt-end)切断する。連結 されたベクターをＤＮＡ- 取込みに用意された菌株大腸菌ＤＨ５α中で形質転換 し、細胞を固形栄養培地上で増殖する。 ）を単離し、上述のように新たに増殖する。 ３．遺伝子を発現ベクターｐＴ７−６中でＥｃｏＲＩ及びＢａｒｎＨＩフラグメ ントによってクローニングする。 大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中で増殖。 伝子ｒｆｂＭ又はｒｆｂＫ）を単離し、酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｒｎＨＩで加水 分解する。同様に発現ベクターｐＴ７−６を酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｒｎＨＩで 加水分解する。 - 取込みに用意された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の株をこれらのベクターでそれ ぞれ形質転換する。形質転換細胞を固形栄養培地上で増殖する。 として夫々の遺伝子を有する、夫々のプラスミドを単離し、加水分解する。 以下に、本発明を詳細にかつ特別の実施態様によって説明する。 活性化された糖、特にＧＤＰ- α -Ｄ- マンノースのバイオ合成は、生体内で ６- リン酸）をホスホムターゼ（ＥＣ５．４．）、特にこの場合ホスホムターゼ （ＥＣ５．４．２．８）を用いて糖 -１- リン酸へ変換する。 マンノース -６- リン酸 マンノース -１- ホスフアート（Ｉ） ＥＣ２．７．７）−、特にこの際ＧＤＰ- α−マンノース- ピロホスホリラーゼ （ＥＣ２．７．７．１３）は、糖 -１- リン酸上で無機ピロリン酸の遊離下にヌ クレオシド三リン酸のヌクレオチジル基の転移を触媒する（Feingold及びBarber ，1990，Methodsin Plant Biochem．2，39-78参照）、特に次の反応（II）下に 行われる。 マンノース -１- リン酸＋ＧＴＰ ＧＤＰ- マンノース＋ＰＰｉ（II） か（たとえば Ginsberg，V．(1964)，Adv．Enzymol．26，35-88参照）又は他の 第二活性化された糖、特にこの場合はＧＤＰ- β -Ｌ- フコースの合成のために 供給する(Yamamoto，K.，1982，Agric．Biol．Chem．48，823-824 及び 1993，A rch．Biochem．Biophys．300，694-698). 化学合成はしばしば困難であり、収率が低いので、酵素合成が常に適用される 。 ホスホマンノムターゼ（ＥＣ５−４．２．８）及びＧＤＰ- マンノース- ピロ ポスホリラーゼ（ＥＣ２．７．７．１３）は、従来種々の起源から検出される。 ＧＤＰ- マンノース- ピロホスホリラーゼは１９５６年に初めて Munch-Peterse n によってベーカー(Baecker)-酵母から一部単離されている。この際使用可能な 酵素の量は酵母充填量に応じて著しく変化する（Munch-Petersen，1956，Aeta C hem．Scand．10，928）。酵素は１９６２年に Preiss 及び Wood によってアン トロバクター(Anthrobacter)sp．から単離されている(J．Biol．Chem．239(10), 3119-3126)。しかしこの著者は、多くの変換され、活性化された糖が他のピロホ スホリラーゼ副反応に戻らないことを知らなかった。シュードモナスアエルギノ ーサ（緑膿菌）及びロドスピリル ムルブルム(Rhodospirillum rubrum)中に二 官能性酵素、すなわちホスホマンノース- イソメラーゼ- 活性を有するＧＤＰ- マンノース- ピロポスポリラーゼが見い出された(Shinabarger 等、1991，J. Bi ol．Chem．266(4)，2080-2088 及び Ideguchi 等、1993，Biochimica et Biophy s．Acta 1172，329-331)。真核生物源からもＧＤＰ- マンノース- ピロホスホリ ラーゼは単離される。(Szumilo等，1993，J．Biol．Chem．268(24)，17943-1795 0). 確認された活性、ＧＤＰ- クールコースへの変換（１００％）、ＩＤＰクール コースへの変換（７２％）及びＧＤＰ- マンノースへの変換（６１％）、むしろ ＧＤＰ- クールコース- ピロホスホリラーゼ(ＥＣ 2.7.7.34)が重要であること を推察させる。 ホスホマンノースムターゼ（ＥＣ 5.4.2.8）は従来アルギナートバイオ合成と 関連してしか考慮されない(Sa-correia等.，1987，J．Bacteriol．169，3224-32 31 及びGoldberg等，1993，J．Bacteriol．175(3)，1605-1611). ＧＤＰ−マンノースの酵素合成は、（Simon等，1990 J．Org．Chem．55，1834 -1841，Wong等，1993 WO 93/0820，Wong 等，1993 J．Org. Chem. 58, 3985-399 0及びPalanka 及びTurner,1993 J．Chem．Soc．PerKion Trans 23(1)，3017-302 2中に従来記載されている。この作用グループは、すべて Munch-Petersen 1956 によって記載された方法に従って、酵母から得られるたん白質調製に利用され、 前もって化学的に生成されたマンノース -１- リン酸から出発してＧＤＰ- マン ノースを合成する。 （産生）発現ベクター（プラスミド）（ｐＴ７−６、Navagen 社）中でクロー ニングし、（産生株）発現菌株大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ＰＬｙｓＳ（Novagen 社）中で形質転換（導入）して、ホスホマンノムターゼ及びＧＤＰ- マンノース - ピロホスホリラーゼを発生する。これらは本発明によれば従来公知の起源から のものよりも多量に得ることができる（表参照）。双方の酵素は、サルモネラエ ンテリカ(Salmonella enterica)、グループＢ〔以前はサルモネラティフィリウ ム(Salmonella typhimurium LT2)〕から由来する。遺伝子（ｒｆｂＭはＧＤＰ- マンノース- ピロホスホリラーゼをコードする；ｒｆｂＫはホスホマンノムター ゼをコードする。）はｒｆｂ- 遺伝子- クラスター中にあり、その構造及び配列 は Jiang 等、1991 Mol．Microbiol．５(3)，695-713によって説明されている 。 複製- 連鎖- 反応（ＰＣＲ）によって、遺伝子ｒｆｂＭ及びｒｆｂＫを複製（ 増幅）し、夫々ベクターｐＵＣ１８（Novagen 社）中でクローニングする。この ベクターから出発して、遺伝子ｒｆｂＭ及びｒｆｂＫ夫々を Novagen社の発現ベ クターｐＴ７−６中でクローニングし、夫々発現菌株大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３） ｐＬｙｓＳ中に導入（形質転換）する。挿入された遺伝子ｒｆｂＭを有するプラ スミドｐＴ７−６を、今後ｐＥＲＪ- １と呼ぶ。挿入された遺伝子ｒｆｂＫを有 するプラスミドｐＴ７〜６を、今後ｐＥＲＪ- ２と呼ぶ（図１〜３参照）。 遺伝子ｒｆｂＭ及びｒｆｂＫによってコードされたたん白質（ＧＤＰ- マンノ ース- ピロホスホリラーゼ及びホスホマンノムターゼ）の産生（発現）を、イソ プロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）（０．４ｍ）によって誘発し、０．０３ ｍＭリフアンピシンで増加させる（図４参照）。 ５０ｍＭトリス- ＨＣｌ- 緩衝液、ｐＨ８及び１５０ｍＭ ＫＣｌ中で細胞（ 大腸菌）の機械的分解し、遠心分離（１００００ｒｐｍで２分）して、たん白質 含有粗抽出物が得られる。この粗抽出物をアニオン交換体（Ｑ−セフアロースＦ Ｆ）上に負荷し、ＧＤＰ- マンノース- ピロホスホリラーゼを１５０ｍＭ ＫＣ ｌ及び４００ｍＭ ＫＣｌで段階的溶離によって生成する。溶離液に１Ｍ硫酸ア ンモニウム及び２０％グリセリン（Ｖ／Ｖ）を加え、フエニルセフアロースＦＦ 上に付与する。吸着後、酵素を５０ｍＭトリス- ＨＣｌ、ｐＨ８中で１Ｍ硫酸ア ンモニウムと０Ｍ硫酸アンモニウムの間の勾配によって、０．４Ｍと０．１Ｍ硫 酸アンモニウムの間で２０グリセリンによって溶離する。限外濾過し、５０ｍＭ トリス- ＨＣｌ（ｐＨ８、１５０ｍＭ ＫＣｌ）で緩衝した後、ＧＤＰ- マンノ ース- ピロホスホリラーゼをゲル濾過カラム上でクロマトグラフィー分離する。 限外濾過後、ＧＤＰ- マンノース- ピロホスホリラーゼに３Ｍ硫酸アンモニウ ムを加え、４０℃で貯蔵する。 ホスホマンノムターゼはＱセフアロースＦＦによって部分的に精製されなけれ ばならない。 ホスホマンノムターゼ及びＧＤＰ- ピロホスホリラーゼは単官能性酵素であり 、これは上記反応（Ｉ及びII）を触媒する。 双方の酵素を、次の反応式に従ってマンノースから出発してＧＤＰ- マンノース の酵素による合成に使用しなければならない： 反応１： ヘキソキナーゼ 反応２： ピルビン酸- キナーゼ 反応３： ホスホマンノムターゼ 反応４： ＧＤＰ- マンノース- ピロホスホリラーゼ 反応５： ピロホスフアターゼ 反応１及び２は、Palanca 及び Turner，1993，J．Chem．Soc．PerKin Trans. 1，3017-3022でマンノース -６- リン酸の生成のためにすでに使用されている。 生成されたＧＤＰ- マンノースを更にマンノシルトランスフエラーゼで多糖類 にその場で変換することができる。 ＧＤＰ- マンノース- ピロホスホリラーゼ- 活性を、ピロリン酸（ＰＰｉ）を 産生するヌクレオチジルトランスフエラーゼ（ＥＣ２．７）の測定のための、新 しく開発された連続的吸光光度テストで検出する。下記の方法で、基質（ノイラ ミン酸の場合糖 -１- リン酸又は糖及びヌクレオシド三リン酸）の前与によって 酵素テスト（ヌクレオチジルトランスフエラーゼ基質スクリーニング検定法“ ＮＵＳＳＡ”）は、ヌクレオチジルトランスフエラーゼ- 反応（ＥＣ２．７- ７ ）で生じるピロリン酸をピロリン酸- 依存性ホスホフクトキナーゼ（植物又は微 生物からのＰＰ_iＰＦＫ ＥＣ２．７．１．９０）と共にフルクトース -６- リ ン酸とフルクトース -２，６- 二リン酸の存在下に反応させて、フルクトース - 1,６- 二リン酸とすることに基づく。この生成物をアルドラーゼでジヒドロキシ アセトンリン酸（ＤＨＡＰ）及びグリセリン -３- リン酸（ＧＡＰ）に分解する 。グリセリンアルデヒド -３- リン酸から、ジヒドロキシアセトンリン酸がトリ オースリン酸イソメラーゼによって生成する。最後にジヒドロキシアセトンリン 酸をグリセリン -３- リン酸- デヒドロゲナーゼによってＮＡＤＨで還元して、 グリセリン -３- リン酸とする。ピロリン酸モルあたりＮＡＤＨ２モルを使用し 、これは吸光光度測定によって追跡することができる。 （１）ＧＤＰ- マンノース- ピロホスホリラーゼ （２）ピロリン酸- 依存性ホスホフルクトキナーゼ （３）アルドース （４）トリオースリン酸- イソメラーゼ （５）グリセリン -３- リン酸- デヒドロゲナーゼ 次の例で本発明を詳細に説明する。その際記載された図に関係する。それは次 の通りである： 図１：クローニング工程 図２：発現ベクターｐＥＲＪ- １ 図３：発現ベクターｐＥＲＪ- ２ 図４：ｐＥＲＪ- １及びｐＥＲＪ- ２の発現された遺伝子生成物のＳＤＳ- ゲル 電気泳動 図５：分子量測定のためのゲル濾過クロマドクラフィー 図６：４℃でＧＤＰ- Ｍａｎ- ピロホスホリラーゼの安定性 図７：ＧＴＰの基質過剰阻害 図８：Ｍ -１- Ｐの基質過剰阻害 図９：ＧＴＰに対するＧＤＰ- Ｍａｎの競合阻止 図10：Ｍ -１- Ｐに対するＧＤＰ- Ｍａｎの非競合阻止 図11：ＧＤＰ- マンノースの合成にｐＨ- 値の影響 図12：ＧＤＰ- マンノース合成の酵素濃度依存 図13：マンノース -１- リン酸及びＧＴＰから出発するＧＤＰ- Ｍａｎの合成の ためのＥ^*ｔ^-曲線 図14：マンノースから出発するＧＤＰ- マンノースのバイオ合成反応式 図15：５ｍＭマンノースから出発してＧＤＰ- マンノースの合成 図16：生成されたＧＤＰ- マンノースの毛管電気泳動- クロマトグラフィー 例１ サルモネラエンテリカのｒｆｂ- 遺伝子クラスターから遺伝子ｒｆｂＭ及びｒｆ ｂＫをクローニング グループＢ． ＤＮＡ- データバンクによってｒｆｂ- 遺伝子クラスター中の遺伝子ｒｆｂＭ 及びｒｆｂＫを同定し、読み枠(Leseraster)を決定する。 ｒｆｂＭ：ＧＤＰ- α -Ｄ- マンノース- ピロホスホリラーゼ（ＥＤ２．７．７ ．１３）をコードする。 Ｂｐ中の長さ：１７３８６−１８８３１：１４４５塩基対 開始コドン １７３８６ 停止コドン ＴＡＡ ＴＡＧ １８８３１ リボソーム結合部位 ＡＡＡ ＡＧＡ ＧＡＴ ＡＡ ｒｆｂＫはホスホマンノムコーゼ（ＥＤ５．４．２．８）をコードする。 Ｂｐ中の長さ：１８８１２−２０２４５：１４３３塩基対 開始コドン： ＡＴＧ １８８１２ 停止コドン： ＴＡＡ ２０２４５ リボソーム結合部位： ＧＡＡ ＧＧＡ ＧＴＧ ＧＡ 試験管内増幅で、双方の遺伝子に対する次のオリゴヌクレオチドプライマーを決 定する。 ｒｆｂ Ｍ： プライマー１：（ｒｆｂ Ｍ１）５'-ＣＴＴ ＧＧＧ ＴＴＡ ＤＡＡ ＡＴＴ ＡＧＧ ＣＡ- ３' プライマー２：（ｒｆｂ Ｍ２）３'-ＡＴＣ ＴＴＴ ＴＡＣ ＡＡＧ ＡＣＣ ＧＣＧ ＡＧ- ５' ｒｆｂ Ｋ： プライマー１：（ｒｆｂ Ｋ１）５'-ＣＣＣ ＣＣＴ ＧＡＡ ＧＴＴ ＡＡＴ ＴＧＡ ＧＡ- ３' プライマー２：（ｒｆｂ Ｋ２）３'-ＣＣＡ ＴＴＴ ＡＡＴ ＣＣＴ ＣＡＣ ＣＣＴ ＣＴ- ５' その際遺伝子の長さはｒｆｂＭに対して１６３３Ｂｐ上で、ｒｆｂＫに対して１ ６０６Ｂｐ上で増加する。 ＰＣＲを次の様に行う： 調製物上に夫々７０μｌ鉱油を入れ、希釈されるのを防ぐ。Vent- ポリメラー ゼ- 緩衝液（Biolabs,ニューイングランド）（１０ｘ） ２００ｍＭトリス- ＨＣｌ、ｐＨ８．８、１００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ（Ｎ Ｈ₄）₂ＳＯ₄、２０ｍＭ ＭｇＳＯ₄、１％トリトンＸ１００（ｗ／ｖ）ＰＣＲの 行程条件を次の様に選ぶ： ５分 ９８℃ ２分 ９５℃ ６回くり返す ３０秒 ４９℃ ９０秒 ７２℃ １分 ９５℃ ４５秒 ４９℃ ２５回くり返す ９０秒 ７２℃ ２分 ７２℃ 冷却 ＰＣＲ後、増幅された遺伝子、夫々１．６ｋＢ、を Lau及び Sheu，1992Meth ．Mol．Cell．Biol．3，190-192、に従ってアガロース- ゲルから単離し、 夫々介助ベクターｐＵＣ_i８中に連結する。このベクターは前もって制限酵素Ｓ ｍａＩによって平滑末端で切断されている。ベクターとＤＮＡ- フラグメントの 比は約１：４である。連結を一晩１４℃で実施する。 リガーゼ- 緩衝液(10x)：０．５Ｍトリス- ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１００ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１００ｍＭ ＤＴＴ、５００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ 挿入された遺伝子を有するこのベクターを大腸菌ＤＨ５αの感応細胞(Hanahan 1983 J．Mol-Biol．166，557-580)中で転質転換する。更に、連結調製物５μｌ 及び滅菌Ｈ₂Ｏ１５μｌ滅菌Ｈ₂Ｏに氷上で解凍された感応細胞夫々２００μｌを 加え、３０分間氷上で培養する。次いで調製物を４０秒間４２℃に加熱し、再び ２分間氷上に置く。次いで調製物にＳＯＣ- 培地８００μｌを加え、これを１時 間３７℃で培養し、次いでＸ- Ｃａｌで被覆されたＬＢ_Amp-100-寒天- プレート 上に塗布する。 ＳＯＣ- 培地：ｐＨ７、２０ｇトリプトン、５ｇ酵母抽出物、０．５ｇＮａＣｌ 、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２０ｍＭ（滅菌された）グルコ ース、Ｈ₂Ｏ、１０００ｍｌ^Lb ＡＭＰ- １００：１０ｇトリプトン、５ｇ酵母抽出物、５ｇ ＮａＣｌ（及び １５ｇ Bacto- 寒天）アンピシリン１００ｍｇ／ｌ Ｘ- Ｇａｌ：５- ブロモ -４- クロロ- インドリル -β -Ｄ- ガラクトース寒天 プレートあたり（４０ｍｇ／ｍｌ）７０μｌ 陽性無色コロニーから、プラスミドｐＵＣ１８／ｒｆｂＭ又はｒｆｂＫを単離 する(Birnboim 及び Doly，1979)。 ｐＵＣ１８／ｒｆｂＭを、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨ Ｉで切断し、遺 伝子ｒｆｂＭをベクターから切断する。アガロースゲルから遺伝子ｒｆｂＭ及び ｒｆｂＫを単離し、発現ベクター（ｐＴ７−６）中に連結する。 連結調製物（ｐＴ７−６／ｒｆｂＭ及びｒｆｂＫ）を感応細胞（Cohen，Shng 及び Hsu，1972 Proc．Nat．Acad．Sci．（USA）69(8)，2110-2114）中で、すな わちｒｆｂＭの場合、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Novagen 社及びｒ ｆｂＫの場合、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中で形質転換する。 ｐＴ７−６中に挿入された遺伝子ｒｆｂＭを有する菌株は、以下大腸菌ＢＬ２ １（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳｐＥＲＪ- １と呼ぶ。 遺伝子ｒｆｂＭ及びｒｆｂＫの発現を次の様に行う： 大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳｐＥＲＪ- １（５ｍｌ ＬＢ_{Amp-Chliramp -50} （アンピシリン及びクロラムフエニコール夫々５０ｍｇ／ｌ）一晩１２０ｒ ｐｍ及び３７℃で）予備培養液から主培養液（１０ｍｌ）２％を植菌し、０．５ の光学光度（５４６ｎｍで）が達成されるまで、Schikanen を有するエルレンマ イヤーフラスコ中で３７℃及び１２０ｒｐｍで振とう器上で増殖する。培養液１ ｍｌを採取し、遠心分離し、上澄液を除去し、ペレットにサンプル緩衝液（ＳＤ Ｓ及びβ- メルタプトエタノール- 含有）５０μｌを加える。このサンプルを３ 分９５℃で加熱し、冷却後ＳＤＳ- ポリアクリルアミドゲル（下記の方法）上に 加える。 培養液の残りに０．４ｍＭ ＩＰＴＧを加え、２０分インキュベートし、その後 再び１ｍｌを採取し、上述の様に処理する。培養液の残りに０．０３ｍＭリフア ンピシンを加え、６０分インキュベートする。１ｍｌを採取し、上述の様に処理 する。このサンプルから夫々１０μｌをＳＤＳ- ポリアクリルアミドゲル上に塗 布する。 大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＥＲＪ- ２を上述の様に増殖する。 ＳＤＳ- ポリアクリルアミドゲル電気泳動を、(Laemmli，1970，Nature 227， 680-685)に従って行う。コマシー(Coomassie)ブリリアントブルーに呈色したゲ ルの写真は図４に示される。 大腸菌ＢＬ２１からＧＤＰ- マンノース- ピロホスホリラーゼを単離３７℃で 振とう器中で１２０ｒｐｍで大腸菌ＢＬ２１の増殖及び細胞の崩壊： 予備培養(Schikanenを有するエルレンマイヤーフラスコ１０００ｍｌ中で一晩 - 培養）から出発して、夫々２ｌＬＢ_{Amp-chloramp-50}を５個の５ｌフラスコ(Sc hikanen１％を有する）中に植菌し、光学密度０．８まで培養液を増殖する（３ ．５時間）。０．４ｍＭ ＩＰＴＧと共に２０分培養した後、培養液を遠心分離 し(Sorvall ＧＳ３，８０００ｒｐｍ，１０分，２０℃)、５０ｍＭトリス- Ｈ Ｃｌ、ｐＨ８で２回洗滌する。次いで水分量を測定し（約２５ｇ）、２０％（ｗ ／ｖ）細胞懸濁液を生成する。次いで細胞を崩壊機Ｓ中で湿性粉砕によって崩壊 する。更に細胞懸濁液４０ｇとビーズ（直径０．３ｍｍ）８０ｇを混合し、１２ 分以内で４０００Ｕｐｍで均質化する。細胞断片及びビーズを１５分の遠心分離 (Sorvall ＧＳＡ，１００００ｒｐｍ，２０℃)によって分離し、１回５０ｍＭ トリス- ＨＣｌ、ｐＨ８で洗滌し、再び遠心分離し、上澄みを一緒にし、Ｑ- セ フアロースＦＦによるアニオン交換クロマトグラフィーのための粗抽出物が生成 する。 Ｑ- セフアロースＦＦ Ｑ- セフアロースＦＦ４００ｍｌに粗抽出物（たん白質１１．１ｍｇ／ｍｌ含 有）２２６ｍｌを負荷する。段階溶離を約８００ｍｌ ５０ｍＭトリス- ＨＣｌ 、ｐＨ８及び約１４００ｍｌ ５０ｍＭトリス- ＨＣｌ、ｐＨ８（１５０ｍＭ ＫＣｌ含有）によって開始する。酵素を約９００ｍｌ ５０ｍＭトリス- ＨＣｌ 、ｐＨ８（４００ｍＭ ＫＣｌ含有）で溶離する。この分画に１Ｍ硫酸アンモニ ウム及び２０％グリセリンを加え、フエニル- セフアロースＦＦ（６６ｍｌ）上 に負荷する。酵素を０Ｍ硫酸アンモニウムに対する５０ｍＭトリス- ＨＣｌ、ｐ Ｈ８（２０％グリセリン含有）（全容量１０００ｍｌ）の線形勾配によって溶離 する。０．４Ｍと０．１Ｍ硫酸アンモニウム濃度の間で最も活性な分画を集め、 限外濾過後、再緩衝し（５０ｍＭトリス- ＨＣｌ、ｐＨ８、１５０ｍＭ ＫＣｌ ）、次いでゲル濾過カラム(Superdex Ｇ- ７５)中でクロマトグラフィー分離す る（次表４参照）。 組換え体ＧＤＰ- マンノース- ピロホスホリラーゼは大腸菌から６．３倍強化 される。収率１３．５％で比活性２．３４Ｕ／ｍｇが得られる。０．３７Ｕ／ｍ ｇからＱ- セフアロースによって精製フアクター２が収率８５％で得られる。フ エニルセフアロースによる次の疎水性相互作用クロマトグラフィーは、最も活性 な分画のみの合併によって比活性が２．２７Ｕ／ｍｇに上昇すると共に比較的高 い損失４０％を生じる。 ＧＤＰ- マンノース- ピロホスホリラーゼの分子量は変性条件（ＳＤＳ- ポリ アクリルアミド- ゲル電気泳動）下で５４ＫＤである。自然の状態での分子量測 定のために、上記精製からの酵素サンプル２ｍｌ（７．５４ｍｇ／ｍｌ）を用い てセフアデックスＧ- ２００（１１５．５ｍｌ）でゲル濾過を行う。活性測定を 、ピロホスホリラーゼに関する下記の本発明の酵素テストによって行う。活性最 大２が測定され、これは分子量２０８７００ダルトン及び１０７８００ダルトン に相当する。したがって自然の状態で酵素が二量体又は四量体として存在する。 ＧＤＰ- α -Ｄ- マンノース- ピロホスホリラーゼの作用- 及び使用試験を次 の様に行う： １）安定性試験 酵素を４℃で貯蔵安定性について調べる。 酵素調製物（１．１５Ｕ／ｍｇ）に安定剤無添加及び０．１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ 、又は３Ｍ硫酸アンモニウム、又は２５％グリセリンを加え、４７日間４℃でイ ンキュベートする。４７日後、安定剤不含及びＢＳＡ含有調製物中に約５％の残 存活性が見い出され、一方グリセリン及び硫酸アンモニウム含有調製物は７５％ 又は６５％の活性をまだ有する。硫酸アンモニウム含有調製物は４ケ月後まだ５ ０％出発活性の活性が認められる（図６）。 更に、安定性を３０℃で調べる。この際酵素（７９．３ｍＵ／ｍｇ）の限定さ れた菌溶液を３０℃で５０ｍＭトリス- ＨＣｌ、ｐＨ８、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂中 でインキュベートし、種々の時間（０，２，６及び３０時間）後、活性測定を行 う。 ＮＵＳＳＡ ２ｍＭ ＧＴＰ及び０．０８ｍＭ Ｍ -１- Ｐを有するＮＵＳＳＡ あたりの活性測定 ２）基質ＧＴＰ及びマンノース -ｉ- リン酸（Ｍ -１- Ｐ）に関するＫ_m- 及び Ｖ_maxの測定。 条件：ゲル濾過後の２．２７μｇ／μｌ ＧＤＰ- マンノース- ピロホスホリラ ーゼ調製物、ＮＵＳＳＡあたりの活性測定 ａ）ＧＴＰ- マンノース -１- リン酸に関するＫ_m- 値及びＶ_max- 値の測定を定 数０．０８ｍＭで開始する。ＧＴＰを０．０１ｍＭと１０ｍＭの間で使用する（ 図７）。 ｂ）Ｍ -１- Ｐ ＧＴＰに関するＫ_m- 値及びＶ_max- 値の測定を定数２ｍＭで開 始する。マンノース -１- リン酸を０．００２ｍＭと０．６ｍＭの間で変化させ る（図８）。 ３）合成へのＧＤＰ- マンノースの影響 条件：ゲル濾過後、２．２７μｇ／ｍｌ〔ａ）に於て〕及び５．６７μｇ／ｍｌ 〔ｂ）に於て〕ＧＤＰ- マンノース- ピロホスホリラーゼ- 調製物。ＮＵＳＳＡ あたりの活性測定。 ａ）マンノース -１- リン酸を、０．０８Ｍ定数で開始する。 ＧＴＰ- マンノースをＤＣＪで０μＭ、５０μＭ及び１００μＭで使用する。 測定された活性の評価は、ＧＴＰに対するＧＤＰ- マンノースの競合阻害を示す （図９）。 Ｋ_i- 値を計算して１．４９μＭとする。 ｂ）ＧＴＰをテストで２ｍＭ一定で使用する。 マンノース -１- リン酸を、０．００３ｍＭと０．３ｍＭとの間で変化させる 。測定された活性の評価は、Ｍ -１- Ｐに対するＧＤＰ- マンノースの非競合阻 害を示す（図１０）。Ｋ_i- 値を計算して１１８μＭとする。 ４）ＧＤＰ- マンノース- ピロホスホリラーゼの基質スペクトル 条件：ＧＤＰ- マンノース- ピロホスホリラーゼを酵素テストＮＵＳＳＡで７． ３ｍＵ／ｍｇで使用する。 ａ）ヌクレオシド三リン酸：ＡＴＰ，ＣＴＰ，ＧＴＰ，ＵＴＰ，ｄＴＴＰ夫々１ ｍＭ糖 -１- リン酸：マンノース -１- リン酸（２．５ｍＭ）。 ｂ）ヌクレオシド三リン酸： 糖 -１- リン酸：グルコース -１- Ｐ、Ｎ- アセチルグルコサミン -１- Ｐ、 グルコサミン -１- Ｐ、ガラクトース -１- Ｐ、ガラクトサミン -１- Ｐ、Ｎ- アセチルガチクトサミン -１- Ｐ、グルクロン酸 -１- Ｐ、ガラクトロン酸 -１ - Ｐ、キシロース -１- Ｐ、マンノース -１- Ｐ。 ａ）及びｂ）に於て、自然基質ＧＴＰ及びマンノース -１- リン酸を用いる 以外は変換は認められない。 ５）ＧＤＰ- マンノース- ピロホスホリラーゼを、ＧＤＰ- マンノースの合成に 使用 合成を、反応式１に従ってマンノースから出発して行わねばならない。 先ず、この際ＧＤＰ- マンノース- ピロホスホリラーゼをピロホスフアターゼ とカップリングさせる（１Ｕ／ｍｌ）。 合成を、種々のｐＨ値（７，８，９）で５０ｍＭトリス- ＨＣｌ、５ｍＭ Ｍ ｇＣｌ₂（２ｍＭ ＧＴＰ及び２ｍＭマンノース -１- リン酸含有）中、２ｍｌ の総容量で室温で行う。ＧＤＰ- マンノース- ピロホスホリラーゼを０．０４Ｕ ／ｍｌで使用し、ピロリン酸は１Ｕ／ｍｌである。種々の時間後、調製物から２ ００μｌを採取し、５分９５℃で加熱し、遠心分離し（エッペンドルフ- 遠心機 、１００００ｒｑｍ、２分、室温）、毛管電気泳動によって分析する。 較正曲線及び面積の比較によってＧＴＰ及びＧＤＰ- マンノースの含有量を測 定する。変換は、ＧＤＰ- マンノースのより高い収率をアルカリ性ｐＨ- 値で示 す（図１１）。他の介助酵素（反応式１：ヘキソキナーゼ及びピルビン酸キナー ゼ）がｐＨ９の間でｐＨ- 最適値を有するので（ベーリンガーマンハイム、1987 Boichemica-Information）、他の合成に対して８のｐＨ- 値が選ばれる。 以下にＧＤＰ- マンノース合成のＧＤＰ- マンノース- ピロホスホリラーゼの インキュベーション時間及び酵素濃度の増加でＧＤＰ- マンノースの高められた 収率を示す（図１２）。インキュベーション時間と共に酵素濃度の増加は、反応 定数を生じる（Ｅ^*ｔ）。酵素濃度又はインキュベーション時間の変化と共に、 Ｅ^*ｔ^-生成物の定数維持下で一定収率が得られる。２０（Ｕ^*分／ｍｌ）のＥ^*ｔ で、反応平衡を選ばれた条件下で調整し、約９０％のＧＤＰ- マンノースの収率 が得られる（図１３）。 例 II ヌクレオチジルトラスフエラーゼ基質スクリーニング検定法 （ＮＵＳＳＡ） （１）ピロホスホリラーゼ、（２）ピロリン酸依存性ホスホフルクトキナーゼ、 （３）アルドラーゼ、（４）トリオースリン酸- イソメラーゼ、（５）グリセリ ン -３- リン酸- デヒドロゲナーゼ、 ＮＴＰ：ヌクレオシド三リン酸／ＮＤＰ：ヌクレオシド二リン酸／ＤＨＡＰ：ジ ヒドロキシアセトン- リン酸／ＧＡＰ：グリセリンアルデヒド -３- リン酸／Ｇ -３- Ｐ：グリセリン -３- リン酸／ＮＡＤ：ニコチン酸アミドアデノシン二リ ン酸、還元された形 O'Brien，Bowien 及び Wood，1975 in J．Biol．Chem．250(22)，8690-8695に は、ピロリン酸依存性ホスホフルクトキナーゼ（ＰＰｉＰＦＫ）の測定のための 吸光光度酵素テストが記載され、たとえばそれは Reeves 等、1974J．Biol．Che m．249，7737-7741 によって初めて Entamoeba histolytica中に開示されている 。この際ＰＰｉＰＦＫをアルドースの反応（反応３）、トリオースリン酸イソメ ラーゼ（反応４）及びグリセリン -３- リン酸- デヒドロゲナーゼ（反応５）と 連結する。反応を吸光光度により３４０ｎｍで追跡する。 次の酵素テスト（ＮＵＳＳＡ）は、本発明に従ってこのテストシステムを含む ヌクレオチジルハランスフエラーゼの反応と連結され、したがって残存するピロ ホスホリラーゼ又は残存するピロリン酸- 遊離酵素の測定を可能にする。テスト ＮＵＳＳＡを、２００μｌ総容量でマイクロ滴定プレートでの測定に最善の状態 にする。 総容量は２００μｌである。調製物を、Titertek-Photometer Molecular Devi ces（ミュンヘン）で吸光光度により測定する。ＰＰｉ- ＰＦＫ- テストの場合 、ＰＰｉで開始し、ピロホスホリラーゼの場合、選択的に糖 -１- リン酸又はヌ クレオシド三リン酸で開始する。 活性を算出するために、次式を使用する： 酵素テストＮＵＳＳＡの使用 １）上記例参照：ＧＤＰ- マンノース- ピロホスホリラーゼの活性測定。 ２）例：２種の酵素源でピロホシドホリラーゼに対するスクリーニングＮＵＳＳ Ａの使用： ａ）大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳｐＥＲＪ- １ ｂ）米（Oryza sativa L.） テストを使用するために、ＰＰｉＰＦＫを精製しなければならない。簡単かつ 良好に適用できる酵素源としてジャガイモ(Solanum tuberosum L.)を選ぶ。精製 をvan Schaftingen 等、1982 Eur．J．Biocnem．129，191-195の方法に従って行 う。酵素（ＰＰｉＰＦＫ）を２５％グリセリン中で−２０℃で保存する。 大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳｐＥＲＪ- １を上述の様に増殖し、崩壊 する。得られた粗ホモジナートを１００００ｒｐｍ、２分、２０℃で遠心分離し 、酵素テストに使用する（２１．０２ｍｇ／ｍｌ）。米を Falling，１９９３， ドイツ特許第４２２１５９５号明細書の記載に従って崩壊し、１００００ｒｐｍ 、１０分２０℃で遠心分離し、粗抽出物（４．２６ｍｇ／ｍｌ）として酵素スク リーンニングで使用する。基質としてテストする： ａ）ヌクレオシド三リン酸：グルコース１- リン酸（２５ｍＭ）とのテストで夫 々１ｍＭのＡＴＰ，ＣＴＰ，ＧＴＰ，ＵＴＰ，ｄＴＴＰ ｂ）テストで夫々２．５ｍＭのヌクレオシド三リン酸（１ｍＭ）、糖 -１- リン 酸。 表７中に、微生物- 及び真核細胞酵素源中でピロホスホリラーゼの非活性を示 す。 テスト調製物中２０μｇ／ｍｌ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ- ｐＪＥＲ -１- 粗抽出物、テスト調製物中１．０６μｇ／ｍｌないし０．１４ｍｇ／ｍｌ Oryza sativa- 粗抽出物。ＮＵＳＳＡによる活性測定 ＧＤＰ- マンノースの合成を分析するために、毛管電気泳動（装置：BecKman 社）を使用する。方法としてホウ酸緩衝システムを有する毛管電気泳〃を使用す る。この際０．４ｍＭホウ酸４０ｍｌ及び０．１ｍＭホウ酸ナトリウム２０ｍｌ を混合し、Ｈ₂Ｏ１４０ｍｌで満たす。この割合で混合し、ｐＨ- 値約８．３を 調整する。流動電流を２５ｋＶに選択する。電流は約３５〜７μＡに調整する。 電気泳動図から濃度を決定するために、５０ｍＭトリス- ＨＣｌ、ｐＨ８（５ｍ Ｍ ＭｇＣｌ₂含有）中でＧＤＰ- マンノース及びＧＴＰの異なる０．０２ｍＭ と０．４ｍＭの間の濃度を定め、毛管電気泳動によって分析する。理論上使用さ れる濃度（ｍＭ）付近で表面にプロットしてから直線が生じ、それによって線状 退縮を行うことができる： ホスホマンノムターゼの単離大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）から大腸菌ＢＬ２１の増 殖及び細胞の崩壊： ＧＤＰ- マンノース- ピロホスホリラーゼに於ける様に１２０ｒｐｍで。得ら れた粗生成物をアニオン交換体に加える： Ｑ- セフアロースＦＦ： Ｑ- セフアロースＦＦ７７ｍｌを粗抽出物（たん白質含有１４ｍｇ／ｍｌ）で 負荷する。線状に増加する勾配（５０ｍＭハリス- ＨＣｌ、ｐＨ８、０- ６００ ｍＭ ＫＣｌ）を使用して、たん白質を２８０〜４６０ｍＭ ＫＣｌで溶離する 。活性な分画を一緒にし、たん白質を３Ｍ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄で沈澱する。遠心分 離（１５分、１００００ｒｐｍ、４０Ｃ）後、ペレットを５ｍｌトリス- ＨＣｌ 、ｐＨ８中に取る。酵素が純度フエクター２．４及び収率７８％で得られる。 マンノースから出発するＧＤＰ- α- Ｄ- マンノースの酵素合成 ＧＤＰ- マンノースの酵素合成（図１４）は、マンノースから出発してＣ６を ヘキソキナーゼ触媒されたリン酸化し、マンノース -６- リン酸をホスホマンノ ムターゼによって異性化してマンノース -１- リン酸とし、マンノース -１- リ ン酸をＧＴＰで、ＧＤＰ- マンノース- ピロホスホリラーゼによってＧＤＰ- マ ンノースに変換して進行する。 使用されるＡＴＰを循環する。その際ヘキソキナーゼ反応で生じるＡＤＰをホ スホエノールピルビン酸でピルビン酸- キナーゼによる触媒下にＡＴＰ及びピル ビン酸に変換する(Wong等、1995，Angen．Chem．107，569-593)（図１５）。 より大きな規模での合成を、“くり返しバッチ法”で実施する。合成調製物の 総容量は８０ｍｌである。次の表に、合成調製物の組成を示す： ＰＭＭ：ホスホマンノムターゼ；ＰＰａｓｅ：ピロホスフアターゼ；ＧＤＰＭ- ＰＰ：ＧＤＰ -α- Ｄ- マンノース- ピロホスホリラーゼ ２４時間後、調製物を限外濾過ＹＭ１０- 膜（１０ＫＤの切片）(Amicon 社) によって５ｍｌに蒸発し、５０ｍＭトリス- ＨＣｌ、ｐＨ８、１０ｍＭ ＫＣｌ 、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂で５０ｍｌに満たし、再び蒸発し、新たに満たし、５ｍ ｌに蒸発する。たん白質含有レテンタート(Retentat)に、新たに合成調製物のた めに基質溶液（７５ｍｌ）を加え、新たに２４時間インキュベートする。この処 理法を更に数回くり返す。 濾液にアルカリ性ホスフアターゼ（１Ｕ／ｍｌ）を加え、２４時間インキュベ ートし、ヌクレオシド一、二及び三リン酸又は糖- リン酸、たとえばマンノース -６- リン酸又は１- リン酸を脱リン酸する。活性糖はホスフアターゼによって 攻撃されない。 全体として３回２５３ｍｇ（０．４ｍｍｏｌ）ＧＴＰと２１６．３ｍｇマンノ ースを反応させる。収率の検査を夫々２４時間後に行う： これは、遊離酸（６０５．３ｇ／モル）に対してＧＤＰ- マンノース５８／ｍ ｇに相当する。 アルカリ性ホスフアターゼと共にインキュベートした後、調製物を限外濾過し 、一緒にし、アニオン交換 Dowex（登録商標）１×２Ｃｌ^-，（Serva）上に加え る。 ＧＤＰ- マンノースを、０と０．５Ｍ ＬｉＣｌ（５００ｍｌ）（１Ｍ Ｌｉ Ｃｌ含有）の間の線形勾配に従って溶離する。ＧＤＰ- マンノース含有溶液（９ ００ｍｌ、０．９２ｍＭ ＧＤＰ- マンノース含有）を回転蒸発器によって蒸発 する。この分画をセフアデックスＧ−１０によってゲル濾過し、次いでＧＤＰ- マンノース含有分画を凍結乾燥する。凍結乾燥物を少量の水に溶解し、氷冷され たアセトンを加える。沈澱したＧＤＰ- マンノースを濾過し、水中に取り、凍結 乾燥し、毛管電気泳動によって較正曲線と表面を比較して分析する。図１６に比 希 釈センプルの電気泳動図を示す（１ｍｇ凍結乾燥物／ｍｌ水）。 全体で、ＧＤＰ- マンノース１９９ｍｇが凍結乾燥物５００ｍｇ中に得ること ができる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年５月２０日 【補正内容】 １．ＧＤＰ- マンノースを生成する方法に於て、ホスホノマンノムターゼ- 又は ＧＤＰ- マンノース- ピロホスホリラーゼ-（ＧＤＰ- Ｍａｎ- ＰＰ）遺伝子発 現は微生物中で高められることを特徴とする上記方法。 ２．ホスホマンノムターゼ-(ｒｆｂＫ)又はＧＤＰ- Ｍａｎ- ＰＰ（ｒｆｂＭ-） 遺伝子発現が、ｒｆｂＫ- 又はｒｆｂＭ- 遺伝子複写数の増加によって高められ る、請求の範囲１記載の方法。 ３．遺伝子複写数の増加のために、ｒｆｂＫ- 又はｒｆｂＭ- 遺伝子を遺伝子構 造中に組込む、請求の範囲２記載の方法。 ４．微生物をｒｆｂＫ- 又はｒｆｂＭ- 遺伝子を有する遺伝子構造で形質転換す る、請求の範囲３記載の方法。 ５．大腸菌株をｒｆｂＫ- 又はｒｆｂＭ- 遺伝子を有する遺伝子構造で形質転換 する、請求の範囲４記載の方法。 ６．大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を遺伝子構造で形質転換する、請求の範囲５記載 の方法。 ７．遺伝子を微生物から単離する、請求の範囲１ないし６のいずれかに記載の方 法。 ８．遺伝子をサルモネラ・エンテリカ(Salmonella emterica)、グループＢから 単離する、請求の範囲７記載の方法。 ９．遺伝子発現の増加後、ホスホマンノムターゼ又はＧＤＰ- Ｍａｎ- ＰＰを単 離する、請求の範囲１ないし８のいずれかに記載の方法。 10．酵素を単離するために、組換え株の粗抽出物をアニオン交換体上に加える、 請求の範囲９記載の方法。 11．ＧＤＰ- Ｍａｎ- ＰＰを単離するために、アニオン交換体で段階的勾配- 溶 離を行い、酵素に富んだ分画からＧＤＰ- Ｍａｎ- ＰＰを直線降下する(ＮＨ₄)₂ ＳＯ₄-勾配を有する“疎水性相互作用クロマトグラフィー”（ＨＩＣ）によって 生成する、請求の範囲１０記載の方法。 12．遺伝子発現の増加後に生成するホスホマンノムターゼを、マンノース -６- リン酸のマンノース -１- リン酸への変換に使用する、請求の範囲１ないし１１ のいずれかに記載の方法。 13．遺伝子発現の増加後に生成されるＧＤＰ- Ｍａｎ- ＰＰをＧＴＰと共に、マ ンノース -１- リン酸のＧＤＰ- マンノースへの変換に使用する、請求の範囲１ ないし１２のいずれかに記載の方法。 14．微生物から単離されるＧＤＰ- Ｍａｎ- ＰＰマンノース- 又はマンノース誘 導体- 比活性＞２０Ｕ／ｍｇ 15．請求の範囲１ないし１０のいずれかに記載の方法で得られたホスホマンノム ターゼ。 16．過剰発現された形でホスホマンノムターゼ又はＧＤＰ- Ｍａｎ- ＰＰを有す る、形質転換された細胞。 17．大腸菌である、請求の範囲１６の形質転換された細胞。 18．大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）である、請求の範囲１７記載の形質転換された細 胞。 19．ピロリン酸を遊離する酵素によって生じるピロリン酸を、ピロリン酸依存性 ホスホフルクトキナーゼ、アルドラーゼ、トリオースリン酸- イソメラーゼ及び グリセリン -３- リン酸- デヒドロゲナーゼによって変換し、デヒドロゲナーゼ によって起こる還元を吸光光度によって測定することを特徴とする、吸光光度テ スト。 20．ピロリン酸を遊離するヌクレオチジルトランスフエラーゼを測定するための 、請求の範囲１９記載の吸光光度テスト。 21．ＧＤＰ- マンノース- ピロホスホリラーゼを測定するための、請求の範囲２ ０記載の吸光光度テスト。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 １９６０６６５１．４ (32)優先日 1996年２月23日 (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者 クラ・マリア−レジナ ドイツ連邦共和国、Ｄ−52382 ニーダー ツィール、ゼルゲンブッシュ、12 (72)発明者 フェルゼック・シュテファン ドイツ連邦共和国、Ｄ−42103 ヴュッペ ルタール、キプドルフ、５

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．微生物から単離される、マンノース- 又はマンノース誘導体- 特異性ＧＤＰ - マンノース- ピロホスホリラーゼ（ＧＤＰ- Ｍａｎ- ＰＰ）（比活性＞２０Ｕ ／ｍｇ）。 ２．細菌から由来する、請求の範囲１記載のＧＤＰ- マンノース- ピロホスホリ ラーゼ。 ３．ＧＤＰ- Ｍａｎ- ＰＰの生成のために組換えられた、酵素産生に関与する菌 株を適する培地中で培養し、得られた細胞を崩壊し、遠心分離によって得られた 粗抽出物を、アニオン交換体上に加え、段階的- 勾配溶離し、その酵素に富んだ 分画からＧＤＰ- Ｍａｎ- ＰＰを、直線降下する（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄-勾配を有する “疎水性相互作用クロマトグラフィー”（ＨＩＣ）によって生成することを特徴 とする、ＧＤＰ- Ｍａｎ- ＰＰの産生方法。 ４．ＧＤＰ- Ｍａｎ- ＰＰをコードした遺伝子ｒｆｂ Ｍをプラスミド中に挿入 し、このプラスミドを適する産生- 株中に入れることによって得られた組換え株 を使用する、請求の範囲３記載の方法。 ５．マンノース -１- リン酸を請求の範囲１記載のＧＤＰ- Ｍａｎ- ＰＰの存在 下にＧＴＰと酵素反応させることを特徴とする、ＧＤＰ- マンノースの生成方法 。 ６．マンノース -１- リン酸をホスホマンノムターゼを用いてマンノース -６- リン酸へ変換して生成することを特徴とする、請求の範囲５記載の方法。 ７．マンノース -１- リン酸中でマンノース -６- リン酸を変換することができ る、微生物由来のホスホノマンノムターゼ。 ８．ホスホマンノムターゼをコードした遺伝子ｒｆｂ Ｋをプラスミド中に挿入 し、このプラスミドを適する産生- 株中に入れることによって得られた組換え株 、特に細菌株から得られる、請求の範囲７記載のホスホマンノムターゼ。 ９．反応式２に従って５段階反応から成る吸光光度ヌクレオチジルトランスフエ ラーゼテストＮＵＳＳＡに於て、ＮＡＤＨを吸光光度により測定し、それに関連 してＮＡＤＨ消費２モルに相当する、変換されたＮＴＰ１モルが換算される、上 記テスト。