CN1145954A

CN1145954A - 编码神经酰胺糖内切酶的基因

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Publication number: CN1145954A
Application number: CN96111091A
Authority: CN
Inventors: 伊豆博幸; 黑目洋子; 泉可也; 佐野睦; 加藤郁之进; 伊东信
Original assignee: Takara Shuzo Co Ltd
Current assignee: Takara Bio Inc; Takara Holdings Inc
Priority date: 1995-06-29
Filing date: 1996-06-29
Publication date: 1997-03-26
Anticipated expiration: 2016-06-29
Also published as: CN1136316C; EP0751222A2; EP0751222A3; KR970001542A; DE69635849D1; KR100454174B1; EP0751222B1; DE69635849T2; US5795765A

Abstract

带有编码具有神经酰胺糖内切酶活性的多肽或其功能等同变异体之序列的分离的DNA，及用基因重组技术生产具有神经酰胺糖内切酶活性之多肽或其功能等同变异体的方法。

Description

编码神经酰胺糖内切酶的基因

本发明涉及编码具有神经酰胺糖内切酶(endoglycoceramidase)活性之多肽的DNA。具体地说，本发明涉及编码神经酰胺糖内切酶的核苷酸序列及其氨基酸序列，所说酶适用对工程化改造的糖链中的糖脂进行结构、功能及其他分析。本发明还涉及工业化生产具有神经酰胺糖内切酶活性之多肽的方法。

在神经鞘糖脂分子中，鞘氨醇中伯醇的羟基基团借助糖苷键结合到单糖或寡糖上，并在其上进一步通过形成酸—酰胺键而结合脂肪酸。包括鞘氨醇碱和脂肪酸的部分被称为神经酰胺(Shishitsuno Kagaku，p.365，Tokyo Kagaku Dojin(1974)]。鞘脂作为细胞表面层的重要成份在动物中有广泛的分布，并已对其与血型物质及细胞抗原性、信号传递和分化等多种功能的联系给予大量关注。

神经酰胺糖内切酶(EC3.2.1，123)是一种水解鞘糖脂中糖链和神经酰胺间糖苷键，以释放完整形式的糖链和神经酰胺的酶。与脑苷脂酶不同，该酶并不作用于经单糖与神经酰胺结合所形成的脑苷脂上。神经酰胺糖内切酶最初是从红球菌属(Rhodococcus)菌株之放线菌中分离的[The Journal of Biological Chemistry，Vol.261，pp.14278-24282(1986)]。还已知红球菌菌株可产生有不同底物特异性的三种不同类型的神经酰胺糖内切酶(I、II、III)(TheJournal of Biological Chemistry，Vol.264，No.16，pp.9510～9519(1989))。

已知的其他类型神经酰胺糖内切酶包括由水蛭(Biochemicaland Biophysical Research Comman.，Vol.141，pp.346-352，1986)、蚯蚓(Biochemical and Biophysical Research Communicution，Vol.149，pp.167-172，1986)、细菌(European Journalof Bioehenistry，Vol.205，pp.729-735，1992)和蛤(The FASEB J.，Vol.8，pp.A1439，1994)产生的神经酰胺糖内切酶。

然而，使用上述生物体以高纯度大量生产神经酰胺糖内切酶是极其困难的。这是因为由上述生物体产生的神经酰胺糖内切酶的量很小，而且还共存有其他的酶，例如糖苷酶和鞘磷脂酶需要的纯化方法校困难。因此需要有一种以低成本生产高纯度酶的方法。已报导了从各种生物体中纯化神经酰胺糖内切酶的方法。但还没有阐明神经酰胺糖内切酶的氨基酸序列和基因结构，从而阻碍了以基因工程技术生产该酶。

因此，本发明的一个目的是提供编码具有神经酰胺糖内切酶活性之多肽的DNA。本发明的另一个目的是提供使用带有插入其中之DNA的重组体以基因工程技术生产高纯度神经酰胺糖内切酶的方法。

为了实现上述目的，本发明人为分离编码具有神经酰胺糖内切酶活性之多肽的DNA，以阐明其碱基序列而进行了深入的研究。结果，本发明人最终在阐明编码具有神经酰胺糖内切酶活性的多肽之DNA的完整碱基序列，以及使用基因工程技术由简单和容易的方法，生产高纯度神经酰胺糖内切酶方面获得了成功。基于这些事实，发明人已完成了本发明。

在一个优选实施方案中，本发明涉及带有编码具有神经酰胺糖内切酶活性的多肽或其功能等同变异体之序列的分离的DNA。具体地说，分离的DNA包括选自下列(a)至(d)的DNA序列：

(a)编码SEQ ID NO：1或SEQ IN NO：3之氨基酸序列的DNA序列，或其片段：

(b)SEQ ID NO2或SEQ ID NO：4的DNA序列，或其片段；

(c)编码经在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示氨基酸序列中删除、加入、插入或取代一个或多个氨基酸而产生之氨基酸序列的DNA序列，或其片段；以及

(d)能够与上述(a)至(c)中的任何一个序列杂交的DNA序列。

在另一个实施方案中，本发明涉及包含本发明分离的DNA的重组DNA，包含该重组DNA的载体，以及用该载体转化的原核或真核细胞。

在另一个实施方案中，本发明涉及生产具有神经酰胺糖内切酶活性之多肽或其功能等同变异体的方法，该方法包括：

(a)培养本发明的细胞；以及

(b)从步骤(a)中得到的培养物中回收具有神经酰胺糖内切酶活性的多肽或其功能等同变异体。

在另一个实施方案中，本发明涉及按本发明方法生产的或由本发明的分离的DNA编码的具有神经酰胺糖内切酶活性的多肽或其功能等同变异体。

在另一个实施方案中，本发明涉及与本发明分离的DNA特异性杂交的合成的寡核苷酸探针或引物。

在另一个实施方案中，本发明涉及与本发明的多肽特异性结合的抗体或其片段。

本发明首先阐明了神经酰胺糖内切酶II的氨基酸序列和编码该酶的核苷酸序列，从而提供编码具有神经酰胺糖内切酶II活性之多肽的DNA。本发明还提供了一种使用基因工程技术在工业规模上生产具有神经酰胺糖内切酶II活性之多肽的方法。

图1显示插入到pM36H、pM36K和pBS1K中之片段的限制性酶切图谱，以及各插入段和编码神经酰胺糖内切酶(EGCase)II之基因的定位。

图2是质粒pTEG2的构建图。

图3是质粒pTEG3的构建图。

图4是质粒pTEGP1的构建图。

如上文中提到的神经酰胺糖内切酶是指水解鞘糖脂中糖链和神经酰胺间的糖苷键以释放完整形式的糖链和神经酰胺的酶，并包括衍生于各种生物体的神经酰胺糖内切酶。例如，已知三种不同类型的神经酰胺糖内切酶是从红球菌属菌株得到的(神经酰胺糖内切酶I、II和III)，并且这些都是本发明优选的神经酰胺糖内切酶。例如，可用The Journal of Biological Chemistry，Vol.267，pp.1522-1527(1992)或Journal of Biochemistry，Vol.264，No.16，pp.9510-9519(1989)中描述的方法检测神经酰胺糖内切酶的活性。

本说明书中使用的术语＂具有神经酰胺糖内切酶活性的多肽＂(本说明书中有时也简单地称为＂神经酰胺糖内切酶＂)不仅是指具有天然神经酰胺糖内切酶之氨基酸序列的多肽，而且还指由于对氨基酸序列进行氨基酸的删除、取代、插入或加入等修饰所得到的其变异体，只要用上述方法检测时它们显示有神经酰胺糖内切酶活性即可。本文中所说的＂天然神经酰胺糖内切酶包括但不只限于由红球菌属株产生的神经酰胺糖内切酶。另外还包括由其他微生物，如其他放线菌、细菌、酵母、真菌、子囊菌和担子菌产生的神经酰胺糖内切酶，以及来自植物、动物、昆虫和其他活体材料的神经酰胺糖内切酶。

本文所使用的术语＂功能等同变异体＂被限定为：

某种天然存在的蛋白质由于蛋白质本身在体内纯化期间或在纯化期间的修饰作用，以及由于编码该蛋白质之基因的多态性和变异，而使其氨基酸序列经受氨基酸缺失、插入、加入、取代及其他变异。一个已知的事实是，有某些这样的多肽就生理学和生物学活性来说实质上等同于无变异的蛋白质。结构上不同于相应的蛋白质，但与该蛋白质又没有明显的功能差异的多肽被称为功能等同变异体。

经在蛋白质的氨基酸序列中人工导入这些变异而制得的多肽也视为功能等同变异体。虽然可以如此得到更加不同的变异体，但只要它们的生理学活性实质上等同于原有的无变异蛋白质，则所得到的变异体也看作是功能等同变异体。

例如，据报道常常通过蛋氨酸氨基肽酶的作用除去在大肠杆菌中表达之蛋白质N末端上的蛋氨酸残基，但某些这样表达的蛋白质具有蛋氨酸残基，而其他的则没有。然而，在大多数情况下是否存在蛋氨酸并不影响蛋白质活性。另外还知道，用丝氨酸置换人白介素2(IL-2)之氨基酸序列中的特定半胱氨酸残基所得到的多肽仍保留IL-2活性(Science，224，1431，1984)。

另外，在用基因工程技术生产蛋白质中，所需的蛋白质常常是作融合蛋白质表达的。例如，将衍生于另一种蛋白质的N末端肽链加到所需蛋白质的N末端上以提高所需蛋白质的表达水平，或者在所需蛋白质的N或C末端加上一个适当的肽链，表达该蛋白质，并使用对所加肽链显示有亲和性的载体，以有利于纯化所需的蛋白质。

此外，就基因上决定特定氨基酸的密码子(三联碱基组合)来说，已知每种氨基存在1至6种密码子。因此，虽然取决于氨基酸序列，但可以有许多编码某一氨基酸序列的基因。事实上，基因都是不稳定的，常常经受核酸变异。基因的变异可能不影响被编码的氨基酸序一列(沉默变异)；在这种情况下，可以说已产生了编码同一氨基酸序列的不同的基因。因此，即使在分离编码特定氨基酸序列的基因时，随着含有该基因之生物体的传代而产生多种编码同一氨基酸序列的基因的可能性也是不能忽视的。

再者，借助多种不同的基因工程技术人工产生多种编码同一氨基酸序列的基因并不困难。

例如，当用于编码所需蛋白质之天然基因的密码子在用于以基因工程生产该蛋白质的宿主中的可利用性低时，有时便不能表达足够量的蛋白质。在这种情况下，可以在没有改变所编码的氨基酸的条件下将密码子人工转变成在相应宿主中有高可利用性的另一个密码子，从而提高所需蛋白质的表达水平。当然有可能人工产生编码某一特定氨基酸序列的各个不同的基因。因此，只要是编码本文公开的氨基酸序列，这些人工产生的不同的多核苷酸均包括于本发明的范围内。

此外，对所需蛋白质之氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基进行包括删除、加入、插入或取代等至少一种改变所产生的多肽通常具有功能上等同于所需蛋白质的活性；编码这些多肽的基因，不管是从天然来源分离的或是人工生产的，也均包括于本发明的范围内。

一般说来，编码功能等同变异体的基因常常是彼此同源的。因此，能够与本发明的基因杂交的，以及编码具有神经酰胺糖内切酶活性之多肽的核酸分子也包括在本发明的范围内。

下文仅就衍生于红球菌属菌株的神经酰胺糖内切酶II详细描述本发明。

首先，获得关于纯化之神经酰胺糖内切酶II的部分氨基酸序列的信息。具体地说，对按照The Journal of BiologicalChemistry，Vol.267，pp.1522-1527(1992)中所述方法纯化的神经酰胺糖内切酶II进行Edman降解(The Journal of BiologicalChemistry，Vol.256，pp.7990-7997，1981)，以便用进一步常规方法进行氨基酸序列测定。但由于神经酰胺糖内切酶II的N末端被封闭，所以尚不能直接进行氨基酸测序。因此须在去保护或释放被封闭的N末端氨基酸残基后再对酶进行氨基酸测序，以确定其部分氨基酸序列。或者，可以在高度特异性的蛋白水解酶如赖氨酰肽链内切酶的作用下将酶部分水解，并可分离并纯化所产生的肽片段，然后进行氨基酸序列测定。基于如此获得的部分氨基酸序列信息，克隆神经酰胺糖内切酶。为此目的，可使用通常的PCR或杂交方法。

然后，基于部分氨基酸序列信息，设计用作Southern杂交探针的合成的寡核苷酸。用包括MluI、SalI、PstI及BanHI在内的适当的限制性酶完全消化红球菌属种类M-777的基因组DNA，并对其进行琼脂糖凝胶电泳分离(T.Maniatis，et al.，Moleculer Cloming，ALaboratory Manual，Ind ed.，Chepter 6，pp.3-20，Cotd SpringHarbor Laboratory Press，1989)，然后用常规方法(T.Mamiatiset al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Ind ed.，Chaptorg，pp.34，Cold Spring Harbor Labrabory Press，1989)将分离的片段转印迹到尼龙膜上。可在常用条件下进行杂交。例如，在含有6×SSC(1×SSC是将8.77gNaCl和4.41g柠檬酸钠溶解于1升水中而制成的)、0.5％SDS、5X Denherdt氏溶液(含有各1％浓度的牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮和Ficoll)和100μg/ml鲑精子DNA的预杂交溶液中，于65℃封闭尼龙膜，并加入各32P标记的合成寡核苷酸，然后于65℃保温过夜。在含有0.1％SDS的2×SSC中将尼龙膜于62℃洗30分钟后，进行放射自显影以检测与合成的寡核苷酸探针杂交的DNA片段。提取相当于所检测之带的DNA片段并从凝胶中纯化之，以常用方法将该DNA片段插入质粒载体中。有用的质粒载体包括但不只限于可从商业途径购得的pUC18、pUC19、pUC119及pTV118N(所有这些都是Talcada Shuzo的产品)。

然后将如此得到的重组质粒导入宿主以转化之。有用的宿主细胞包括细菌(如大肠杆菌、柘草芽孢杆菌和放线菌)的原核细胞，以及酵母、真菌、动物、植物等的真核细胞。

当宿主是大肠杆菌时，只要能够被转化并表达所需的基因，其可以是野生型或变异的菌株。可按常用方法，例如T.Maniatis etal.，The Moleculoor Cloning，A Laboratory Manual，ColdSpring Hafbor Laboratory Press(1982)中描述的方法实现这一质粒导入过程。

然后选择携带所需DNA片段的转化体。为此，可利用质粒载体的特征。例如，在使用pUC19的情况下，可在含有氨苄青素的平皿上选择氨苄青霉素抗性菌落，或在含有氨苄青霉素、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(X-Gal)和异丙基-β-D-巯基呋喃半乳糖苷(IPTG)的平皿上选择氨苄青霉素抗性白色菌落，以选择已导入了外来基因的菌落。

然后从上述群体中挑选出携带有含所需DNA片段之载体的菌落。可依据载体类型适当选用集落杂交方法(T.Maniatis，et al.，Moleculer Cloning，A Laboratory Manual，Ind ed.，Chapter 1，pp 90-104，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press)或噬斑杂交法(T.Maniatis，et al.，Molecular Coloning，ALaboratoryManuel，Ind ed.，Chapter 2，pp.108-117，ColdSpring HarborLaboratory Press，1989)完成这一选择。也可运用PCR方法[chapter 14，Pages 15 to 19 of the Molocularcloning，ALaboratory Manual，Ind ed.，T.Maniatis et al.，Cold SpringHarbor Laboratory Press，(1989)]。

在选择出含有所需DNA片段的载体之后，即可用常规方法，如双脱氧链终止法(T.Maniatis，et al.，Molecular Cloring，ALaboratory Manual，Ind ed.，Chapter 13，pp.3-10，ColdSpringHarbor Laboratory Press，1989)测定该载体中插入之所需DNA片段的碱基序列。将如此测得的碱基序列与神经酰胺糖内切酶II的部分氨基酸序列、分子量等进行比较，以弄清神经酰胺糖内切酶II的基因结构及整个氨基酸序列。

当所需DNA片段不含有全长度神经酰胺糖内切酶II时，可以用其他限制性酶消化红球菌属种类M-777的基因组DNA，例如使用按上述方法制得的DNA片段的一部作为探针，经杂交从消化产物中得到缺少的部分，然后再连接该缺少的部分，即获得全长度神经酰胺糖内切酶II。

将按上面所述获得的所得完整或部分的神经酰胺糖内切酶II基因插入到适当的质粒载体中，然后再将该载体转化到宿主细胞内。在常用条件下培养如此得到的转化体，以产生具有神经酰胺糖内切酶活性的多肽。

例如，在分别使用大肠杆菌和pTV 118N作为宿主细胞和质粒载体时，在含有100μg/ml氨苄青霉素的L培养基(0.1％Trypton、0.05％酵母提取物、0.1％NaCl，pH7.2)中将转化体37℃培养过夜；在600nm吸光率达到约0.5后，加入IPTG，然后用于37℃培养4小时。然后回收细胞、裂解、并经超声波等处理破碎之，以溶解在细胞中产生并积聚的所需的神经酰胺糖内切酶II，然后离心得到作为神经酰胺糖内切酶II之无细胞提取溶液的上清液。被表达的所需的酶可以以包涵体的形式产生。

可以通过(例如)检测神经酰胺糖内切酶II活性来进一步证实基因产物的表达。例如当重组体是大肠杆菌时，可以使用重组大肠杆菌的提取物作为酶溶液，以Journal of Biological Chemistry，Vol.267，pp.1522-1527(1992)中所述的方法检测活性；或者使用纯化的脱唾液酸GMI(asialo-GM1)作为底物，以Journal ofBiological Chemistry，Vol.264，No.16，pp.9510-9519(1989)中所述的Park和Johnson的方法检测活性。

当记录到所期望的神经酰胺糖内切酶II表达水平时，即检查神经酰胺糖内切酶II表达的最适条件。

可用常规方法从转化体培养物中纯化神经酰胺糖内切酶II。亦即，离心收集转化体细胞，经超声波处理等方法破碎细胞，然后例如离心得到无细胞提取物，并用诸如盐析及包括离子交换层析、凝胶过滤、疏水层析和亲和层析等多种层析方法的常规蛋白质纯化方法纯化之。依据所使用的宿主一载体系统，可由转化体细胞外分泌表达产物；在这种情况下，可按上述同样方法从培养物上清中纯化产物。当宿主是大肠杆菌时，表达产物可以是以不溶性包涵体的形式存在的。在这种情况下，于培养后离心收集细胞，经超声波处理或类似方法破碎细胞，然后进行离心等方法以分离含包涵体的不溶性部分。洗涤后，用常用的蛋白质增溶剂例如尿素或盐酸胍溶解包涵体，然后以各种层析法，例如离子交换层析、凝胶过滤、疏水层析及亲和层析等层析纯化，并按需要通过透析或稀释进行再折叠处理以得到保留其活性的神经酰胺糖内切酶II制剂。可用各种层析法纯化该制剂，以产生高纯度的神经酰胺糖内切酶II制剂。

本发明的DNA是带有编码神经酰胺糖内切酶活性肽之DNA片段的分离的DNA，例如是带有编码序列表中所示SEQ ID NO：1之氨基酸序列的DNA片段的DNA。作为实例，还可以是具有编码序列表中所示具有神经酰胺糖内切酶活性或功能等同物活性之SEQ ID NO：1的部分氨基酸序列的DNA片段的DNA。这样的DNA的例子包括序列中所示SEQ ID NO：2的DNA，及其含有编码具神经酰胺糖内切酶活性之多肽的部分核苷酸序列的DNA。

在本发明中，还包括与上述DNA杂交并编码具有神经酰胺糖内切酶活性之多肽或其功能等同变异体的DNA。本发明的基因还包括有或没有编码信号序列之核苷酸序列的基因。例如，SEQ ID NO：1中显示的神经酰胺糖内切酶II的完整氨基酸序列(包括信号序列)；SEQ ID NO：2中所示的其DNA序列；和SEQ ID NO：3中所示的神经酰胺糖内切酶II的完整氨基酸序列(不包括信号序列的N末端序列)；SEQ ID NO：4中所示的其DNA序列。

也可以使用本发明的核苷酸序列，通过杂交从来自其他细胞的基因或cDNA得到编码具有神经酰胺糖内切酶活性之多肽的本发明的DNA。在这种情况下，例如可使用下述方法。

首先，将从所需的基因来源获得的染色体DNA，或借助反转录酶从mRNA制得的cDNA连接到质粒或噬载体载体上并用常规方法将其导入宿主中以产生基因文库。然后在平皿上培养该文库；将所得到的集落或噬斑转移到硝酸纤维素或尼龙膜上并进行变性处理，以将DNA固定在膜上。在含用32p等标记之探针(使用的探针可以是编码序列表中SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的任何基因或其部分；例如可使用SEQ ID NO：2或IEQ ID NO：4所示的基因或其部分)的溶液中保温该膜，以形成膜上DNA与探针间的杂交体。

例如，在含有6×SSC、1％SDS、100μg/ml鲑精子DNA和5×Denhardt氏溶液的溶液中，将其上面固定有DNA的膜与探针于65℃杂交20小时。杂交后，洗掉非特异性吸附的蛋白质，然后进行放射自显影等，以鉴定与探针形成了杂交体的克隆。重复该操作直至得到形成了杂交体的单个克隆。如此得到的克隆具有已插入其中的编码所需蛋白质的基因。

然后，例如用下述方法检测所得基因的碱基序列，以证实所得到的基因是否与编码具有神经酰胺糖内切酶活性之多肽的所需基因相同。在重组体是大肠杆菌时，可在试管或类似容器中培养大肠杆菌，用常规方法提取质粒，用限制性酶消化所提取的质粒，分离插入段并亚克隆到M13噬菌体载体或类似载体中，并以双脱氧法测定碱基序列，从而完成对经杂交所得克隆的碱基测序工作。当重组体是噬菌体时，可使用基本上与上述程序相同的程序确定碱基序列。例如在T.Maniatis，et al.，Molecular Cloning，A LaboratoryMamual，Ind.ed.，Cotd Spring Harbor Laboratory Press(1989)中描述了从培养到碱基测序的基本实验技术。

可以将测得碱基序列与本发明神经酰胺糖内切酶基因的碱基序列及序列表中SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列相比较，以进一步证实如此得到的基因即为编码具有神经酰胺糖内切酶活性之多肽的所需基因。

如果所得到的基因不含有编码具有神经酰胺糖内切酶活性之多肽的完整区域，可以根据所得基因制备合成的DNA引物，以PCR方法扩增缺少的区域或使用所得的作为探针的基因片段筛选DNA文库或cDNA文库，以确定与本发明的神经酰胺糖内切酶基因杂交的，编码具有神经酰胺糖内切酶活性之多肽的完整区域的碱基序列。

可以按下述基因工程技术制得具有神经酰胺糖内切酶活性的多肽：

首先，用常规方法将如上制得的编码具有神经酰胺糖内切酶活性之多肽的DNA连接到能够在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、放线菌、酵母、动物细胞、昆虫细胞或植物细胞等适当宿主细胞中表达该基因的表达载体上，然后导入宿主细胞内以得到转化株。培养该转化株即可产生具有神经酰胺糖内切酶活性的多肽。由真核生物体衍生的神经酰胺糖内切酶可能带有糖链。可以使用不能生物合成糖链的细胞，如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌和放线菌作为宿主，或者使用已丢失了其生物合成糖链之能力的变异的酵母、真菌、动物、昆虫或植物细胞作为宿主，表达具有神经酰胺糖内切酶活性但不带糖链的多肽。

在某些表达系统中，所表达的神经酰胺糖内切酶以不溶性包涵体的形式积聚于重组体细胞中。在这种情况下，回收包涵体并在温和条件下例如使用尿素溶解包涵体之后，除去变性剂以恢复酶的原有活性。可用上述方法检测神经酰胺糖内切酶活性以进一步证实其表达。

可用普通层析技术从重组细胞中纯化具有神经酰胺糖内切酶活性的多肽。例如，当在破碎细胞后溶出所需多肽时，可对上清液进行层析如疏水相互作用，离子交换层析或凝胶过滤层析，以得到已获表达的所需多肽。当所需多肽以不溶性形式积聚于重组细胞时，可破碎培养的细胞，然后回收沉淀物并用尿素等变性剂溶解之。然后除去变性剂，并按上述方法使分子重新折叠并进行层析处理，以得到有所需活性的多肽。

本发明提供神经酰胺糖内切酶II的一级结构及其基因结构。阐明本发明的基因结构即可用基因工程技术生产具有神经酰胺糖内切酶活性的多肽。借助本发明的基因工程方法，可以以低成本生产具有神经酰胺糖内切酶活性的高纯度多肽制剂。

实施例

下列实施例进一步举例说明本发明，而不是以任何方式限制本发明。实施例1：神经酰胺糖内切酶II结构基因的克隆

(1)基因组DNA的提取和纯化

将神经酰胺糖内切酶II生产菌，红球菌菌种M-777接种到含有1.5％真菌蛋白胨(由OXOID生产的)、0.2％NaCl和0.1％酵母提取物的900ml培养基(pH7.0)中，并于28℃振荡培养3天。培养完成后，离心培养液；收集细胞并悬浮于4.5ml含有10mM Tris-HCl和20mM EDTA的缓冲液(pH8.0)中，然后冻融。向该细胞悬液内加入2.5ml含有50mM Tris-HCl、50mM EDTA和4mg/ml溶菌酶的缓冲液(pH8.0)，然后30℃保温16小时。向该混合物中加入10ml提取缓冲液(50mMTris-HCl，1％SDS、0.4mg/ml蛋白酶K，pH7.5)，并于50℃保温16小时，然后再加入10ml提取缓冲液，并保温16小时。保温后使混合物冷却至室温，加入已用TE缓冲液(10mM Tris-HCl、1mM EDTA，pH8.0)饱和的等体积酚/氯仿溶液，然后轻轻旋转振荡16小时并以3500rpm离心30分钟以回收上清液。将该溶液对含有5mM EDTA的10mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)4℃透析，得到基因组DNA溶液。(2)神经酰胺糖内切酶II的部分氨基酸序列测定

首先用Journal of Biological Chemistry，Vol.267，pp.1522-1527(1992)中所述的方法纯化神经酰胺糖内切酶II。由于纯化的神经酰胺糖内切酶II的N末端被封闭，所以不能用Edman降解法测定其N末端氧基酸序列。

鉴于这一发现，决定按下述方法测定内部氨基酸序列：

在含有4μl吡啶、1μl 4-乙烯基吡啶、1μl三丁基膦和5μl蒸馏水的试管内插入一个含有纯化三神经酰胺糖内切酶II的较小样品管，并真空密封外管，然后100℃加热5分钟以使呈气相之神经酰胺糖内切酶II的半胱氨酸残基吡啶乙基化。将1nmol 如此S-吡啶乙基化的神经酰胺糖内切酶II的样品溶解于50μl含4M尿素的20mM Tris缓冲液(pH9.0)中；加入8pmol赖氨酰肽链内切酶(由Pierce生产的)，然后于37℃消化16小时。使用SMART系统(由Pharmacia生产的)，通过μRPC C2/C18 SC2.1/10柱(由Pharmacia生产的)在从含0.065％三氟乙酸(TFA)的蒸馏水到含0.05％TFA的乙腈的密度梯度上进行反相层析，以纯化肽片段。

使用477型气相肽序列仪(由Applied Biosystems生产的)以Edman降解法分析纯化的肽片段，以确定部分氨基酸序列EGC1(SEQ ID NO：5)、EGC2(SEQ ID NO：6)、EGC4(SEQ ID NO：7)、EGC5(SEQ ID NO：8)、EGC7(SEQ ID NO：9)、EGC8(SEQ ID NO：10)及EGC11(SEQ ID NO：11)。(3)含有神经酰胺糖内切酶II基因之DNA片段的克隆

用各100U限制性酶M1uI、PstI和SalI将上述实施例1(1)中制得的30μg基因组DNA于37℃消化6小时；再加入各100U上述酶后使反应继续进行16小时。使其量相当于5μg DNA的反应混合物经受0.7％琼脂糖凝胶电泳，然后以Southern印迹法(IdenshiKenkyuhouII，pp.218-22l，Tokyo Kagaku Dojin出版)将DNA转移到尼龙膜(Hybond-N⁺，由Amersham生产)上。该膜一式两份提供。

所用的杂交探针是基于实施例1(2)中测得的部分氨基酸序列EGC1合成的寡核苷酸EGIH1(SEQ ID NO：12)和EGIH2(SEQ ID NO：13)。使用MEGARRABEL^TM(由Takara Shuzo生产的)，用³²P标记各5pmol合成的寡核苷酸，得到标记的探针。按上述方法制备的各对膜在含有6×SSC(1×SC是8.77g NaCl和4.41g柠檬酸钠在1升水中形成的水溶液)、0.5％SDS、100μg/μl鲱鱼精子DNA和5×Denhardt氏溶液(含有浓度各为0.1％的牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮和Ficoll)的水溶液中65℃预杂交5小时，然后加入浓度为0.5pmole/μl的各种标记的探针，并于65℃杂交过夜。然后将每片膜于6×SSC中室温下洗10分钟，在2×SSC和0.1％ SDS中室温下洗10分钟，并在0.2×SSC和0.1％SDS中62℃洗30分钟；除去过量溶液后，使各滤膜曝露于影象板(由Fuji Photo Film生产的)3小时，并使用BAS 20000图象分析仪(由Fuji Photo Film生产的)检测图象。

结果，在相当于MluI消化产物的大约4.4Kbp、Pst1消化产物的大约1.9kbp及SalI消化产物的大约1.2kbp的位置上出现了与合成的寡核苷酸EGIH1(用作探针)杂交的带。除了用合成的寡核苷酸EGIH1检测到的带外，还检测到许多与合成的寡核苷酸EGIH2杂交的非特异带。基于这一发现，使用MluI消化产物进行下述实验。

在pUC19(由Takada Shuzo生产的)的HincII消化产物中插入并连接一个磷酸化的MluI接头(由Takada Shuzo生产的)，构建一个带有新插入之MluI位点的质粒并定名为pUC19M。对20μg用限制性酶MluI消化的基因组DNA进行0.7％琼脂糖凝胶电泳分离；切下相应于上述杂交中出现之带的琼脂部分并使用EASYTRAP^TM(由TakadaShuzo生产的)提取并纯化之，将所得到的DNA片段插入并连接到用限制性酶MluI消化pUC19M所得到的片段上。

用该质粒转化大肠杆菌JM109，然后将其培养于5个含有L-琼脂培养基(其中加有100μg/ml氨苄青霉素)的8.5cm直径圆形平皿上，直到每个平皿中形成200至1000个菌落。从这些平皿中选出500个菌落并移至置于同样培养基之平皿上的尼龙膜(Hybond-N⁺，由Amersham生产的)上。37℃保温3小时后，将此尼龙膜在浸于含0.5M NaOH和1.5M NaCl之溶液中的滤纸上放置5分钟(变性)，并在浸于含0.5M Tris-HCl缓冲液(pH7.0)和3M NaCl之溶液中的滤纸上放置5分钟(中和)，然后用2×SSC淋洗。使用该尼龙膜并以合成的寡核苷酸EG1HI(SEQ ID NO：12)作探针，在上述同样条件下进行杂交；得到两个有阳性信号的克隆。这些大肠杆菌JM 109克隆分别称为1-25和3-6。从这些克隆中分离质粒DNA，并用碱裂解法(T.Maniatiset al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Inded.，Chapterl，pp.25-28，CoLd Spring Harbor Laboratory，1989)纯化之，并分别称之为pEGCM 125和pEGCM36。用几种限制性酶(MlUI、EcoRI、HindIII)消化这些质粒DNA 并电泳以进行酶切图谱分析。结果发现pEGCM125具有两个MluI插入段。

基于这一发现，使用pEGCM36进行下述实验。

用24种限制性酶消化pEGCM36，并电泳以进行酶切图谱分析。另外还用上述Southern印迹法将菌落转移到尼龙膜(Hybond-N⁺，由Amersham生产的)上，使用合成的寡核苷酸EGIH1(SEQ ID NO：12)作为探针，在上述的同样条件下进行杂交。在与探针杂交的带中，经琼脂糖凝胶电泳纯化出用限制性酶Hinc II消化得到的约1kpb DNA片段和用限制性酶KpnI消化得到的约1.1kbp DNA片段，并分别亚克隆到pUC19的HincII位点和Kpn位点中。所得到的质粒分别称为pM36H和pM36K。用合适的限制性酶(PstI、SphI、SmaI/NaeI)进一步消化这些质粒，并使用DNA连接试剂盒(由Takada Shuzo生产的)使之自身连接以得到各种缺失变异体。

用双脱氧链终止法(T.Maniatis et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manaal，Ind ed.，Chapter 13，pp.3-10，CotdSpring Horbor Laborutaory，1989)从其末端检测这些缺失变异体和pM36H、pM36K及pEGCM36的碱基序列；其显示pM36H插入段和pM36K插入段在pEGDM36插入段的末端彼此交迭。另外还显示编码部分氨基酸序列EGC1(SEQ ID NO：5)、EGC2(SEQ ID NO：6)、EGC4(SEQ ID NO：7)、EGC5(SEQ ID NO：8)、EGC8(SEQ ID NO：10)和EGC11(SEQ ID NO：11)的碱基序列存在于同一阅读框上，并且编码信号肽样序列的DNA序列存在于阅读框的上游。

然而，这里所测得的碱基序列都没有编码部分氨基酸序列EGC7(SEQ ID NO：9)的碱基序列，也没有编码部分氨基酸序列EGC1、EGC2、EGC4、EGC5、EGC8和EGC11之阅读框下游的终止密码子。(4)克隆含有编码神经酰胺糖内切酶IIC末端区域之基因的DNA片段

为了包括神经酰胺糖内切酶II基因的全长度，筛选pEGCM36中缺少的编码接近C末端部分的DNA片段。以按上文实施例1(3)中所述同样方法进行Southern杂交。所使用的探针是用HincII消化pM36K得到的，含有最接近C末端之DNA序列的约200bp片段。具体地说，用HincII消化pM36K并进行1％琼脂糖凝胶电泳，然后切下所得到的约200bp DNA片段。

使用SpinBind^TM(由Takada Shuzo生产的)提取并纯化HincII消化片段，使用BcaBEST^TM标记试剂盒(由Takada Shuzo生产的)对所得到的纯化之DNA片段进行³²P标记，以得到标记的探针。在37℃下用各180U限制性酶BamHI、PstI和HincII将50μg实施例1(1)中制备的基因组DNA消化6小时。按实施例1(3)中所述同样方法由相当于10μgDNA的该反应混合物制备杂交滤膜。在含有6×SSC(1×SSC是8.77g NaCl和4.41g柠檬酸钠在1升水中制成的水溶液)、0.5％SDS、100μg/ml鲱鱼精子DNA和5×Denhardt氏溶液(含有浓度各为0.1％的牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮和Ficoll)的溶液中，于68℃使各膜预杂交3小时，然后以0.1pmos/ml的浓度加入标记的探针，并于68℃杂交过夜。然后在6×SSC中将各滤膜室温下洗10分钟，在2×SSC和0.1％SDS中室温下洗10分钟，并在0.2×SSC和0.1％SDS中70℃下洗30分钟。除去过量的水后，使各滤膜对影象板(由Fiji PhotoFilm生产的)曝露10分钟，并使用BAS 2000图象分析仪(由FujiPhoto Film生产的)检测影象。

结果，在相当于BamHI消化产物之约2.7kbp、PstI消化产物之1.3kbp、和HincII消化产物之0.3kbp的位置上出现与探针杂交的带。对用BamHI消化的20μg基因组DNA进行0.7％琼脂糖凝胶电泳分离；切下相当于上述杂交中显示之约2.7kb带的琼脂部分；使用ESYTRAP(由Takada SHuzo生产的)进行提取和纯化；将所得到的DNA片段插入到pUC19的BamHI位点。

用该质粒转化大肠杆菌JM109后，在10个含有添加100μg/ml氨苄青霉素之L-琼脂培养基的8.5cm直径圆形平皿上将其培养过夜，直到每平皿形成200至500个菌落。从这些平皿中选择500个菌落并转移到置于同样培养基平板上的尼龙膜(Hybond-N⁺，由Amersham生产的)上。37℃保温10小时后，将该尼龙膜在浸于含0.5M NaOH和1.5MNaCl之溶液中的滤纸上放置5分钟(变性)，并在浸于含0.5MTris-HCl缓冲液(pH7.0)和3M NaCl之溶液中的滤纸上放置5分钟(中和)，然后用2×SSC淋洗。使用该尼龙膜并以pM36K的约200bpHincII片段作为探针，在如上所述条件下，按上述同样方法进行杂交；得到一个显示阳性信号的克隆。用碱裂解法制备该克隆的质粒DNA，并定名为pEGCB20。

用几种限制性酶(BamHI、EcoRI、HincII、HindIII、KpnI、PstI、SacI、SalI、SmaI、SphI、XbaI)消化该克隆，并电泳以进行酶切图谱分析。另外用上述Southern印迹法将菌落转移到尼龙膜(Hybond-N⁺，由Amersham生产的)上，然后使用pM36K的约200bpHincII片段作为探针，在如上所述的相同条件下进行杂交。用琼脂糖凝胶电泳法从与探针杂交的带中纯化出经用限制性酶SphI消化所得到的约1kbp DNA片段，并亚克隆到pUC19的SphI位点中；所得到的质粒定名为pBS1K。用适当的限制性酶(MluI、NaeI、SphI)进一步消化该质粒并亚克隆之。

用双脱氧法从其末端检测这些亚克隆及pBS1K的碱基序列。结果出现了pM36K之约200bp HincII片段的碱基序列，连同编码部分氨基酸序列EGC1(SEQ ID NO：9)的碱基序列。此外，在实施例1(3)中测得的pEGCM36之MluI插入段和pEGCB20之BamHI插入段间的区域有1473 bp的开放阅读框(ORF)。在该ORF内，发现了实施例1(2)中测得的编码神经酰胺糖内切酶II之氨基酸序列的所有核苷酸序列。

基于上述结果，确定了神经酰胺糖内切酶II基因的完整碱基序列和一级结构。结果示于图1中，其中显示了pM36H、pM36K和pBS1K插入段的限制性酶切图及这些插入片段的位置。序列表中的SEQID NO：2中显示了神经酰胺糖内切酶II基因之ORF的碱基序列。序列表中的SEQ ID NO.1中显示了由神经酰胺糖内切酶II基因编码之多肽的氨基酸序列。如从序列表的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中可知，在神经酰胺糖内切酶基因中，相当于起始密码子的碱基序列是GTG。实施例2.表达神经酰胺糖内切酶II之质粒的构建

从实施例1制得的pEGCM 36和pEGCB20中分离神经酰胺糖内切酶II结构基因(其中所说的结构基因以两部分存在)，将其连接到适于其在大肠杆菌中表达的质粒上，并将连接产物导入大肠杆菌细胞内，从而构建在大肠杆菌中表达神经酰胺糖内切酶II的质粒。同一原则也适用于其他宿主细胞；可以从pEGMC36和pEGCB20中分离神经酰胺糖内切酶II结构基因(其中结构基因以两部分存在)，将其连接到适于其在宿主细胞内表达的质粒上，并将连接产物导入宿主细胞内，从而构建在任何选择的宿主细胞内表达神经酰胺糖内切酶II的质粒。

首先，用限制性酶AccIII消化pEGC36，然后使用DNA末端钝端化试剂盒(由Takada Shuzo生产)将末端修成平头并再次用限制性酶MluI消化，其后进行琼脂糖凝胶电泳并从凝胶中提取和纯化，得到约1kpb的EGLM36-AccIII/MluI片段。分别用限制性酶MluI和SphI消化实施例1中经亚克隆从pEGCB20得到的pES1K，并进行琼脂糖电泳，然后切下约500bp的BS1K-MluI/SphI片段并提取之。将这些EGCM36-AccIII/MluI和BS1K-Mlu1/SphI片段同时连接并插入到pTV118N(由Takada Shuzo生产的)中以产生pTEG2，其pTV118N是以前用限制性酶EcoRI消化过，末端修成平头并进一步用限制性酶SphI消化的(图2)。

因为该质粒含有编码包括1acZa衍生肽之6个氨基酸残基(SEQID NO：14)的序列，所说的序列位于没有信号样序列之神经酰胺糖内切酶II编码区域的N末端侧上游，所以可望使用SD序列和1acZ的起始密码子诱导表达作为与lac Zα形成融合复合体的神经酰胺糖内切酶II。

同样，将EGCM 36-AccIII/MluI和BS1K-MluI/SphI片段同时连接并插入到pTV118N(由Takada Shuzo生产的)上，以得到pTEG3，其中pTV118N是已用限制性酶SalI消化，末端修成平头并进一步用SphI消化的(图3)。该质粒含有编码包括lacZα衍生肽之18氨基酸残基(SEQ ID NO：15)的序列，所说的序列位于神经酰胺糖内切酶II编码区域之N末端侧的上游，而没有信号样序列。

构建一个包括信号样序列的表达质粒。

用限制性酶AccIII和PmaCI消化实施例1中制得的pM36H并进行琼脂糖凝胶电泳分离，然后从凝胶中提取并纯化得到约90bp的M36H-AccIII-PmaCI片段。

另外用限制性酶AccIII和HindIII消化上述的pTEG2并进行琼脂糖凝胶电泳分离，然后从凝胶中提取并纯化得到约1.6kpp的TEG2-AccIII/HindIII片段。将这些M36H-AccIII/PmaCI和TEG2-AccIII/HindIII片段同时连接并插入到pTV118N中得到pTEGP1，其中所说的pTV118N是预先用限制性酶PstI消化，末端成平头并进一步用限制性酶HindIII消化的(图4)。

用这些质粒转化大肠杆菌宿主细胞得到重组细胞株。

将分别掺入pTEG2、pTEG3和pTEGP1的大肠杆菌JM109菌株分别定名为大肠杆菌JM109/pTEG2、大肠杆菌JM109/pTEG3和大肠杆菌JM109/pTEGP1，其中大肠杆菌JM109/pTEGP1以保藏号FERM BP-5530保藏在Natinal Institute of Biosaience and Human-Technology，Ayency of Industrial Saience and Technology。实施例3.重组神经酰胺糖内切酶II在大肠杆菌中的表达

将实施例2中制得的大肠杆菌JM109/pTEG2、大肠杆菌JM109/pTEG3和大肠杆菌JM109/pTEGP1分别接种到5ml含有100μg/ml氨苄青霉素的L培养基(0.1％Trpton、0.05％酵母提取物、0.1％NaCl，pH7.2)中，并于37℃振荡培养过夜；取100μl培养基液转入120ml同样培养基中。37℃振荡培养过夜后浊度(600nm吸光率)达到约0.5时，加入IPTG至终浓度为1mM，然后将培养物于37℃振荡4小时。培养完成后，离心培养液，收集细胞，将细胞悬浮于3ml含有0.5mM4-(2-氨乙基)苯磺氟盐酸化物，用超声波破碎细胞并离心，收集所得到的上清液用作粗酶溶液。

使用纯化的脱唾液酸GM1作为底物，用Park和Johnson所描述的方法(Journal of Biochemistry，Vol.264，No.16，pp.9510-9519，1989)检测该粗酶溶液中的神经酰胺糖内切酶II活性。将在50μl50mM乙酸钠缓冲液(pH5.5)中的50nmol纯化的脱唾液酸GM1、10μg牛血清白蛋白、适当量酶及0.4％Triton X-100的反应混合物溶液37℃保温15分钟。加入250μl碳酸盐—氰化物溶液(pH 11)终止反应。然后用Park和Johnson(J.of Biological Chemistry，Vol.181，pp.149-151，1949)所述的方法定量所得到的还原糖。作为对照，将底物溶液37℃保温15分钟，然后加入碱溶液，再加入酶。1单位酶限定为能够在上述条件下每分钟从纯化的脱唾液酸GM1催化释放10μmol葡萄糖的酶量。

结果，测得这些上清液中的活性分别是：大肠杆菌/JM109/pTEG2约19mU/ml，大肠杆菌JM109/pTEG3约244mU/ml，大肠杆菌JM109/pTEGP1约15mU/ml。换句话说，发现可从1升大肠杆菌JM109/pTEG2培养液中得到0.5U，从大肠杆菌JM109/pTEG3培养液中得到约6.1U，从大肠杆菌JM109/pTEGP1培养液中得到约0.4U神经酰胺糖内切酶。

对本发明上述实施方案的其他修饰对本领域的技术人员而言是显而易见的，并应包括于本发明下述权利要求范围内。

序列表(1)一般信息：(iii)序列数： 15(2)SEQ ID NO：1的信息：(i)序列特征：

(A)长度：490氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：1Met Arg Arg Thr Arg Leu Val Ser Leu Ile Val Thr Gly Ser Leu1 5 10 15Val Phe Gly Gly Gly Val Ala Ala Ala Gln Ser Ser Leu Ala Ala

20 25 30Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Leu Thr Pro Ser Tyr

35 40 45Leu Lys Asp Asp Asp Gly Arg Ser Leu Ile Leu Arg Gly Phe Asn

50 55 60Thr Ala Ser Ser Ala Lys Ser Ala Pro Asp Gly Met Pro Gln Phe

65 70 75Thr Glu Ala Asp Leu Ala Arg Glu Tyr Ala Asp Met Gly Thr Asn

80 85 90Phe Val Arg Phe Leu Ile Ser Trp Arg Ser Val Glu Pro Ala Pro

95 100 105Gly Val Tyr Asp Gln Gln Tyr Leu Asp Arg Val Glu Asp Arg Val

110 115 120Gly Trp Tyr Ala Glu Arg Gly Tyr Lys Val Met Leu Asp Met His

125 130 135Gln Asp Val Tyr Ser Gly Ala Ile Thr Pro Glu Gly Asn Ser Gly

140 145 150Asn Gly Ala Gly Ala Ile Gly Asn Gly Ala Pro Ala Trp Ala Thr

155 160 165Tyr Met Asp Gly Leu Pro Val Glu Pro Gln Pro Arg Trp Glu Leu

170 175 180Tyr Tyr Ile Gln Pro Gly Val Met Arg Ala Phe Asp Asn Phe Trp

185 190 195Asn Thr Thr Gly Lys His Pro Glu Leu Val Glu His Tyr Ala Lys

200 205 210Ala Trp Arg Ala Val Ala Asp Arg Phe Ala Asp Asn Asp Ala Val

215 220 225Val Ala Tyr Asp Leu Met Asn Glu Pro Phe Gly Gly Ser Leu Gln

230 235 240Gly Pro Ala Phe Glu Ala Gly Pro Leu Ala Ala Met Tyr Gln Arg

245 250 255Thr Thr Asp Ala Ile Arg Gln Val Asp Gln Asp Thr Trp Val Cys

260 265 270Val Ala Pro Gln Ala Ile Gly Val Asn Gln Gly Leu Pro Ser Gly

275 280 285Leu Thr Lys Ile Asp Asp Pro Arg Ala Gly Gln Gln Arg Ile Ala

290 295 300Tyr Cys Pro His Leu Tyr Pro Leu Pro Leu Asp Ile Gly Asp Gly

305 310 315His Glu Gly Leu Ala Arg Thr Leu Thr Asp Val Thr Ile Asp Ala

320 325 330Trp Arg Ala Asn Thr Ala His Thr Ala Arg Val Leu Gly Asp Val

335 340 345Pro Ile Ile Leu Gly Glu Phe Gly Leu Asp Thr Thr Leu Pro Gly

350 355 360Ala Arg Asp Tyr Ile Glu Arg Val Tyr Gly Thr Ala Arg Glu Met

365 370 375Gly Ala Gly Val Ser Tyr Trp Ser Ser Asp Pro Gly Pro Trp Gly

380 385 390Pro Tyr Leu Pro Asp Gly Thr Gln Thr Leu Leu Val Asp Thr Leu

395 400 405Asn Lys Pro Tyr Pro Arg Ala Val Ala Gly Thr Pro Thr Glu Trp

410 415 420Ser Ser Thr Ser Asp Arg Leu Gln Leu Thr Ile Glu Pro Asp Ala

425 430 435Ala Ile Thr Ala Pro Thr Glu Ile Tyr Leu Pro Glu Ala Gly Phe

440 445 450Pro Gly Asp Val His Val Glu Gly Ala Asp Val Val Gly Trp Asp

455 460 465Arg Gln Ser Arg Leu Leu Thr Val Arg Thr Pro Ala Asp Ser Gly

470 475 480Asn Val Thr Val Thr Val Thr Pro Ala Ala

485 490(2)SEQ ID NO：2的信息：(i)序列特征：

(A)长度：1473碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：基因组DNA(xi)序列描述：SEQ ID NI：2：GTGCGTCGCA CCCGGCTCGT ATCGCTGATC GTGACAGGTT CGCTGGTGTT CGGCGGCGGC 60GTTGCCGCCG CTCAGAGCAG CTTGGCCGCA TCCGGAAGCG GAAGTGGCAG TGGTACCGCG 120CTGACGCCGT CCTACCTGAA GGACGATGAC GGCCGCTCAC TGATCCTGCG CGGGTTCAAC 180ACGGCATCGA GCGCGAAGAG CGCGCCGGAC GGCATGCCGC AGTTCACCGA GGCGGACCTG 240GCGCGCGAGT ATGCAGACAT GGGAACCAAC TTCGTTCGGT TCCTCATCTC GTGGCGGTCG 300GTCGAACCAG CACCGGGCGT GTACGACCAG CAGTATCTGG ACCGTGTCGA AGATCGGGTC 360GGCTGGTACG CCGAGCGCGG CTACAAGGTG ATGCTCGACA TGCACCAGGA CGTGTACTCC 420GGCGCGATCA CCCCGGAGGG CAACAGCGGC AACGGTGCCG GCGCCATCGG CAACGGCGCA 480CCGGCCTGGG CGACCTACAT GGACGGCCTT CCGGTCGAGC CGCAGCCCCG GTGGGAGCTG 540TACTACATCC AGCCCGGCGT GATGCGCGCG TTCGACAACT TCTGGAACAC CACCGGCAAG 600CACCCCGAAC TCGTCGAGCA CTACGCGAAA GCGTGGCGGG CGGTCGCCGA CCGATTCGCC 660GACAACGACG CCGTCGTGGC CTACGACCTG ATGAACGAGC CGTTCGGAGG ATCCCTGCAG 720GGACCGGCGT TCGAGGCAGG GCCGCTCGCC GCGATGTACC AGCGCACCAC CGACGCCATC 780CGGCAGGTAG ACCAGGACAC CTGGGTCTGC GTGGCCCCGC AGGCGATCGG CGTCAACCAG 840GGTCTCCCCA GCGGGCTCAC CAAGATCGAC GACCCTCGTG CGGGTCAACA GCGCATCGCG 900TACTGCCCGC ACCTCTACCC ACTGCCGCTG GATATCGGTG ACGGCCACGA GGGCCTGGCC 960CGGACGCTCA CCGACGTGAC CATCGACGCC TGGCGTGCCA ACACCGCCCA CACCGCCCGT 1020GTGCTGGGTG ACGTGCCCAT CATCCTCGGC GAGTTCGGCC TGGACACAAC GCTGCCCGGG 1080GCCCGGGATT ACATCGAACG CGTCTACGGG ACCGCGCGAG AGATGGGGGC CGGAGTCTCG 1140TACTGGTCCA GCGATCCCGG CCCCTGGGGC CCGTACCTGC CTGACGGCAC GCAGACGCTG 1200CTCGTCGACA CCCTGAACAA GCCGTACCCC CGCGCAGTGG CCGGCACACC CACCGAGTGG 1260TCGTCGACCT CCGATCGCCT CCAATTGACG ATCGAGCCGG ACGCCGCGAT CACCGCTCCC 1320ACCGAGATCT ACCTCCCGGA GGCAGGATTC CCGGGCGACG TCCACGTCGA AGGCGCCGAC 1380GTCGTGGGGT GGGATCGGCA GAGTCGACTG CTCACGGTGC GCACTCCGGC CGACTCGGGC 1440AACGTGACCG TGACGGTCAC TCCGGCAGCC TGA 1473(2)SEQ ID NO：3的信息：(i)序列特征：

(A)长度：461个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：3Ala Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Leu Thr Pro Ser1 5 10 15Tyr Leu Lys Asp Asp Asp Gly Arg Ser Leu Ile Leu Arg Gly Phe

20 25 30Asn Thr Ala Ser Ser Ala Lys Ser Ala Pro Asp Gly Met Pro Gln

35 40 45Phe Thr Glu Ala Asp Leu Ala Arg Glu Tyr Ala Asp Met Gly Thr

50 55 60Asn Phe Val Arg Phe Leu Ile Ser Trp Arg Ser Val Glu Pro Ala

65 70 75Pro Gly Val Tyr Asp Gln Gln Tyr Leu Asp Arg Val Glu Asp Arg

80 85 90Val Gly Trp Tyr Ala Glu Arg Gly Tyr Lys Val Met Leu Asp Met

95 100 105His Gln Asp Val Tyr Ser Gly Ala Ile Thr Pro Glu Gly Asn Ser

110 115 120Gly Asn Gly Ala Gly Ala Ile Gly Asn Gly Ala Pro Ala Trp Ala

125 130 135Thr Tyr Met Asp Gly Leu Pro Val Glu Pro Gln Pro Arg Trp Glu

140 145 150Leu Tyr Tyr Ile Gln Pro Gly Val Met Arg Ala Phe Asp Asn Phe

155 160 165Trp Asn Thr Thr Gly Lys His Pro Glu Leu Val Glu His Tyr Ala

170 175 180Lys Ala Tro Arg Ala Val Ala Asp Arg Phe Ala Asp Asn Asp Ala

185 190 195Val Val Ala Tyr Asp Leu Met Asn Glu Pro Phe Gly Gly Ser Leu

200 205 210Gln Gly Pro Ala Phe Glu Ala Gly Pro Leu Ala Ala Met Tyr Gln

215 220 225Arg Thr Thr Asp Ala Ile Arg Gln Val Asp Gln Asp Thr Trp Val

230 235 240Cys Val Ala Pro Gln Ala Ile Gly Val Asn Gln Gly Leu Pro Ser

245 250 255Gly Leu Thr Lys Ile Asp Asp Pro Arg Ala Gly Gln Gln Arg Ile

260 265 270Ala Tyr Cys Pro His Leu Tyr Pro Leu Pro Leu Asp Ile Gly Asp

275 280 285Gly His Glu Gly Leu Ala Arg Thr Leu Thr Asp Val Thr Ile Asp

290 295 300Ala Trp Arg Ala Asn Thr Ala His Thr Ala Arg Val Leu Gly Asp

305 310 315Val Pro Ile Ile Leu Gly Glu Phe Gly Leu Asp Thr Thr Leu Pro

320 325 330Gly Ala Arg Asp Tyr Ile Glu Arg Val Tyr Gly Thr Ala Arg Glu

335 340 345Met Gly Ala Gly Val Ser Tyr Trp Ser Ser Asp Pro Gly Pro Trp

350 355 360Gly Pro Tyr Leu Pro Asp Gly Thr Gln Thr Leu Leu Val Asp Thr

365 370 375Leu Asn Lys Pro Tyr Pro Arg Ala Val Ala Gly Thr Pro Thr Glu

380 385 390Trp Ser Ser Thr Ser Asp Arg Leu Gln Leu Thr Ile Glu Pro Asp

395 400 405Ala Ala Ile Thr Ala Pro Thr Glu Ile Tyr Leu Pro Glu Ala Gly

410 415 420Phe Pro Gly Asp Val His Val Glu Gly Ala Asp Val Val Gly Trp

425 430 435Asp Arg Gln Ser Arg Leu Leu Thr Val Arg Thr Pro Ala Asp Ser

440 445 450Gly Asn Val Thr Val Thr Val Thr Pro Ala Ala

455 460(2)SEQ ID NO：4的信息(i)序列特征：

(A)长度：1386碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：基因组DNA(xi)序列描述：SEQ ID NI：4：GCATCCGGAA GCGGAAGTGG CAGTGGTACC GCGCTGACGC CGTCCTACCT GAAGGACGAT 60GACGGCCGCT CACTGATCCT GCGCGGGTTC AACACGGCAT CGAGCGCGAA GAGCGCGCCG 120GACGGCATGC CGCAGTTCAC CGAGGCGGAC CTGGCGCGCG AGTATGCAGA CATGGGAACC 180AACTTCGTTC GGTTCCTCAT CTCGTGGCGG TCGGTCGAAC CAGCACCGGG CGTGTACGAC 240CAGCAGTATC TGGACCGTGT CGAAGATCGG GTCGGCTGGT ACGCCGAGCG CGGCTACAAG 300GTGATGCTCG ACATGCACCA GGACGTGTAC TCCGGCGCGA TCACCCCGGA GGGCAACAGC 360GGCAACGGTG CCGGCGCCAT CGGCAACGGC GCACCGGCCT GGGCGACCTA CATGGACGGC 420CTTCCGGTCG AGCCGCAGCC CCGGTGGGAG CTGTACTACA TCCAGCCCGG CGTGATGCGC 480GCGTTCGACA ACTTCTGGAA CACCACCGGC AAGCACCCCG AACTCGTCGA GCACTACGCG 540AAAGCGTGGC GGGCGGTCGC CGACCGATTC GCCGACAACG ACGCCGTCGT GGCCTACGAC 600CTGATGAACG AGCCGTTCGG AGGATCCCTG CAGGGACCGG CGTTCGAGGC AGGGCCGCTC 660GCCGCGATGT ACCAGCGCAC CACCGACGCC ATCCGGCAGG TAGACCAGGA CACCTGGGTC 720TGCGTGGCCC CGCAGGCGAT CGGCGTCAAC CAGGGTCTCC CCAGCGGGCT CACCAAGATC 780GACGACCCTC GTGCGGGTCA ACAGCGCATC GCGTACTGCC CGCACCTCTA CCCACTGCCG 840CTGGATATCG GTGACGGCCA CGAGGGCCTG GCCCGGACGC TCACCGACGT GACCATCGAC 900GCCTGGCGTG CCAACACCGC CCACACCGCC CGTGTGCTGG GTGACGTGCC CATCATCCTC 960GGCGAGTTCG GCCTGGACAC AACGCTGCCC GGGGCCCGGG ATTACATCGA ACGCGTCTAC 1020GGGACCGCGC GAGAGATGGG GGCCGGAGTC TCGTACTGGT CCAGCGATCC CGGCCCCTGG 1080GGCCCGTACC TGCCTGACGG CACGCAGACG CTGCTCGTCG ACACCCTGAA CAAGCCGTAC 1140CCCCGCGCAG TGGCCGGCAC ACCCACCGAG TGGTCGTCGA CCTCCGATCG CCTCCAATTG 1200ACGATCGAGC CGGACGCCGC GATCACCGCT CCCACCGAGA TCTACCTCCC GGAGGCAGGA 1260TTCCCGGGCG ACGTCCACGT CGAAGGCGCC GACGTCGTGG GGTGGGATCG GCAGAGTCGA 1320CTGCTCACGG TGCGCACTCC GGCCGACTCG GGCAACGTGA CCGTGACGGT CACTCCGGCA 1380GCCTGA 1386(2)SEQ ID NO：5的信息(i)序列特征：

(A)长度：25氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：肽

(v) 片段类型：内部片段

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5Ser Ala Pro Asp Gly Met Pro Gln Phe Thr Glu Ala Asp Leu Ala1 5 10 15Arg Glu Tyr Ala Asp Met Gly Thr Asn Phe

20 25(2)SEQ ID NO：6的信息(i)序列特征：

(A)长度：25氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(v) 片段类型：内部片段(xi)序列描述：SEQ ID NO：6Ile Asp Asp Pro Arg Ala Gly Gln Gln Arg Ile Ala Tyr Pro Pro1 5 10 15His Leu Tyr Pro Leu Pro Leu Asp Ile Gly

20 25(2)SEQ ID NO：7的信息(i)序列特征：

(A)长度：31氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(v) 片段类型：内部片段(xi)序列描述：SEQ ID NO：7Ala Trp Arg Ala Val Ala Asp Arg Phe Ala Asp Asn Asp Ala Val1 5 10 15Val Ala Tyr Xaa Leu Met Asn Glu Pro Phe Gly Gly Ser Leu Gln

20 25 30Gly(2)SEQ ID NO：8的信息(i)序列特征：

(A)长度：30氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(v) 片段类型：内部片段(xi)序列描述：SEQ ID NO：8Val Met Leu Asp Met His Gln Asp Val Tyr Ser Gly Ala Ile Thr1 5 10 15Pro Glu Gly Asn Ser Gly Asn Gly Ala Gly Ala Ile Gly Asn Gly

20 25 30(2)SEQ ID NO：9的信息(i)序列特征：

(A)长度：21氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(v) 片段类型：内部片段(xi)序列描述：SEQ ID NO：9Pro Tyr Pro Arg Ala Val Ala Gly Thr Pro Thr Glu Trp Ser Ser1 5 10 15Thr Xaa Asp Arg Leu Gln

20(2)SEQ ID NO：10的信息(i)序列特征：

(A)长度：l0个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(v) 片段类型：内部片段(xi)序列描述：SEQ ID NO：10His Pro Glu Leu Val Glu His Gyr Ala lys1 5 10(2)SEQ ID NO：11的信息(i)序列特征：

(A)长度：19氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(v) 片段类型：内部片段(xi)序列描述：SEQ ID NO：11Asp Asp Asp Gly Arg Ser Leu Ile Leu Arg Gly Phe Asn Thr Ala1 5 10 15Ser Ser Ala Lys(2)SEQ ID NO：12的信息：(i)序列特征：

(A)长度：47碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：其他核酸(合成DNA)(xi)序列描述：SEQ ID NI：12：AAGTCSGCCC CCGACGGYAT GCCSCAGTTC ACSGARGCCG ACCTCGG 47(2)SEQ ID NO：13的信息：(i)序列特征：

(A)长度：50碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：其他核酸(合成DNA)(xi)序列描述：SEQ ID NI：13：TTCACCGAGG CCGACCTSGC SCGSGARTAY GCCGACATGG GYACCAACTT 50(2)SEQ ID NO：14的信息：(i)序列特征：

(A)长度：6氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：Met Ala Met Ile Thr Asn1 5(2)SEQ ID NO：15的信息：(i)序列特征：

(A)长度：18氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：肽(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：Met Ala Met Ile Thr Asn Ser Ser Ser Val Pro Glu Asp Pro Leu1 5 10 15Glu Ser Thr

Claims

1.带有编码具有神经酰胺糖内切酶活性的多肽或其功能等同变异体之序列的分离的DNA。

2.根据权利要求1的分离的DNA，其中分离的DNA包括选自(a)至(d)的DNA序列：

(a)编码SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3之氨基酸序列的DNA序列，或其片段：

(b)SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的DNA序列，或其片段：

(c)编码经在SEQ ID在NO：1或SEQ ID NO：3所示氨基酸序列中删除、加入、插入或取代一个或多个氨基酸而产生之氨基酸序列的DNA序列，或其片段；以及

(d)能够与上述(a)至(c)中的任何一个序列杂交的DNA序列。

3.根据权利要求1或2的分离的DNA，其中多肽是从红球菌属的菌株中产生的。

4.根据权利要求3的分离的DNA，其中多肽是从红球菌M-777菌种产生的。

5.包含权利要求1至4中任何一项之分离的DNA的重组DNA。

6.包含权利要求5之重组DNA的载体。

7.根据权利要求6的载体，其中重组DNA可操作地连接到启动子上。

8.用权利要求6或7的载体转化的原核生物或真核生物细胞。

9.生产具有神经酰胺糖内切酶活性之多肽或其功能等同变异体的方法，其包括：

(a)培养权利要求8的细胞，以及

10.按权利要求9的方法生产的，或由权利要求1至4中任一项的分离的DNA编码的具有神经酰胺糖内切酶活性的多肽，或其功能等同变异体。

11.与权利要求1至4中任一项的分离的DNA特异杂交的合成寡核苷酸探针或引物。

12.特异性结合权利要求10之多肽的抗体或其片段。