KR20070068365A

KR20070068365A - 우리딘 5'-디인산-ｎ-아세틸갈락토사민의 제조법

Info

Publication number: KR20070068365A
Application number: KR1020077008331A
Authority: KR
Inventors: 키요시 오쿠야마; 토시타다 노구치
Original assignee: 야마사 쇼유 가부시키가이샤
Priority date: 2004-10-21
Filing date: 2005-10-18
Publication date: 2007-06-29
Also published as: WO2006043525A1; EP1816206A4; JP4606419B2; KR101123062B1; CN101052724B; EP1816206A1; JPWO2006043525A1; CA2582686A1; US7901912B1; CA2582686C; CN101052724A; EP1816206B1

Abstract

본 발명은 올리고 당 합성의 중요한 기질인 우리딘 5'-디인산-N-아세틸갈락토사민(UDP-GalNAc)의 제조법에 관한 것으로, 우리딘 5'-트리 인산(UTP)과 N-아세틸갈락토사민 1-인산(GalNAc1-P)으로부터 우리딘 5'-디인산-N-아세틸갈락토사민(UDP-GalNAc)을 효소적으로 제조하는 데 있어, 효소로서 미생물(단, 병원성 미생물을 제외한다) 유래의 우리딘 5'-디인산-N-아세틸글루코사민 피로포스포릴라제(UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제)을 이용하는 것을 특징으로 하고, 나아가 GalNAc1-P로서 N-아세틸갈락토사민 키나제를 이용하여 N-아세틸갈락토사민과 인산공여체로부터 반응계 내에서 조제한 것을 이용할 수 있다. 본 발명에 따라 비교적 저가의 기질을 이용하여 우리딘 5'-디인산-N-아세틸갈락토사민을 효율적으로 제조할 수 있다.

UDP-GalNAc, 우리딘 5'-디인산-N-아세틸갈락토사민, GalNAc1-P, UTP

Description

우리딘 5'-디인산-Ｎ-아세틸갈락토사민의 제조법{Method of producing uridine 5'-diphospho-N-acetylgalactosamine}

본 발명은 올리고당 합성의 중요한 기질인 우리딘 5'-디인산-N-아세틸갈락토사민(UDP-GalNAc)의 제조법에 관한 것이다.

올리고당을 효소 합성하는 방법으로서는 올리고당의 가수분해효소의 역반응을 이용하는 방법 및 당전이 효소를 이용하는 방법의 2가지 통용되는 방법을 생각할 수 있다. 당전이 효소를 채용하는 합성법은, 합성 수율이나 복잡한 구조를 가지는 올리고당 합성으로의 응용이라는 점에서 가수분해효소의 역반응을 이용하는 방법보다도 유리하다고 생각되고 있으며, 또한 최근의 재조합 DNA 기술의 진보에 의한 각종 당전이 효소의 양산화도 상기 기술의 실현화를 지지하고 있다.

그러나, 당전이 효소를 채용하는 합성법에서 사용하는 당 공여체인 당 뉴클레오티드는 일부를 제외하고 여전히 고가여서, 양적으로도 시약 레벨의 얼마 안 되는 공급량 밖에 제공할 수 없는 실정이다. 예를 들면, UDP-GalNAc의 제조법으로서 갈락토사민을 출발 원료로서 사용하고, 효소법과 화학적인 아세틸화를 조합시켜서 UDP-Ga1NAc을 합성하는 방법이 보고되어 있다.

그러나, (A) 실험실에서의 작은 스케일 반응에 불과함, (B) 효소의 조제가 용이하지 않음, (C) 갈락토사민의 인산화에 있어서 ATP 재생계를 보충할 필요가 있고 반응 전(全)공정의 수율도 낮음, (D) 반응액 중에 UDP-갈락토사민이 잔류했을 경우, 이것과 목적으로 하는 UDP-GalNAc과의 분리가 문제가 되는 등의 문제를 가져 반드시 실용적인 방법이 될 수는 없었다 (Methods Enzymol., 28, 271-277, (1972), J. Org.Chem., 57, 152-157.(1992)).

또한, 우리딘 5'-디인산-N-아세틸 글루코사민4-에피메라제(UDP-GlcNAc41에피메라제)를 써서 우리딘 5'-디인산-N-아세틸 글루코사민(UDP-GlcNAc)으로부터 UDP-GalNAc을 합성하는 방법이 보고되어 있지만 (WO2002/050267), (가) UDP-GlcNAc4-에피메라제는 동물조직 또는 균체에 지극히 소량밖에 존재하지 않는다, (나) 재조합 DNA 방법에 의해 UDP-GlcNAc4-에피메라제를 조제하는 것도 가능하지만, 이 효소반응은 평형 반응이기 때문에 전환율은 낮고, 이에 더하여 기질인 UDP-GlcNAc은 완전하게 소비되지 않고 반응액 중에 다량 잔류하기 때문에, UDP-GalNAc과 UDP-GlcNAc과의 분리는 곤란하다는 문제를 가져 이 방법도 실용적인 방법으로 하는 것은 문제가 있었다.

특허문헌 1: WO 2002/050267

비특허문헌 1: Methods Enzymol., 28, 271-277, (1972)

비특허문헌 2: J. Org. Chem., 57, 152-157, (1992)

비특허문헌 3: J. Biol. Chem. 271, 23653-23656, (1996)

비특허문헌 4: J. Biol. Chem. 234, 1822-1827 (1959)

비특허문헌 5: J. Biol. Chem. 273, 27055-27057 (1998)

비특허문헌 6: J. Biol. Chem. 271, 13147-13154 (1996)

따라서, 본 발명은 저렴한 기질을 사용하여 효소적으로 UDP-GalNAc을 효율적으로 제조할 수 있는 실용적인 방법을 제공하는 것을 목적으로 하는 것이다.

본 발명자 등은 UDP-GalNAc의 생합성 경로에 관해서 상세하게 검토한 결과, 이하를 찾아내고, 본 발명을 완성하게 되었다.

제1점으로, 병원성의 포도상구균(Staphylococcus aureus), 인간, 돼지 유래의 각 우리딘 5'-디인산-N-아세틸글루코사민 피로포스포릴라제(UDP-GlcNAc피로포스포릴라제)는 하기 (A)의 본래의 변환 반응을 촉매하는 활성을 가지는 이외에 하기 (B)의 변환 반응도 촉매하는 활성을 가지고 있는 것이 보고되어 있었지만 (J. Biol. Chem. 234, 1822-1827 (1959), J. Biol. Chcm. 273, 27055-27057 (1998), J. Biol. Chem. 271, 13147-13154 (1996)), Staphylococcus oureus 이외의 병원성 없는 미생물 유래의 UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제에는 그러한 보고는 없었지만, 시험 결과, 하기 (A)의 활성 이외에도 하기 (B)의 활성을 갖고 있음을 확인했다. 그리고, 예를 들면 대장균 유래의 UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제를 사용하여 N-아세틸갈락토사민1-인산(GalNAc1-P)과 우리딘 5'-트리 인산(UTP)으로부터 UDP-GalNAc을 합성하면, UDP-GlcNAc이나 UDP-갈락토사민 등 종래 방법에서 문제가 있던 것 이외의 당 뉴클레오티드와의 분리의 문제를 해결할 수 있는 것.

(A) UDP-GlcNAc+피롤린 산 ⇔ UTP+GlcNAc1-P

(B) UDP-Ga1NAc+피롤린 산 ⇔ UTP+GalNAc1-P

다음으로, GalNAc1-P은 고가이고, 화학적으로도 조제가 용이하지 않기 때문에, N-아세틸갈락토사민(GalNAc)을 효소적으로 인산화할 수 없는지 검토하고 있는 과정에서, GalNAc을 인산화하는 활성은 인간 또는 돼지의 간장 또는 신장 등의 조직 중에 존재하는 것이 보고되고 있어(J. Biol. Chem. 271, 39, 23653-23656, (1996)), 이 효소에 의해 GalNAc으로부터 GalNAc1-P을 효소적으로 조제할 수 있는 것.

그러나, 동물 유래의 N-아세틸갈락토사민 키나제를 대장균 등의 미생물을 숙주로 하는 계에서 생산하는 것은 곤란하여 해당 효소를 실용 목적에 제공하는 것은 불가능 했지만, 동물 유래의 N-아세틸갈락토사민 키나제를 코드하는 GALK2 유전자를 다른 미생물 유래의 단백질 (예를 들면, 대장균 UDP-Glc NAc 피로포스포릴라제)을 코드하는 유전자의 3’말단의 하류에 연결하고 융합단백질로 생산하는 것으로써 대장균 내에서 활성을 가지는 상태로 동물 유래의 N-아세틸갈락토사민 키나제를 생산할 수 있는 것.

또한, 이러한 동물 유래의 N-아세틸갈락토사민 키나제와 미생물 유래의 UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제 또는 이들의 융합단백질을 사용해서 GalNAc과 UTP로부터 UDP-GalNAc을 합성할 수 있고, 나아가 효모 균체에 의해 아데노신 5'-트리 인산(ATP) 생산과 우리딘 5'-모노 인산(UMP)의 인산화를 행하면서 N-아세틸갈락토사민 키나제와 대장균 UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제를 작용시킴으로써, 저렴한 UMP과 GalNAc으로부터 UDP-GalNAc을 합성할 수 있는 것을 각각 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

즉, 본 발명은 UTP과 GalNAc1-P으로부터 UDP-Ga1NAc을 효소적으로 제조하는 방법에 있어서, 효소로서 미생물(단, 병원성 미생물을 제외한다) 유래의 UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제를 이용하는 것을 특징으로 하는 UDP-GalNAc의 제조법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제가 미생물 유래의 UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제 유전자를 이용한 재조합 DNA 방법으로 조제된 것을 특징으로 하는 UDP-GalNAc의 제조법에 관한 것이다.

나아가, 본 발명은 상기 Ga1NAc1-P이 N-아세틸갈락토사민 키나제를 사용하여, GalNAc과 인산공여체로부터 반응계 내에서 조제한 것을 특징으로 하는 UDP-GalNAc의 제조법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서는, 상기 N-아세틸갈락토사민 키나제는 동물 유래의 N-아세틸갈락토사민 키나제 유전자를 이용한 재조합 DNA 방법으로 조제된 것으로 할 수 있고, 재조합 DNA 방법을 이용해서 미생물 유래의 단백질과의 융합단백질의 형태로 조제된 것으로 할 수 있고, 혹은 미생물 유래의 UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제와의 융합단백질의 형태로 조제된 것을 이용하는 것이 가능하다.

또한, 본 발명에 있어서는, 상기 인산공여체를 아데노신 5'-트리 인산(ATP)으로 할 수 있고, 상기 아데노신 5'-트리 인산(ATP)이 효모 균체에 의해 생성되는 것으로 해도 된다.

또한 본 발명의 UDP-GalNAc의 제조법에 있어서는, UTP을 쓰는 대신에 미생물 균체나 효소를 이용한 UTP 생성/재생계로 병용할 수도 있고, UTP을 쓰는 대신에 UMP과 효모 균체를 이용한 UMP으로부터의 UTP 생성계를 병용하는 것도 가능하다.

또한 본 발명에 있어서는, 상기 미생물 유래의 UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제 유전자는 대장균 유래의 UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제 유전자(glmU)로 하는 것이 가능하다. 또한 상기 UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제에 의한 UDP-GalNAc의 합성에 있어서, 반응계에 생성하는 피롤린 산을 분해하는 효소를 첨가하여도 좋다.

또한, 본 발명에 있어서는, 상기 효모 균체로서 사카로마이세스 속, 치고사카로마이세스속, 칸디다 속, 톨로푸시스 속, 한세눌라 속, 데바리오마이세스 속으로부터 선택되는 1 또는 2 이상의 효모 유래의 균체를 사용할 수 있고, 상기 효모 균체의 일례로서 건조 효모 균체를 사용할 수 있다. 상기 효모 균체를 사용하는 반응에, 무기 인산이나 소요의 에너지원을 첨가하는 것도 유익하다.

또한, 본 발명에 있어서는, 상기 N-아세틸갈락토사민 키나제에 의해 조제된 GalNAc1-P의 분해를 방지하는 불화 나트륨을 첨가할 수도 있다.

본 발명에 의해 미생물 유래 UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제가 GalNAc1-P과 UTP로부터 UDP-GalNAc을 생성하는 활성이 있는 것을 발견해내고, 상기 효소와 동물 유래 N-아세틸갈락토사민 키나제를 사용하여, GalNAc의 인산화와 UDP 부가를 연동(連動)하여 행함으로써 UDP-GalNAc을 효율적으로 제조하는 것이 처음으로 가능하게 되었다.

또한, N-아세틸갈락토사민 키나제와 UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제를 융합단백질로서 생산 가능하게 되고, 동물 유래의 N-아세틸갈락토사민 키나제의 생산을 대장균 내에서 처음으로 가능하게 되고, 2 종류의 효소를 한번에 생산할 수 있으며, 효소 조제가 용이해졌다.

나아가, 효모 균체에 의해 ATP 생산과 UMP의 인산화를 수행하면서 N-아세틸갈락토사민 키나제와 미생물 유래 UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제를 작용시킴으로써, 저렴한 UMP와 GalNAc으로부터 UDP-GalNAc를 효율적으로 합성할 수 있다.

또한, 본 발명의 방법은 UDP-GalNAc 이외의 당 뉴클레오티드가 거의 생성되지 않기 때문에 반응액으로부터 목적하는 UDP-GalNAc 단리정제를 매우 간단하게 행할 수 있다.

도 1은 GalNAc과 UTP으로부터의 UDP-GalNAc 합성계를 나타낸 것이다.

도 2는 인간 신장 유래의 N-아세틸갈락토사민 키나제와 대장균 UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제를 공존시켰을 때의 UDP-GalNAc 생성량의 시간에 따른 변화를 나타낸 것이다.

도 3은 인간 신장 유래의 N-아세틸갈락토사민 키나제와 대장균 UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제와의 융합 단백질을 채용한 때의 UDP-GalNAc 생성량의 시간에 따른 변화를 나타낸 것이다.

도 4는 자 퍼멘터에서의 합성 반응에 있어서의 UDP-GalNAc 생성량의 시간에 따른 변화를 나타낸 것이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명은 UTP과 GalNAc1-P으로부터 UDP-GalNAc을 효소적으로 제조하는 방법에 있어서, 효소로서 미생물 유래의 UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제를 채용하는 것을 특징으로 하는 UDP-GalNAc의 제조법에 관한 것이다.

반응계에 첨가하는 UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제로서는 병원성을 가지지 않는 미생물 유래의 것을 사용할 수 있다. 이들 효소는, 각각의 효소의 유전자를 클론화하고, 미생물 균체내에서 대량 발현시키는, 소위 재조합 DNA 방법을 이용해서 조제하는 것도 가능하다. 미생물 유래의 UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제로서는 엣세리키아(Escherichia)속 (Journal of Bactcriology, 175, 6150 (1993)), 삿카로마이세스(Saccharomyces)속 (Agricultural Biological Chemistry, 40, 2275 (1976)), 또는 뉴로스포라(Neurospoa)속 (Can. J. Microbiology, 25, 1381 (1979))에 속하는 미생물 유래의 것이 예시되며, 특히 대장균 유래의 UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제가 바람직하다.

이러한 UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제는, 해당 활성을 소유하는 한 어떤 형태 라도 된다. 구체적으로는, 미생물 균체, 상기 균체의 처리물 또는 상기 처리물로 부터 얻어진 효소 조제물 등을 예시할 수 있다.

미생물의 균체 처리물로서는 상기 미생물 균체를 기계적 파괴(와링 블렌더, 프렌치 프레스, 호모지나이저, 유발(乳鉢) 등에 의함), 동결 융해, 자기소화, 건조(동결건조, 풍건(風乾) 등에 의함), 효소처리(리소자임 등에 의함), 초음파처리, 화학처리(산, 알칼리 처리 등에 의함) 등의 일반적인 처리법을 따라 처리하여 얻어지는 균체의 파괴물 또는 균체의 세포벽 혹은 세포막의 변성물을 예시할 수 있다.

효소 조제물로서는 상기 균체 처리물로부터 해당 효소 활성을 가지는 획분을 일반적인 효소의 정제 수단(염석 처리, 등전점 침전 처리, 유기용매 침전 처리, 투석 처리, 각종 크로마토그래피 처리 등)을 행하여 얻을 수 있는 조(粗)효소 또는 정제 효소를 예시할 수 있다.

미생물 균체로부터의 UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제의 조제법을 구체적으로 설명하면, 집균하여 얻어진 균체를 초음파 처리에 의해 균체를 파쇄하고, 균체 파괴액을 원심분리하여 상청을 얻고, 이 상청을 이온교환 크로마토그래피, 겔 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피 처리를 행하여 UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제 활성 획분을 농축, 탈염하는 것으로 목적하는 효소 조제물을 취득할 수 있다.

반응에 사용하는 UTP과 GalNAc1-P은, 반응계 내에서 각각을 조제하여도 상관없다. 예를 들면, GalNAc1-P의 반응계 내에서의 조제는 N-아세틸갈락토사민 키나제를 이용하여 Ga1NAc와 인산공여체로부터 실시할 수 있다.

반응에 사용하는 N-아세틸갈락토사민 키나제는 인간, 돼지, 마우스 등의 포유류의 신장이나 간장, 췌장, 폐, 심장, 대동맥, 뇌 등의 조직에 존재하고, 특히 신장 또는 간장에 많이 포함되어 있어 이들 조직으로부터 조제가능하다. 또한 반응계에 첨가하는 N-아세틸갈락토사민 키나제는 해당 활성을 가지는 한 어떤 형태라도 된다. 구체적으로는, 돼지 간장의 처리물 또는 상기 처리물로부터 얻어지는 효소 조제물 등을 예시할 수 있다.

그러나, 효소 조제의 간편성 등의 측면으로부터, 일반적인 방법을 따라 N-아세틸갈락토사민 키나제 유전자를 클론화하고, 미생물 균체 내에서 대량발현시키는, 소위 재조합 DNA 방법에 의해 조제하는 쪽이 좋다. 미생물을 숙주로 해서 재조합 DNA 방법에 의해 동물 유래의 N-아세틸갈락토사민 키나제를 조제할 경우, 일반적인 방법에서는 목적하는 효소가 생산되지 않던가 생산되어도 극히 소량으로 실용에 맞지 않는다. 이 때문에 숙주와 같은 미생물 유래의 단백질(예를 들면, 대장균 UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제)을 코드하는 유전자의 하류에 연결하고, 융합단백질로서 생산시킴으로써 대장균 등의 숙주 내에서 활성을 갖는 상태에서 동물 유래의 N-아세틸갈락토사민 키나제를 생산할 수 있다.

상기 융합단백질을 생산하기 위한 유전자의 연결, 플라스미드의 구축, 숙주의 형질전환, 효소의 생산 등은 이미 이 분야에서는 주지의 기술이며, 후술 실시예 에 나타나 있는 바와 같이, 일반적인 방법을 따라서 수행할 수 있다.

반응에 첨가하는 N-아세틸갈락토사민 키나제로서는 UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제와 마찬가지로, 해당 활성을 소유하는 한 어떤 형태라도 된다. 구체적으로는, 미생물의 균체, 상기 균체의 처리물 또는 상기 처리물로부터 얻어지는 효소 조제물 등을 예시할 수 있다.

또한 UTP의 반응계 내에서의 조제는, 미생물 균체나 효소를 이용한 UTP 생성/재생계로 병용하여 실시할 수 있다. 구체적으로는, UMP과 효모 균체를 이용한 UMP 로부터의 UTP 생성계를 이용할 수 있으며, 우선 이것에 관하여 설명한다(도 1 참조).

사용하는 효모 균체로서는 당 뉴클레오티드의 제조에 사용되는 것이면 특히 제한되지 않는다. 구체적으로는, 삿카로마이세스(Saccharomyces)속, 자이고삿카로마이세스(Zygosaccharomyces)속, 칸디다(Candida)속, 톨로푸시스(Torulopsis)속, 한세눌라(Hansenula)속, 데바리오마이세스(Debaryomyces)속 등의 효모 유래의 균체를 예시할 수 있다. 이러한 효모 균체는, 생효모 균체, 건조 효모 균체 어느 것이든 상관없지만, 반응 수율, 취급의 용이성 등의 점에서 건조 효모 균체를 쓰는 것이 바람직하다.

또한 UTP의 반응계 내에서의 조제는, 상기의 UMP과 효모 균체를 이용한 UMP로부터의 UTP 생성계에 한정되는 것이 아니라, 예를 들면, 미생물 균체를 이용한 오로친산으로부터의 UTP 생성계 (일본국 공개특허공보 특개평 5-276974호), 혹은 효소를 이용한 UTP 생성계와 ATP 재생계가 공역(共役)한 것(구체적으로는, 아데닐산(AMP)에 폴리인산키나제, 아데닐레이트키나제 및 폴리 인산을 작용하게 해서 ATP를 재생하면서 UMP에 우리딜산키나제 및 필요에 따라 뉴클레오시드이인산 키나제를 작용하게 해서 UTP를 생성하는 계)등을 이용할 수도 있다.

이러한 효소와 기질을 이용하여 UDP-GalNAc을 제조하는 조건은 사용하는 효소나 기질에 따라 약간 다르다.

(1) 효소로서 미생물 유래의 UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제를 이용하여, UTP 와 GalNAc1-P으로부터 UDP-GalNAc을 효소적으로 제조할 경우

반응에 사용하는 UTP와 GalNAc1-P은 시판품, 혹은 공지의 방법(J. Am. Chem. Soc., 115, 2260-2267 (1993))을 응용해서 조제한 것을 사용할 수 있다. 사용 농도로서는 특히 제한되지 않지만, 각각 약 1∼200mM, 바람직하게는 약 1∼100mM의 범위에서 적정하게 설정할 수 있다.

UDP-GalNAc의 합성 반응은, 예를 들면 pH 약 6.0∼9.0의 인산 완충액 중에 UTP와 Ga1NAc1-P을 첨가하고, 이 반응액에 상기 UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제를 약0.1 유닛/ml 이상, 바람직하게는 약 0.5∼20.0 유닛/ml 첨가 공존시켜 약 5∼30℃, 바람직하게는 약 5∼25℃에서 1∼70 시간 정도, 필요에 따라 교반(攪拌)하면서 반응시킴으로써 실시할 수 있다.

또한, UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제에 의한 UDP-GalNAc의 합성 반응은, 평형 반응이며, UDP-GalNAc의 합성 수율을 향상시키기 위해서, 반응계에 생성하는 피롤린산을 분해하는 효소 (예를 들면, 피로포스파타제)를 0.1 유닛/ml이상 첨가하는 것이 바람직하다.

(2) 효소로서 미생물 유래의 UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제와 동물 유래의 N-아세틸갈락토사민 키나제 또는 이들의 융합 효소를 사용하여 UTP와 GalNAc으로부터 UDP-GalNAc을 효소적으로 제조할 경우

반응에 사용하는 UTP과 GalNAc은 시판품을 사용할 수 있다. 사용 농도로서는, 특히 제한되지 않지만, 각각 약 1∼200 mM, 바람직하게는 약 1∼100 mM의 범위에서 적절하게 설정할 수 있다.

UDP-GalNAc의 합성 반응은, 예를 들면 pH 약 6.0∼9.0의 인산 완충액 중에 UTP와 GalNAc을 첨가하고, 이 반응액에 상기 2종류의 효소를 각각 혹은 융합 효소를 약 0.1 유닛/ml 이상, 바람직하게는 약 0.5∼20.0 유닛/ml 첨가 공존시켜, 약 5∼30℃, 바람직하게는 약 5∼25℃에서 1∼70 시간 정도, 필요에 따라 교반하면서 반응시킴으로써 실시할 수 있다.

또한, 상기 (1)과 마찬가지로, 피롤린 산을 분해하는 효소(예를 들면, 피로포스파타제)을 0.1 유닛/ml 이상 첨가하고, 또 N-아세틸갈락토사민 키나제에 의해 조제된 GalNAc1-P의 분해를 방지하기 위해서, 1mM 이상의 불화 나트륨을 첨가하는 것이 바람직하다.

(3) 효소로서 미생물 유래의 UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제와 동물 유래의 N-아세틸갈락토사민 키나제 또는 이들의 융합 효소를 사용하여 효모 균체를 이용한 UMP으로부터의 UTP 생성계를 병용하고, UMP와 GalNAc으로부터 UDP-GalNAc을 제조할 경우

반응에 사용하는 UMP과 GalNAc은 시판품을 사용할 수 있다. 사용 농도로서는, 특히 제한되지 않지만, 각각 약 1∼200mM, 바람직하게는 약 10∼50mM의 범위에서 적당하게 설정할 수 있다.

UDP-GalNAc의 합성 반응은, 예를 들면 pH 약 6.0∼9.0의 인산 완충액 중에 UMP와 GalNAc을 첨가하고, 이 반응액에 상기 2종류의 효소 각각, 혹은 융합 효소를 약 0.1 유닛/ml 이상, 바람직하게는 약 0.5∼20.0 유닛/ml 첨가하고, 또한 효모 균체를 1∼10％（w/v) 공존시켜, 약 5∼30℃에서 1∼70 시간 정도, 필요에 따라 교반 하면서 반응시킴으로써 실시할 수 있다.

상기 반응에는 무기 인산과 에너지원을 반응계에 첨가하는 것이 바람직하다.무기 인산은, 인산 칼륨 등을 그대로 사용할 수도 있지만, 인산 완충액의 형태로 사용하는 것이 바람직하다. 에너지원으로서는, 글루코오스, 프룩토스 등의 당류, 아세트산, 구연산 등의 유기산을 사용할 수 있다. 각각의 사용 농도는, 특히 제한되지 않지만, 약 10∼1000mM, 바람직하게는 약 100∼500mM의 범위에서 적당하게 설정할 수 있다.

또한, 상기 반응계에는, 상기 (1) 및 (2)의 효소반응과 달리, 피롤린 산을 분해하는 효소나 GalNAc1-P의 분해를 방지하기 위한 불화 나트륨 등의 불화 염을 반응계에 첨가할 필요는 없다.

상기와 같이 얻어진 UDP-GalNAc은 당 뉴클레오티드의 일반적인 단리정제 수단(이온 교환 크로마토그라피, 흡착 크로마토그래피, 염석 등)에 의해 단리정제할 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 나타내며, 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이것에 한정되지 않음은 명백하다. 또한, 실시예에 있어서, 반응액 중의 UDP-GalNAc의 정량은 HPLC법에 의해 행하였다. 즉, 분리에는 YMC 회사제의 ODS-AQ312 칼럼을 이용하고, 용출액으로서 0.5M 인산 칼륨 용액을 사용하였다. DNA의 조제, 제한효소에 의한 절단, T4 DNA 리가제에 의한 DNA 연결 및 대장균의 형질전환법은 모두 「Molecular cloning」(Maniatis 등 편, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982))을 따라 수행하였다. 제한 효소, ExTaq DNA 중합효소, T4 DNA 리가제는 다카라 바이오(주)에서 입수하였다.

실시예 1

(1) 인간 신장 유래 N-아세틸갈락토사민 키나제를 코드하는 GALK2 유전자의 클론화

인간 신장 유래 cDNA 라이브러리(클론텍사에서 입수 가능)를 주형으로 하여 이하에 나타내는 2종류의 프라이머 DNA를 일반적인 방법을 따라 합성하고, PCR 법에 의해 인간 신장 GALK2 유전자(Submitted to NCBI, Acccssion No.NM_002044)를 증폭하였다.

프라이머(A):5'-CGGGGATCCATGGCTACAGAGAGCCCTGCT-3'

프라이머(B):5'-TACGTCGACTTAGGCCTCAAGCAAAACCAA-3'

PCR에 의한 GALK2 유전자의 증폭은, 반응액 100μl(50mM 염화칼륨, 10mM 트리스 염산(pH 8.3), 1.5mM 염화마그네슘, 0.001％ 젤라틴, 0.2mM dATP, 0.2mM dGTP, 0.2 mM dCTP, 0.2mM dTTP, 주형 DNA O.1ng, 프라이머 DNA (A) 및 (B) 각각0.2μM, ExTaq DNA 중합효소 2.5 유닛)을 다카라 바이오사제 DNA Thermal Cycler Dice를 이용하여, 열변성(94℃, 1분), 어닐링(59℃, 1분), 신장 반응(72℃, 2분)의 스텝을 30회 반복함으로써 수행하였다.

유전자 증폭 후, DNA를 문헌(Molecular Cloning, 전술)의 방법에 따라 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리하고, 1.4kb의 DNA 단편을 정제하였다. 상기 DNA를 제한효소 BamHI 및 SalI으로 소화하고, 같은 제한효소 BamHI 및 SalI으로 소화한 플라스미드 pMAL-c2x(New England BioLabs 사에서 입수)와 T4 DNA 리가제를 이용하여 연결했다. 연결 반응액을 이용하여 대장균 K12주 JM109균(다카라 바이오 주식 회사에서 입수)을 형질전환하고, 얻어진 암피실린 내성 형질전환체로부터 플라스미드 pMAL-hGLK2을 단리하였다. pMAL-hGLK2은 maltose binding protein 유전자의 3' 말단 하류의 BamHI-SalI 절단 부위에 인간 신장 GALK2 구조유전자를 포함하는 BamHI-SalI DNA 단편이 삽입된 것이다.

(2) 인간 신장 GALK2 유전자 산물의 조제 플라스미드 pMAL-hGLK2을 보유하는 대장균 JM109균을, 100μg/ml의 암피실린을 함유하는 배지(2％ Peptone, 1％ 효모엑기스, 0.5％ NaCl, 0.1％ 글루코오스) 100ml에 식균하고, 37℃에서 진탕배양 하였다. 균수가 4×10⁸개/ml에 달한 시점에서 배양액에 최종 농도 0, 0.01, 0.1, 또는 1.0mM의 각 농도가 되도록 IPTG를 첨가하고, 또 25℃에서 20시간 각각 진탕배양을 계속했다. 배양 종료 후, 원심분리(4℃, 9,000×g, 10분)에 의해 균체를 회수하고, 20ml의 완충액(50mM 인산 칼륨(pH 7.5))에 현탁하였다. 브론슨사제 초음파 파쇄기(모델450 소니파)를 이용하여 빙냉하에서 초음파처리를 행하고 (50W, 2분, 3회), 4℃, 12,000×g의 조건 하에서 20분간 원심분리하고, 가용성 분획(상청)을 회수하였다.

상기와 같이 얻어진 상청 획분을 효소 표본(標品)으로 하고, 효소 표본에 있어서의 N-아세틸갈락토사민 키나제 활성을 측정하였다. 그 결과를 하기 표에 나타낸다.

균/플라스미드	IPTG 농도(mM)	N-아세틸갈락토사민 키나제 활성 (유닛/mg 단백질)
JM109/pMAL-hGLK2	0	<0.01
	0.01	0.04
	0.1	0.24
	1.0	0.25

또한, N-아세틸갈락토사민 키나제 활성은, 이하에 나타내는 방법으로 ATP와 GalNAc으로부터 GalNAc1-P으로의 인산화 활성을 측정, 산출한 것이다. 즉, 100mM 트리스 염산 완충액(pH 7.5), 10mM 염화마그네슘, 5mM GalNAc, 5mM ATP·3Na, 5mM불화 나트륨에 N-아세틸갈락토사민 키나제 효소 표본을 첨가해서 37℃에서 10분 반응시킨다. 반응액을 5분간 펄펄 끓여 반응을 정지하고, 당분석기 HPAEC-CD(High-performance anione-exchange chromatography coupled with conductimetric detection)에 의한 분석을 한다. 분리에는 다이오네쿠스 사제의 Carbopac PA1 칼럼(4×250mm)을 사용하고, 용출액으로서 (A) 0.1M NaOH 용액과 (B) 0.1M NaOH, 0. 5M 아세트산 나트륨 용액의 농도구배(0-15분:B=1％-50％, 15-20분:B=100％을 사용한다. HPAEC-CD분석 결과로부터 반응액 중의 GalNAc1-P의 생성량을 산출하고, 37 ℃에서 1분간에 1μmole의 GalNAc1-P을 생성하는 활성을 1단위(유닛))로 한다.

(3) UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제의 조제

대장균(IFO3972=NBRC3972)의 염색체 DNA로부터, 문헌공지의 방법(Biosci, Biotechnol. Biochem., 64(2), 386-392(2000))을 따라 조제한 대장균 JM109 [pTrc-glmU]을 암피실린을 100μg/ml 포함하는 2×YT배지(Methods Enzymol., 153, 3-11, (1987))10ml에서 하룻밤 37℃에서 배양했다. 이것을, 암피실린을 100μg/ml 포함하는 2×YT 배지 500ml에 식균(植菌)하였다. 37℃에서 2시간 배양 후, IPTG을 최종 농도 0.1mM이 되도록 첨가하고, 계속해서 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 배양 종료후, 원심분리(4℃，9,000xg, 20분)에 의해 균체를 회수했다. 회수한 균체를 50mM 트리스 염산(pH 7.5)에 현탁하고, 브란손 사제 초음파 파쇄기(모델 450 소니파)를 이용하여 파쇄 후(50W, 2분, 3회), 4℃, 15,000rpm의 조건 하에서 20분간 원심분리하고, 가용성 분획(상청)을 회수하였다.

이렇게 얻어진 상청 분획을 효소 표본(標品)으로 하고 효소 표본에 있어서의 UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제 활성을 측정했다. 그 결과를 대조균(pTrc99A를 보유하는 대장균 JM109균)과 함께 하기 표 2에 나타낸다.

균/플라스미드	UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제(유닛/mg 단백질
JM109/pTrc99A	0.19
JM109/pTrc-glmU	30.97

또한, UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제 활성은, Biosci. Biotechnol. Biochem ., 64(2), 386-392(2000)에 나타내는 방법, 즉 UDP-GlcNAc과 피롤린 산으로부터 N -아세틸글루코사민 1-인산과 UTP로의 분해 활성을 측정, 산출한 것이다. 즉, 50mM 트리스 염산 완충액(pH 7.5), 5mM 염화마그네슘, 3mM 피롤린산 나트륨, 1mM UDP-GlcNAc에 UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제 효소 표본을 첨가해서 37℃에서 5분 반응시킨다. 또한 피롤린산 나트륨 용액 대신에 물을 이용하여 같은 반응을 행하고, 이것을 컨트롤로 한다.

반응액을 5분간 펄펄 끓여 반응을 정지하고, HPLC에 의한 분석을 행한다. 분리에는 YMC 회사제의 ODS-AQ312 칼럼을 사용하고, 용출액으로서 0.5M 인산-칼륨 용액을 사용한다. HPLC 분석 결과로부터 반응액 중에 생긴 UTP량을 산출하고, 37 ℃ 에서 1분간에 1μmole의 UTP을 생성하는 활성을 1단위(유닛)로 한다.

(4) 대장균 UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제에 의한 UDP-GalNAc의 효소합성

50mM 트리스 염산 완충액(pH7.5), 5mM 염화마그네슘, 1mM 5'-UTP·3Na, 1mM GalNAc1-P을 포함하는 용액 0.5ml에 상기 (3)에서 조제한 소정 활성량의 UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제 효소액(4.8 유닛)을 첨가하고, 37 ℃에서 반응을 수행했다. 반응 도중의 반응액으로부터 적당량을 채취하고, 5분간 펄펄 끓인 후 원심분리해서 그 상청을 HPLC 분석에 제공했다.

반응 개시 후의 반응액을 분석한 결과, 1mM의 UTP과 1mM의 GalNAc1-인산으로부터 0.33mM의 UDP-GalNAc이 합성된 것을 확인했다. 나아가, 반응액에 무기 피로포스파타제(시그마 사제)를 첨가하는 것에 의해 평형이 UDP-GalNAc 합성 쪽으로 기울고, 합성 수율이 향상(60％ 정도 향상)하는 것도 확인했다.

실시예 2

(1) 인간 N-아세틸갈락토사민 키나제 및 대장균 UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제에 의한 UDP-GalNAc의 합성

100mM 트리스 염산 완충액(pH 7.5), 10mM 염화마그네슘, 5mM 5'-UTP·3Na, 5mM GalNAc, 5mM 5'-ATP·3Na, 5mM 불화 나트륨을 포함하는 용액 0.2ml에 상기 실시예 1에서 조제한 소정 활성량의 N-아세틸갈락토사민 키나제 효소액(0.094 유닛)과 UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제 효소액(4.4 유닛) 및 무기 피로호스파타제(시그마사제, 0.5 유닛)를 첨가하고, 37℃에서 반응을 수행했다.

반응 도중의 반응액으로부터 적당량을 채취하고, 5 분간 펄펄 끓인 후 원심분리해서 그 상청을 HPLC분석에 제공했다. 반응 개시 4시간 후의 반응액을 분석한 결과, N-아세틸갈락토사민 키나제, UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제 및 무기 피로포스파타제 존재 하에서, 3.2mM의 UDP-GalNAc이 합성된 것을 확인했다. 또한, N-아세틸갈락토사민 키나제를 존재시키지 않고, UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제 및 무기 피로포스파타제 만의 반응 조건하에서는 UDP-GalNAc은 생성되지 않았다.

실시예 3

(1) 건조 효모와 인간 N-아세틸갈락토사민 키나제 및 대장균 UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제를 이용한 UDP-GalNAc의 합성

200mM 글루코오스, 50mM GalNAc, 50mM UMP, 200mM 인산 칼륨(pH 8.0), 20mM염화마그네슘, 3％（w/v) 건조 빵효모(오리엔탈 효모 공업)을 포함하는 용액 1ml에, 실시예 1에서 조제한 재조합 효소(N-아세틸갈락토사민 키나제; 0.32 유닛, UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제; 10.4 유닛)을 첨가하고, 26 ℃에서 300rpm의 교반속도로 교반하면서 반응를 수행하였다. 또한, 반응 개시 16, 24, 40, 48시간에 2M의 글루코오스 용액을 0.1mL씩 반응액에 첨가했다. 경시적으로 반응액을 분석한 결과를 도 2에 나타낸다. UDP-GalNAc의 축적량은 반응 49시간에서 32mM에 달했다.

실시예 4

실시예 2 및 3에서는 2종류의 효소를 사용한 반응예를 나타냈지만, 여기에서는 2종류의 효소를 융합 단백질로서 생산한 것을 이용해서 UDP-GalNAc 합성 반응을 행한 결과를 나타낸다.

(1) 대장균 UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제와 인간 신장 유래 N-아세틸갈락토사민 키나제의 융합

대장균 UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제 유전자 발현용 플라스미드, pTrc-glmU를 주형으로 하고, 이하에 나타내는 2종류의 프라이머 DNA를 일반적인 방법을 따라 합성하고, PCR 법에 의해 glmU 유전자를 포함하는 DNA 단편을 증폭했다.

프라이머(C):5'-GAGCGGATAACAATTTCAC-3'

프라이머(D):5'-CCAGGATCCCTTTTTCTTTACCGGACGACG-3'

PCR에 의한 glmU 유전자를 포함하는 DNA 단편의 증폭은, 반응액 100μl(50mM염화칼륨, 10mM 트리스 염산(pH 8.3), 1.5mM 염화마그네슘, 0.001％ 젤라틴, 0.2mM dATP, 0.2mM dGTP, 0.2mM dCTP, 0.2mM dTTP, 주형 DNA 0.1ng , 프라이머 DNA (C) 및 (D) 각각 0.2μM, ExTaq DNA 중합효소 2.5 유닛)을 다카라 바이오사제 DNA Thermal Cyclcr Dice를 이용하여 열변성(94℃, 1분), 어닐링(64℃, 1분), 신장반응(72℃, 2분)의 스텝을 30회 반복함으로써 수행하였다.

DNA 단편 증폭 후, DNA를 문헌(Molecular Cloning, 전술)의 방법에 따라서 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리하고, 1.4kb의 DNA 단편을 정제했다. 상기 DNA를 제한효소 EcoRI 및 BamHI으로 소화하고, 같은 제한효소 EcoRI 및 BamHI으로 소화한 플라스미드 pTrc99A(Pharmacia사에서 입수)이라고 T4 DNA 리가제를 사용하여 연결했다.

연결 반응액을 이용하여 대장균 K12주 JM109균(다카라 바이오 주식회사에서 입수)을 형질전환 하고, 얻어진 암피실린 내성 형질전환체로부터 플라스미드 pTrc-glmU3을 단리했다. pTrc-g㎞U3의 glmU 유전자는, 종시(終始) 코돈이 없고 그 대신 BamHI 인식 부위가 삽입된 것이다.

다음으로, pTrc-hGLK2을 제한효소 BamHI와 SalI으로 소화하고, 1.4kb 상당의 DNA 단편을 단리·정제했다. 이것을 같은 제한효소 BamHI와 SalI으로 소화한 플라스미드 pTrc-gllnU3과 T4 DNA 리가제를 이용하여 연결했다. 연결 반응액을 이용하여 대장균 JM109균을 형질전환하고, 얻어진 암피실린 내성 형질전환체로부터 플라스미드 pTrc-glmU·hGLK2을 단리했다. pTrc-gln1U·hGLK2은, g㎞U 유전자의 3'-말단 하류에 프레임을 가지런히 정돈하여 hGLK2 유전자가 연결된 것이다. 다음에 pTrc-glmU·hGLK2을 제한효소 SacI과 SalI으로 소화하고, 1.4kb 상당의 DNA 단편을 단리·정제했다. 이것을 같은 제한효소 SacI과 SalI으로 소화한 플라스미드 pTrc12-6과 T4 DNA 리가제를 사용하여 연결했다. 연결 반응액을 이용하여 대장균 DH1주(ATCC 33849)을 형질전환 하고, 얻어진 가나마이신 내성 형질전환체로부터 플라스미드 p12-6-glmU·hGLK2을 단리했다.

또한, 플라스미드 pTrc12-6은 플라스미드 벡터 πAG1(플라스미드 벡터 πAG1을 보유한 대장균 K-12주 TNC111균의 기탁번호: FERM BP-6901호: 평성 11년 9월 30일 기탁)과 발현 플라스미드 pTrc99A를 기초로 구축되어, pTrc99A의 β-락타마제 유전자가 완전하게 결실되어 있으며(position 567-1816 bp가 결실), 그 결실 부위에 Tn903 유래의 가나마이신 내성 유전자가 삽입된 것이다(일본국 공개특허공보 특개 2001-103973).

(2) 대장균 glmU 유전자 산물과 인간 신장 GALK2 유전자 산물의 융합 단백질의 조제

플라스미드 p12-6-glmU·hGLK2을 보유하는 대장균 DH1주를, 100μg/ml의 가나마이신을 함유하는 배지(2％ Peptone, 1％ 효모 엑기스, 0.5％ NaCl, 0.1％ 글루코오스) 50ml에 식균하고, 37℃에서 진탕배양 했다. 균수가 4×10⁸개/ml에 달한 시점에서 배양액에 최종농도 0.1mM이 되도록 IPTG을 첨가하고, 또 25℃에서 20시간 진탕배양을 계속했다. 배양 종료 후, 원심분리(4℃, 9,000×g, 10분)에 의해 균체를 회수하고, 20ml의 완충액(50mM 인산 칼륨(pH 7.5))에 현탁했다. 빙냉(氷冷) 하에서 초음파 처리에 의해 균체를 파쇄하고, 또 원심분리(4℃, 12,000×g, 10분)에 의해 균체 찌꺼기를 제거했다.

이렇게 하여 얻어진 상청 획분을 효소 표본으로 하고 효소 표본에 있어서의 UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제 활성 및 N-아세틸갈락토사민 키나제 활성을 실시예 1에 기재된 방법으로 측정했다. 그 결과를 하기 표 3에 나타낸다.

균/플라스미드	UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제 활성(유닛/mg 단백질）	N-아세틸갈락토사민 키나제활성(유닛/mg 단백질)
DH1/pTrc12-6	0.16	<0.01
DH1/p12-6-glmU·hGLK2	9.11	0.18

(3) 융합 단백질을 이용한 UDP-GalNAc의 합성

상기 융합 효소 표본을 이용해서 UDP-GalNAc를 합성하였다. 즉, 200mM 글루코오스, 50mM GalNAc, 28mM UMP, 200mM 인산 칼륨(pH 8.0), 20mM 염화마그네슘, 3％（w/v) 건조 빵효모(오리엔탈 효모 공업)를 포함하는 2.5mL 용액에, 상기 재조합융합효소액(N-아세틸갈락토사민 키나제; 1.75 유닛, UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제; 88.9 유닛)을 첨가하고, 27℃, 100rpm에서 교반하면서 반응을 수행했다. 반응 개시로부터 14, 24, 40 시간에 글루코오스를 0.09g 반응액에 첨가했다. 또한 반응 개시 24시간 후에 0.5M의 UMP 용액 110μ1을 반응액에 첨가했다.

경시적으로 반응액을 분석한 결과를 도 3에 나타낸다. 융합 단백질을 이용한 경우에도, 개개로 조제한 양 효소를 혼합하여 사용한 경우와 거의 동등하게 UDP-GalNAc가 합성되어 반응 40시간에서 UDP-GalNAc은 30mM에 달했다.

(4) 대장균 glmU 유전자 산물과 인간 신장 GALK2 유전자 산물의 융합 단백질의 조제(스케일업)

플라스미드 p12-6-glmU·hGLK2을 보유하는 대장균 DH1주를, 100μg/ml의 가나마이신을 함유하는 배지(2％ Peptone, 1％ 효모 엑기스, 0.5％ NaCl, 0.1％ 글루코오스) 3mL에 접종하고, 37℃에서 밤새 진탕배양 했다. 이 배양액의 전량을 125mL의 같은 배지에 접종하고, 37℃에서 8부터 11시간 진탕배양 했다. 이 배양액 전량을 5L의 같은 배지에 식균하고, 37 ℃, 통기량 1.Ovvm, 교반날개 회전수 300rpm의 조건으로 배양했다.

균수가 4×10⁸개/ml에 달한 시점에서 배양액에 최종 농도 0.1mM이 되도록 IPTG을 첨가하고, 배양 온도를 28℃로 내려서 14시간 배양을 계속했다. 배양 종료 후, 균체를 원심분리(9,000×g, 10분)에 의해 회수하고, 500ml의 완충액(50mM 인산 칼륨(pH 7.5))에 현탁했다. 빙냉하에서 초음파 처리에 의해 균체를 파쇄한 뒤, 원심분리(12,000×g, 10분)에 의해 균체 찌꺼기를 제거했다.

이렇게 얻어진 상청 획분을 효소 표본으로 하여 UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제 활성을 실시예 1에 기재된 방법으로 측정했다. 그 값은 9.50 유닛/mg 단백질이었다.

(5) UDP-GalNAc 합성 반응의 스케일업

융합효소 표본을 이용한 UDP-GalNAc 합성 반응을 스케일업 하여 자펀멘터에서 행하였다. 즉, 200mM 글루코오스, 50mM N-아세틸갈락토사민, 28mM UMP, 200mM 인산 칼륨(pH 8.0), 20mM 염화마그네슘, 3％（w/v) 건조 빵효모(오리엔탈 효모 공업) 및 상기 재조합 융합 효소액(UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제 활성으로 하여 525,000 유닛)을 첨가해서 1,500mL로 필업하고, 27 ℃, 통기량 0.1vvm, 교반날개 회전수 150rpm의 조건으로 반응을 행했다. 반응 개시로부터 14, 24, 38시간에 글루코오스를 54g 반응액에 첨가했다. 또한, 반응 개시 24시간 후에 0.5M의 UMP 용액 66mL을 반응액에 첨가했다.

경시적으로 반응액을 분석한 결과를 도 4에 나타낸다. 자퍼멘터에서 반응한 경우에도, UDP-GalNAc이 합성되어 반응 40시간에서 UDP-GalNAc은 35mM에 달했다.

<수탁증>

<110> YAMASA CORPORATION <120> Process for producing uridine 5'-diphospho-N-acetylgalactosamine <150> JP2004-306783 <151> 2004-10-21 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of GALK2 gene <400> 1 cggggatcca tggctacaga gagccctgct 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of GALK2 gene <400> 2 tacgtcgact taggcctcaa gcaaaaccaa 30 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of glmU gene <400> 3 gagcggataa caatttcac 19 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of glmU gene <400> 4 ccaggatccc tttttcttta ccggacgacg 30

Claims

우리딘 5'-트리 인산(UTP)과 N-아세틸갈락토사민 1-인산(GalNAc1-P)으로부터 우리딘 5'-디인산-N-아세틸갈락토사민(UDP-GalNAc)을 효소적으로 제조하는 방법에 있어서,

효소로서 미생물(단, 병원성 미생물을 제외한다) 유래의 우리딘 5'-디인산-N-아세틸글루코사민 피로포스포릴라제(UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제)를 이용하는 것을 특징으로 하는 UDP-GalNAc의 제조법.
제1항에 있어서, 상기 UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제가 미생물 유래의 UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제 유전자를 이용한 재조합 DNA 방법으로 조제된 것을 특징으로 하는 UDP-GalNAc의 제조법.
제2항에 있어서, 상기 미생물 유래의 UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제 유전자가 대장균 유래의 UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제 유전자(glmU)인 것을 특징으로 하는 UDP-GalNAc의 제조법.
제1항에 있어서, 상기 UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제에 의한 UDP-GalNAc의 합성에 있어 반응계에 생성하는 피롤린산을 분해하는 효소를 첨가하는 것을 특징으로 하는 UDP-GalNAc의 제조법.
제1항에 있어서, 상기 Ga1NAc1-P이, N-아세틸갈락토사민 키나제를 사용하여, N-아세틸갈락토사민과 인산공여체로부터 반응계 내에서 조제된 것을 특징으로 하는 UDP-GalNAc의 제조법.
제5항에 있어서, 상기 인산공여체가, 아데노신 5'- 트리 인산(ATP)인 것을 특징으로 하는 UDP-GalNAc의 제조법.
제6항에 있어서, 상기 아데노신 5'-트리 인산(ATP)이 효모 균체에 의해 생성되는 것을 특징으로 하는 UDP-GalNAc의 제조법.
제5항에 있어서, N-아세틸갈락토사민 키나제가 동물 유래의 N-아세틸갈락토사민 키나제 유전자를 이용한 재조합 DNA 방법으로 조제된 것을 특징으로 하는 UDP-GalNAc의 제조법.
제5항에 있어서, 상기 N-아세틸갈락토사민 키나제가, 재조합 DNA 방법을 이용하여 미생물 유래의 단백질과의 융합단백질의 형태로 조제된 것을 특징으로 하는 UDP-GalNAc의 제조법.
제9항에 있어서, 동물 유래의 N-아세틸갈락토사민 키나제 유전자(GALK2)를 다른 미생물 유래의 단백질을 코드하는 유전자의 3' 말단의 하류에 연결하는 것으로 상기 융합단백질을 조정하는 것을 특징으로 하는 UDP-Ga1NAc의 제조법.
제5항에 있어서, 상기 N-아세틸갈락토사민 키나제가, 미생물 유래의 UDP-GlcNAc 피로포스포릴라제와의 융합단백질의 형태로 조제된 것을 이용하는 것을 특징으로 하는 UDP-GalNAc의 제조법.
제5항에 있어서, 상기 N-아세틸갈락토사민 키나제에 의해 조제된 GalNAc1-P의 분해를 방지하는 불화염을 첨가하는 것을 특징으로 하는 UDP-GalNAc의 제조법.
제1항에 있어서, 상기 UTP의 일부 혹은 전부를 이용하는 대신에, 미생물 균체나 효소를 사용한 UTP 생성/재생계를 병용한 것을 특징으로 하는 UDP-GalNAc의 제조법.
제1항에 있어서, 상기 UTP의 일부 혹은 전부를 이용하는 대신에, 우리딘 5'-모노인산(UMP)과 효모 균체를 사용한 UMP로부터의 UTP 생성계를 병용한 것을 특징으로 하는 UDP-GalNAc의 제조법.
제14항에 있어서, 상기 효모 균체로서, 사카로마이세스 속, 치고삿카로마이세스 속, 칸디다 속, 톨로푸시스 속, 한세눌라 속, 데바리오마이세스 속으로부터 선택되는 1 또는 2 이상의 효모 유래의 균체를 사용하는 것을 특징으로 하는 UDP-GalNAc의 제조법.
제14항에 있어서, 상기 효모 균체로서, 건조 효모 균체를 사용하는 것을 특징으로 하는 UDP-GalNAc의 제조법.
제14항에 있어서, 상기 효모 균체를 사용하는 반응에, 무기 인산을 첨가하는 것을 특징으로 하는 UDP-GalNAc의 제조법.
제14항에 있어서, 상기 효모 균체를 사용하는 반응에, 소요(所要)의 에너지원을 첨가하는 것을 특징으로 하는 UDP-GalNAc의 제조법.