CN108251394B - 一种新型的鞘糖脂内切糖苷酶 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鞘糖脂内切糖苷酶，所述糖苷酶不仅显著提高了水解活性，还进一步拓宽了底物范围；在相应被改造的糖苷合成酶的基础上，也显著提高了合成酶的活性。本发明还涉及到一种鞘糖脂内切糖苷酶在鞘糖脂或寡糖制备、分析以及生产中的应用。

Description

一种新型的鞘糖脂内切糖苷酶

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种催化活性显著提高的新型鞘糖脂内切糖苷酶以及其在鞘糖脂或寡糖的制备、生产和分析中的应用。

背景技术

鞘糖脂(Glycosphingolipid,GSL)是真核细胞细胞膜的组成成分，是一类由神经酰胺和寡糖链以糖苷键结合形成的双亲分子。研究表明，鞘糖脂参与多种生理过程，包括信号传导、细胞免疫以及大脑发育等。此外鞘糖脂还与一些病理过程相关，包括病原入侵、癌症发生以及胰岛素抗性等。

由于鞘糖脂的神经酰胺部分在碳链长度、饱和度、羟基化状态上呈现多样性(Journal of Lipid Research,2012,53(10):2142-2251)，因此使得鞘糖脂的分析显得较为复杂。而神经酰胺部分的去除将有效降低鞘糖脂分析的难度。当前臭氧分解(Europeanjournal of biochemistry,1970,15(2):287-292)以及锇催化的高碘酸氧化(Journal ofLipid Research,1966,7(6):789-792)可以实现鞘糖脂神经酰胺链的去除，然而这些化学方法耗时复杂，并不是绝佳的选择。取而代之的是一种来源于Rhodococcus sp.M750的鞘糖脂内切糖苷酶II，该酶能够水解鞘糖脂的寡糖链与神经酰胺之间的β-糖苷键，生成完整的寡糖链和神经酰胺，胞内总鞘糖脂在经过EGCase II处理后，使用糖印迹分析或质谱分析释放的寡糖链，能够用于发现新的组织特异性或者疾病特异产生的鞘糖脂，在新药发现和再生医学中具有重要应用。但该酶目前仍存在底物谱窄，水解活力低等问题，比如来自Rhodococcus sp.M-750的培养液分离出三种具有完全不同底物特异性的EGCase，分别命名为EGCase I，EGCase II和EGCase III(又称为EGALC)(Journal of BiologicalChemistry,1989,264(16):9510-9)。其中，EGCase I展现出最宽泛的底物特异性，既可以水解神经节苷脂系列和乳糖系列的鞘糖脂；EGCase II则不能水解的岩藻糖基单唾液酸四己糖神经节苷脂(Fucosyl-GM1，图1)和Globo系列鞘糖脂(Journal of Lipid Research,2012,53(10):2242-2251)，而Fucosyl-GM1已被鉴定为多种肿瘤标志物，因此利用酶工程手段对其进行改造，提高催化酶的活力很有必要。

同时，EGCase II在鞘糖脂合成的相关研究中也具有广泛的应用，包括EGCase II的转糖基活性和突变后产生的糖苷合成酶活性。加拿大不列颠哥伦比亚大学的StephenG.Withers教授课题组通过对天然水解神经节苷脂的鞘糖脂内切酶EGCase II进行了分子改造，通过突变其活性中心的亲核攻击基团，使其成为一种糖苷合成酶，该酶可以催化氟化修饰的寡糖链和鞘氨醇链模块组装，生成溶血形式的鞘糖脂(lyso-GSL)，之后再通过化学法对其进行酰基化，即可获得完整的鞘糖脂结构。但该EGCase II糖苷合成酶存在活性仍较低、底物谱较窄等问题(Journal of the American Chemical Society,2006,128(19):6300-6301)限制了该酶的应用范围。因此，利用蛋白质工程策略构建更高效的EGCase II突变体，大幅度提高其催化活性和利用非天然底物的能力，将有利于构建更高效的糖苷合成酶，为酶法合成鞘糖脂类药物提供性质更优良的酶源。

综上，亟待寻找具高活性的EGCase II的突变体，既可以提高水解活性，又可以作为一种高效的糖苷合成酶，以应用于实验室与工业化鞘糖脂或寡糖的制备、生产与分析中。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型的鞘糖脂内切糖苷酶以及其在鞘糖脂或寡糖的制备、生产与分析中的应用。

在本发明的第一方面，提供一种鞘糖脂内切糖苷酶，所述的鞘糖脂内切糖苷酶与SEQ ID No:2具有至少90％的氨基酸序列一致性，且包含以下至少一个或多个位点的突变，所述位点为第63、148、149、150、151、152、153、154位或其对应位点，所述突变为在突变位点取代、插入或删除一个或多个氨基酸残基，其中，148位与149位氨基酸残基不为取代突变。

优选地，所述糖基转移酶与SEQ ID NO:2具有至少93％的氨基酸序列一致性；更优选地，与SEQ ID NO:2具有至少95％的氨基酸序列一致性。

在一优选例中，所述的第63位丝氨酸被甘氨酸所取代；

在一优选例中，所述的第148位到154位的一个或多个氨基酸残基发生删除突变；

优选地，所述的删除突变包括第148位到154位7个氨基酸残基的删除。

在又一优选例中，所述的突变还包括第314位天冬氨酸被酪氨酸替代的突变或者第351位谷氨酸被丝氨酸替代的突变。

更优选地，所述的第63位丝氨酸被甘氨酸所取代。

在本发明的另一方面，提供一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码所述的鞘糖脂内切糖苷酶。

在一优选实施例中，可以在所述多核苷酸的末端增加上用于下一步纯化与分析的分子标签，如组氨酸标签等。

在本发明的另一方面，提供一种表达载体，所述的表达载体包括所述的多核苷酸。

在一优选例中，所述的表达载体选用pET-28a。

在本发明的另一方面，提供一种基因工程化的细胞，所述的细胞包括所述的表达载体或其基因组中整合有所述的多核苷酸。

所述的基因工程化细胞可以为革兰氏阳性细菌，如枯草芽孢杆菌；也可以是革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌；也可以是放线菌，如链霉菌；还可以是真菌，如酵母类、曲酶菌等其他宿主微生物；

在一优选实施例中，所述的基因工程化细胞选用大肠杆菌。

在本发明的另一方面，提供一种在催化岩藻糖基单唾液酸四己糖神经节苷脂(Fucosyl-GM1)中的方法，在生物酶法催化系统中，使用上述任一鞘糖脂内切糖苷酶。

在一优选实施例中，所述的生物酶法催化体系为体外酶法；

在一优选实施中，所述的生物酶法催化体系为全细胞催化；

所述的生物酶法催化体系还包括固定化酶催化、纯化后的酶催化以及含有人工代谢途径的细胞工厂等。

在一优选例中，所述的催化类型为水解所述岩藻糖基单唾液酸四己糖神经节苷脂；水解的产物为岩藻糖基单唾液酸四己糖和神经酰胺类化合物；

在另一优选例中，所述的催化类型为反向合成所述岩藻糖基单唾液酸四己糖神经节苷脂的前体化合物；所述前体化合物为含有岩藻糖基单唾液酸四己糖的溶血鞘氨醇；通过催化氟化岩藻糖基单唾液酸四己糖与带有自由羟基的鞘氨醇发生糖苷化反应获得溶血鞘氨醇。

在本发明的另一方面，提供一种将上述鞘糖脂内切糖苷酶用于在鞘糖脂或寡糖的制备、生产、分析与合成中的应用。

在一优选例实施例中，所述应用为利用所述鞘糖脂内切糖苷酶的水解功能，以鞘糖脂为底物，获得相应的神经酰胺模块和寡糖模块，并进一步分析寡糖或神经酰胺的类型；

优选地，所述神经节苷酯为岩藻糖基单唾液酸四己糖神经节苷脂；

在一优选实施例中，所述的应用为利用所述鞘糖脂内切糖苷酶的转糖基活性，将鞘糖脂上的糖基转移至带有自由羟基的醇类受体上，并进一步分析受修饰的产物的功能；

所述糖基为单糖或寡糖；

所述单糖包括但不限于葡萄糖、半乳糖或岩藻糖；所述寡糖包括但不限于二糖(如乳糖)、三糖(如唾液酸乳糖)、四糖(如单唾液酸三己糖)、五糖(单唾液酸四己糖)等；

所述的带有自由羟基的醇类受体包含鞘氨醇或脂肪醇类化合物或其化学修饰物；所述的鞘氨醇类化合物包括但不限于鞘氨醇、二氢鞘氨醇或者植物鞘氨醇。

在一优选实施例中，所述的应用为利用所述鞘糖脂内切糖苷酶的合成酶活性，使底物氟化糖与带羟基的鞘氨醇类或脂肪醇类化合物或其化学修饰物发生糖苷化，并进一步制备以及生产鞘糖脂和糖脂类化合物；

所述鞘氨醇类化合物包括但不限于鞘氨醇、二氢鞘氨醇或者植物鞘氨醇；

所述氟化糖为α-氟代单糖或α-氟代寡糖；

更优选地，所述单糖或寡糖还原端糖残基为葡萄糖或半乳糖残基；

所述的α-氟代单糖为1位α-羟基被氟取代的单糖，包括但不限于α-氟代葡萄糖，α-氟代半乳糖，α-氟代岩藻糖；所述的α-氟代寡糖为还原端1位α-羟基被氟取代的寡糖，包括但不限于氟化二糖(如氟化乳糖)，氟化三糖(如氟代唾液酸乳糖)，氟化四糖(如α-氟代单唾液酸三己糖[GM2 oligosaccharylα-fluoride])，氟化五糖(如α-氟代单唾液酸四己糖[GM1oligosaccharylα-fluoride])。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1.岩藻糖基单唾液酸四己糖神经节苷脂(Fucosyl-GM1)的结构示意图

图2.常见糖基供体的氟化糖的结构示意图

图3.常见羟基受体的结构示意图

图4.EGCase I,EGCase II晶体结构比较，浅色代表103S_EGCase I结构；深色代表EGCase II结构；两个结构的差异区域标记为A、B和C，底物GM1用棍棒模型显示。

具体实施方式

本发明人经过研究筛选，提供了一种鞘糖脂内切糖苷酶，经改造的酶不仅显著提高了水解活性，进一步拓宽了底物类型，也提高了相关突变酶的糖苷合成酶的活性。

本发明的鞘糖脂内切糖苷酶可以是重组蛋白、合成蛋白。其可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。本发明的糖苷酶的序列与SEQ ID No:2具有90％到100％的氨基酸序列一致性，且包含以下至少一个或多个位点的突变，所述位点为第63、148、149、150、151、152、153、154位或其对应位点，所述突变为在突变位点取代、插入或删除一个或多个氨基酸残基，其中，148位与149位氨基酸残基不为取代突变。

本发明还包括鞘糖脂内切糖苷酶的衍生物和类似物。如本文所用，术语“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的糖苷酶相同的生物学功能或活性的蛋白。本发明的蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的蛋白，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，鞘糖脂内切糖苷酶可以指基于SEQ ID NO:2所示序列突变的蛋白。该术语还包括具有与突变酶相同功能的、SEQ ID NO:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(如1-3个、1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(例如为300个以内，较佳地200个以内，更佳地100个以内，更佳地50个以内，例如40、30、20、10、5、3、2、1)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括突变酶的活性片段和活性衍生物。

本发明中，也包括为了增加突变酶的稳定性、半衰期、促进功效而对一个或几个氨基酸加以修饰后构成的修饰形式的多肽(通常不改变一级结构)，包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了抗水解性能或优化了溶解性能的突变酶。

本发明还提供了编码本发明鞘糖脂内切糖苷酶突变酶的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。也即，“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或鞘糖脂内切糖苷酶突变酶的编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

术语“表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

包含上述的适当多核苷酸序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达多肽。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

生物酶法催化体系为一类利用生物酶为催化剂，实现氧化、合成、水解等功能，制备或生产相应大分子或小分子化合物的过程，现有主要的生物酶法反应系统包括，体外酶法、全细胞催化、固定化酶催化、纯化后的酶催化以及含有人工代谢途径的细胞工厂等。

体外酶法催化是指酶在体外作为催化剂进行工业生产。

全细胞催化是指利用完整的生物有机体(即全细胞、组织甚至个体)作为催化剂进行生物转化，其本质是利用细胞内的酶进行催化。

固定化酶，是指在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶。通常酶催化反应都是在水溶液中进行的，而固定化酶是将水溶性酶用物理或化学方法处理，使之成为不溶于水的，但仍具有酶活性的状态。固定化酶催化是指用固定化酶作为催化剂在体外进行的催化反应。

单糖，为含有3-6个碳原子的多羟基醛或多羟基酮，是不能再水解的糖类，构成各种糖分子的基本单位。根据碳原子的数目，可进一步分为丙糖、丁糖、戊糖、己糖等。最常见的单糖有果糖、葡萄糖、半乳糖等

寡糖，为2个或2个以上(一般指2-10个)单糖单位以糖苷键相连形成的糖分子。

自由羟基，连接在碳链骨架上，未与其它基团发生反应的游离羟基。

鞘糖脂，鞘糖脂是真核细胞细胞膜的组成成分，是一类由神经酰胺和寡糖链以糖苷键结合形成的双亲分子。神经节苷脂GM1为常见的药用鞘糖脂。鞘糖脂的神经酰胺部分由一分子长链的鞘氨醇(2-氨基-1,3-二醇)和一分子脂肪酸以酰胺键连接组成。

溶血鞘糖脂，鞘糖脂通过去酰基化反应去掉结构中脂肪酸链的衍生物。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本发明所述的生物材料的来源的一般性说明：

1、引物合成：本发明中所使用的引物均由苏州金唯智公司合成制备。

2、实验中所使用T4DNA连接酶等购自于NewEngland Biolabs公司；PrimeSTAR HS高保真酶购自TakaRa公司；限制性内切酶均购自于Fermentas公司；使用的DNA胶回收试剂盒及质粒小提试剂盒均购自于Axygen公司。

3、本发明所改造的鞘糖脂内切糖苷酶突变酶来源于Rhodococcus sp.M750鞘糖脂内切糖苷酶II(Endoglycoceramidase II，EGCase II)。

实施例1EGCase II突变体的设计

基于现有技术中EGCase I与底物的复合晶体的结构，我们发现EGCase II(SEQ IDNO:2)有两个关键区域存在酶与底物结合的空间位阻，通过结构比较，我们针对区域A和区域B进行了一系列消除底物与酶结合的空间位阻的设计(图4)。

1)将Ser63突变为侧链最短的氨基酸Gly(区域A)；

2)将Ser64突变为Gly(区域A)；

3)Ser63和Ser64同时删除(区域A)；

4)61-TASSAKS-67替换为NVDKD(区域A)；

5)A142和I143同时删除(区域B)；

6)Loop(Asn148到Gly154)删除(区域B)。

以pET28a-EGCase II重组质粒为模板(将经密码子优化后的EGCase II编码核酸序列SEQ ID NO:1载入pET28a的表达载体上)，应用全质粒PCR突变法构建上突变体。采用ClonExpress MutiS One Step Cloning Kit(Vazyme,Nanjing,China)试剂盒的方法进行构建。用于EGCase II突变体构建的所有引物设计如下：

S63G-F 5'GGATTTAATACGGCCGGATCTGCAAAAAGTGCC 3'(SEQ ID NO:3)

S63G-R 5'GGCACTTTTTGCAGATCCGGCCGTATTAAATCC 3'(SEQ ID NO:4)

S64G-F5'TTTAATACGGCCTCAGGAGCAAAAAGTGCCCCTGAC 3'(SEQ ID NO:5)

S64G-R5'AGGGGCACTTTTTGCTCCTGAGGCCGTATTAAATCC 3'(SEQ ID NO:6)

S63S64-del-F 5'CGTGGATTTAATACGGCCGCAAAAAGTGCCCCTGAC 3'(SEQ ID NO:7)

S63S64-del-R 5'GTCAGGGGCACTTTTTGCGGCCGTATTAAATCCACG 3'(SEQ ID NO:8)

A142I143-del-F 5'AGTGGTAATGGCGCAGGTGGTAATGGGGCACCGGCG 3'(SEQ ID NO:9)

A142I143-del-R 5'CGCCGGTGCCCCATTACCACCTGCGCCATTACCACT 3'(SEQ ID NO:10)

loop-del-F

5'GGGGCCATTACTCCGGAAGGCGCGATTGGTAATGGGGCACCG 3'(SEQ ID NO:11)

loop-del-R

5'CGGTGCCCCATTACCAATCGCGCCTTCCGGAGTAATGGCCCC 3'(SEQ ID NO:12)

EGCase II-swap-F

5'ATTCTTCGTGGATTTAATAATGTCGATAAAGATGCCCCTGACGGCATGCCA 3'(SEQ ID NO:13)

EGCase II-swap-R

5'TGGCATGCCGTCAGGGGCATCTTTATCGACATTATTAAATCCACGAAGAAT 3'(SEQ ID NO:14)

扩增体系为：PrimeSTAR Mix(5×)10μL、dNTP(2.5mM)4μL、重组质粒模板20ng、引物(10μM)各2μL、PrimeSTAR HS高保真酶0.5μL、补充双蒸水至50μL。扩增条件为98℃预变性1分钟；98℃变性10秒、68℃退火及延伸7分钟(30个循环)。胶回收PCR产物，用DpnI酶(Fermentas公司)在37℃条件下消化胶回收产物2h，降解初始模板。消化产物转化至E.coliBL21(DE3)，涂布到含有50μg/mL卡那霉素LB琼脂平板上，37℃过夜培养，筛选阳性克隆，测序验证。得到鞘糖脂内切糖苷酶突变体的重组菌。

实施例2EGCase II突变体水解活性测试

以含有不同糖链的各种鞘糖脂为底物，通过测定初速度和平衡产率两种方式来测定酶对底物的特异性。

(1)初速度

EGCase II以标准测活体系进行测定，反应时间30min。反应液经2-氨基苯甲酸衍生化处理后进行HPLC检测。标准测活反应总体系为20μL，反应温度37℃，先将1μL 10mM GM1底物加入14μL含0.1％Triton X-100的50mM乙酸钠(pH 6.0)缓冲液中，再加入5μL一定稀释倍数的酶液，反应在带“O”型环螺帽的1.6mL聚丙烯管中进行；37℃恒温水浴中保温10min后于沸水浴中放置3min终止反应，12000rpm离心1min，直接加入100ul 2-AA衍生化试剂进行衍生，拧紧螺帽防止挥发，80℃保温45min，12000rpm离心30min，取上清液进行高效液相分析。

(2)平衡产率

标准反应体系中加入过量的酶，37℃下反应24h，反应液经2-氨基苯甲酸衍生化处理后进行HPLC检测，反应产率(％)＝产生的寡糖浓度×100/0.5mM。

表1 EGCase II及其突变体比活力

测活结果如表1所示：S63G突变体活力提高9.4倍，Loop-del突变体活力提高约1.6倍。同时，第63位的删除突变或在63位增加1个或多个氨基酸的插入突变，或在第148-154位间任意删除一个或多个氨基酸残基，或将第150-154位间任一替换一个或多个氨基酸残基，或在第148-154位间插入一个或多个氨基酸残基，也可以显著提高突变酶的活性。

实施例3EGCase II-S63G突变体水解岩藻糖基单唾液酸四己糖神经节苷脂(Fucosyl-GM1)

按照实施例2所描述的平衡产率的测定方法，标准反应体系中加入过量的酶(底物为Fucosyl-GM1)，37℃下反应24h，反应液经2-氨基苯甲酸衍生化处理后进行HPLC检测。

表2 EGCase II-S63G平衡产率

如实施例2所述的任一催化活性提高的突变体，可以Fucosyl-GM1为底物，获得较高的寡糖平衡产率。

实施例4EGCase II突变体合成溶血鞘糖脂(底物为α-氟代单唾液酸四己糖，GM1OSF，图2)

EGCase II突变体合成活性测定方法为：标准测活反应总体系为40μL，反应温度37℃，先将2μL 50mM鞘氨醇(Sphingosine)、1μL GM1OSF加入27μL含0.2％Triton X-100的50mM乙酸钠(pH 5.8)缓冲液中，再加入10μL稀释100倍的酶液，37℃恒温水浴中保温30min后于沸水浴中放置5min终止反应，13000rpm离心10min，取上清10μL加入20μL OPA衍生化试剂室温衍生5min，13000rpm离心30min，取上清液进行高效液相分析。

以GM1OSF为底物，测定数据如下，

表2 EGCase II突变体合成活性(以GM1OSF为底物)

由上述结果可知，在原有EGCase II-E351S或者EGCase II-E351S/D314Y的基础上，引入S63G突变点后，其活性都有相应提高，提高倍数最大为2.4倍。

实施例5EGCase II突变体合成溶血鞘糖脂(底物为α-氟代乳糖，Lacto-F，图2)

EGCase II突变体合成活性测定方法为：标准测活反应总体系为40μL，反应温度37℃，先将2μL 50mM鞘氨醇(Sphingosine)、1μL Lacto-F加入27μL含0.2％Triton X-100的50mM乙酸钠(pH 5.8)缓冲液中，再加入10μL稀释100倍的酶液，37℃恒温水浴中保温30min后于沸水浴中放置5min终止反应，13000rpm离心10min，取上清10μL加入20μL OPA衍生化试剂室温衍生5min，13000rpm离心30min，取上清液进行高效液相分析。

以Lacto-F为底物，测定数据如下，

表3 EGCase II突变体合成活性(以Lacto-F为底物)

由上述结果可知，在原有EGCII-E351S或者EGCase II-E351S/D314Y的基础上，引入S63G突变点后，其活性有相应提高，提高倍数最大为5.6倍。

实施例6EGCase II突变体合成溶血鞘糖脂(底物为α-氟代单唾液酸三己糖，GM2OSF，图2)

EGCII突变体合成活性测定方法为：标准测活反应总体系为40μL，反应温度37℃，先将2μL 50mM鞘氨醇(Sphingosine)、1μL GM2OSF加入27μL含0.2％Triton X-100的50mM乙酸钠(pH 5.8)缓冲液中，再加入10μL稀释100倍的酶液，37℃恒温水浴中保温30min后于沸水浴中放置5min终止反应，13000rpm离心10min，取上清10μL加入20μL OPA衍生化试剂室温衍生5min，13000rpm离心30min，取上清液进行高效液相分析。

以GM2OSF为底物，测定数据如下，

表4 EGCase II突变体合成活性(以GM2OSF为底物)

由上述结果可知，在原有EGCII-E351S或者EGCase II-E351S/D314Y的基础上，引入S63G突变点后，其活性有相应提高，提高倍数最大为2.1倍。

实施例7EGCase II突变体合成溶血鞘糖脂(底物为α-氟代单唾液酸二己糖(GM3OSF，图2)

EGCII突变体合成活性测定方法为：标准测活反应总体系为40μL，反应温度37℃，先将2μL 50mM鞘氨醇(Sphingosine)、1μL GM3OSF加入27μL含0.2％Triton X-100的50mM乙酸钠(pH 5.8)缓冲液中，再加入10μL稀释100倍的酶液，37℃恒温水浴中保温30min后于沸水浴中放置5min终止反应，13000rpm离心10min，取上清10μL加入20μL OPA衍生化试剂室温衍生5min，13000rpm离心30min，取上清液进行高效液相分析。

以GM3OSF为底物，测定数据如下，

表5 EGCase II突变体合成活性(以GM3OSF为底物)

由上述结果可知，在原有EGCII-E351S或者EGCase II-E351S/D314Y的基础上，引入S63G突变点后，其活性有相应提高，提高倍数最大为3.5倍。

实施例4～实施例7中所述的鞘氨醇可以是如图3所示带有自由羟基的鞘氨醇，同时，上述具有合成活性的突变酶亦可以催化如图2所示的氟化糖基与如图3所示的鞘氨醇或脂肪醇发生糖苷化反应。

同时，第63位的删除突变或在63位增加1个或多个氨基酸的插入突变，或在第148-154位间任意删除一个或多个氨基酸残基，或将第150-154位间任一替换一个或多个氨基酸残基，或在第148-154位间插入一个或多个氨基酸残基，也可以显著提高突变酶的活性。

实施例8EGCase II突变体在胞内鞘糖脂糖组分分析中的应用

鞘糖脂是细胞膜中的重要元件，具有重要的生物功能。通过EGCase II突变体酶法降解糖链，然后组合多糖印迹的样品制备方法和MALDI-TOF/TOF质谱分析能够用于细胞特异的胞内鞘糖脂糖组分的分析，在药物发现和再生医学领域具有重要的应用前景。

1)中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1的培养

在10cm的细胞培养盘中添加10ml的RPMI1640培养基，并添加抗生素试剂(包括100单位/ml的青霉素，100μg/ml的链霉素)和10％的胎牛血清。在37℃，浓度为5％的二氧化碳培养箱中培养细胞，当细胞到达100％培养克隆率时进行细胞回收，倒掉上清，使用PBS缓冲液洗涤细胞两次，然后添加含有10ml含有10mM EDTA的PBS缓冲液，1000g离心10min，倒掉上清。细胞颗粒重悬在新的PBS中，计数细胞，然后取总量为1×10⁶细胞溶液在新的离心管中离心，移除上清，将细胞保存在-80℃中。

2)抽提细胞总鞘糖脂

室温下添加450μl的氯仿/甲醇溶液(2:1，v/v)到上述细胞团中，使用超声破碎仪进行细胞破碎，超声6次，工作时间10s/次，暂停10s，工作总时间为1min；添加150μl的甲醇重复上述超声步骤一次，继续添加300μl甲醇重复上述超声步骤一次。细胞破碎液5000rpm离心10min，上清转移到新管中进行干燥。干燥后的总鞘糖脂直接使用EGCase II突变体酶法水解释放糖链。

3)从GSL中释放糖原

粗鞘糖脂悬浮在50μl的50mM Tris-HCl缓冲液中(pH7.5)，包含0.1％的胆酸钠作为表面活性剂，然后添加25mU的EGCase II S63G纯酶，37°反应24h催化完整的糖链从鞘糖脂上水解下来。

4)多糖印迹

EGCase处理过的样品用于多糖印迹分析，根据Sumitomo Bakelite公司的BlotGlyco磁珠糖链纯化标记试剂盒的操作步骤进行纯化。BlotGlyco^TM磁珠是化学合成的高分子颗粒，BlotGlyco的高密度酰肼基团可特异性地结合多糖降解端的醛基，所以BlotGlyco磁珠可从不同的生物样品中选择并全面捕获多糖。酰肼基团可与醛基稳定结合，因此进行洗脱后就能很容易地除去肽和其它杂质。50μl的样品溶液直接加到含有BlotGlyco磁珠的亲水性PTFE，0.45μm的滤板中，添加450μl含有0.2％乙酸的乙腈溶液于80℃孵育45min；未反应的酰肼集团使用含有10％的醋酸酐的甲醇溶液在室温下反应30min进行乙酰基封闭；使用150mM的1-甲基-3-对甲苯基三氮的二氧六环溶液在60℃下对糖链中的唾液酸残基的羧基进行甲基酯化保护；随后颗粒上捕获的酯化多糖与180μl的含2％乙酸的乙腈溶液和试剂盒含有的20mM的独特标记试剂氨氧基WR试剂(aoWR)混合进行亚胺交换反应，多糖链与荧光试剂的aoWR结合，从磁珠上被取代下来，用于随后的MALDI-TOF/TOF MS分析。

5)MALDI-TOF/TOF质谱分析

纯化过的GSL-糖原溶液与溶于30％乙腈中的2,5-二羟基苯甲酸溶液(10mg/ml)混合，随后用于MALDI-TOF分析。质谱分析条件如下：Ultraflex II TOF/TOF质谱仪，加速电压25KV，反射极电压26.3kV，阳离子模式下的脉冲离子提取为160ns使用FlexAnalysis3.0软件包进行结果注释，使用GlycoSuiteDB和SphinGOMAP在线数据库进行结构鉴定。在TOF/TOF模式下进行片段离子分析时，前体离子加速到8kV。共鉴定得到9种鞘糖脂，表6所示：

表6 CHO-K1细胞胞内鞘糖脂来源的多糖组分鉴定

*上述鞘糖脂类化合物根据Svennerholm创立的通用术语命名法(Svennerholm，1963；IUPAC-IUB，1998)进行命名。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 一种新型的鞘糖脂内切糖苷酶

<130> <待立案后插入>

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1473

<212> DNA

<213> Rhodococcus sp.M750

<400> 1

atgcgtcgca cccggctcgt atcgctgatc gtgacaggtt cgctggtgtt cggcggcggc 60

gttgccgccg ctcagagcag cttggccgca tccggaagcg gaagtggcag tggtaccgcg 120

ctgacgccgt cctacctgaa ggacgatgac ggccgctcac tgatcctgcg cgggttcaac 180

acggcatcga gcgcgaagag cgcgccggac ggcatgccgc agttcaccga ggcggacctg 240

gcgcgcgagt atgcagacat gggaaccaac ttcgttcggt tcctcatctc gtggcggtcg 300

gtcgaaccag caccgggcgt gtacgaccag cagtatctgg accgtgtcga agatcgggtc 360

ggctggtacg ccgagcgcgg ctacaaggtg atgctcgaca tgcaccagga cgtgtactcc 420

ggcgcgatca ccccggaggg caacagcggc aacggtgccg gcgccatcgg caacggcgca 480

ccggcctggg cgacctacat ggacggcctt ccggtcgagc cgcagccccg gtgggagctg 540

tactacatcc agcccggcgt gatgcgcgcg ttcgacaact tctggaacac caccggcaag 600

caccccgaac tcgtcgagca ctacgcgaaa gcgtggcggg cggtcgccga ccgattcgcc 660

gacaacgacg ccgtcgtggc ctacgacctg atgaacgagc cgttcggagg atccctgcag 720

ggaccggcgt tcgaggcagg gccgctcgcc gcgatgtacc agcgcaccac cgacgccatc 780

cggcaggtag accaggacac ctgggtctgc gtggccccgc aggcgatcgg cgtcaaccag 840

ggtctcccca gcgggctcac caagatcgac gaccctcgtg cgggtcaaca gcgcatcgcg 900

tactgcccgc acctctaccc actgccgctg gatatcggtg acggccacga gggcctggcc 960

cggacgctca ccgacgtgac catcgacgcc tggcgtgcca acaccgccca caccgcccgt 1020

gtgctgggtg acgtgcccat catcctcggc gagttcggcc tggacacaac gctgcccggg 1080

gcccgggatt acatcgaacg cgtctacggg accgcgcgag agatgggggc cggagtctcg 1140

tactggtcca gcgatcccgg cccctggggc ccgtacctgc ctgacggcac gcagacgctg 1200

ctcgtcgaca ccctgaacaa gccgtacccc cgcgcagtgg ccggcacacc caccgagtgg 1260

tcgtcgacct ccgatcgcct ccaattgacg atcgagccgg acgccgcgat caccgctccc 1320

accgagatct acctcccgga ggcaggattc ccgggcgacg tccacgtcga aggcgccgac 1380

gtcgtggggt gggatcggca gagtcgactg ctcacggtgc gcactccggc cgactcgggc 1440

aacgtgaccg tgacggtcac tccggcagcc tga 1473

<210> 2

<211> 490

<212> PRT

<213> Rhodococcus sp.M750

<400> 2

Met Arg Arg Thr Arg Leu Val Ser Leu Ile Val Thr Gly Ser Leu Val

1 5 10 15

Phe Gly Gly Gly Val Ala Ala Ala Gln Ser Ser Leu Ala Ala Ser Gly

20 25 30

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Leu Thr Pro Ser Tyr Leu Lys Asp

35 40 45

Asp Asp Gly Arg Ser Leu Ile Leu Arg Gly Phe Asn Thr Ala Ser Ser

50 55 60

Ala Lys Ser Ala Pro Asp Gly Met Pro Gln Phe Thr Glu Ala Asp Leu

65 70 75 80

Ala Arg Glu Tyr Ala Asp Met Gly Thr Asn Phe Val Arg Phe Leu Ile

85 90 95

Ser Trp Arg Ser Val Glu Pro Ala Pro Gly Val Tyr Asp Gln Gln Tyr

100 105 110

Leu Asp Arg Val Glu Asp Arg Val Gly Trp Tyr Ala Glu Arg Gly Tyr

115 120 125

Lys Val Met Leu Asp Met His Gln Asp Val Tyr Ser Gly Ala Ile Thr

130 135 140

Pro Glu Gly Asn Ser Gly Asn Gly Ala Gly Ala Ile Gly Asn Gly Ala

145 150 155 160

Pro Ala Trp Ala Thr Tyr Met Asp Gly Leu Pro Val Glu Pro Gln Pro

165 170 175

Arg Trp Glu Leu Tyr Tyr Ile Gln Pro Gly Val Met Arg Ala Phe Asp

180 185 190

Asn Phe Trp Asn Thr Thr Gly Lys His Pro Glu Leu Val Glu His Tyr

195 200 205

Ala Lys Ala Trp Arg Ala Val Ala Asp Arg Phe Ala Asp Asn Asp Ala

210 215 220

Val Val Ala Tyr Asp Leu Met Asn Glu Pro Phe Gly Gly Ser Leu Gln

225 230 235 240

Gly Pro Ala Phe Glu Ala Gly Pro Leu Ala Ala Met Tyr Gln Arg Thr

245 250 255

Thr Asp Ala Ile Arg Gln Val Asp Gln Asp Thr Trp Val Cys Val Ala

260 265 270

Pro Gln Ala Ile Gly Val Asn Gln Gly Leu Pro Ser Gly Leu Thr Lys

275 280 285

Ile Asp Asp Pro Arg Ala Gly Gln Gln Arg Ile Ala Tyr Cys Pro His

290 295 300

Leu Tyr Pro Leu Pro Leu Asp Ile Gly Asp Gly His Glu Gly Leu Ala

305 310 315 320

Arg Thr Leu Thr Asp Val Thr Ile Asp Ala Trp Arg Ala Asn Thr Ala

325 330 335

His Thr Ala Arg Val Leu Gly Asp Val Pro Ile Ile Leu Gly Glu Phe

340 345 350

Gly Leu Asp Thr Thr Leu Pro Gly Ala Arg Asp Tyr Ile Glu Arg Val

355 360 365

Tyr Gly Thr Ala Arg Glu Met Gly Ala Gly Val Ser Tyr Trp Ser Ser

370 375 380

Asp Pro Gly Pro Trp Gly Pro Tyr Leu Pro Asp Gly Thr Gln Thr Leu

385 390 395 400

Leu Val Asp Thr Leu Asn Lys Pro Tyr Pro Arg Ala Val Ala Gly Thr

405 410 415

Pro Thr Glu Trp Ser Ser Thr Ser Asp Arg Leu Gln Leu Thr Ile Glu

420 425 430

Pro Asp Ala Ala Ile Thr Ala Pro Thr Glu Ile Tyr Leu Pro Glu Ala

435 440 445

Gly Phe Pro Gly Asp Val His Val Glu Gly Ala Asp Val Val Gly Trp

450 455 460

Asp Arg Gln Ser Arg Leu Leu Thr Val Arg Thr Pro Ala Asp Ser Gly

465 470 475 480

Asn Val Thr Val Thr Val Thr Pro Ala Ala

485 490

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 3

ggatttaata cggccggatc tgcaaaaagt gcc 33

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 4

ggcacttttt gcagatccgg ccgtattaaa tcc 33

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 5

tttaatacgg cctcaggagc aaaaagtgcc cctgac 36

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 6

aggggcactt tttgctcctg aggccgtatt aaatcc 36

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 7

cgtggattta atacggccgc aaaaagtgcc cctgac 36

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 8

gtcaggggca ctttttgcgg ccgtattaaa tccacg 36

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 9

agtggtaatg gcgcaggtgg taatggggca ccggcg 36

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 10

cgccggtgcc ccattaccac ctgcgccatt accact 36

<210> 11

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 11

ggggccatta ctccggaagg cgcgattggt aatggggcac cg 42

<210> 12

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 12

cggtgcccca ttaccaatcg cgccttccgg agtaatggcc cc 42

<210> 13

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 13

attcttcgtg gatttaataa tgtcgataaa gatgcccctg acggcatgcc a 51

<210> 14

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工引物

<400> 14

tggcatgccg tcaggggcat ctttatcgac attattaaat ccacgaagaa t 51

Claims (6)

1.一种鞘糖脂内切糖苷酶，其特征在于，所述的鞘糖脂内切糖苷酶的氨基酸序列如SEQID No：2所示，且具有选自下组的突变：

第63位丝氨酸被甘氨酸所取代；或

第148位到第154位的氨基酸残基发生删除突变；或

第314位天冬氨酸被酪氨酸替代的突变；或

第351位谷氨酸被丝氨酸替代。

2.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如权利要求1所述的鞘糖脂内切糖苷酶。

3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含有权利要求2所述的多核苷酸。

4.一种基因工程化的细胞，其特征在于，所述的细胞包括权利要求3所述的表达载体或其基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸,并且所述细胞不为植物细胞。

5.一种催化岩藻糖基单唾液酸四己糖神经节苷脂的方法，其特征在于，在生物酶法催化体系中，使用如权利要求1所述的鞘糖脂内切糖苷酶；

其中，所述的催化反应类型为水解所述的岩藻糖基单唾液酸四己糖神经节苷脂或者反向合成所述的岩藻糖基单唾液酸四己糖神经节苷脂的前体化合物，所述前体化合物为含有岩藻糖基单唾液酸四己糖的溶血鞘氨醇。

6.如权利要求1所述的鞘糖脂内切糖苷酶在鞘糖脂或寡糖的制备、生产、分析与合成中的应用。

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