JPH11500921A - GDP−α−D−マンノースの酵素による生成方法、これに適する酵素及びその生成方法並びに酵素テスト - Google Patents
GDP−α−D−マンノースの酵素による生成方法、これに適する酵素及びその生成方法並びに酵素テストInfo
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Abstract
(57)【要約】
本発明はGDP- マンノース- ピロホスホリラーゼに関する。本発明の目的は経済的に妥当な費用で特にその単官能性のゆえにより長い時間にわたる連続多段階処理で問題を生じないGDP- マンノース- ピロホスホリラーゼを生成することにある。この目的のために、微生物から単離されるGDP- マンノース- ピロホスホリラーゼ(比活性>2U/mg)が生成される。
Description
【発明の詳細な説明】
GDP- α -D- マンノースの酵素による生成方法、これに適する酵素
及びその生成方法並びに酵素テスト
本発明の対象は、ヘキソース基に関して単官能性の新規GDP- マンノース-
れをGDP- マンノースの生成に使用する方法である。
GDP- マンノースは、グリコシルトランスフエラーゼによってオリゴ糖に変
換される、現在広い範囲にわたって研究されている活性化された糖に属する。更
に、これはGDP- フコースの生成の出発化合物である。
GDP- マンノース- ピロホスホリラーゼは、長い間知られている。これは種
々の起源から単離される。すなわち1964年にすでに Preiss 等(J.Biol.C
hem.239(1964)3119-26)にはアントロベクターsp.からの酵素の単離が報告
されている。D.Shinabarger等(J.Biol.Chem.266(1991)2080-88)には、ホ
スホマンノース- イソメラーゼ- 及びピロホスホリラーゼ- 活性を有するシュー
ドモナスアエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)(緑膿菌)からの多官能性G
DP- Man- PPの単離が記載されている。
哺乳動物- 腺から単離されたGDP- Man- PPは、GDPマンノース及び
GDP- グルコースの合成を触媒する。ブタ甲状腺から70,000倍純粋なCDP-
Man- PPが得られる。これは全くGDP- グルコース- 合成- 活性を示さな
い。
T.Szumilo等(J.Biol.Chem.268(1993)17943-50)にはブタ肝臓からGD
Pの単離及び5000- 倍の精製が報告されている。この際、肝臓1kgから多段階
精製で比活性9.25U/mgを有する酵素4mgが得られる。この酵素もCD
P- マンノース及びGDP- グルコースの生成を触媒する。
近頃、GDP- Man- PP- 源として主に酵母(S.cerevisiae)が使用され
、そして酵素は一般に特に精製されない(P.Wang 等、J.Org.Chem.58(1993
)3985-90)。WO93/0820 A1中に酵母からのGDP- Man- PPの精製について
報告されている。その方法によれば酵母細胞- 抽出物から分別される(NH4)2
SO4-沈澱によって及び透析によって活性0.1U/mlを有する酵素溶液が得
られる。要約すると、市場で入手できないGDP- Man- PPは極めて多大な
費用をかけて単離されるかあるいは全く又はほんの一部しか精製されない形で生
じることが確認され、この際一部多官能性の種々の形が存在する。
したがって本発明の目的は、経済的に妥当な費用で得られるGDP- Man-
PPにあり、これは特にその単官能性のゆえにより長い時間にわたる連続的多段
階処理に問題を生じない。
この目的にかなうGDP- Man- PPは請求の範囲1の記載に相当する。本
発明の他の要件は、従属項から明らかである。
GDP- Man- PPを微生物、たとえば酵母、B.subtilis-及び大腸菌株の
学修飾に適し、遺伝子工学的に操作されたそれ自体公知の種類のプラスミド中に
成し、この粗抽出物中に酵素がかなりの濃度ですでに存在するので、工業的規模
での後処理及び精製の費用は、全く僅かである。
次表に、種々の酵素源中に存在する酵素含有量(粗抽出物中)、後処理後に得
られる比活性(公知でない限り)及び得られた酵素の官能性を示す。
この表から単官能性(“マンノース- 特異性”)酵素に対して、本発明による
効果的な酵素源の供給が優れていることが明らかである。
これらの酵素を、GDP- マンノースを多量に得るために使用することができ
る。この際より安価なマンノース -6- リン酸から出発するのが有利であり、こ
れを先ずホスホマンノムターゼによってマンノース -1- リン酸に変える。
GDP- Man- PP及びホスホマンノムターゼは、特に、対応する遺伝子(
rfbM又はrfbK)をプラスミド中に挿入し、夫々の産生菌株中にこのプラ
スミドを入れることによって上記遺伝子を有する産生菌株から出発して得られる
。このことを次の工程で示す:
1.PCR(Vent- ポリメラーゼ)を用いて遺伝子を増幅
メラードを有するPCRで増幅する。
2.プラスミド(酵素 Sma Iを有する平滑末端)中に遺伝子をクローニングする
。大腸菌DH5α中で増殖。
した後、遺伝子を夫々ベクターpUC18で連結(結合)する。このベクターを
予め Sma I(制限酵素)で加水分解して、平滑末端(blunt-end)切断する。連結
されたベクターをDNA- 取込みに用意された菌株大腸菌DH5α中で形質転換
し、細胞を固形栄養培地上で増殖する。
)を単離し、上述のように新たに増殖する。
3.遺伝子を発現ベクターpT7−6中でEcoRI及びBarnHIフラグメ
ントによってクローニングする。
大腸菌BL21(DE3)中で増殖。
伝子rfbM又はrfbK)を単離し、酵素EcoRI及びBarnHIで加水
分解する。同様に発現ベクターpT7−6を酵素EcoRI及びBarnHIで
加水分解する。
- 取込みに用意された大腸菌BL21(DE3)の株をこれらのベクターでそれ
ぞれ形質転換する。形質転換細胞を固形栄養培地上で増殖する。
として夫々の遺伝子を有する、夫々のプラスミドを単離し、加水分解する。
以下に、本発明を詳細にかつ特別の実施態様によって説明する。
活性化された糖、特にGDP- α -D- マンノースのバイオ合成は、生体内で
6- リン酸)をホスホムターゼ(EC5.4.)、特にこの場合ホスホムターゼ
(EC5.4.2.8)を用いて糖 -1- リン酸へ変換する。
マンノース -6- リン酸 マンノース -1- ホスフアート(I)
EC2.7.7)−、特にこの際GDP- α−マンノース- ピロホスホリラーゼ
(EC2.7.7.13)は、糖 -1- リン酸上で無機ピロリン酸の遊離下にヌ
クレオシド三リン酸のヌクレオチジル基の転移を触媒する(Feingold及びBarber
,1990,Methodsin Plant Biochem.2,39-78参照)、特に次の反応(II)下に
行われる。
マンノース -1- リン酸+GTP GDP- マンノース+PPi(II)
か(たとえば Ginsberg,V.(1964),Adv.Enzymol.26,35-88参照)又は他の
第二活性化された糖、特にこの場合はGDP- β -L- フコースの合成のために
供給する(Yamamoto,K.,1982,Agric.Biol.Chem.48,823-824 及び 1993,A
rch.Biochem.Biophys.300,694-698).
化学合成はしばしば困難であり、収率が低いので、酵素合成が常に適用される
。
ホスホマンノムターゼ(EC5−4.2.8)及びGDP- マンノース- ピロ
ポスホリラーゼ(EC2.7.7.13)は、従来種々の起源から検出される。
GDP- マンノース- ピロホスホリラーゼは1956年に初めて Munch-Peterse
n によってベーカー(Baecker)-酵母から一部単離されている。この際使用可能な
酵素の量は酵母充填量に応じて著しく変化する(Munch-Petersen,1956,Aeta C
hem.Scand.10,928)。酵素は1962年に Preiss 及び Wood によってアン
トロバクター(Anthrobacter)sp.から単離されている(J.Biol.Chem.239(10),
3119-3126)。しかしこの著者は、多くの変換され、活性化された糖が他のピロホ
スホリラーゼ副反応に戻らないことを知らなかった。シュードモナスアエルギノ
ーサ(緑膿菌)及びロドスピリル ムルブルム(Rhodospirillum rubrum)中に二
官能性酵素、すなわちホスホマンノース- イソメラーゼ- 活性を有するGDP-
マンノース- ピロポスポリラーゼが見い出された(Shinabarger 等、1991,J. Bi
ol.Chem.266(4),2080-2088 及び Ideguchi 等、1993,Biochimica et Biophy
s.Acta 1172,329-331)。真核生物源からもGDP- マンノース- ピロホスホリ
ラーゼは単離される。(Szumilo等,1993,J.Biol.Chem.268(24),17943-1795
0).
確認された活性、GDP- クールコースへの変換(100%)、IDPクール
コースへの変換(72%)及びGDP- マンノースへの変換(61%)、むしろ
GDP- クールコース- ピロホスホリラーゼ(EC 2.7.7.34)が重要であること
を推察させる。
ホスホマンノースムターゼ(EC 5.4.2.8)は従来アルギナートバイオ合成と
関連してしか考慮されない(Sa-correia等.,1987,J.Bacteriol.169,3224-32
31 及びGoldberg等,1993,J.Bacteriol.175(3),1605-1611).
GDP−マンノースの酵素合成は、(Simon等,1990 J.Org.Chem.55,1834
-1841,Wong等,1993 WO 93/0820,Wong 等,1993 J.Org. Chem. 58, 3985-399
0及びPalanka 及びTurner,1993 J.Chem.Soc.PerKion Trans 23(1),3017-302
2中に従来記載されている。この作用グループは、すべて Munch-Petersen 1956
によって記載された方法に従って、酵母から得られるたん白質調製に利用され、
前もって化学的に生成されたマンノース -1- リン酸から出発してGDP- マン
ノースを合成する。
(産生)発現ベクター(プラスミド)(pT7−6、Navagen 社)中でクロー
ニングし、(産生株)発現菌株大腸菌BL21(DE3)PLysS(Novagen
社)中で形質転換(導入)して、ホスホマンノムターゼ及びGDP- マンノース
- ピロホスホリラーゼを発生する。これらは本発明によれば従来公知の起源から
のものよりも多量に得ることができる(表参照)。双方の酵素は、サルモネラエ
ンテリカ(Salmonella enterica)、グループB〔以前はサルモネラティフィリウ
ム(Salmonella typhimurium LT2)〕から由来する。遺伝子(rfbMはGDP-
マンノース- ピロホスホリラーゼをコードする;rfbKはホスホマンノムター
ゼをコードする。)はrfb- 遺伝子- クラスター中にあり、その構造及び配列
は Jiang 等、1991 Mol.Microbiol.5(3),695-713によって説明されている
。
複製- 連鎖- 反応(PCR)によって、遺伝子rfbM及びrfbKを複製(
増幅)し、夫々ベクターpUC18(Novagen 社)中でクローニングする。この
ベクターから出発して、遺伝子rfbM及びrfbK夫々を Novagen社の発現ベ
クターpT7−6中でクローニングし、夫々発現菌株大腸菌BL21(DE3)
pLysS中に導入(形質転換)する。挿入された遺伝子rfbMを有するプラ
スミドpT7−6を、今後pERJ- 1と呼ぶ。挿入された遺伝子rfbKを有
するプラスミドpT7〜6を、今後pERJ- 2と呼ぶ(図1〜3参照)。
遺伝子rfbM及びrfbKによってコードされたたん白質(GDP- マンノ
ース- ピロホスホリラーゼ及びホスホマンノムターゼ)の産生(発現)を、イソ
プロピルチオガラクトシド(IPTG)(0.4m)によって誘発し、0.03
mMリフアンピシンで増加させる(図4参照)。
50mMトリス- HCl- 緩衝液、pH8及び150mM KCl中で細胞(
大腸菌)の機械的分解し、遠心分離(10000rpmで2分)して、たん白質
含有粗抽出物が得られる。この粗抽出物をアニオン交換体(Q−セフアロースF
F)上に負荷し、GDP- マンノース- ピロホスホリラーゼを150mM KC
l及び400mM KClで段階的溶離によって生成する。溶離液に1M硫酸ア
ンモニウム及び20%グリセリン(V/V)を加え、フエニルセフアロースFF
上に付与する。吸着後、酵素を50mMトリス- HCl、pH8中で1M硫酸ア
ンモニウムと0M硫酸アンモニウムの間の勾配によって、0.4Mと0.1M硫
酸アンモニウムの間で20グリセリンによって溶離する。限外濾過し、50mM
トリス- HCl(pH8、150mM KCl)で緩衝した後、GDP- マンノ
ース- ピロホスホリラーゼをゲル濾過カラム上でクロマトグラフィー分離する。
限外濾過後、GDP- マンノース- ピロホスホリラーゼに3M硫酸アンモニウ
ムを加え、40℃で貯蔵する。
ホスホマンノムターゼはQセフアロースFFによって部分的に精製されなけれ
ばならない。
ホスホマンノムターゼ及びGDP- ピロホスホリラーゼは単官能性酵素であり
、これは上記反応(I及びII)を触媒する。
双方の酵素を、次の反応式に従ってマンノースから出発してGDP- マンノース
の酵素による合成に使用しなければならない:
反応1: ヘキソキナーゼ
反応2: ピルビン酸- キナーゼ
反応3: ホスホマンノムターゼ
反応4: GDP- マンノース- ピロホスホリラーゼ
反応5: ピロホスフアターゼ
反応1及び2は、Palanca 及び Turner,1993,J.Chem.Soc.PerKin Trans.
1,3017-3022でマンノース -6- リン酸の生成のためにすでに使用されている。
生成されたGDP- マンノースを更にマンノシルトランスフエラーゼで多糖類
にその場で変換することができる。
GDP- マンノース- ピロホスホリラーゼ- 活性を、ピロリン酸(PPi)を
産生するヌクレオチジルトランスフエラーゼ(EC2.7)の測定のための、新
しく開発された連続的吸光光度テストで検出する。下記の方法で、基質(ノイラ
ミン酸の場合糖 -1- リン酸又は糖及びヌクレオシド三リン酸)の前与によって
酵素テスト(ヌクレオチジルトランスフエラーゼ基質スクリーニング検定法“
NUSSA”)は、ヌクレオチジルトランスフエラーゼ- 反応(EC2.7- 7
)で生じるピロリン酸をピロリン酸- 依存性ホスホフクトキナーゼ(植物又は微
生物からのPPiPFK EC2.7.1.90)と共にフルクトース -6- リ
ン酸とフルクトース -2,6- 二リン酸の存在下に反応させて、フルクトース -
1,6- 二リン酸とすることに基づく。この生成物をアルドラーゼでジヒドロキシ
アセトンリン酸(DHAP)及びグリセリン -3- リン酸(GAP)に分解する
。グリセリンアルデヒド -3- リン酸から、ジヒドロキシアセトンリン酸がトリ
オースリン酸イソメラーゼによって生成する。最後にジヒドロキシアセトンリン
酸をグリセリン -3- リン酸- デヒドロゲナーゼによってNADHで還元して、
グリセリン -3- リン酸とする。ピロリン酸モルあたりNADH2モルを使用し
、これは吸光光度測定によって追跡することができる。
(1)GDP- マンノース- ピロホスホリラーゼ
(2)ピロリン酸- 依存性ホスホフルクトキナーゼ
(3)アルドース
(4)トリオースリン酸- イソメラーゼ
(5)グリセリン -3- リン酸- デヒドロゲナーゼ
次の例で本発明を詳細に説明する。その際記載された図に関係する。それは次
の通りである:
図1:クローニング工程
図2:発現ベクターpERJ- 1
図3:発現ベクターpERJ- 2
図4:pERJ- 1及びpERJ- 2の発現された遺伝子生成物のSDS- ゲル
電気泳動
図5:分子量測定のためのゲル濾過クロマドクラフィー
図6:4℃でGDP- Man- ピロホスホリラーゼの安定性
図7:GTPの基質過剰阻害
図8:M -1- Pの基質過剰阻害
図9:GTPに対するGDP- Manの競合阻止
図10:M -1- Pに対するGDP- Manの非競合阻止
図11:GDP- マンノースの合成にpH- 値の影響
図12:GDP- マンノース合成の酵素濃度依存
図13:マンノース -1- リン酸及びGTPから出発するGDP- Manの合成の
ためのE*t-曲線
図14:マンノースから出発するGDP- マンノースのバイオ合成反応式
図15:5mMマンノースから出発してGDP- マンノースの合成
図16:生成されたGDP- マンノースの毛管電気泳動- クロマトグラフィー
例1
サルモネラエンテリカのrfb- 遺伝子クラスターから遺伝子rfbM及びrf
bKをクローニング
グループB.
DNA- データバンクによってrfb- 遺伝子クラスター中の遺伝子rfbM
及びrfbKを同定し、読み枠(Leseraster)を決定する。
rfbM:GDP- α -D- マンノース- ピロホスホリラーゼ(ED2.7.7
.13)をコードする。
Bp中の長さ:17386−18831:1445塩基対
開始コドン 17386
停止コドン TAA TAG 18831
リボソーム結合部位 AAA AGA GAT AA
rfbKはホスホマンノムコーゼ(ED5.4.2.8)をコードする。
Bp中の長さ:18812−20245:1433塩基対
開始コドン: ATG 18812
停止コドン: TAA 20245
リボソーム結合部位: GAA GGA GTG GA
試験管内増幅で、双方の遺伝子に対する次のオリゴヌクレオチドプライマーを決
定する。
rfb M:
プライマー1:(rfb M1)5'-CTT GGG TTA DAA ATT
AGG CA- 3'
プライマー2:(rfb M2)3'-ATC TTT TAC AAG ACC
GCG AG- 5'
rfb K:
プライマー1:(rfb K1)5'-CCC CCT GAA GTT AAT
TGA GA- 3'
プライマー2:(rfb K2)3'-CCA TTT AAT CCT CAC
CCT CT- 5'
その際遺伝子の長さはrfbMに対して1633Bp上で、rfbKに対して1
606Bp上で増加する。
PCRを次の様に行う:
調製物上に夫々70μl鉱油を入れ、希釈されるのを防ぐ。Vent- ポリメラー
ゼ- 緩衝液(Biolabs,ニューイングランド)(10x)
200mMトリス- HCl、pH8.8、100mM KCl、100mM(N
H4)2SO4、20mM MgSO4、1%トリトンX100(w/v)PCRの
行程条件を次の様に選ぶ:
5分 98℃
2分 95℃ 6回くり返す
30秒 49℃
90秒 72℃
1分 95℃
45秒 49℃ 25回くり返す
90秒 72℃
2分 72℃
冷却
PCR後、増幅された遺伝子、夫々1.6kB、を Lau及び Sheu,1992Meth
.Mol.Cell.Biol.3,190-192、に従ってアガロース- ゲルから単離し、
夫々介助ベクターpUCi8中に連結する。このベクターは前もって制限酵素S
maIによって平滑末端で切断されている。ベクターとDNA- フラグメントの
比は約1:4である。連結を一晩14℃で実施する。
リガーゼ- 緩衝液(10x):0.5Mトリス- HCl、pH7.6、100mM
MgCl2、100mM DTT、500μg/ml BSA
挿入された遺伝子を有するこのベクターを大腸菌DH5αの感応細胞(Hanahan
1983 J.Mol-Biol.166,557-580)中で転質転換する。更に、連結調製物5μl
及び滅菌H2O15μl滅菌H2Oに氷上で解凍された感応細胞夫々200μlを
加え、30分間氷上で培養する。次いで調製物を40秒間42℃に加熱し、再び
2分間氷上に置く。次いで調製物にSOC- 培地800μlを加え、これを1時
間37℃で培養し、次いでX- Calで被覆されたLBAmp-100-寒天- プレート
上に塗布する。
SOC- 培地:pH7、20gトリプトン、5g酵母抽出物、0.5gNaCl
、2.5mM KCl、10mM MgCl2、20mM(滅菌された)グルコ
ース、H2O、1000mlLb
AMP- 100:10gトリプトン、5g酵母抽出物、5g NaCl(及び
15g Bacto- 寒天)アンピシリン100mg/l
X- Gal:5- ブロモ -4- クロロ- インドリル -β -D- ガラクトース寒天
プレートあたり(40mg/ml)70μl
陽性無色コロニーから、プラスミドpUC18/rfbM又はrfbKを単離
する(Birnboim 及び Doly,1979)。
pUC18/rfbMを、制限酵素EcoRI及びBamH Iで切断し、遺
伝子rfbMをベクターから切断する。アガロースゲルから遺伝子rfbM及び
rfbKを単離し、発現ベクター(pT7−6)中に連結する。
連結調製物(pT7−6/rfbM及びrfbK)を感応細胞(Cohen,Shng
及び Hsu,1972 Proc.Nat.Acad.Sci.(USA)69(8),2110-2114)中で、すな
わちrfbMの場合、大腸菌BL21(DE3)pLysS(Novagen 社及びr
fbKの場合、大腸菌BL21(DE3)中で形質転換する。
pT7−6中に挿入された遺伝子rfbMを有する菌株は、以下大腸菌BL2
1(DE3)pLysSpERJ- 1と呼ぶ。
遺伝子rfbM及びrfbKの発現を次の様に行う:
大腸菌BL21(DE3)pLysSpERJ- 1(5ml LBAmp-Chliramp -50
(アンピシリン及びクロラムフエニコール夫々50mg/l)一晩120r
pm及び37℃で)予備培養液から主培養液(10ml)2%を植菌し、0.5
の光学光度(546nmで)が達成されるまで、Schikanen を有するエルレンマ
イヤーフラスコ中で37℃及び120rpmで振とう器上で増殖する。培養液1
mlを採取し、遠心分離し、上澄液を除去し、ペレットにサンプル緩衝液(SD
S及びβ- メルタプトエタノール- 含有)50μlを加える。このサンプルを3
分95℃で加熱し、冷却後SDS- ポリアクリルアミドゲル(下記の方法)上に
加える。
培養液の残りに0.4mM IPTGを加え、20分インキュベートし、その後
再び1mlを採取し、上述の様に処理する。培養液の残りに0.03mMリフア
ンピシンを加え、60分インキュベートする。1mlを採取し、上述の様に処理
する。このサンプルから夫々10μlをSDS- ポリアクリルアミドゲル上に塗
布する。
大腸菌BL21(DE3)pERJ- 2を上述の様に増殖する。
SDS- ポリアクリルアミドゲル電気泳動を、(Laemmli,1970,Nature 227,
680-685)に従って行う。コマシー(Coomassie)ブリリアントブルーに呈色したゲ
ルの写真は図4に示される。
大腸菌BL21からGDP- マンノース- ピロホスホリラーゼを単離37℃で
振とう器中で120rpmで大腸菌BL21の増殖及び細胞の崩壊:
予備培養(Schikanenを有するエルレンマイヤーフラスコ1000ml中で一晩
- 培養)から出発して、夫々2lLBAmp-chloramp-50を5個の5lフラスコ(Sc
hikanen1%を有する)中に植菌し、光学密度0.8まで培養液を増殖する(3
.5時間)。0.4mM IPTGと共に20分培養した後、培養液を遠心分離
し(Sorvall GS3,8000rpm,10分,20℃)、50mMトリス- H
Cl、pH8で2回洗滌する。次いで水分量を測定し(約25g)、20%(w
/v)細胞懸濁液を生成する。次いで細胞を崩壊機S中で湿性粉砕によって崩壊
する。更に細胞懸濁液40gとビーズ(直径0.3mm)80gを混合し、12
分以内で4000Upmで均質化する。細胞断片及びビーズを15分の遠心分離
(Sorvall GSA,10000rpm,20℃)によって分離し、1回50mM
トリス- HCl、pH8で洗滌し、再び遠心分離し、上澄みを一緒にし、Q- セ
フアロースFFによるアニオン交換クロマトグラフィーのための粗抽出物が生成
する。
Q- セフアロースFF
Q- セフアロースFF400mlに粗抽出物(たん白質11.1mg/ml含
有)226mlを負荷する。段階溶離を約800ml 50mMトリス- HCl
、pH8及び約1400ml 50mMトリス- HCl、pH8(150mM
KCl含有)によって開始する。酵素を約900ml 50mMトリス- HCl
、pH8(400mM KCl含有)で溶離する。この分画に1M硫酸アンモニ
ウム及び20%グリセリンを加え、フエニル- セフアロースFF(66ml)上
に負荷する。酵素を0M硫酸アンモニウムに対する50mMトリス- HCl、p
H8(20%グリセリン含有)(全容量1000ml)の線形勾配によって溶離
する。0.4Mと0.1M硫酸アンモニウム濃度の間で最も活性な分画を集め、
限外濾過後、再緩衝し(50mMトリス- HCl、pH8、150mM KCl
)、次いでゲル濾過カラム(Superdex G- 75)中でクロマトグラフィー分離す
る(次表4参照)。
組換え体GDP- マンノース- ピロホスホリラーゼは大腸菌から6.3倍強化
される。収率13.5%で比活性2.34U/mgが得られる。0.37U/m
gからQ- セフアロースによって精製フアクター2が収率85%で得られる。フ
エニルセフアロースによる次の疎水性相互作用クロマトグラフィーは、最も活性
な分画のみの合併によって比活性が2.27U/mgに上昇すると共に比較的高
い損失40%を生じる。
GDP- マンノース- ピロホスホリラーゼの分子量は変性条件(SDS- ポリ
アクリルアミド- ゲル電気泳動)下で54KDである。自然の状態での分子量測
定のために、上記精製からの酵素サンプル2ml(7.54mg/ml)を用い
てセフアデックスG- 200(115.5ml)でゲル濾過を行う。活性測定を
、ピロホスホリラーゼに関する下記の本発明の酵素テストによって行う。活性最
大2が測定され、これは分子量208700ダルトン及び107800ダルトン
に相当する。したがって自然の状態で酵素が二量体又は四量体として存在する。
GDP- α -D- マンノース- ピロホスホリラーゼの作用- 及び使用試験を次
の様に行う:
1)安定性試験
酵素を4℃で貯蔵安定性について調べる。
酵素調製物(1.15U/mg)に安定剤無添加及び0.1mg/mlBSA
、又は3M硫酸アンモニウム、又は25%グリセリンを加え、47日間4℃でイ
ンキュベートする。47日後、安定剤不含及びBSA含有調製物中に約5%の残
存活性が見い出され、一方グリセリン及び硫酸アンモニウム含有調製物は75%
又は65%の活性をまだ有する。硫酸アンモニウム含有調製物は4ケ月後まだ5
0%出発活性の活性が認められる(図6)。
更に、安定性を30℃で調べる。この際酵素(79.3mU/mg)の限定さ
れた菌溶液を30℃で50mMトリス- HCl、pH8、5mM MgCl2中
でインキュベートし、種々の時間(0,2,6及び30時間)後、活性測定を行
う。
NUSSA 2mM GTP及び0.08mM M -1- Pを有するNUSSA
あたりの活性測定
2)基質GTP及びマンノース -i- リン酸(M -1- P)に関するKm- 及び
Vmaxの測定。
条件:ゲル濾過後の2.27μg/μl GDP- マンノース- ピロホスホリラ
ーゼ調製物、NUSSAあたりの活性測定
a)GTP- マンノース -1- リン酸に関するKm- 値及びVmax- 値の測定を定
数0.08mMで開始する。GTPを0.01mMと10mMの間で使用する(
図7)。
b)M -1- P GTPに関するKm- 値及びVmax- 値の測定を定数2mMで開
始する。マンノース -1- リン酸を0.002mMと0.6mMの間で変化させ
る(図8)。
3)合成へのGDP- マンノースの影響
条件:ゲル濾過後、2.27μg/ml〔a)に於て〕及び5.67μg/ml
〔b)に於て〕GDP- マンノース- ピロホスホリラーゼ- 調製物。NUSSA
あたりの活性測定。
a)マンノース -1- リン酸を、0.08M定数で開始する。
GTP- マンノースをDCJで0μM、50μM及び100μMで使用する。
測定された活性の評価は、GTPに対するGDP- マンノースの競合阻害を示す
(図9)。
Ki- 値を計算して1.49μMとする。
b)GTPをテストで2mM一定で使用する。
マンノース -1- リン酸を、0.003mMと0.3mMとの間で変化させる
。測定された活性の評価は、M -1- Pに対するGDP- マンノースの非競合阻
害を示す(図10)。Ki- 値を計算して118μMとする。
4)GDP- マンノース- ピロホスホリラーゼの基質スペクトル
条件:GDP- マンノース- ピロホスホリラーゼを酵素テストNUSSAで7.
3mU/mgで使用する。
a)ヌクレオシド三リン酸:ATP,CTP,GTP,UTP,dTTP夫々1
mM糖 -1- リン酸:マンノース -1- リン酸(2.5mM)。
b)ヌクレオシド三リン酸:
糖 -1- リン酸:グルコース -1- P、N- アセチルグルコサミン -1- P、
グルコサミン -1- P、ガラクトース -1- P、ガラクトサミン -1- P、N-
アセチルガチクトサミン -1- P、グルクロン酸 -1- P、ガラクトロン酸 -1
- P、キシロース -1- P、マンノース -1- P。
a)及びb)に於て、自然基質GTP及びマンノース -1- リン酸を用いる
以外は変換は認められない。
5)GDP- マンノース- ピロホスホリラーゼを、GDP- マンノースの合成に
使用
合成を、反応式1に従ってマンノースから出発して行わねばならない。
先ず、この際GDP- マンノース- ピロホスホリラーゼをピロホスフアターゼ
とカップリングさせる(1U/ml)。
合成を、種々のpH値(7,8,9)で50mMトリス- HCl、5mM M
gCl2(2mM GTP及び2mMマンノース -1- リン酸含有)中、2ml
の総容量で室温で行う。GDP- マンノース- ピロホスホリラーゼを0.04U
/mlで使用し、ピロリン酸は1U/mlである。種々の時間後、調製物から2
00μlを採取し、5分95℃で加熱し、遠心分離し(エッペンドルフ- 遠心機
、10000rqm、2分、室温)、毛管電気泳動によって分析する。
較正曲線及び面積の比較によってGTP及びGDP- マンノースの含有量を測
定する。変換は、GDP- マンノースのより高い収率をアルカリ性pH- 値で示
す(図11)。他の介助酵素(反応式1:ヘキソキナーゼ及びピルビン酸キナー
ゼ)がpH9の間でpH- 最適値を有するので(ベーリンガーマンハイム、1987
Boichemica-Information)、他の合成に対して8のpH- 値が選ばれる。
以下にGDP- マンノース合成のGDP- マンノース- ピロホスホリラーゼの
インキュベーション時間及び酵素濃度の増加でGDP- マンノースの高められた
収率を示す(図12)。インキュベーション時間と共に酵素濃度の増加は、反応
定数を生じる(E*t)。酵素濃度又はインキュベーション時間の変化と共に、
E*t-生成物の定数維持下で一定収率が得られる。20(U*分/ml)のE*t
で、反応平衡を選ばれた条件下で調整し、約90%のGDP- マンノースの収率
が得られる(図13)。
例 II
ヌクレオチジルトラスフエラーゼ基質スクリーニング検定法
(NUSSA)
(1)ピロホスホリラーゼ、(2)ピロリン酸依存性ホスホフルクトキナーゼ、
(3)アルドラーゼ、(4)トリオースリン酸- イソメラーゼ、(5)グリセリ
ン -3- リン酸- デヒドロゲナーゼ、
NTP:ヌクレオシド三リン酸/NDP:ヌクレオシド二リン酸/DHAP:ジ
ヒドロキシアセトン- リン酸/GAP:グリセリンアルデヒド -3- リン酸/G
-3- P:グリセリン -3- リン酸/NAD:ニコチン酸アミドアデノシン二リ
ン酸、還元された形
O'Brien,Bowien 及び Wood,1975 in J.Biol.Chem.250(22),8690-8695に
は、ピロリン酸依存性ホスホフルクトキナーゼ(PPiPFK)の測定のための
吸光光度酵素テストが記載され、たとえばそれは Reeves 等、1974J.Biol.Che
m.249,7737-7741 によって初めて Entamoeba histolytica中に開示されている
。この際PPiPFKをアルドースの反応(反応3)、トリオースリン酸イソメ
ラーゼ(反応4)及びグリセリン -3- リン酸- デヒドロゲナーゼ(反応5)と
連結する。反応を吸光光度により340nmで追跡する。
次の酵素テスト(NUSSA)は、本発明に従ってこのテストシステムを含む
ヌクレオチジルハランスフエラーゼの反応と連結され、したがって残存するピロ
ホスホリラーゼ又は残存するピロリン酸- 遊離酵素の測定を可能にする。テスト
NUSSAを、200μl総容量でマイクロ滴定プレートでの測定に最善の状態
にする。
総容量は200μlである。調製物を、Titertek-Photometer Molecular Devi
ces(ミュンヘン)で吸光光度により測定する。PPi- PFK- テストの場合
、PPiで開始し、ピロホスホリラーゼの場合、選択的に糖 -1- リン酸又はヌ
クレオシド三リン酸で開始する。
活性を算出するために、次式を使用する:
酵素テストNUSSAの使用
1)上記例参照:GDP- マンノース- ピロホスホリラーゼの活性測定。
2)例:2種の酵素源でピロホシドホリラーゼに対するスクリーニングNUSS
Aの使用:
a)大腸菌BL21(DE3)pLysSpERJ- 1
b)米(Oryza sativa L.)
テストを使用するために、PPiPFKを精製しなければならない。簡単かつ
良好に適用できる酵素源としてジャガイモ(Solanum tuberosum L.)を選ぶ。精製
をvan Schaftingen 等、1982 Eur.J.Biocnem.129,191-195の方法に従って行
う。酵素(PPiPFK)を25%グリセリン中で−20℃で保存する。
大腸菌BL21(DE3)pLysSpERJ- 1を上述の様に増殖し、崩壊
する。得られた粗ホモジナートを10000rpm、2分、20℃で遠心分離し
、酵素テストに使用する(21.02mg/ml)。米を Falling,1993,
ドイツ特許第4221595号明細書の記載に従って崩壊し、10000rpm
、10分20℃で遠心分離し、粗抽出物(4.26mg/ml)として酵素スク
リーンニングで使用する。基質としてテストする:
a)ヌクレオシド三リン酸:グルコース1- リン酸(25mM)とのテストで夫
々1mMのATP,CTP,GTP,UTP,dTTP
b)テストで夫々2.5mMのヌクレオシド三リン酸(1mM)、糖 -1- リン
酸。
表7中に、微生物- 及び真核細胞酵素源中でピロホスホリラーゼの非活性を示
す。
テスト調製物中20μg/ml大腸菌BL21(DE3)pLysS- pJER
-1- 粗抽出物、テスト調製物中1.06μg/mlないし0.14mg/ml
Oryza sativa- 粗抽出物。NUSSAによる活性測定
GDP- マンノースの合成を分析するために、毛管電気泳動(装置:BecKman
社)を使用する。方法としてホウ酸緩衝システムを有する毛管電気泳〃を使用す
る。この際0.4mMホウ酸40ml及び0.1mMホウ酸ナトリウム20ml
を混合し、H2O140mlで満たす。この割合で混合し、pH- 値約8.3を
調整する。流動電流を25kVに選択する。電流は約35〜7μAに調整する。
電気泳動図から濃度を決定するために、50mMトリス- HCl、pH8(5m
M MgCl2含有)中でGDP- マンノース及びGTPの異なる0.02mM
と0.4mMの間の濃度を定め、毛管電気泳動によって分析する。理論上使用さ
れる濃度(mM)付近で表面にプロットしてから直線が生じ、それによって線状
退縮を行うことができる:
ホスホマンノムターゼの単離大腸菌BL21(DE3)から大腸菌BL21の増
殖及び細胞の崩壊:
GDP- マンノース- ピロホスホリラーゼに於ける様に120rpmで。得ら
れた粗生成物をアニオン交換体に加える:
Q- セフアロースFF:
Q- セフアロースFF77mlを粗抽出物(たん白質含有14mg/ml)で
負荷する。線状に増加する勾配(50mMハリス- HCl、pH8、0- 600
mM KCl)を使用して、たん白質を280〜460mM KClで溶離する
。活性な分画を一緒にし、たん白質を3M(NH4)2SO4で沈澱する。遠心分
離(15分、10000rpm、40C)後、ペレットを5mlトリス- HCl
、pH8中に取る。酵素が純度フエクター2.4及び収率78%で得られる。
マンノースから出発するGDP- α- D- マンノースの酵素合成
GDP- マンノースの酵素合成(図14)は、マンノースから出発してC6を
ヘキソキナーゼ触媒されたリン酸化し、マンノース -6- リン酸をホスホマンノ
ムターゼによって異性化してマンノース -1- リン酸とし、マンノース -1- リ
ン酸をGTPで、GDP- マンノース- ピロホスホリラーゼによってGDP- マ
ンノースに変換して進行する。
使用されるATPを循環する。その際ヘキソキナーゼ反応で生じるADPをホ
スホエノールピルビン酸でピルビン酸- キナーゼによる触媒下にATP及びピル
ビン酸に変換する(Wong等、1995,Angen.Chem.107,569-593)(図15)。
より大きな規模での合成を、“くり返しバッチ法”で実施する。合成調製物の
総容量は80mlである。次の表に、合成調製物の組成を示す:
PMM:ホスホマンノムターゼ;PPase:ピロホスフアターゼ;GDPM-
PP:GDP -α- D- マンノース- ピロホスホリラーゼ
24時間後、調製物を限外濾過YM10- 膜(10KDの切片)(Amicon 社)
によって5mlに蒸発し、50mMトリス- HCl、pH8、10mM KCl
、10mM MgCl2で50mlに満たし、再び蒸発し、新たに満たし、5m
lに蒸発する。たん白質含有レテンタート(Retentat)に、新たに合成調製物のた
めに基質溶液(75ml)を加え、新たに24時間インキュベートする。この処
理法を更に数回くり返す。
濾液にアルカリ性ホスフアターゼ(1U/ml)を加え、24時間インキュベ
ートし、ヌクレオシド一、二及び三リン酸又は糖- リン酸、たとえばマンノース
-6- リン酸又は1- リン酸を脱リン酸する。活性糖はホスフアターゼによって
攻撃されない。
全体として3回253mg(0.4mmol)GTPと216.3mgマンノ
ースを反応させる。収率の検査を夫々24時間後に行う:
これは、遊離酸(605.3g/モル)に対してGDP- マンノース58/m
gに相当する。
アルカリ性ホスフアターゼと共にインキュベートした後、調製物を限外濾過し
、一緒にし、アニオン交換 Dowex(登録商標)1×2Cl-,(Serva)上に加え
る。
GDP- マンノースを、0と0.5M LiCl(500ml)(1M Li
Cl含有)の間の線形勾配に従って溶離する。GDP- マンノース含有溶液(9
00ml、0.92mM GDP- マンノース含有)を回転蒸発器によって蒸発
する。この分画をセフアデックスG−10によってゲル濾過し、次いでGDP-
マンノース含有分画を凍結乾燥する。凍結乾燥物を少量の水に溶解し、氷冷され
たアセトンを加える。沈澱したGDP- マンノースを濾過し、水中に取り、凍結
乾燥し、毛管電気泳動によって較正曲線と表面を比較して分析する。図16に比
希
釈センプルの電気泳動図を示す(1mg凍結乾燥物/ml水)。
全体で、GDP- マンノース199mgが凍結乾燥物500mg中に得ること
ができる。
【手続補正書】特許法第184条の8第1項
【提出日】1997年5月20日
【補正内容】
1.GDP- マンノースを生成する方法に於て、ホスホノマンノムターゼ- 又は
GDP- マンノース- ピロホスホリラーゼ-(GDP- Man- PP)遺伝子発
現は微生物中で高められることを特徴とする上記方法。
2.ホスホマンノムターゼ-(rfbK)又はGDP- Man- PP(rfbM-)
遺伝子発現が、rfbK- 又はrfbM- 遺伝子複写数の増加によって高められ
る、請求の範囲1記載の方法。
3.遺伝子複写数の増加のために、rfbK- 又はrfbM- 遺伝子を遺伝子構
造中に組込む、請求の範囲2記載の方法。
4.微生物をrfbK- 又はrfbM- 遺伝子を有する遺伝子構造で形質転換す
る、請求の範囲3記載の方法。
5.大腸菌株をrfbK- 又はrfbM- 遺伝子を有する遺伝子構造で形質転換
する、請求の範囲4記載の方法。
6.大腸菌BL21(DE3)を遺伝子構造で形質転換する、請求の範囲5記載
の方法。
7.遺伝子を微生物から単離する、請求の範囲1ないし6のいずれかに記載の方
法。
8.遺伝子をサルモネラ・エンテリカ(Salmonella emterica)、グループBから
単離する、請求の範囲7記載の方法。
9.遺伝子発現の増加後、ホスホマンノムターゼ又はGDP- Man- PPを単
離する、請求の範囲1ないし8のいずれかに記載の方法。
10.酵素を単離するために、組換え株の粗抽出物をアニオン交換体上に加える、
請求の範囲9記載の方法。
11.GDP- Man- PPを単離するために、アニオン交換体で段階的勾配- 溶
離を行い、酵素に富んだ分画からGDP- Man- PPを直線降下する(NH4)2
SO4-勾配を有する“疎水性相互作用クロマトグラフィー”(HIC)によって
生成する、請求の範囲10記載の方法。
12.遺伝子発現の増加後に生成するホスホマンノムターゼを、マンノース -6-
リン酸のマンノース -1- リン酸への変換に使用する、請求の範囲1ないし11
のいずれかに記載の方法。
13.遺伝子発現の増加後に生成されるGDP- Man- PPをGTPと共に、マ
ンノース -1- リン酸のGDP- マンノースへの変換に使用する、請求の範囲1
ないし12のいずれかに記載の方法。
14.微生物から単離されるGDP- Man- PPマンノース- 又はマンノース誘
導体- 比活性>20U/mg
15.請求の範囲1ないし10のいずれかに記載の方法で得られたホスホマンノム
ターゼ。
16.過剰発現された形でホスホマンノムターゼ又はGDP- Man- PPを有す
る、形質転換された細胞。
17.大腸菌である、請求の範囲16の形質転換された細胞。
18.大腸菌BL21(DE3)である、請求の範囲17記載の形質転換された細
胞。
19.ピロリン酸を遊離する酵素によって生じるピロリン酸を、ピロリン酸依存性
ホスホフルクトキナーゼ、アルドラーゼ、トリオースリン酸- イソメラーゼ及び
グリセリン -3- リン酸- デヒドロゲナーゼによって変換し、デヒドロゲナーゼ
によって起こる還元を吸光光度によって測定することを特徴とする、吸光光度テ
スト。
20.ピロリン酸を遊離するヌクレオチジルトランスフエラーゼを測定するための
、請求の範囲19記載の吸光光度テスト。
21.GDP- マンノース- ピロホスホリラーゼを測定するための、請求の範囲2
0記載の吸光光度テスト。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(31)優先権主張番号 19606651.4
(32)優先日 1996年2月23日
(33)優先権主張国 ドイツ(DE)
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L
U,MC,NL,PT,SE),CA,JP,US
(72)発明者 クラ・マリア−レジナ
ドイツ連邦共和国、D−52382 ニーダー
ツィール、ゼルゲンブッシュ、12
(72)発明者 フェルゼック・シュテファン
ドイツ連邦共和国、D−42103 ヴュッペ
ルタール、キプドルフ、5
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.微生物から単離される、マンノース- 又はマンノース誘導体- 特異性GDP - マンノース- ピロホスホリラーゼ(GDP- Man- PP)(比活性>20U /mg)。 2.細菌から由来する、請求の範囲1記載のGDP- マンノース- ピロホスホリ ラーゼ。 3.GDP- Man- PPの生成のために組換えられた、酵素産生に関与する菌 株を適する培地中で培養し、得られた細胞を崩壊し、遠心分離によって得られた 粗抽出物を、アニオン交換体上に加え、段階的- 勾配溶離し、その酵素に富んだ 分画からGDP- Man- PPを、直線降下する(NH4)2SO4-勾配を有する “疎水性相互作用クロマトグラフィー”(HIC)によって生成することを特徴 とする、GDP- Man- PPの産生方法。 4.GDP- Man- PPをコードした遺伝子rfb Mをプラスミド中に挿入 し、このプラスミドを適する産生- 株中に入れることによって得られた組換え株 を使用する、請求の範囲3記載の方法。 5.マンノース -1- リン酸を請求の範囲1記載のGDP- Man- PPの存在 下にGTPと酵素反応させることを特徴とする、GDP- マンノースの生成方法 。 6.マンノース -1- リン酸をホスホマンノムターゼを用いてマンノース -6- リン酸へ変換して生成することを特徴とする、請求の範囲5記載の方法。 7.マンノース -1- リン酸中でマンノース -6- リン酸を変換することができ る、微生物由来のホスホノマンノムターゼ。 8.ホスホマンノムターゼをコードした遺伝子rfb Kをプラスミド中に挿入 し、このプラスミドを適する産生- 株中に入れることによって得られた組換え株 、特に細菌株から得られる、請求の範囲7記載のホスホマンノムターゼ。 9.反応式2に従って5段階反応から成る吸光光度ヌクレオチジルトランスフエ ラーゼテストNUSSAに於て、NADHを吸光光度により測定し、それに関連 してNADH消費2モルに相当する、変換されたNTP1モルが換算される、上 記テスト。
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