CN111500660A - 一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的合成方法 - Google Patents
一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的合成方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111500660A CN111500660A CN202010324378.2A CN202010324378A CN111500660A CN 111500660 A CN111500660 A CN 111500660A CN 202010324378 A CN202010324378 A CN 202010324378A CN 111500660 A CN111500660 A CN 111500660A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- synthesizing
- reaction
- sph
- concentration
- triphosphate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 150000002270 gangliosides Chemical class 0.000 title description 6
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 title description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 116
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 22
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims abstract description 19
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 29
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- PGAVKCOVUIYSFO-UHFFFAOYSA-N uridine-triphosphate Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 PGAVKCOVUIYSFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- PGAVKCOVUIYSFO-XVFCMESISA-N UTP Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 PGAVKCOVUIYSFO-XVFCMESISA-N 0.000 claims description 19
- 229950010342 uridine triphosphate Drugs 0.000 claims description 19
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 claims description 17
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 17
- LFTYTUAZOPRMMI-NESSUJCYSA-N UDP-N-acetyl-alpha-D-galactosamine Chemical compound O1[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C)[C@H]1O[P@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 LFTYTUAZOPRMMI-NESSUJCYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 12
- HSCJRCZFDFQWRP-ABVWGUQPSA-N UDP-alpha-D-galactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-ABVWGUQPSA-N 0.000 claims description 11
- HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N Uridindiphosphoglukose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 11
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- PCDQPRRSZKQHHS-CCXZUQQUSA-N Cytarabine Triphosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 PCDQPRRSZKQHHS-CCXZUQQUSA-N 0.000 claims description 9
- OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N N-Acetyl-D-Galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N 0.000 claims description 9
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 9
- 101000638915 Arabidopsis thaliana UDP-sugar pyrophosphorylase Proteins 0.000 claims description 8
- 101710111023 GTPase Obg/CgtA Proteins 0.000 claims description 8
- 101000662009 Homo sapiens UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase Proteins 0.000 claims description 8
- 101100174763 Mus musculus Galk1 gene Proteins 0.000 claims description 8
- 102100037921 UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase Human genes 0.000 claims description 8
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 8
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 claims description 7
- WWUZIQQURGPMPG-KRWOKUGFSA-N sphingosine Chemical compound CCCCCCCCCCCCC\C=C\[C@@H](O)[C@@H](N)CO WWUZIQQURGPMPG-KRWOKUGFSA-N 0.000 claims description 7
- WWUZIQQURGPMPG-UHFFFAOYSA-N (-)-D-erythro-Sphingosine Natural products CCCCCCCCCCCCCC=CC(O)C(N)CO WWUZIQQURGPMPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 6
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims description 5
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 claims description 5
- GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N methanol;hydrate Chemical compound O.OC GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000010992 reflux Methods 0.000 claims description 4
- 238000002390 rotary evaporation Methods 0.000 claims description 4
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 claims description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 claims description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 3
- 229910001437 manganese ion Inorganic materials 0.000 claims description 3
- WTBAHSZERDXKKZ-UHFFFAOYSA-N octadecanoyl chloride Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(Cl)=O WTBAHSZERDXKKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 claims description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 3
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 claims description 2
- BXZBGYJQEFZICM-UHFFFAOYSA-N icosanoyl chloride Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(Cl)=O BXZBGYJQEFZICM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 claims description 2
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 claims description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 2
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 claims 11
- 125000005257 alkyl acyl group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 6
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract description 4
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 abstract description 3
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 abstract 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 40
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 17
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N (+)-Galactose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N 0.000 description 6
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 6
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- XTHFKEDIFFGKHM-UHFFFAOYSA-N Dimethoxyethane Chemical compound COCCOC XTHFKEDIFFGKHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KBGAYAKRZNYFFG-BOHATCBPSA-N aceneuramic acid Chemical compound OC(=O)C(=O)C[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO KBGAYAKRZNYFFG-BOHATCBPSA-N 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 229940050906 magnesium chloride hexahydrate Drugs 0.000 description 3
- DHRRIBDTHFBPNG-UHFFFAOYSA-L magnesium dichloride hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[Cl-].[Cl-] DHRRIBDTHFBPNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 3
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- TTWYZDPBDWHJOR-IDIVVRGQSA-L adenosine triphosphate disodium Chemical compound [Na+].[Na+].C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O TTWYZDPBDWHJOR-IDIVVRGQSA-L 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 229940106189 ceramide Drugs 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 2
- SOBHUZYZLFQYFK-UHFFFAOYSA-K trisodium;hydroxy-[[phosphonatomethyl(phosphonomethyl)amino]methyl]phosphinate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].OP(O)(=O)CN(CP(O)([O-])=O)CP([O-])([O-])=O SOBHUZYZLFQYFK-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YDNKGFDKKRUKPY-JHOUSYSJSA-N C16 ceramide Natural products CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)N[C@@H](CO)[C@H](O)C=CCCCCCCCCCCCCC YDNKGFDKKRUKPY-JHOUSYSJSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- CRJGESKKUOMBCT-VQTJNVASSA-N N-acetylsphinganine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCC[C@@H](O)[C@H](CO)NC(C)=O CRJGESKKUOMBCT-VQTJNVASSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical class [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007036 catalytic synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- ZVEQCJWYRWKARO-UHFFFAOYSA-N ceramide Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)C(=O)NC(CO)C(O)C=CCCC=C(C)CCCCCCCCC ZVEQCJWYRWKARO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001783 ceramides Chemical class 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- YVBGRQLITPHVOP-UHFFFAOYSA-L disodium;[hydroxy-[hydroxy(oxido)phosphoryl]oxyphosphoryl] hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])(=O)OP(O)(=O)OP(O)([O-])=O YVBGRQLITPHVOP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- QPJBWNIQKHGLAU-IQZHVAEDSA-N ganglioside GM1 Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC[C@H](NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC)[C@H](O)\C=C\CCCCCCCCCCCCC)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@]2(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C2)[C@H](O)[C@H](O)CO)C(O)=O)[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](CO)O1 QPJBWNIQKHGLAU-IQZHVAEDSA-N 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000001841 imino group Chemical group [H]N=* 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000002085 irritant Substances 0.000 description 1
- 231100000021 irritant Toxicity 0.000 description 1
- 238000002761 liquid phase assay Methods 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 1
- CNFDGXZLMLFIJV-UHFFFAOYSA-L manganese(II) chloride tetrahydrate Chemical compound O.O.O.O.[Cl-].[Cl-].[Mn+2] CNFDGXZLMLFIJV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003955 neuronal function Effects 0.000 description 1
- VVGIYYKRAMHVLU-UHFFFAOYSA-N newbouldiamide Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)C(O)C(O)C(CO)NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC VVGIYYKRAMHVLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 1
- 238000012803 optimization experiment Methods 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 1
- 239000006104 solid solution Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明涉及一种工业合成单唾液酸四己糖神经节苷脂的方法，以氟代乳糖(Lac‑F)为原料，经过10种酶催化的五步连续反应制备单唾液酸四己糖神经节苷脂，并达到由克级至公斤级的制备规模，从而满足了工业生产GM1的需求，取代了传统从猪脑提取的工艺路线。另外，本专利将制备单唾液酸四己糖神经节苷脂的工艺缩短为五步，并且在前三个步骤中未纯化中间产物，减少了因中间步骤纯化引起的产品损耗，节约了时间成本。
Description
【技术领域】
本发明涉及一种工业合成单唾液酸四己糖神经节苷脂的方法，属于生物化学催化合成技术领域。
【背景技术】
单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)，系自猪脑中提取制得的对神经细胞功能损伤具有作用的物质。其结构包括疏水的神经酰胺和亲水的带有唾液酸的寡糖链，两端通过糖苷键连接在一起。疏水的神经酰胺主要包含鞘氨醇和脂肪酸，二者通过亚氨基连接。鞘氨醇由多羟基脂肪胺构成，链长为18或20个碳原子，其结构式为：
现有技术对于GM1的提取都立足于提高产品纯度、收率，降低产品成本，减少毒害有机溶剂的使用量等方面进行了大量的研究并且市场已有单唾液酸四己糖神经节苷脂注射液、注射用单唾液酸四己糖神经节苷脂等多种产品在销售使用。由于来源于生物原料猪脑，目前的提取技术不够精细，采用生物化学合成的方式获得的GM1是比较理想的方式。目前，合成GM1的技术存在一定的缺陷，合成周期长，步骤繁多，转化率低。截止目前，有研究利用氟代乳糖为原料制备肿瘤疫苗GM3，而尚未有以氟代乳糖(Lac-F)为原料制备GM1的专利技术；另外，有文献(“Strategies for chemoenzymatic synthesis of carbohydrates”Wanqing Li,John B.McArthur,Xi Che等，Carbohydrate research,2019年第472期，第86-97页)利用鞘氨醇(Sphingosine)取代Lac-F中的氟而制备Lac-Sph，进而制备GM1的方案，但该方案存在转化率低、每步反应均要纯化的缺点，该过程增加了产品制备中的时间成本和劳动成本。另外有文献(“One-pot multi-enzyme(OPME)systems for chemoenzymaticsynthesis of carbohydrates.”Hai Yu and Xi Chen等，Org.Biomol.Chem.,2016年第14期第2809-2818页)介绍了以GalA作为底物利用多种酶合成UDP-GalNAc，但目前尚未有研究利用此方法高效合成GM1或其中间产物。
因此需要一种周期短、步骤简便、成本低的GM1合成方法。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种单唾液酸四己糖神经节苷脂GM1的合成方法。
为了实现上述目的，本发明的单唾液酸四己糖神经节苷脂GM1的合成，所述方法包括如下步骤：
1.采用NmCSS、PmST1和PmPpA三种酶将氟代乳糖(Lac-F)、唾液酸(Neu5Ac)和三磷酸胞苷(CTP)催化生成GM3-F；
其中，所述底物氟代乳糖的摩尔浓度优选为10-40mM，更优选30mM；
所述底物氟代乳糖、唾液酸与三磷酸胞苷的摩尔浓度比优选为1：(1.2-2)：(1.3-2)；更优选1:1.7:1.6；
所述NmCSS的用量优选为80-140U，更优选100U；
所述PmST1的用量优选为80-220U，更优选180U；
所述反应温度优选为10-40℃，更优选30℃；
所述反应的pH值优选为7-9，更优选为9。
2.采用N-乙酰半乳糖胺(GalNac)与三磷酸尿苷(UTP)、三磷酸腺苷(ATP)在NahK、AGX1两种酶的作用下先生成中间产物UDP-GalNac(步骤S1)，然后UDP-GalNac与底物GM3-F在酶CgtA的作用下催化生成GM2-F(步骤S2)。
其中，在步骤S1反应中：
所述GalNac的浓度优选20-50mM，更优选30mM；
所述底物GalNac、ATP与UTP的摩尔浓度比优选为1：(1.2-1.3)：(1.2-1.3)，更优选1:1.3:1.2；
所述NahK的用量优选为200-260U，更优选为240U；
所述AGX1的用量优选为120-270U，更优选为170U；
所述反应温度优选为30-42℃，更优选为37℃；
所述反应的pH值优选为7-9，更优选为9。
进一步地，在步骤S2反应中：
所述GM3-F的浓度优选10-30mM，更优选15mM；
所述底物GM3-F、UTP-GalNac摩尔浓度比优选为1：1；
所述CgtA添加量优选100-300U，更优选为200U；
所述反应温度优选为25-40℃，更优选为37℃；
所述反应的pH值优选为7-9，更优选为9。
3.采用半乳糖和ATP、UTP在GalK、AtUSP两种酶的作用下生成中间产物UDP-Gal(步骤S3)；UDP-Gal与GM2-F在酶CgtB的作用下生产GM1-F(步骤S4)。
其中，在所述步骤S3中：
所述底物Gal的浓度范围优选20-80mM，更优选40mM；
所述底物Gal、ATP、UTP的摩尔浓度比优选为1:(1-1.2):(1-1.3)，更优选1:1.1:1.2；
所述反应温度范围优选为30-40℃，更优选37℃；
所述反应pH值范围优选为7-9，更优选8；
所述反应酶GalK的添加量优选40-120U，更优选100U；
所述反应酶AtUSP的添加量优选20-80U，更优选40U；
所述反应还包含激活剂为金属离子Mg+，其添加量优选5-20mM，更优选5mM。
进一步地，在所述步骤S4中：
所述底物GM2-F的浓度范围优选10mM；
所述底物GM2-F、UDP-Gal的摩尔浓度比优选为1:1；
所述反应温度范围优选为25-40℃，更优选37℃；
所述反应pH值范围优选为7-9，更优选7.5；
所述反应金属离子Mn+的添加量优选5-20mM，更优选10mM；
所述反应酶CgtB的添加量优选40-160U，更优选120U。
4.采用酶EGC II将GM1-F和鞘氨醇(Sph)在含乙醇体系下催化生成GM1-Sph；
5.GM1-Sph与十八碳酰氯分别溶解后合成GM1-C18，或者与二十碳酰氯分别溶解后合成GM1-C20。
本发明用到的酶为行业术语英文简称，其名称与简称对照表如下：
本发明另外一个目的是提供一种四己糖神经节苷脂中间体GM1-Sph的提纯工艺，具体为：
GM1-Sph经离子交换柱吸附、超滤浓缩和C18柱层析提纯。
进一步地，GM1-Sph的提纯工艺如下：
1.向GM1-Sph混合溶液中加入1:1当量乙醇，调节pH值，静止过夜后离心取上层清液；
2.对步骤1中获得液体进行超滤，取上层回流液；
3.旋转蒸发去除回流液中乙醇后，采用柱层析分离GM1-Sph；
4.旋转蒸发去除步骤3)中引入的甲醇，然后冻干液体，获得白色固体粉末即GM1-Sph。
进一步地，步骤1中所述pH值范围为5-9；
进一步地，步骤2中所述超滤采用聚酰胺复合膜或聚醚砜复合膜，截留分子量范围为300-500D；
进一步地，步骤3中所述柱层析填料为C18材料；
进一步地，步骤3中所述柱层析分离方法采用水-甲醇体系；
进一步地，步骤3中所述柱层析流程为：先用水冲洗层析柱，然后用体积分数为50％甲醇水溶液冲洗柱体积至无杂质，再用体积分数为80％甲醇水溶液冲洗下产物，最后采用100％甲醇洗柱。
通过上述制备方法及提纯工艺制备得到的GM1纯度为99％以上，HPLC图见附图1，质谱图见附图9B。
其中，HPLC结果如下：
进一步地，由于GM1的分子量已知，通过一级质谱分析所得分子量为1590，所得GM1即为目标产物。
本发明的有益效果：
1.本发明采用沉降、超滤和柱层析等手段将GM1-Sph纯度提高到99％。与未处理样品相比，采用本发明所述纯化工艺提纯后GM1-Sph产品中基本不含有盐类、有机溶剂、裸糖和糖核苷酸。同时，该方案也适用于食品和药品领域提纯GM1-Sph，有利于工业上的大规模获取GM1-Sph。
2.以氟代乳糖(Lac-F)为原料通过10种酶的催化作用生成GM1，相比现有技术避免了每步反应均要纯化的缺点，整个制备路线周期短、步骤简便、成本低。
3.步骤4中加入适量乙醇而不是乙二醇二甲醚，在改善了鞘氨醇和GM1-Sph在反应中的溶解度的同时，避免了刺激性有机溶剂乙二醇二甲醚的使用。
【附图说明】
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1是本发明实施例1合成的GM1的高效液相色谱图。
图2是本发明实施例1中氟代乳糖的消耗与生成GM3-F的薄层色谱图。
图3A是本发明实施例1中N-乙酰半乳糖胺的消耗与生成UDP-GalNac的薄层色谱图。
图3B是本发明实施例1中生成UDP-GalNac的高效液相色谱图。
图4是本发明实施例1中GM3-F的消耗与生成GM2-F的薄层色谱图。
图5A是本发明实施例1中D-半乳糖的消耗与生成UDP-Gal的薄层色谱图。
图5B是本发明实施例1中生成UDP-Gal的高效液相色谱图。
图6是本发明实施例1中GM2-F的消耗与生成GM1-F的薄层色谱图。
图7是本发明实施例1中GM1-F的消耗与生成GM1-sph的薄层色谱图。
图8是本发明实施例3纯化后的GM1-Sph的高效液相色谱图。
图9A是本发明实施例4中GM1-Sph的消耗与生成GM1的薄层色谱图。
图9B是本发明实施例4中生成GM1的质谱图。
【具体实施方式】
为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰明白，以下结合附图和具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并不是为了限定本发明。
实施例1：
步骤1：在2L发酵罐中依次加入10.23g氟代乳糖、12.98g唾液酸五钠、26.85g三磷酸胞苷二钠和6.09g六水合氯化镁，用氢氧化钠调节pH至9。然后加入100U NmCSS、172UPmST1和8.8mg PmPPA，加水补齐至800mL。在30℃下反应4h，通过TLC检测Lac-F与GM3-F的消耗与生成情况，TLC检测见图2。
步骤2：在另一2L发酵罐中依次加入6.63g N-乙酰半乳糖胺(GalNac)、21.49g三磷酸腺苷二钠，19.8g三磷酸尿苷三钠和6.09g六水合氯化镁，用氢氧化钠调节pH至8。然后加入用氢氧化钠调节pH至8，加入240U NahK、170U Agx1、8.8mg PmPPA加水补齐至1mL，在37℃反应4h，TLC检测反应进程，TLC检测见图3A，HPLC对UDP-GalNac定量，见图3B。将获得的反应液与GM3-F反应液混合后调节pH到8，并加入200U CgtA在37℃下反应4h，通过TLC检测GM3-F与GM2-F的消耗与生成情况，TLC检测见图4。
步骤3：在2L发酵罐中加入1500mL GM2-F的反应液，依次加7.2g D-半乳糖(D-Gal)、24g三磷酸腺苷二钠、26g三磷酸尿苷三钠、4.06g六水合氯化镁，92U GalK、32U AtUSP和8.8mg PmPPA，补水至1L在37℃反应4h，TLC检测反应进程，TLC检测见5A，HPLC对UDP-Gal定量，TLC检测见图5B。将获得的反应液与GM3-F反应液混合后调节pH到8，1.9g四水合氯化锰，200U CgtB，在37℃、pH 8反应4h，通过TLC检测GM2-F与GM1-F的消耗与生成情况，TLC检测见图6。
步骤4：在2L发酵罐中依次加入1.7L GM1-F反应液和4g鞘氨醇，再加入体积分数10％的乙醇，以及100U EGC II。37℃在pH值5.3过夜反应12h，通过TLC检测GM1-F与GM1-sph的消耗与生成情况，TLC检测见图7。
实施例2：提纯GM1-Sph
用1M NaOH调节步骤四中反应液，pH调整至7.5；然后加入800mL乙醇，过夜沉降然后离心。清液用1L离子交换填料DEAE静态吸附2h。取出清液，用过膜机过膜：压力为8-9kg，膜：300-500D聚酰胺复合膜。超滤至溶液完全干涸，向2000mL烧杯中加入400mL无水乙醇，再超滤至完全干涸，反复两次后加入100mL水将产品洗出，过0.22μm膜抽滤，约获得溶液50mL。将上一步获得的水溶液加入120g Fresh柱中，填料为50μm tC18，洗脱条件为：500mL100％水——500mL 50％甲醇水——1200mL 80％甲醇水——500mL 100％甲醇。将含有样品的组分取下，旋转蒸发至80mL去除甲醇(37℃，压力为0.1个大气压)。将上一步获得溶液加入至150*150mm培养皿中，在负八十冰箱中冰冻12h，取出后放入离位式冻干机中，冻干48h，获得固体。
实施例3：GM1-Sph高效液相检测
将上一步获得的白色固体，取1mg溶于1mL水溶液中，过0.22μm膜。处理后用高效液相色谱检测。洗脱条件见表1，检测条件为：
高效液相色谱仪：Unimicro ChromStation，色谱柱：Ultimate XB-C18(月旭，4.6×250mm，3.5μm)，流动相A：异丙醇:甲醇:乙腈＝35:40:25；流动相B：水；流速：0.8mL/min；温度40℃，柱温为40℃、检测器为蒸发光散射器(流量为2.50L/min)。
纯化前后结果HPLC见图8，GM1-Sph保留时间为9.5min，纯度大于99％，回收率为90％。
表1：洗脱条件
实施例4：
将3g GM1-Sph用30mL饱和碳酸氢钠溶解，滴加20mL四氢呋喃所溶解的1.5mL十八酰氯，室温搅拌反应12h，对生成的GM1进行TLC检测见附图9A，质谱图见附图9B。
由于GM1的分子量已知，通过一级质谱分析所得分子量为1590，所得GM1即为目标产物。
实施例5：GM1高效液相检测
高效液相色谱仪：Unimicro ChromStation，色谱柱：C18(Waters，4.6×150mm，3.5μm)，流动相A：0.01mol·L-1磷酸二氢钾溶液—乙腈(30:70)，用三乙胺调节pH＝7.0；流动相B：乙腈。流速：1.0mL·min-1，检测波长205nm，进样体积：20μL，柱温：40℃。
采用梯度洗脱程序见表2：
表2：梯度洗脱程序
其中，HPLC结果如下：
实施例6-19
条件优化实验：通过以下对照实验组寻找最佳反应条件。
针对实施例6-19，分别按照实施例1中的步骤1-4分别进行反应底物比、反应温度、反应pH、酶的添加量等因素进行了实验(列表)。
表3为实施例6-19分别对步骤1的GM3-F反应进行的实验，并与实施例1进行对照。最终实施例1在Lac-F为底物的浓度为30mM，Lac-F:Neu5Ac:CTP的底物摩尔浓度比为1:1.7:1.6，反应温度为30℃，pH为9.0，NmCSS添加量100U，PmST1添加量180U时反应效果最好，底物在酶的作用下能完全转化为GM3-F。
反应底物Lac-F浓度偏低或偏高时不利于反应的完全转化，浓度偏低时反应动力不够，浓度高时分子之间的作用力加强不利于反应的进行；另外反应与底物Lac-F、Neu5Ac、CTP的摩尔浓度比也有关系，Neu5Ac和CTP相对于Lac-F的量偏高与偏低均不利于反应的完全转化；反应的pH值、温度对酶的活性影响较大，只有在条件温和的pH和温度状况下，活性才会高，反应速率越快；酶的用量影响反应速率，在符合转化率的前提下宜选择最经济的与用量NmCSS和PmST1添加量分别选100U、180U。
表3：实施例6-19(步骤1)的实验条件
表4为实施例6-19分别对步骤2中生成中间体UDP-GalNac的反应进行的实验，并与实施例1进行对照。实施例1在底物GalNac的浓度为30mM，GalNac:ATP:UTP的底物比为1:1.3:1.2，反应温度为37℃，pH为9.0，NahK添加量240U，AGX1添加量170U时反应效果最好，底物在酶的作用下能完全转化为UDP-GalNac。
反应底物GalNac的浓度偏低或偏高时不利于反应的完全转化，浓度偏低时反应动力不够，浓度高时分子之间的作用力加强不利于反应的进行；另外反应与底物GalNac、ATP、UTP的摩尔浓度比也有关系ATP和UTP相对于GalNac的量偏高与偏低均不利于反应的完全转化；同上，反应的pH值、温度对酶的活性影响较大，只有在条件温和的pH和温度状况下，活性才会高，反应速率越快；酶的用量影响反应速率，在符合转化率的前提下宜选择最经济的与用量NahK和AGX1添加量分别选240U、170U。
表4：实施例6-19(步骤2生成UDP-GalNac)的实验条件
表5为实施例6-19对步骤2中UDP-GalNac与GM3-F反应生成GM2-F进行实验，并与实施例1进行对照。实施例1在GM3-F为底物的浓度为15mM，GM3-F:UDP-GalNac的底物比为1:1，反应温度为37℃，pH为9.0，CgtA添加量200U时反应效果最好，底物在酶的作用下能完全转化为GM2-F。
反应底物UDP-GalNac的浓度偏低或偏高时不利于反应的完全转化，浓度偏低时反应动力不够，浓度高时分子之间的作用力加强不利于反应的进行；另外反应与底物GM3-F、UDP-GalNac的摩尔浓度比也有关系，UDP-GalNac相对于GM3-F的量偏高与偏低均不利于反应的完全转化；同上，反应的pH值、温度对酶的活性影响较大，只有在条件温和的pH和温度状况下，活性才会高，反应速率越快；酶的用量影响反应速率，在符合转化率的前提下宜选择最经济的与用量CgtA添加量选200U。
表5 实施例6-8(步骤2生成GM2-F)的实验条件
表6为实施例6-19对步骤3中UDP-Gal反应进行的实验，并与实施例1进行对照。其中实施例1在Gal等为底物的浓度为40mM，底物(Gal:ATP:UTP)之比为1:1.1:1.2，反应温度为37℃，pH为8.0，GalK添加量100U，AtUSP添加量40U时反应效果最好，底物在酶的作用下能完全转化为UDP-Gal。
反应底物Gal的浓度偏低或偏高时不利于反应的完全转化，浓度偏低时反应动力不够，浓度高时分子之间的作用力加强不利于反应的进行；另外反应与底物Gal、ATP、UTP的摩尔浓度比也有关系ATP和UTP相对于Gal的量偏高与偏低均不利于反应的完全转化；同上，反应的pH值、温度对酶的活性影响较大，只有在条件温和的pH和温度状况下，活性才会高，反应速率越快；酶的用量影响反应速率，在符合转化率的前提下宜选择最经济的与用量GalK和AtUSP添加量分别选100U、40U。
表6：实施例6-19(步骤3UDP-Gal反应)的实验条件
表7为对实施例6-8步骤3中GM2-F反应进行的实验，并与实施例1进行对照。发现实施例1在GM2-F为底物的浓度为10mM，镁离子添加量为5mM，锰离子添加量为10mM，GM2-F:UDP-Gal底物比为1:1，反应温度37℃，pH为7.5，CgtB添加量120U时反应效果最好，底物在酶的作用下能完全转化为GM1-F。
反应底物GM2-F的浓度偏低或偏高时不利于反应的完全转化，浓度偏低时反应动力不够，浓度高时分子之间的作用力加强不利于反应的进行；另外同上，反应的pH值、温度对酶的活性影响较大，只有在条件温和的pH和温度状况下，活性才会高，反应速率越快；酶的用量影响反应速率，在符合转化率的前提下宜选择最经济的与用量，CgtB的添加量选120U；在本对比实验中，Mg2+和Mn2+作为激活剂，与酶和底物形成桥梁作用，形成金属离子—酶—底物的三元复合物，但其用量偏高会因为离子效益产生抑制反应作用，偏低时激活作用不强，故Mg2+和Mn2+用量宜选择5mM和10mM。
表7 实施例6-19(步骤3GM2-F反应)的实验条件
本发明并不仅仅限于说明书和实施方式中所描述，因此对于熟悉领域的人员而言可容易地实现另外的优点和修改，故在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念的精神和范围的情况下，本发明并不限于特定的细节、代表性的设备和这里示出与描述的图示示例。
Claims (10)
1.一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
A.采用第一组合酶将氟代乳糖、唾液酸与三磷酸胞苷催化生成GM3-F；
B.采用N-乙酰半乳糖胺、三磷酸腺苷、三磷酸尿苷与GM3-F在第二组合酶的作用下催化生成GM2-F；
C.采用半乳糖、三磷酸腺苷、三磷酸尿苷与GM2-F在第三组合酶的作用下生产GM1-F；
D.采用第四酶将GM1-F在醇的作用下催化生成GM1-Sph；
E.用烷基酰氯与GM1-Sph合成得到单唾液酸四己糖神经节苷脂。
2.根据权利要求1所述的一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的合成方法，其特征在于：
步骤A中所述第一组合酶为NmCSS、PmST1和PmPpA；
步骤B中所述第二组合酶为NahK、AGX1、PmPpA和CgtA，所述步骤B采用N-乙酰半乳糖胺与三磷酸尿苷、三磷酸腺苷在NahK、AGX1、PmPpA三种酶的作用下生成第一中间产物UDP-GalNac，然后UDP-GalNac与GM3-F在酶CgtA的作用下催化生成GM2-F；
步骤C中所述第三组合酶为GalK、AtUSP、PmPpA和CgtB，步骤C采用半乳糖、三磷酸腺苷和三磷酸尿苷在GalK、AtUSP、PmPpA三种酶的作用下生成第二中间产物UDP-Gal；然后UDP-Gal与GM2-F在酶CgtB的作用下生产GM1-F；
步骤D中所述第四酶为EGC II，步骤D采用酶EGC II将GM1-F、鞘氨醇在含乙醇体系下催化生成GM1-Sph；
步骤E采用十八碳酰氯与GM1-Sph合成GM1-C18，或采用二十碳酰氯和GM1-Sph合成GM1-C20。
3.根据权利要求2所述的单唾液酸四己糖神经节苷脂的合成方法，其特征在于步骤A中：
所述氟代乳糖的摩尔浓度为10-40mM；
所述氟代乳糖、唾液酸和三磷酸胞苷的摩尔浓度比为1：(1.2-2)：(1.3-2)；
所述NmCSS的用量为80-140U；
所述PmST1的用量为80-220U；
反应温度为10-40℃，pH值为7-9。
4.根据权利要求2所述的单唾液酸四己糖神经节苷脂的合成方法，其特征在于步骤A中：
所述氟代乳糖的摩尔浓度为30mM；
所述氟代乳糖、唾液酸和三磷酸胞苷的摩尔浓度比为1：1.7：1.6；
所述NmCSS的用量为100U；
所述PmST1的用量为180U；
反应温度为30℃，pH值为9。
5.根据权利要求2所述的单唾液酸四己糖神经节苷脂的合成方法，其特征在于步骤B中：
所述N-乙酰半乳糖胺的浓度为20-50mM；
所述N-乙酰半乳糖胺、三磷酸腺苷与三磷酸尿苷的摩尔浓度比为1：(1.2-1.3)：(1.2-1.3)；
所述NahK的用量为200-260U；
所述AGX1的用量为120-270U；
所述生成第一中间产物反应温度为30-42℃，pH值为7-9；
所述GM3-F的浓度10-30mM；
所述GM3-F与第一中间产物的摩尔浓度比为1：1；
所述CgtA添加量为100-300U；
所述GM3-F与第一中间产物的反应温度为25-40℃，pH值为7-9。
6.根据权利要求2所述的单唾液酸四己糖神经节苷脂的合成方法，其特征在于步骤B中：
所述N-乙酰半乳糖胺的浓度为30mM；
所述N-乙酰半乳糖胺、三磷酸腺苷与三磷酸尿苷的摩尔浓度比为1：1.3：1.2；
所述NahK的用量为240U；
所述AGX1的用量为170U；
所述生成第一中间产物反应温度为37℃，pH值为9；
所述GM3-F的浓度15mM；
所述CgtA添加量为100-300U；
所述GM3-F与第一中间产物的反应温度为37℃，pH值为9。
7.根据权利要求2所述的单唾液酸四己糖神经节苷脂的合成方法，其特征在于步骤C中：
所述半乳糖的浓度范围为20-80mM；
所述半乳糖、三磷酸腺苷和三磷酸尿苷的摩尔浓度比为1：(1-1.2)：(1-1.3)；
合成所述第二中间产物的反应温度范围为30-40℃，pH值范围为7-9；
合成所述第二中间产物的反应还包括镁离子，其浓度为5-20mM；
所述GalK的添加量选40-120U；
所述AtUSP的添加量20-80U；
所述GM2-F的浓度为10mM；
所述GM2-F与第二中间产物的摩尔浓度比为1：1；
所述GM2-F与第二中间产物的反应温度范围为25-40℃，pH值范围为7-9；
所述GM2-F与第二中间产物的反应还包括锰离子，其浓度为5-20mM；
所述CgtB的添加量为40-160U。
8.根据权利要求2或7中所述的单唾液酸四己糖神经节苷脂的合成方法，其特征在于步骤C中：
所述半乳糖的浓度范围为40mM；
所述半乳糖、三磷酸腺苷和三磷酸尿苷的摩尔浓度比为1：1.1：1.2；
合成所述第二中间产物的反应温度范围为37℃，pH值范围为8；
合成所述镁离子浓度为5mM；
所述GalK的添加量选100U；
所述AtUSP的添加量40U；
GM2-F与第二中间产物反应温度范围为37℃，pH值范围为7.5；
所述锰离子浓度为10mM；
所述CgtB的添加量为120U。
9.根据权利要求1或2所述的单唾液酸四己糖神经节苷脂的合成方法，其特征在于，还包括GM1-Sph的提纯工艺，所述工艺如下：
1)向GM1-Sph混合溶液中加入1:1当量乙醇，调节pH值，低温静止过夜后离心取上层清液；
2)对步骤A中获得液体进行超滤，取上层回流液；
3)旋转蒸发去除回流液中乙醇后，采用柱层析分离GM1-Sph；
4)旋转蒸发去除步骤C中引入的甲醇，然后冻干液体，获得白色固体粉末即GM1-Sph。
10.根据权利要求9所述的GM1-Sph的提纯工艺，其特征在于：
步骤1)中所述pH值范围为5-9；
步骤2)中所述超滤采用聚酰胺复合膜或聚醚砜复合膜的一种，截留分子量范围为300-500D；
步骤3)中所述柱层析填料为C18材料；
步骤3)中所述柱层析分离方法采用水-甲醇体系；
步骤3)中所述柱层析流程为：先用水冲洗层析柱，然后用体积分数50％的甲醇水溶液冲洗柱体积至无杂质，再用体积分数80％的甲醇水溶液冲洗下产物，最后采用100％甲醇洗柱。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010324378.2A CN111500660A (zh) | 2020-04-23 | 2020-04-23 | 一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的合成方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010324378.2A CN111500660A (zh) | 2020-04-23 | 2020-04-23 | 一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的合成方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111500660A true CN111500660A (zh) | 2020-08-07 |
Family
ID=71871142
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010324378.2A Pending CN111500660A (zh) | 2020-04-23 | 2020-04-23 | 一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的合成方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111500660A (zh) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1570080A (zh) * | 2004-05-12 | 2005-01-26 | 华东理工大学 | 单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备方法 |
| US20050032742A1 (en) * | 2001-08-17 | 2005-02-10 | Defrees Shawn | Chemo-enzymatic synthesis of sialylated oligosaccharides |
| CN101052724A (zh) * | 2004-10-21 | 2007-10-10 | 雅玛山酱油株式会社 | 尿苷5＇－二磷酸－n－乙酰半乳糖胺的制备方法 |
| CN101415834A (zh) * | 2006-03-09 | 2009-04-22 | 国家科学研究中心 | 生产涎化低聚糖的方法 |
| CN108251403A (zh) * | 2016-12-29 | 2018-07-06 | 上海交通大学 | 一种新型鞘糖脂内切糖苷酶及其基因工程制备方法和应用 |
| CN110396532A (zh) * | 2019-08-23 | 2019-11-01 | 中国科学院合肥物质科学研究院 | 一种制备唾液酸乳糖的方法 |
| CN110592164A (zh) * | 2019-09-23 | 2019-12-20 | 东北师范大学 | 一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备方法 |
-
2020
- 2020-04-23 CN CN202010324378.2A patent/CN111500660A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050032742A1 (en) * | 2001-08-17 | 2005-02-10 | Defrees Shawn | Chemo-enzymatic synthesis of sialylated oligosaccharides |
| CN1570080A (zh) * | 2004-05-12 | 2005-01-26 | 华东理工大学 | 单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备方法 |
| CN101052724A (zh) * | 2004-10-21 | 2007-10-10 | 雅玛山酱油株式会社 | 尿苷5＇－二磷酸－n－乙酰半乳糖胺的制备方法 |
| CN101415834A (zh) * | 2006-03-09 | 2009-04-22 | 国家科学研究中心 | 生产涎化低聚糖的方法 |
| CN108251403A (zh) * | 2016-12-29 | 2018-07-06 | 上海交通大学 | 一种新型鞘糖脂内切糖苷酶及其基因工程制备方法和应用 |
| CN110396532A (zh) * | 2019-08-23 | 2019-11-01 | 中国科学院合肥物质科学研究院 | 一种制备唾液酸乳糖的方法 |
| CN110592164A (zh) * | 2019-09-23 | 2019-12-20 | 东北师范大学 | 一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的制备方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| HAI YU等: "Sequential One-Pot Multienzyme Chemoenzymatic Synthesis of Glycosphingolipid Glycans" * |
| HAI YU等: "Streamlined chemoenzymatic total synthesis ofprioritized ganglioside cancer antigens" * |
| 刘新平等: "神经节苷脂氟化寡糖在大肠杆菌中的生物合成" * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Li et al. | Efficient chemoenzymatic synthesis of an N-glycan isomer library | |
| JP5876649B2 (ja) | ヌクレオチド糖の改良製造法 | |
| EP2322533A1 (en) | Process for producing sugar chain asparagine derivative | |
| AU2003296067C1 (en) | Sugar chain asparagine derivatives, sugar chain asparagine, sugar chain, and processes for producing these | |
| Hoch et al. | Synthesis of 6-deoxy-6-sulfo-α-D-glucopyranosyl phosphate | |
| CN111500660A (zh) | 一种单唾液酸四己糖神经节苷脂的合成方法 | |
| WO2004058789A9 (ja) | 糖鎖アスパラギン誘導体およびその製造方法 | |
| CN114958935B (zh) | 一种手性(2s,3r)-对甲砜基苯丝氨酸的合成方法 | |
| CN112940058B (zh) | 一种氟标签及其制备方法、辅助的酶法合成寡糖链的方法 | |
| Weïwer et al. | Synthesis of uridine 5′-diphosphoiduronic acid: A potential substrate for the chemoenzymatic synthesis of heparin | |
| JPH0635481B2 (ja) | ジグルコシル−α−サイクロデキストリンおよびその製造方法 | |
| CN103540537A (zh) | 一种尿苷三磷酸的制备方法 | |
| JPH03294281A (ja) | オキサゾピロロキノリン類の製造法 | |
| WO2023027178A1 (ja) | シチジン－５'－ジリン酸化合物の製造方法 | |
| CN113173961A (zh) | 一种用于制备腺苷的方法 | |
| Heskamp et al. | Synthesis of Guanosine 5′-(β-L-Fucopyranosyl)-Diphosphate Revisited | |
| Utkina et al. | Synthesis of P 1-(11-phenoxyundecyl)-P 2-(α-D-galactopyranosyl) diphosphate and P 1-(11-phenoxyundecyl)-P 2-(α-D-glucopyranosyl) diphosphate and investigation on their acceptor properties in the reaction of mannosyl residue transfer catalyzed by mannosyltransferase from Salmonella newport | |
| Takaku et al. | A chemical synthesis of UDP-LacNAc and its regioisomer for finding ‘oligosaccharide transferases’ | |
| KR101599588B1 (ko) | 생물학적 방법을 이용한 홍조류로부터 3,6-무수갈락토오스의 제조 및 분리 정제 방법 | |
| ITMI20001696A1 (it) | Derivati di carnosina, procedimento per la loro preparazione e composizioni farmaceutiche che li contengono. | |
| CN116554238A (zh) | 一种高纯度β-烟酰胺单核苷酸的制备方法及其应用 | |
| JPH04312598A (ja) | β−フコピラノシル燐酸塩およびきわめて高純度のＧＤＰ−フコースの立体選択的調製法 | |
| Frohnmeyer et al. | Process Development for the Enzymatic Gram‐Scale Production of the Unnatural Nucleotide Sugar UDP‐6‐Azido‐GalNAc | |
| EP0861904A1 (en) | Process for the preparation of sugar nucleotides | |
| CN112480188A (zh) | 唾液酸乳糖糖苷和/或类似物、合成方法及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200807 |