CN108251403A - 一种新型鞘糖脂内切糖苷酶及其基因工程制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及了一种可实现鞘糖脂内切糖苷酶EGCase I工程化表达的方法，可以有效地将EGCase I可溶性地表达，并保持有优秀的水解以及转糖苷活性；并在此基础上，进一步开发出了一种新型的EGCase I突变酶，既具有较宽的底物谱，又兼具糖苷合成酶活性；所获得的鞘糖脂内切糖苷酶非常适合应用于工业化鞘糖脂的分析与合成中。

Description

一种新型鞘糖脂内切糖苷酶及其基因工程制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种鞘糖脂内切糖苷酶及其基因工程制备方法，以及在鞘糖脂分析与合成中的应用。

背景技术

鞘糖脂(Glycosphingolipid,GSL)是真核细胞细胞膜的组成成分，是一类由神经酰胺和寡糖链以糖苷键结合形成的双亲分子。研究表明，鞘糖脂参与多种生理过程，包括信号传导、细胞免疫以及大脑发育等。此外鞘糖脂还与一些病理过程相关，包括病原入侵、癌症发生以及胰岛素抗性等。

由于鞘糖脂结构复杂，其来源主要依靠天然提取，然而提取过程中需要大量使用丙酮、氯仿和甲醇等有机溶剂，污染环境、成本高昂且收率较低；而化学合成方法步骤复杂、人力耗费大、成本较高，同时也存在产率低污染环境的问题。因此大大地制约了鞘糖脂大规模的工业化生产。

鞘糖脂内切糖苷酶(Endoglycoceramidase，EGCase，EC 3.2.1.123)是属于糖苷水解酶家族5的一类内切酶，能够水解鞘糖脂的寡糖链与神经酰胺之间的β-糖苷键，生成完整的寡糖链和神经酰胺，基于此该酶可用于胞内鞘糖脂分析。

1989年Ito课题组在Rhodococcus sp.M-750的培养液中发现了三种具有完全不同底物特异性的EGCase，分别命名为EGCase I，EGCase II和EGCase III(又称为EGALC)(Journal of Biological Chemistry,1989,264(16):9510-9)。EGCase I展现出最宽泛的底物特异性，既可以水解神经节苷脂系列和乳糖系列的鞘糖脂，还可以水解EGCase II不能水解的岩藻糖基单唾液酸四己糖神经节苷脂(Fucosyl-GM1)和Globo系列鞘糖脂(Journalof Lipid Research,2012,53(10):2242-2251)，然而，这一类EGCase I的原始菌种培养条件苛刻、产酶水平极低且目的酶的纯化困难，同时由于Rhodococcus sp.M-750来源的EGCase I自身蛋白质折叠的缺陷，难以通过基因工程的方法获得可溶性产物，也进一步限制了对这一类酶的开发和工业化应用的可能性。

加拿大不列颠哥伦比亚大学的Stephen G.Withers教授课题组通过对天然水解神经节苷脂的鞘糖脂内切酶EGCase II进行了分子改造，通过突变其活性中心的亲核攻击基团，使其成为一种糖苷合成酶，该酶可以催化氟化修饰的寡糖链和鞘氨醇链模块组装，生成溶血形式的鞘糖脂(lyso-GSL)，之后再通过化学法对其进行酰基化，即可获得完整的鞘糖脂结构。但该EGCase II糖苷合成酶存在活性仍较低、底物谱较窄等问题(Journal of theAmerican Chemical Society,2006,128(19):6300-6301)限制了该酶的应用范围。因此，利用蛋白质工程策略构建更高效的EGCase突变体，大幅度提高其催化活性和利用非天然底物的能力，将有利于构建更高效的糖苷合成酶，为酶法合成鞘糖脂类药物提供性质更优良的酶源。

综上，亟需寻找一种可实现EGCase I工程化表达的方法，以及在此基础上开发出新型的EGCase I突变酶，既具有较宽的底物谱，又具有糖苷合成酶活性，以应用于工业化鞘糖脂的分析与合成中。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鞘糖脂内切糖苷酶EGCase I及其基因工程制备方法，以及在鞘糖脂分析与合成中应用。

在本发明的第一方面，提供一种鞘糖脂内切糖苷酶，所述糖苷酶与SEQ ID NO:2的序列一致性不低于85％，且第339位或其对应位点发生突变，所述突变为第339位的谷氨酸被甲硫氨酸所取代；

优选地，所述糖苷酶与SEQ ID NO:2具有至少90％的氨基酸序列一致性；更优选地，与SEQ ID NO:2具有至少95％的氨基酸序列一致性。

所述的糖苷酶获得了糖苷合成酶的活性。

在本发明的另一方面，提供一种多核苷酸，所述的多核苷酸与SEQ ID NO:1的序列一致性不低于80％。

优选地，所述的多核苷酸与SEQ ID NO:1的序列一致性不低于85％；更优选地，与SEQ ID NO:1的序列一致性不低于90％；最优选地，与SEQ ID NO:1的序列一致性不低于95％。

在一优选实施例中，所述的多核苷酸编码表达如SEQ ID NO：2序列的蛋白。

在一优选实施例中，所述的多核苷酸所编码的蛋白与SEQ ID NO:2具有不低于85％的序列一致性，且编码蛋白的第339位或其对应位点发生突变，所述突变为第339位的谷氨酸被甲硫氨酸所取代；

在一优选实施例中，可以在所述多核苷酸的末端增加上用于下一步纯化与分析的分子标签，如组氨酸标签等。

在本发明的另一方面，提供一种表达载体，所述的表达载体包括所述的多核苷酸；

在一优选实施例中，所述的表达载体选用pET-28a。

在本发明的另一方面，提供一种基因工程化的细胞，所述的细胞包含有所述的表达载体或在其基因组中整合有所述的多核苷酸；

所述的基因工程化细胞可以为革兰氏阳性细菌，如枯草芽孢杆菌；也可以是革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌；也可以是放线菌，如链霉菌；还可以是真菌，如酵母类、曲酶菌等其他宿主微生物；

在一优选实施例中，所述的基因工程化细胞选用大肠杆菌。

在本发明的另一方面，提供一种可基因工程化表达鞘糖脂内切糖苷酶的方法，将所述的多核苷酸插入到所述的表达载体中，再整合所述的基因工程化细胞中进行培养和表达，最终可在胞内或胞外获得可溶性的鞘糖脂内切糖苷酶。

在一优选实施例中，可以在细胞发酵上清液中收获所述的鞘糖脂内切糖苷酶；

在一优选实施例中，可以通过细胞破壁的方法获得所述的鞘糖脂内切糖苷酶。

在本发明的另一方面，提供一种糖苷键合成方法，在生物酶法催化系统中，使用所述的鞘糖脂内切糖苷酶，以氟化糖作为糖供体，可以使带有羟基的底物发生糖苷化。

在一优选实施例中，所述氟化糖为α-氟代单糖或α-氟代寡糖；

更优选地，所述单糖或寡糖还原端糖残基为葡萄糖或半乳糖残基；

所述的α-氟代单糖为1位α-羟基被氟取代的单糖，包括但不限于α-氟代葡萄糖，α-氟代半乳糖，α-氟代岩藻糖；所述的α-氟代寡糖为还原端1位α-羟基被氟取代的寡糖，包括但不限于氟化二糖(如氟化乳糖)，氟化三糖(如氟代唾液酸乳糖)，氟化四糖(如α-氟代单唾液酸三己糖[GM2oligosaccharylα-fluoride])，氟化五糖(如α-氟代单唾液酸四己糖[GM1oligosaccharylα-fluoride])；

在一优选实施例中，所述带有羟基的底物为带有自由羟基的醇类化合物，包括鞘氨醇类或脂肪醇类化合物或其化学衍生物；所述鞘氨醇类化合物包括但不限于鞘氨醇、二氢鞘氨醇或者植物鞘氨醇。

在一优选实施例中，所述的生物酶法催化体系为体外酶法；

在一优选实施中，所述的生物酶法催化体系为全细胞催化；

所述的生物酶法催化体系还包括固定化酶催化、纯化后的酶催化以及含有人工代谢途径的细胞工厂等。

在本发明的另一方面，提供一种在鞘糖脂制备以及生产中的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)由所述的鞘糖脂内切糖苷酶催化氟化糖基与鞘氨醇模块组装为溶血鞘糖脂；

(2)由去酰基化酶催化溶血鞘糖脂与脂肪酸链模块组装为完整的鞘糖脂。

在本发明的另一方面，提供了一种在鞘糖脂或寡糖的制备、生产、分析与合成中的应用，使用所述的鞘糖脂内切糖苷酶或所述的多核苷酸或所述的表达载体或所述的基因工程化细胞。

在一优选例实施例中，所述的鞘糖脂分析为利用所述鞘糖脂内切糖苷酶的水解鞘糖脂，获得鞘氨醇模块和寡糖模块，并进一步分析寡糖或鞘氨醇的类型；

在一优选实施例中，所述的鞘糖脂分析为利用所述鞘糖脂内切糖苷酶的转糖基活性，将鞘糖脂上的糖基转移至受体烷基醇上，并进一步分析受修饰的产物的功能；

在一优选实施例中，所述的鞘糖脂合成为利用所述鞘糖脂内切糖苷酶的合成酶活性，并进一步制备以及生产鞘糖脂。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1.常见糖基供体结构示意图

图2.常见含羟基受体结构示意图

图3.103S_EGCase I的表达和纯化结果的SDS-PAGE电泳图，M：蛋白标准分子量marker；1：诱导后的感受态细胞(BL21pLysS，pET28a-EGCase I)破碎上清液；2：Ni²⁺柱纯化过的蛋白

图4.103S_EGCase I水解反应的薄层色谱图，Std.：单唾液酸四己糖神经节苷脂GM1寡糖标准品；+：反应体系中添加EGCase I；-：反应体系中不添加EGCase I

图5.103S_EGCase I第339突变体合成反应的薄层色谱图，1：对照组；2：E339M；3：E339S；4：E339A；5：阳性对照。

图6.103S_EGCase I E339M突变体合成乳糖基鞘氨醇的质谱图。

图7.103S_EGCase I转糖基反应的薄层色谱图。Met:糖基受体为甲醇；Pen:糖基受体为正戊醇；Hex:糖基受体为正己醇。

具体实施方式

本发明人经过研究筛选，提供了一种可实现鞘糖脂内切糖苷酶EGCase I工程化表达的方法，以及在此基础上开发出了一种新型的EGCase I突变酶，既具有较宽的底物谱，又具有糖苷合成酶活性，以应用于工业化鞘糖脂的分析与合成中。

本发明的鞘糖脂内切糖苷酶可以是重组蛋白、合成蛋白。其可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。本发明的鞘糖脂内切糖苷酶的序列与SEQ ID NO:2具有至少85％到100％的氨基酸序列一致性，且第339位或其对应位点发生突变，所述突变为第339位的谷氨酸被甲硫氨酸所取代。

本发明还包括鞘糖脂内切糖苷酶的衍生物和类似物。如本文所用，术语“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的糖苷酶相同的生物学功能或活性的蛋白。本发明的蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的蛋白，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，鞘糖脂内切糖苷酶可以指具有SEQ ID NO:2所示序列及其突变的蛋白。还包括具有与糖苷酶相同功能的、包含SEQ ID NO:2序列突变的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(如1-3个、1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(例如为300个以内，较佳地200个以内，更佳地100个以内，更佳地50个以内，例如40、30、20、10、5、3、2、1)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括突变酶的活性片段和活性衍生物。

本发明中，也包括为了增加酶的稳定性、半衰期、促进功效而对一个或几个氨基酸加以修饰后构成的修饰形式的多肽(通常不改变一级结构)，包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了抗水解性能或优化了溶解性能的突变酶。

本发明还提供了编码本发明鞘糖脂内切糖苷酶的多核苷酸序列。本发明所述的多核苷酸序列为鞘糖脂内切糖苷酶基因工程化的产物，与SEQ ID NO:1的具有至少80％-100％的序列一致性。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。也即，“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或鞘糖脂内切糖苷酶突变酶的编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。术语“表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

包含上述的适当多核苷酸序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达多肽。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

生物酶法催化体系为一类利用生物酶为催化剂，实现氧化、合成、水解等功能，制备或生产相应大分子或小分子化合物的过程，现有主要的生物酶法反应系统包括，体外酶法、全细胞催化、固定化酶催化、纯化后的酶催化以及含有人工代谢途径的细胞工厂等。

体外酶法催化是指酶在体外作为催化剂进行工业生产。

全细胞催化是指利用完整的生物有机体(即全细胞、组织甚至个体)作为催化剂进行生物转化，其本质是利用细胞内的酶进行催化。

固定化酶，是指在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶。通常酶催化反应都是在水溶液中进行的，而固定化酶是将水溶性酶用物理或化学方法处理，使之成为不溶于水的，但仍具有酶活性的状态。固定化酶催化是指用固定化酶作为催化剂在体外进行的催化反应。

单糖，为含有3-6个碳原子的多羟基醛或多羟基酮，是不能再水解的糖类，构成各种糖分子的基本单位。根据碳原子的数目，可进一步分为丙糖、丁糖、戊糖、己糖等。最常见的单糖有果糖、葡萄糖、半乳糖等

寡糖，为2个或2个以上(一般指2-10个)单糖单位以糖苷键相连形成的糖分子。

自由羟基，连接在碳链骨架上，未与其它基团发生反应的游离羟基

鞘糖脂，鞘糖脂是真核细胞细胞膜的组成成分，是一类由神经酰胺和寡糖链以糖苷键结合形成的双亲分子。神经节苷脂GM1为常见的药用鞘糖脂。鞘糖脂的神经酰胺部分由一分子长链的鞘氨醇(2-氨基-1,3-二醇)和一分子脂肪酸以酰胺键连接组成。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明所述的生物材料的来源的一般性说明：

1、引物合成：本发明中所使用的引物均由南京金斯瑞公司合成制备。

2、实验中所使用T4DNA连接酶等购自于NewEngland Biolabs公司；PrimeSTARHS高保真酶购自TakaRa公司；限制性内切酶均购自于Fermentas公司；使用的DNA胶回收试剂盒及质粒小提试剂盒均购自于Axygen公司。

3、本发明所改造的鞘糖脂内切糖苷酶突变酶来源于马红球菌Rhodococcusequi103S鞘糖脂内切糖苷酶I(Endoglycoceramidase I，103S_EGCase I)。

实施例1、野生型鞘糖脂内切糖苷酶103S_EGCase I基因的克隆

首先从马红球菌Rhodococcus equi 103S基因组中克隆出103S_EGCase I的多核甘酸序列，通过密码子的优化，意外地发现该优化的序列(SEQ ID NO：1)可以在大肠杆菌宿主中大量可溶性表达鞘糖脂内切糖苷酶I 103S_EGCase I(SEQ ID NO：2)，克服了Rhodococcus sp.M-750来源的鞘糖脂内切糖苷酶EGCase I无法可溶性表达，限制其应用的缺点。具体克隆方法如下：

使用上游引物5’-AAACGCGGATCCGCCCCGCCGGCGACCCCGATTAC-3’

(带下划线碱基为限制性内切酶BamH I识别位点，SEQ ID NO:3)

和下游引物5’-AAACCCAAGCTTTCAGGACGAACCGCTAC-3’

(带下划线碱基为限制性内切酶Hind III识别位点，SEQ ID NO：4)

扩增目的基因，该PCR反应使用Takara的PrimeSTAR Mix聚合酶，PCR反应条件为：98℃2min，然后98℃10sec，55℃15sec，72℃90sec，共25个循环；最后72℃10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到1.5kb大小的条带，与预期结果相符。DpnI消化模板，回收，纯化该目的片段，将其用限制性内切酶BamH I和Hind IIII进行双酶切后与经同样酶双酶切的质粒pET28a(Novagen)进行连接，将连接产物转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)pLysS感受态细胞中，将转化细胞涂布于含有50ug/ml卡那霉素(Kan)的LB平板上筛选阳性克隆，提取质粒，对其进行测序，测序结果表明克隆的鞘糖脂内切糖苷酶EGCase I基因序列正确，且正确连入pET28a中，将该重组质粒命名为pET28a-103S_EGCase I。

实施例2 103S_EGCase I的表达、纯化及活力测定

将甘油管中的工程菌按体积比1％接种到含100ug/mL卡那霉素的4mL LB培养基试管中，37℃220rpm培养12h。将该4mL菌液转接至含50ug/mL卡那霉素的1L LB培养基摇瓶中，37℃220rpm培养约2.5h，使OD600达到0.9左右，加入0.1mM IPTG诱导剂，25℃200rpm诱导培养12-16h。将发酵后收获的大肠杆菌菌体悬液超声破碎，再经过一步Ni-NTA亲和层析处理后就能得到95％以上纯度的目的蛋白(图3)。

以单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)为底物测试重组酶的水解活力，10nmol底物与适量酶液在20μL的50mM乙酸钠缓冲液体系中(pH 6.0，0.1％(w/v)Triton X-100)，37℃反应2h，反应产物进行TLC分析，展开剂为氯仿/甲醇/0.2％CaCl 2(5/4/1，v/v/v)，应用Orcinol-H₂SO₄试剂显色表明重组酶能够完全水解GM1产生相应的寡糖(图4)。

实施例3 103S_EGCase I的合成活性突变体的设计、构建、表达、纯化及性质表征

将糖苷水解酶的亲核催化残基定点突变为不具备亲核功能的氨基酸，导致酶的原有水解活性丧失，这样的突变体能够利用具有自我夺电子能力的α-D-氟化糖催化糖苷键的合成，从而变成糖苷合成酶。我们利用序列比对确定了103S_EGCase I的亲核催化残基为第339位的谷氨酸，将其突变为一系列无亲核作用的氨基酸，包括丙氨酸、丝氨酸以及甲硫氨酸。以重组质粒pET28a-103S_EGCase I为模板，以带有突变位点的一对互补的寡核苷酸为引物，用PrimeSTAR Mix高保真酶(TakaRa公司)进行全质粒PCR扩增，获得具有特定突变位点的重组质粒。引物序列如下：

扩增体系为：PrimeSTAR Mix(5×)10μL、dNTP(2.5mM)4μL、重组质粒模板20ng、引物(10μM)各2μL、PrimeSTAR HS高保真酶0.5μL、补充双蒸水至50μL。扩增条件为98℃预变性1分钟；98℃变性10秒、68℃退火及延伸7分钟(30个循环)。胶回收PCR产物，用DpnI酶(Fermentas公司)在37℃条件下消化胶回收产物2h，降解初始模板。消化产物转化至E.coliBL21(DE3)，涂布到含有50μg/mL卡那霉素LB琼脂平板上，37℃过夜培养，筛选阳性克隆，测序验证。得到鞘糖脂内切糖苷酶突变体的重组菌。

按照实施例2的方法得到103S_EGCase I酶定点突变突变体的纯酶液，并检测其合成酶活性。

合成反应体系(见表1)：

表1合成反应体系

α-氟代单唾液酸四己糖神经节苷脂寡糖(GM1OSF)10.14mg，溶解于100μL ddH₂O中，浓度为100mM。

α-氟代乳糖：3.44mg氟化乳糖溶于100μL ddH₂O中，浓度为100mM。

D-鞘氨醇：3mg D-鞘氨醇溶于100μL乙醇中，加入等摩尔数的HCl，混合后真空浓缩蒸干，加入200μL ddH₂O超声溶解，浓度为50mM。

合成反应缓冲液为含有0.1％Triton X-100(w/v)的50mM乙酸钠缓冲液，pH 6.0。

37℃反应过夜，取20μL反应液真空浓缩蒸干，加入20μL氯仿/甲醇(1/2，体积比)，超声溶解TLC检测，检测方法同实施例2。

剩余反应液真空浓缩蒸干后，加入200ul甲醇，超声溶解后13000rpm离心30min，取上清液进行质谱分析，仪器为HPLC 1290-MS 6230(Agilent)，质谱条件如下：流动相：甲醇；毛细管电压：3000V；锥孔电压：45V；干燥器：N2；干燥器流量：350L/h；脱溶剂气温度：250℃；离子源温度：100℃。化合物使用负离子模式离子化，离子化方式为电喷雾(ESI)。

实施例4 103S_EGCase I水解鞘糖脂

以含有不同糖链的各种鞘糖脂为底物，使用103S-EGCase I纯酶液催化它们水解。

(1)初速度

鞘糖脂内切糖苷酶的活力测定方法为：标准测活反应总体系为20μL，反应温度37℃，先将1μL 10mM GM1底物加入14μL含0.1％Triton X-100的50mM乙酸钠(pH 6.0)缓冲液中，再加入5μL一定稀释倍数的酶液，反应在带“O”型环螺帽的1.6mL聚丙烯管中进行；37℃恒温水浴中保温10min后于沸水浴中放置3min终止反应，12000rpm离心1min，直接加入100ul 2-AA衍生化试剂进行衍生，拧紧螺帽防止挥发，80℃保温45min，12000rpm离心30min，取上清液进行高效液相分析。

色谱柱：TSK gel-Amide 80(4.6×250mm 5μm)；流速：1mL/min；进样量：10μL；荧光检测器：Ex 360nm，Em 425nm；柱温：室温。适用于葡萄糖基神经酰胺，半乳糖基神经酰胺分析的流动相组成为水相/有机相(15：85)，等度洗脱，分析时间10min；适用于乳糖基神经酰胺分析的流动相组成水相/有机相(25：75)，等度洗脱，分析时间10min；适用于单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)，单唾液酸二己糖神经节苷脂(GM3)，鞘糖脂Gb4Cer，岩藻糖基单唾液酸四己糖神经节苷脂(Fucosyl-GM1)寡糖分析的流动相梯度变化，具体如表2

表2

酶活力单位(U)的定义：单位时间内(1min)从GM1水解释放1μmol GM1寡糖的蛋白量计为一个酶活力单位。

(2)平衡产率

标准反应体系中加入过量的酶，37℃下反应24h，反应液经2-氨基苯甲酸衍生化处理后进行HPLC检测，反应产率(％)＝产生的寡糖浓度×100/0.5mM。

表3总结了103S_EGCase I水解多种鞘糖脂的比活力及产率。

表3 103S_EGCase I水解活性的比活力和产率

*上述鞘糖脂类化合物根据Svennerholm创立的通用术语命名法(Svennerholm，1963；IUPAC-IUB，1998)进行命名。

实施例5 103S_EGCase I催化鞘糖脂的糖基转移

103S_EGCase I能够催化鞘糖脂上的糖链转移到多种受体烷基醇上。

反应体系为20μL，反应温度37℃，先将1μL 10mM GM1底物加入15μL含0.1％TritonX-100的50mM乙酸钠(pH 6.0)缓冲液中，然后添加2μL的烷基醇，再加入2μL一定稀释倍数的酶液，37℃反应3h后于沸水浴灭活5min，用真空浓缩仪蒸干，加入10μL甲醇振荡后，使用TLC分析，检测方法同实施例2，结果表明103S_EGCase I能够转移GM1的糖链到戊醇和己醇受体上(图7)。

实施例6 103S_EGCase I突变酶合成乳糖基鞘氨醇

EGCI突变体合成活性测定方法为：标准测活反应总体系为40μL，反应温度37℃，先将2μL 50mM鞘氨醇、1μL 50mMα-氟代乳糖加入27μL含0.2％Triton X-100的50mM乙酸钠(pH5.8)缓冲液中，再加入10μL稀释100倍的酶液，37℃恒温水浴中保温30min后于沸水浴中放置5min终止反应，13000rpm离心10min，取上清10μL加入20μL OPA衍生化试剂室温衍生5min，13000rpm离心30min，取上清液进行高效液相分析。

表4EGCase I突变体合成活性(以α-氟代乳糖为糖基供体)

由上述结果可知，在所有构建的EGCaseI合成突变体中，只有EGCI-E339M有合成活性，可以利用α-氟代乳糖和鞘氨醇为底物，生成乳糖基鞘氨醇(图5)。产物的质谱图如图6所示，根据分子量判断，该化合物为乳糖基鞘氨醇，产物HR-MS：m/z 622.3751[M+H]^-，进一步证明第339位谷氨酸替换为甲硫氨酸具有合成活性。

实施例7 103S_EGCase I突变酶合成溶血单唾液酸四己糖神经节苷脂

EGCI突变体合成活性测定方法为：标准测活反应总体系为40μL，反应温度37℃，先将2μL 50mM鞘氨醇、1μLα-氟代单唾液酸四己糖神经节苷脂寡糖加入27μL含0.2％TritonX-100的50mM乙酸钠(pH 5.8)缓冲液中，再加入10μL稀释100倍的酶液，37℃恒温水浴中保温30min后于沸水浴中放置5min终止反应，13000rpm离心10min，取上清10μL加入20μL OPA衍生化试剂室温衍生5min，13000rpm离心30min，取上清液进行高效液相分析。

表5EGCase I突变体合成活性

(以α-氟代单唾液酸四己糖神经节苷脂寡糖为糖基供体)

由上述结果可知，在所有构建的EGCaseI合成突变体中，只有EGCI-E339M有合成活性，可以利用α-氟代单唾液酸四己糖神经节苷脂寡糖和鞘氨醇为底物，生成单唾液酸四己糖基鞘氨醇溶血鞘糖脂。

此外，如图1所示的常见糖基供体和如图2所述的常见含羟基受体，均可以在EGCI-E339M的作用下发生糖苷化反应，合成鞘糖脂或糖基脂肪醇。

实施例8 103S_EGCase I在胞内鞘糖脂糖组分分析中的应用

鞘糖脂是细胞膜中的重要元件，具有重要的生物功能。通过103S_EGCase I酶法降解糖链，然后组合多糖印迹的样品制备方法和MALDI-TOF/TOF质谱分析能够用于细胞特异的胞内鞘糖脂糖组分的分析，在药物发现和再生医学领域具有重要的应用前景。

1)中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1的培养

在10cm的细胞培养盘中添加10ml的RPMI1640培养基，并添加抗生素试剂(包括100单位/ml的青霉素，100μg/ml的链霉素)和10％的胎牛血清。在37℃，浓度为5％的二氧化碳培养箱中培养细胞，当细胞到达100％培养克隆率时进行细胞回收，倒掉上清，使用PBS缓冲液洗涤细胞两次，然后添加含有10ml含有10mM EDTA的PBS缓冲液，1000g离心10min，倒掉上清。细胞颗粒重悬在新的PBS中，计数细胞，然后取总量为1×10⁶细胞溶液在新的离心管中离心，移除上清，将细胞保存在-80℃中。

2)抽提细胞总鞘糖脂

室温下添加450μl的氯仿/甲醇溶液(2:1，v/v)到上述细胞团中，使用超声破碎仪进行细胞破碎，超声6次，工作时间10s/次，暂停10s，工作总时间为1min；添加150μl的甲醇重复上述超声步骤一次，继续添加300μl甲醇重复上述超声步骤一次。细胞破碎液5000rpm离心10min，上清转移到新管中进行干燥。干燥后的总鞘糖脂直接使用103S_EGCase I酶法水解释放糖链。

3)从鞘糖脂中释放糖原

粗鞘糖脂悬浮在50μl的50mM Tris-HCl缓冲液中(pH7.5)，包含0.1％的胆酸钠作为表面活性剂，然后添加25mU的103S_EGCase I纯酶，37°反应24h催化完整的糖链从鞘糖脂上水解下来。

4)多糖印迹

103S_EGCase I处理过的样品用于多糖印迹分析，根据Sumitomo Bakelite公司的BlotGlyco磁珠糖链纯化标记试剂盒的操作步骤进行纯化。BlotGlycoTM磁珠是化学合成的高分子颗粒，BlotGlyco的高密度酰肼基团可特异性地结合多糖降解端的醛基，所以BlotGlyco磁珠可从不同的生物样品中选择并全面捕获多糖。酰肼基团可与醛基稳定结合，因此进行洗脱后就能很容易地除去肽和其它杂质。50μl的样品溶液直接加到含有BlotGlyco磁珠的亲水性PTFE，0.45μm的滤板中，添加450μl含有0.2％乙酸的乙腈溶液于80℃孵育45min；未反应的酰肼集团使用含有10％的醋酸酐的甲醇溶液在室温下反应30min进行乙酰基封闭；使用150mM的1-甲基-3-对甲苯基三氮的二氧六环溶液在60℃下对糖链中的唾液酸残基的羧基进行甲基酯化保护；随后颗粒上捕获的酯化多糖与180μl的含2％乙酸的乙腈溶液和试剂盒含有的20mM的独特标记试剂氨氧基WR试剂(aoWR)混合进行亚胺交换反应，多糖链与荧光试剂的aoWR结合，从磁珠上被取代下来，用于随后的MALDI-TOF/TOFMS分析

5)MALDI-TOF/TOF质谱分析

纯化过的GSL-糖原溶液与溶于30％乙腈中的2,5-二羟基苯甲酸溶液(10mg/ml)混合，随后用于MALDI-TOF分析。质谱分析条件如下：Ultraflex II TOF/TOF质谱仪，加速电压25KV，反射极电压26.3kV，阳离子模式下的脉冲离子提取为160ns使用FlexAnalysis3.0软件包进行结果注释，使用GlycoSuiteDB和SphinGOMAP在线数据库进行结构鉴定。在TOF/TOF模式下进行片段离子分析时，前体离子加速到8kV。共鉴定得到9种鞘糖脂，表6所示：

表6CHO-K1细胞胞内鞘糖脂来源的多糖组分鉴定

*上述鞘糖脂类化合物根据Svennerholm创立的通用术语命名法(Svennerholm，1963；IUPAC-IUB，1998)进行命名。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 一种新型鞘糖脂内切糖苷酶及其基因工程制备方法和应用

<130> <待立案后插入>

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1479

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列

<400> 1

atgcgtaaga ccgttgtcgc cttcgccgcc gctatcgccg cctgttccgc cgttctgtca 60

agcaccacca cctcagcagc cccgccggcg accccgatta ccacgctgca ggccgatggt 120

acccatctgg tcgacggcta tggtcgtacg gtgctgctgc acggtgttaa caatgtcgat 180

aaagatgccc cgtacctgcc ggcgggtgaa accctgacgc cgcaggatat tgacatcctg 240

gttcgccatg gttttaacac cgtccgtctg ggcacgagct tcgatgcact gatgccgcag 300

cgtggtcaaa ttgatgaagc atatctggac cgtctgaccg gtgtggttga tgcactgacg 360

gctcgcggca tgcatgtgct gctggataac caccaggacg gtctgtcaaa ggcatggggc 420

ggtaatggct ttccggaatg ggcgatcgaa tcgcgtccgc gcgaatggga accgaatccg 480

ggtttcccgc tgtattacct gatgccgtct ctgaacgcgg gctgggatga agtttggggt 540

aatacccatg gcgcactgga ccatctgggt accgctctgg gtgccctggc ggaacgtgtt 600

gaaggcaaac cgggtgtcat gggcattgaa ctgctgaacg aaccgtggcc gggtagccgc 660

tttctgtctt gcttcccgaa tggctgtccg gattttgacc gtacctatca ggcggccatg 720

caaaagctga ccgatgccgt ccgtgcacag aacccgacca tcccggtgta ctgggaaccg 780

aacgttacct ggaatcaaat gatgccgagc aacctgtttg caccgccggt taccccggca 840

ctgaccaccg ctgatgtcgt gttcgccccg cacgactatt gcattccgag tcagctggca 900

atctacctgg gtctgccgca agctctgcgt ggcctgtgtg tgccgcagca agatctgacc 960

tggtccaaca ttgacgcaat cacggaacgc gctaatgtgc cgaccgttat tacggaattt 1020

ggcgatggtg acccgaccgt tctgaaaaac acgctggcac gtgctgatga acgctttatc 1080

ggttggcagt attggcattt cggcgccggt aatgctaccg atccgttcct gggtgaagtc 1140

ggccgtcagc tggtgcgtac ctatccgcaa gccaccgcag gtgaaccggg tcgtatgatt 1200

tttgatgcgg acaacggcga ttttgcctat cgctttaccc cgcgcgcagc tacccgtccg 1260

accgaaatct tcgtgagcga tctgcactat ccggacggtt acgcggtgca ggttgatggc 1320

ggtcaagtga cgtctgcccc gggtgcacgt attgttaccg ttgtcgcgga tggcagtggt 1380

ccggtcaccg tgaagatcaa tcgcccgggt tccgccggcg cagaagtgcc ggatggtccg 1440

attgaaacgt cgtccagcgg tagtagcggt tcgtcctga 1479

<210> 2

<211> 492

<212> PRT

<213> Rhodococcus equi 103S

<400> 2

Met Arg Lys Thr Val Val Ala Phe Ala Ala Ala Ile Ala Ala Cys Ser

1 5 10 15

Ala Val Leu Ser Ser Thr Thr Thr Ser Ala Ala Pro Pro Ala Thr Pro

20 25 30

Ile Thr Thr Leu Gln Ala Asp Gly Thr His Leu Val Asp Gly Tyr Gly

35 40 45

Arg Thr Val Leu Leu His Gly Val Asn Asn Val Asp Lys Asp Ala Pro

50 55 60

Tyr Leu Pro Ala Gly Glu Thr Leu Thr Pro Gln Asp Ile Asp Ile Leu

65 70 75 80

Val Arg His Gly Phe Asn Thr Val Arg Leu Gly Thr Ser Phe Asp Ala

85 90 95

Leu Met Pro Gln Arg Gly Gln Ile Asp Glu Ala Tyr Leu Asp Arg Leu

100 105 110

Thr Gly Val Val Asp Ala Leu Thr Ala Arg Gly Met His Val Leu Leu

115 120 125

Asp Asn His Gln Asp Gly Leu Ser Lys Ala Trp Gly Gly Asn Gly Phe

130 135 140

Pro Glu Trp Ala Ile Glu Ser Arg Pro Arg Glu Trp Glu Pro Asn Pro

145 150 155 160

Gly Phe Pro Leu Tyr Tyr Leu Met Pro Ser Leu Asn Ala Gly Trp Asp

165 170 175

Glu Val Trp Gly Asn Thr His Gly Ala Leu Asp His Leu Gly Thr Ala

180 185 190

Leu Gly Ala Leu Ala Glu Arg Val Glu Gly Lys Pro Gly Val Met Gly

195 200 205

Ile Glu Leu Leu Asn Glu Pro Trp Pro Gly Ser Arg Phe Leu Ser Cys

210 215 220

Phe Pro Asn Gly Cys Pro Asp Phe Asp Arg Thr Tyr Gln Ala Ala Met

225 230 235 240

Gln Lys Leu Thr Asp Ala Val Arg Ala Gln Asn Pro Thr Ile Pro Val

245 250 255

Tyr Trp Glu Pro Asn Val Thr Trp Asn Gln Met Met Pro Ser Asn Leu

260 265 270

Phe Ala Pro Pro Val Thr Pro Ala Leu Thr Thr Ala Asp Val Val Phe

275 280 285

Ala Pro His Asp Tyr Cys Ile Pro Ser Gln Leu Ala Ile Tyr Leu Gly

290 295 300

Leu Pro Gln Ala Leu Arg Gly Leu Cys Val Pro Gln Gln Asp Leu Thr

305 310 315 320

Trp Ser Asn Ile Asp Ala Ile Thr Glu Arg Ala Asn Val Pro Thr Val

325 330 335

Ile Thr Glu Phe Gly Asp Gly Asp Pro Thr Val Leu Lys Asn Thr Leu

340 345 350

Ala Arg Ala Asp Glu Arg Phe Ile Gly Trp Gln Tyr Trp His Phe Gly

355 360 365

Ala Gly Asn Ala Thr Asp Pro Phe Leu Gly Glu Val Gly Arg Gln Leu

370 375 380

Val Arg Thr Tyr Pro Gln Ala Thr Ala Gly Glu Pro Gly Arg Met Ile

385 390 395 400

Phe Asp Ala Asp Asn Gly Asp Phe Ala Tyr Arg Phe Thr Pro Arg Ala

405 410 415

Ala Thr Arg Pro Thr Glu Ile Phe Val Ser Asp Leu His Tyr Pro Asp

420 425 430

Gly Tyr Ala Val Gln Val Asp Gly Gly Gln Val Thr Ser Ala Pro Gly

435 440 445

Ala Arg Ile Val Thr Val Val Ala Asp Gly Ser Gly Pro Val Thr Val

450 455 460

Lys Ile Asn Arg Pro Gly Ser Ala Gly Ala Glu Val Pro Asp Gly Pro

465 470 475 480

Ile Glu Thr Ser Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser

485 490

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 3

aaacgcggat ccgccccgcc ggcgaccccg atta 34

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 4

aaacccaagc tttcaggacg aaccgctac 29

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 5

accgttatta cggcatttgg cgatggt 27

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 6

accatcgcca aatgccgtaa taacggt 27

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 7

accgttatta cgacatttgg cgatggt 27

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 8

accatcgcca aatgtcgtaa taacggt 27

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 9

accgttatta cgatgtttgg cgatggt 27

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 10

accatcgcca aacatcgtaa taacggt 27

Claims (10)

1.一种鞘糖脂内切糖苷酶，其特征在于，所述鞘糖脂内切糖苷酶与SEQ ID NO:2的序列一致性不低于85％，且第339位或其对应位点发生突变，所述突变为第339位的谷氨酸被甲硫氨酸所取代。

2.一种多核苷酸，编码一种鞘糖脂内切糖苷酶，其特征在于：所述的多核苷酸编码如权利要求1所述的一种鞘糖脂内切糖苷酶或与SEQ ID NO:1的序列一致性不低于80％。

3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求2所述的多核苷酸。

4.一种基因工程化的细胞，其特征在于，所述的细胞包含权利要求3所述的表达载体，或者其基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸。

5.一种可基因工程化表达鞘糖脂内切糖苷酶的方法，其特征在于，将权利要求2所述的多核苷酸插入到权利要求3所述的表达载体中，再整合至权利要求4所述的基因工程化细胞中进行培养和表达，最终可在胞内或胞外获得可溶性的鞘糖脂内切糖苷酶。

6.一种糖苷键合成的方法，其特征在于，在生物酶法催化体系中，使用如权利要求1所述的鞘糖脂内切糖苷酶，以氟化糖作为糖基供体，可以使带羟基的底物发生糖苷化。

7.根据权利要求6所述的一种糖苷键合成的方法，其特征在于，所述氟化糖为α-氟代单糖或α-氟代寡糖。

8.根据权利要求6所述的一种糖苷键合成的方法，其特征在于，所述带羟基的底物为带有自由羟基的鞘氨醇类化合物或者脂肪醇类化合物或其化学衍生物。

9.一种在鞘糖脂制备以及生产中的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)由权利要求1所述的鞘糖脂内切酶催化氟化糖与鞘氨醇类化合物组装为溶血鞘糖脂；

(2)由去酰基化酶催化溶血鞘糖脂与脂肪酸链模块组装为完整的鞘糖脂。

10.如权利要求1所述的鞘糖脂内切糖苷酶或如权利要求2所述的多核苷酸或如权利要求3所述的表达载体或如权利要求4所述的基因工程化细胞在鞘糖脂或寡糖的制备、生产、分析与合成中的应用。