CN115552026A

CN115552026A - 用于制备CMP-Neu5Ac的酶促方法

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Publication number: CN115552026A
Application number: CN202180034356.5A
Authority: CN
Inventors: T·F·T·莱克瑟; R·马霍尔
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 2020-04-08
Filing date: 2021-04-07
Publication date: 2022-12-30
Also published as: EP4103730A1; WO2021204898A1; EP4103730C0; CA3171195A1; JP2023521779A; EP4103730B1; EP3892731A1

Abstract

本发明涉及一种由低成本底物N‑乙酰‑D‑葡萄糖胺(GlcNAc)、丙酮酸盐、胞苷和多磷酸盐在与一组任选固定或任选共固定的酶在单一反应混合物中产生胞苷5′‑单磷酸‑N‑乙酰‑神经氨酸(CMP‑Neu5Ac，1)的方法，所述酶包括N‑酰基葡萄糖胺2‑差向异构酶(AGE)、N‑乙酰神经氨酸裂解酶(NAL)、N‑酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)、尿苷激酶(UDK)、单磷酸尿苷激酶和多磷酸激酶3(PPK3)。此外，所述方法可适于产生Neu5酰化的即唾液酸化的生物分子和生物分子，其包括糖、肽、蛋白质、糖肽、糖蛋白、糖脂、聚糖、抗体和糖缀合物，特别是抗体药物缀合物和碳水化合物缀合疫苗或类黄酮。

Description

用于制备CMP-Neu5Ac的酶促方法

技术领域

本发明涉及一种由低成本底物N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)、丙酮酸盐、胞苷和多磷酸盐与一组酶在单一反应混合物中产生胞苷5′-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸(CMP-Neu5Ac，1)的方法，所述酶包括N-酰基葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)、N-乙酰神经氨酸裂解酶(NAL)、N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)、尿苷激酶(UDK)、单磷酸尿苷激酶和多磷酸激酶3(PPK3)。此外，所述方法可适于产生Neu5酰化的即唾液酸化的生物分子和生物分子，其包括糖、肽、蛋白质、糖肽、糖蛋白、糖脂、聚糖、抗体、糖缀合物，特别是抗体药物缀合物和碳水化合物缀合疫苗或类黄酮。

背景技术

N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)是一种唾液酸和九碳(C-9)酸性单糖，其天然存在于附着于细胞表面和可溶性蛋白的糖链的末端。在人体内，最高浓度的N-乙酰神经氨酸存在于大脑中，在其中它作为神经节苷脂结构的组成部分参与突触发生和神经传递。人乳中还含有高浓度的附着在游离寡糖的末端的唾液酸，特别是半乳糖神经酰胺。在某些病理学中，例如在神经外胚层起源的侵袭性肿瘤中，Neu5Ac在细胞表面过表达。

某些细菌菌株在其荚膜多糖中含有大量的N-乙酰神经氨酸。例如，脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)血清组B荚膜多糖是唾液酸的线性均聚物，其由约200个重复单位的α(2-8)连接的N-乙酰神经氨酸组成(Bhattacharjee A.K.等人,J.Biol.Chem.1975,250,pp.1926-1932)。该均聚物不限于脑膜炎奈瑟菌血清组B，因为它也存在于引起新生儿脑膜炎的病原体大肠杆菌K1的荚膜中、重要的兽医病原体溶血性巴斯德菌A2中以及鼻graves中常见的非致病微生物非液化莫拉克斯氏菌(Moraxella)中。

N-乙酰神经氨酸在自然界中很少游离存在。它们更常见地作为粘蛋白、糖蛋白和糖脂的寡糖链的组分存在。它们通常以各种连接方式(主要与半乳糖、N-乙酰氨基半乳糖和其他唾液酸部分连接)占据外膜和内膜表面的复杂碳水化合物的寡糖链的末端非还原位置，在这里它们高度暴露且功能上很重要。

来自高等动物和各种微生物的细胞在以葡萄糖为起始的长途径中产生唾液酸。胞苷5′-单磷酸-N-乙酰-D-神经氨酸(CMP-Neu5Ac)是大量生物技术应用的关键底物。

CMP-Neu5Ac是唾液酸转移酶的供体底物，唾液酸转移酶将唾液酸与多种生物聚合物(包括聚唾液酸、糖脂和糖蛋白)中的受体羟基连接(Tsuji，1996)。

存在于哺乳动物外细胞表面的唾液酸化寡糖在细胞相互作用中发挥重要作用，并且一些细菌能够模拟这些结构以逃避其宿主的免疫系统。深入了解唾液酸化的途径以实现抑制剂和模拟物的设计和产生对感染性疾病和自身免疫性疾病和癌症的研究将有很大的益处。唾液酸化分两个阶段进行，第一阶段是激活唾液酸，第二阶段是将其转移至靶分子。活化步骤由CMP-Neu5Ac合成酶(CSS或CNS)催化。

由于CMP-Neu5Ac不稳定且相对昂贵，CMP-Neu5Ac合成酶对唾液酸化寡糖的制备型酶促合成是有价值的。它还可用于使唾液酸类似物带电荷以合成相应的唾液酸寡糖类似物。Kean(1991)综述了唾液酸活化，并从各种真核和原核来源分离出CMP-Neu5Ac合成酶。一些细菌性病原体已被证明具有唾液酸化荚膜和脂多糖作为重要的毒力因子，这推动了对这些微生物中唾液酸生物合成和掺入的研究。Warren和Blacklow(1962)证明脑膜炎奈瑟菌是CMP-Neu5Ac合成酶的良好来源，但非致病性重组菌株更适合用于扩大该酶的产生及其在唾液酸化寡糖的制备合成中的应用。编码CMP-Neu5Ac合成酶的细菌基因已从大肠杆菌(Vann等人，1987)、脑膜炎奈瑟菌(Edwards和Frosch，1992，Ganguli等人，1994)、无乳链球菌(Haft等人，1996)和杜克雷嗜血杆菌(Tullius等人，1996)中克隆。

CMP-Neu5Ac是产生碳水化合物疫苗和日益增长的个体化药物领域(即制备用于药物递送的糖纳米材料(glyconanomaterial))所必需的。此外，为了在体外构建单克隆抗体和其他重组蛋白的核心结构，迫切需要CMP-Neu5Ac。

因此，非常需要包括Neu5酰化即唾液酸化生物分子。然而，尽管对CMP-Neu5Ac的需求量很高(大约每年数吨)，但即使对研究人员来说，CMP-Neu5Ac的可用性也非常有限。

已知10mM浓度的5'-单磷酸腺苷(AMP)和5'-三磷酸腺苷(ATP)抑制某些N-乙酰神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)的超过60％的活性。在已知的方法中，高浓度的胞苷核苷酸例如CMP、CDP或CTP直接被提供到CMP-Neu5Ac的酶促合成中。然而，此类磷酸化胞苷例如CMP、CDP和CTP已知为N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)的抑制剂，因为CSS由胞苷核苷酸通过与其第二个胞苷结合位点结合而被抑制(Ignacio G.BRAVO等人,Biochem.J,2001,258,pp568-598)。

据报道，极低浓度的5’-单磷酸胞苷(CMP)和5’-二磷酸胞苷(CDP)强烈抑制某些N-乙酰神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)的活性。例如，来自麦奇钩吻鲑(Oncorhynchus mykiss)的CSS的活性被0.3mM的CMP抑制57％，以及被CDP抑制45％。来自Pelophyls eschulenuts的CSS的活性被1.0mM的CMP抑制43％以及被1mM的CDP抑制49％。高浓度(高于5mM)的CTP也抑制来组灰仓鼠和褐家鼠的CCS的活性。

因此，很明显，直接提供高浓度的CMP、CDP和/或CTP在技术上不利于CMP-Neu5Ac的酶促产生。

相反，胞苷在高浓度(高于60mM)下不抑制CSS的活性。此外，ATP可用作CCS的激活剂(Ignacio G.BRAVO等人,Biochem.J.2001,258,pp568-598)。

尽管文献中描述了CMP-Neu5Ac合成的上述缺点，但CMP-Neu5Ac的一般反应的另一个缺点是基于以下事实：起始物料(特别是各自的5’-单磷酸胞苷(CMP)和5’-三磷酸胞苷(CTP))非常昂贵，因此合成途径导致CMP-Neu5Ac的成本密集合成。如上所述，本领域需要提供用于由低成本和容易获得的起始物料制备CMP-Neu5Ac的成本效益高且有效的方法。

为了提供用于制备CMP-Neu5Ac的成本效益高且有效的方法，鉴定低成本底物例如N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)、丙酮酸盐、胞苷和多磷酸盐作为在多酶级联反应中产生CMP-Neu5Ac的合适起始物料，如图1A所示。

本发明的级联反应包括(a)由N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)形成N-乙酰-D-甘露糖胺(ManNAc)，(b)由ManNAc和丙酮酸盐形成N-乙酰-D-神经氨酸(Neu5Ac)，(c)由胞苷和5'-三磷酸腺苷(ATP)形成5’-单磷酸胞苷(CMP)，(d)由CMP和ATP形成5’-二磷酸胞苷(CDP)，(e)由CDP和多磷酸盐(PolyP_n)形成5’-三磷酸胞苷(CTP)，和(f)Neu5Ac与CTP反应生成CMP-Neu5Ac。任选地，可通过添加1D-PPK2以协助ADP转化为ATP来扩展级联。此外，可通过添加2D-PPK2以激活AMP磷酸化为ADP来扩展级联。此外，可以通过添加1D-PPK2和2DPPK2以抑制磷酸腺苷的频繁水解来扩展级联。

预期CMP-Neu5Ac可在N-酰基葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)、N-乙酰神经氨酸裂解酶(NAL)、N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)、尿苷激酶(UDK)、单磷酸尿苷激酶和多磷酸激酶3(PPK3)的存在下由N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)、丙酮酸盐、胞苷和多磷酸盐直接产生。

最重要的是，为了控制强烈抑制N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)的催化活性的CMP和CDP的浓度，CMP在尿苷激酶(UDK)的存在下由胞苷原位产生，CDP也通过单磷酸尿苷(UMP)激酶由CMP持续原位产生。

令人惊讶的是，本发明人发现，由尿苷激酶(UDK)催化的胞苷原位转化为5’-单磷酸胞苷(CMP)控制磷酸化胞苷核苷酸的浓度，特别是CMP和CDP，其抑制N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)的催化活性。此外，当包含N-酰基葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)、N-乙酰神经氨酸裂解酶(NAL)、N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)、尿苷激酶(UDK)、单磷酸尿苷激酶和多磷酸激酶3(PPK3)的一组酶共固定在固体支持物上时，增强了多酶级联反应的功效。

长期以来一直需要一种用于从低成本和容易获得的底物开始以成本效益高的方式产生CMP-Neu5Ac的高效的多酶促方法。

因此，本发明的目的是提供一种制备CMP-Neu5Ac的成本效益高且有效的多酶促方法。

本发明的目的通过独立权利要求的教导来解决。本发明的进一步有利特征、方面和细节从本申请的从属权利要求、描述、图和实施例中明显看出。

发明内容

因此，本发明涉及一种产生胞苷5′-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸(CMP-Neu5Ac，1)的方法。

包括：

A)提供包含N-乙酰-D-葡萄糖胺、丙酮酸盐、多磷酸盐、胞苷和5'-三磷酸腺苷(ATP)的溶液，和

一组酶，所述酶包括N-酰基葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)、N-乙酰神经氨酸裂解酶(NAL)、N-乙酰神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)、尿苷激酶(UDK)、单磷酸尿苷激酶和多磷酸激酶3(PPK3)；

B)将所述溶液和所述一组酶混合，并使所得溶液反应以产生胞苷5′-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸(CMP-Neu5Ac)，

其中尿苷激酶(UDK)将胞苷原位转移至5'-单磷酸胞苷(CMP)。

本发明的优选实施方案涉及一种产生胞苷5′-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸(CMP-Neu5Ac，1)的方法

包括：

其中该组酶或该组中的至少三种酶共固定在固体支持物上，并且尿苷激酶(UDK)将胞苷原位转移至5'-单磷酸胞苷(CMP)。

可替代地，N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)在N-乙酰-葡萄糖胺脱乙酰酶的存在下由D-葡萄糖胺(GlcN)和乙酸盐单独或原位生成。因此，在一些情况下，可以在步骤A)之前单独执行额外的步骤A1)，具体如下：

A1)在N-乙酰-葡萄糖胺脱乙酰酶的存在下，由D-葡萄糖胺(GlcN)和乙酸盐产生N-乙酰-D-葡萄糖胺。

在另一种情况下，N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)由D-葡萄糖胺(GlcN)和乙酸盐在N-乙酰-葡萄糖胺脱乙酰酶的存在下原位生成。

因此，本发明涉及一种产生胞苷5′-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸(CMP-Neu5Ac，1)的方法

包括：

A')提供包含D-葡萄糖胺、乙酸盐、丙酮酸盐、多磷酸盐、胞苷和5'-三磷酸腺苷(ATP)的溶液，和

一组酶，所述酶包括N-乙酰-葡萄糖胺脱乙酰酶、N-酰基-葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)、N-乙酰神经氨酸裂解酶(NAL)、N-乙酰神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)、尿苷激酶(UDK)、单磷酸尿苷激酶和多磷酸激酶3(PPK3)；

B')将所述溶液和所述一组酶混合，并使所得溶液反应以产生胞苷5′-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸(CMP-Neu5Ac)，

其中尿苷激酶(UDK)将胞苷原位转移至5'-单磷酸胞苷(CMP)。

优选地，该组酶共固定在固体支持物上，更优选地，该组酶共固定在可重复使用的、机械稳定的固体支持物上，从而增加或保持每种酶的大部分活性。

任选地，该组酶还包括无机二磷酸酶(PPA)。此外，该组酶还包括单结构域多磷酸激酶2(1D-PPK2)和/或双结构域多磷酸激酶2(2D-PPK2)。无机二磷酸酶(PPA)、单结构域多磷酸激酶2(1DPPK2)和/或双结构域多磷酸激酶2(2DPPK2)优选与上述酶共固定在相同的固体支持物上。

优选地，在本发明的方法中，步骤B)中得到的溶液的pH值在5.0-10.0，优选5.5-9.5，更优选6.0-9.0，更优选6.5-9.0，最优选7.0-9.0的范围内。

优选地，在本发明的方法中，N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)的浓度在10mM至3500mM的范围内，优选20mM至3000mM，更优选15mM至2500mM，更优选20mM至2000mM，最优选在20mM至1000mM的范围内；

和/或丙酮酸盐的浓度在10mM至3500mM的范围内，优选20mM至3000mM，更优选15mM至2500mM，更优选20mM至2000mM，最优选在20mM至1000mM的范围内；

和/或胞苷的浓度在1mM至50mM的范围内，优选1mM至40mM，更优选1mM至30mM，更优选10mM至20mM，最优选在1mM至15mM的范围内；

和/或5'-三磷酸腺苷(ATP)的浓度在0.001mM至10mM的范围内，优选0.005mM至10mM，更优选0.01mM至10mM，更优选0.05mM至10mM，最优选在0.1mM至10mM的范围内；

和/或多磷酸盐的浓度在1mM至30mM的范围内，优选1mM至25mM，更优选1mM至20mM，更优选1mM至15mM，最优选在1mM至10mM的范围内。

优选地，在本发明的方法中，N-乙酰-D-葡萄糖胺和胞苷的比例在1:1至100:1的范围内。

优选地，在本发明的方法中，所得溶液进一步包含Mg²⁺，其浓度在0.1mM至500mM的范围内，优选0.1mM至200mM，更优选1mM至100mM，更优选10mM至100mM，最优选20mM至50mM。

优选地，在本发明的方法中，每种酶具有以下氨基酸序列：

N-酰基葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列；

N-乙酰神经氨酸裂解酶(NAL)包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列；

N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)包含SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列；

尿苷激酶(UDK)包含SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列；

单磷酸尿苷激酶(URA6)包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列；

多磷酸激酶3(PPK3)包含SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列；和

无机二磷酸酶(PPA)包含SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列。

特别地，固体支持物由珠子或树脂组成，所述珠子或树脂包含具有环氧化物官能团、具有氨基环氧化物官能团、具有乙二胺官能团、具有氨基C2官能团、具有氨基C6官能团、具有阴离子/氨基C6间隔官能团的聚合物。固体支持物是多孔或非多孔颗粒，包括纳米颗粒或孔径为

至

的多孔珠子。

优选地，该组酶直接共固定在固体支持物上，其来自细胞裂解物或细胞匀浆。

本发明还涉及一种用于产生Neu5酰化即唾液酸化的生物分子的方法，所述方法包括：

i)执行如上所述的方法以获得CMP-Neu5Ac，

ii)将步骤i)后获得的CMP-Neu5Ac与生物分子反应，其通过在唾液酸转移酶的存在下去除CMP基团而与生物分子的羟基形成O-糖苷键，

其中所述生物分子是糖、糖肽、糖蛋白、糖脂、聚糖、肽、蛋白质、抗体、抗体药物缀合物、碳水化合物缀合疫苗或类黄酮。

优选地，唾液酸转移酶选自β-半乳糖酰胺α-2,6-唾液酸转移酶(EC2.4.99.1)、α-N-乙酰氨基半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶(EC2.4.99.3)、β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶(EC2.4.99.4)、N-乙酰乳糖铵α-2,3-唾液酸转移酶(EC2.4.99.6)、α-N-乙酰-神经氨酸苷α-2,8-唾液酸转移酶(EC2.4.99.8)和乳糖神经酰胺α-2,3-唾液酸转移酶(EC2.4.99.9)。这些酶使用CMP-Neu5Ac作为糖基供体。

唾液酸转移酶可能负责序列Neu5Ac-α-2,3-Gal-β-1,3-GalNAc-的合成，该序列存在于与Thr或Ser O-连接的糖链上，并且也是某些神经节苷脂上的末端序列。这些酶在糖基化过程中催化唾液酸基转移反应，并且是II型膜蛋白。

因此，优选地，所述生物分子包含选自半乳糖苷(Gal)、氨基半乳糖苷(GalN)、N-乙酰氨基半乳糖苷(GalNAc)、神经氨酸苷(Neu)、N-乙酰神经氨酸苷(Neu5Ac)、N-羟乙酰神经氨酸苷、3-脱氧-D-甘油-D-半乳糖基-2-尤罗索尼克酸(nonulosonic Acid)(KDN)和N-乙酰氨基乳糖苷(acetyllacosaminide)(Gal-β-1-3-GlcNAc)的任一部分作为末端基团。

更优选地，所述生物分子是糖肽、糖蛋白或抗肿瘤疫苗，其包含T抗原(Gal-β-1-3-GalNAc-α-1-O-)或Tn-抗原(GalNAc-α-1-O-)；或包含Gal-β-1-4-GlcNAc-β-1-O-的糖脂。

本发明还涉及一组酶，所述酶包括N-酰基葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)、N-乙酰神经氨酸裂解酶(NAL)、N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)、尿苷激酶(UDK)、单磷酸尿苷(UMP)激酶和多磷酸激酶3(PPK3)，其中所述一组酶通过共价键固定或共固定在聚合物上。

优选地，该组酶包括N-酰基葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)、N-乙酰-神经氨酸裂解酶(NAL)、N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)、尿苷激酶(UDK)、单磷酸尿苷(UMP)激酶和多磷酸激酶3(PPK3)，其中该组酶优选共固定在用环氧基团官能化的聚合物上。

优选地，本发明的一组酶还包括无机二磷酸酶(PPA)、单结构域多磷酸激酶2(1D-PPK2)和/或双结构域多磷酸激酶2(2D-PPK2)。

发明详述

定义

如本文所用，术语“N-酰基葡萄糖胺2-差向异构酶(GlcNAc 2-差向异构酶，ACE)”是指具有催化N-酰基-D-葡萄糖胺异构化为N-酰基-D-甘露糖胺的活性结构域的酶，具体如下：

N-酰基-D-葡萄糖胺N-酰基-D-甘露糖胺

因此，该酶有一种底物N-酰基-D-葡萄糖胺和一种产物N-酰基-D-甘露糖胺。该酶属于异构酶家族，特别是属于作用于碳水化合物和衍生物的外消旋酶和差向异构酶。

N-酰基葡萄糖胺2-差向异构酶属于EC分类5.1.3.8.。N-酰基-葡萄糖胺2-差向异构酶也具有以下同义词：N-酰基-D-葡萄糖胺2-差向异构酶、酰基葡萄糖胺2-差向异构酶和N-乙酰葡萄糖胺2-差向异构酶。该酶参与氨基糖代谢。它使用一种辅因子ATP。

如本文所用，术语“N-乙酰葡萄糖胺脱乙酰酶”是指具有催化以下反应的活性结构域的酶：

N-乙酰-D-葡萄糖胺+H₂O D-葡萄糖胺+乙酸盐

该酶促反应是可逆的，因此，在本发明中，N-乙酰葡萄糖胺脱乙酰酶用于通过将平衡推向GlcNAc的产生来产生N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)。因此，在本发明中，该酶使用两种底物D-葡萄糖胺和乙酸盐来产生N-乙酰-D-葡萄糖胺。

该酶属于水解酶家族，其作用于肽键以外的碳氮键，特别是在线性酰胺中。N-乙酰葡萄糖胺脱乙酰酶属于EC分类EC 3.5.1.33.。N-乙酰葡萄糖胺脱乙酰酶也有以下同义词：N-乙酰-D-葡萄糖胺酰胺水解酶、乙酰氨基脱氧葡萄糖乙酰水解酶和N-乙酰-D-葡萄糖胺基N-脱乙酰酶。

如本文所用，术语“N-乙酰神经氨酸裂解酶(NAL)”是指具有催化以下反应的活性结构域的多肽：

N-乙酰神经氨酸盐N-乙酰-D-甘露糖胺+丙酮酸盐

该酶促反应是可逆的，因此，在本发明中，N-乙酰神经氨酸酶裂解酶用于通过将平衡推向Neu5Ac的产生来产生CMP-Neu5Ac。因此，在本发明中，该酶使用两种底物N-乙酰-D-甘露糖胺和丙酮酸盐来产生N-乙酰神经氨酸盐。

该酶属于裂解酶家族，特别是氧代酸裂解酶，其裂解碳-碳键。N-乙酰神经氨酸裂解酶属于EC分类EC4.1.3.3.。N-乙酰神经氨酸裂解酶也有以下同义词：N-乙酰神经氨酸丙酮酸裂解酶(形成N-乙酰-D-甘露糖胺-)。常用的其他名称包括N-乙酰神经氨酸醛缩酶、乙酰神经氨酸裂解酶、唾液醛缩酶、唾液酸醛缩酶、唾液酸盐裂解酶、N-乙酰神经氨酸醛缩酶、神经氨酸醛缩酶、N-乙酰神经氨酸盐醛缩酶、神经氨酸醛缩酶、N-乙酰神经氨酸醛缩酶、神经氨酸醛缩酶、N-乙酰神经氨酸的裂解酶、N-乙酰神经氨酸裂解酶、NPL、NALase、NANA裂解酶、乙酰神经氨酸丙酮酸裂解酶和N-乙酰神经氨酸丙酮酸裂解酶。该酶参与氨基糖代谢。

如本文所用，术语“N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)”是指具有催化5'-三磷酸胞苷(CTP)与N-乙酰-D-神经氨酸的反应和产生CMP-N-乙酰-D-神经氨酸(CMP-Neu5Ac)的活性结构域的多肽。

N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶还有以下同义词：CMP-唾液酸焦磷酸化酶、CMP-唾液酸合酶、5’-单磷酸胞苷唾液酸合成酶、CMP-Neu5Ac合成酶(CNS)、CMP-NeuAc合成酶、酰基神经氨酸胞苷酰转移酶、CMP-N-乙酰神经氨酸盐合成酶、CMP-N-乙酰神经氨酸盐合酶、CMP-N-乙酰神经氨酸合酶、CMP-NANA合成酶、CMP-唾液酸盐合成酶、CMP-唾液酸合成酶、胞苷5’-单磷酸-N-乙酰神经氨酸合成酶、胞苷5-单磷酸N-乙酰神经氨酸合成酶、胞苷单磷酸唾液酸合成酶、胞苷单磷酸乙酰神经氨酸合成酶、胞苷单磷酸唾液酸盐焦磷酸化酶、胞苷单磷酸唾液酸盐合成酶和乙酰神经氨酸胞苷酰转移酶。

N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶属于EC分类2.7.7.43.。N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶催化以下反应：

Neu5Ac+CTP→CMP-Neu5Ac+PPi

N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶获自微生物，包括灰仓鼠(Cricetulus griseus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、亨氏热纤梭菌(Hungateiclostridium thermocellum)、溶血曼海姆菌(Mannheimia haemolytica)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、麦奇钩吻鲑(Oncorhynchus mykiss)、溶血性巴斯德菌A2(Pasteurella haemolytica A2)、Pelophylax esculentus、鱼发光杆菌(Photobacterium leiognathi)、褐家鼠(Rattusnorvegicus)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)和野猪(Sus scrofa)；小鼠、大鼠、小牛和虹鳟。

脑膜炎奈瑟菌CSS的突变体至少有以下一种突变：Q104A、R165A、Q166A、N175A、Y179A、F192A、F193A。

激酶是构成磷酸转移酶家族的一部分的酶。激酶是催化磷酸基团从高能量磷酸供体分子转移到特定底物的酶。该过程称为磷酸化，其中底物获得磷酸基团，高能量核苷酸(例如三磷酸腺苷(ATP))分子献出磷酸基团。该酯交换产生磷酸化底物和ADP。

如本文所用，术语“尿苷激酶”是指具有在三磷酸腺苷(ATP)的存在下催化尿苷反应至5'-单磷酸尿苷的活性结构域的多肽，如下：

因此，该酶的两种底物为ATP和尿苷，而其两种产物为ADP和UMP。

此外，发现在三磷酸腺苷的存在下尿苷激酶能够催化胞苷反应至5’-单磷酸胞苷，如下：

该酶属于转移酶家族，特别是以乙醇基团为受体的转移含磷基团的酶(磷酸转移酶)。尿苷激酶属于EC分类2.7.1.48.。常用的其他名称包括嘧啶核糖核苷激酶、尿苷-胞苷激酶、尿苷激酶(磷酸化)和尿苷磷酸激酶。该酶参与嘧啶代谢。

如本文所用，术语“单磷酸尿苷(UMP)激酶”或指具有在三磷酸腺苷的存在下催化5'-单磷酸尿苷反应至5'-二磷酸尿苷的活性结构域的多肽。单磷酸尿苷激酶属于EC分类2.7.4.22.。单磷酸尿苷激酶催化以下反应：

此外，发现单磷酸尿苷(UMP)激酶能够在三磷酸腺苷的存在下催化单磷酸胞苷反应至5’-二磷酸胞苷，如下：

该酶属于转移酶家族，特别是以磷酸基团为受体的转移含磷基团的酶(磷酸转移酶)。常用的其他名称包括尿苷酸激酶、UMPK、单磷酸尿苷激酶、PyrH、UMP-激酶和SmbA。该酶参与嘧啶代谢。

如本文所用，术语“多磷酸盐”是指含有由6个或更多个磷酸盐(PO₄)四面体的角共享产生的几个P–O–P键(导致长链的形成)的任何盐。术语“PolyP_n”是同义使用的，其中n表示磷酸盐残基的数量的平均链长，例如，PolyP₂₅是指具有约25个磷酸盐残基的多磷酸盐，PolyP₁₄是指具有约14个磷酸盐残基的多磷酸盐。

如本文所用，术语“多磷酸激酶”是指具有多磷酸激酶活性的多肽，即多磷酸激酶催化以下反应：

N为核苷酸诸如鸟苷、腺苷、尿苷等，NMP为单磷酸核苷，NDP为二磷酸核苷，NTP为三磷酸核苷。

在尿苷的情况下，多磷酸激酶催化以下反应：

多磷酸激酶属于EC分类2.7.4.1.。在本文所述的本发明的方法中使用的多磷酸激酶的代表包括但不限于多磷酸激酶1(PPK1)、多磷酸激酶2(PPK2)、2-结构域多磷酸激酶2(2D-PPK2)和1-结构域多磷酸激酶2(1D-PPK2)和多磷酸激酶3(PPK3)。

如本文所用，术语“焦磷酸酶”是指具有焦磷酸酶活性的多肽，即催化以下反应的多肽：

其中PPi是指焦磷酸盐，Pi指磷酸盐。

焦磷酸酶属于EC分类3.6.1.1.。在这种情况下，术语“二磷酸酶”是指催化二磷酸盐水解为磷酸盐的焦磷酸酶多肽。

如本文所用，术语“唾液酸转移酶”是GT家族的酶，其在含有寡糖和糖缀合物的Neu5Ac的生物合成中发挥不可或缺的作用。通常在ST催化的糖基化反应中，糖核苷酸供体为5’-单磷酸胞苷Neu5Ac(CMP-Neu5Ac)，受体是由半乳糖(Gal)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)或其他Neu5Ac残基终止的寡糖或糖缀合物。根据Neu5Ac转移至的糖基受体位置对ST进行分类。在人类中，这些是ST3、ST6和ST8，它们分别在Neu5Ac的C2原子与受体的3'-、6'-或8'-羟基之间形成α-糖苷键。优选地，“唾液酸转移酶”选自β-半乳糖酰胺α-2,6-唾液酸转移酶(EC2.4.99.1)、α-N-乙酰氨基半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶(EC2.4.99.3)、β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶(EC2.4.99.4)、N-乙酰乳糖铵α-2,3-唾液酸转移酶(EC2.4.99.6)、α-N-乙酰-神经氨酸苷α-2,8-唾液酸转移酶(EC2.4.99.8)和乳糖神经酰胺α-2,3-唾液酸转移酶(EC2.4.99.9)。这些酶使用CMP-Neu5Ac作为糖基供体。

如本文所用，“糖”是指但不限于单糖、二糖、三糖、四糖、五糖、六糖、七糖、八糖、寡糖、聚糖和多糖。糖优选地包含选自以下的单糖单元中的至少一个：

D-阿拉伯糖、D-来苏糖、D-核糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、L-来苏糖、L-核糖、L-木糖、D-核酮糖、D-木酮糖、L-核酮糖、L-木酮糖、D-脱氧核糖、L-脱氧核糖、D-赤藓糖、D-苏糖、L-甘油-D-甘露糖-庚糖、D-甘油-D-甘露糖-庚糖、D-阿洛糖、D-阿卓糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-古洛糖、D-艾多糖、D-半乳糖、D-塔洛糖、D-阿洛酮糖、D-果糖、D-山梨糖、D-塔格糖、6-脱氧-L-阿卓糖、6-脱氧-D-塔洛糖、D-岩藻糖、L-岩藻糖、D-鼠李糖、L-鼠李糖、D-奎诺糖、橄榄糖、泰维糖、蛔糖、阿比可糖、泊雷糖、洋地黄毒糖、可立糖、D-葡萄糖胺、D-半乳糖胺、D-甘露糖胺、D-阿洛糖胺、L-阿卓糖胺、D-古洛糖胺、L-艾多糖胺、D-塔洛糖胺、N-乙酰-d-葡萄糖胺、N-乙酰-D-半乳糖胺、N-乙酰-D-甘露糖胺、N-乙酰-D-阿洛糖胺、N-乙酰-L-阿卓糖胺、N-乙酰-D-谷糖胺、N-乙酰-L-艾多糖胺、N-乙酰-D-塔洛糖胺、N-乙酰-D-岩藻糖胺、N-乙酰-L-岩藻糖胺、N-乙酰-L-鼠李糖胺、N-乙酰-D-奎诺糖胺、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸、D-甘露糖醛酸、D-阿洛糖醛酸、L-阿鲁糖醛酸、D-古洛糖醛酸、L-古洛糖醛酸、L-艾杜糖醛酸、D-牛磺酸、神经氨酸、N-乙酰神经氨酸、N-羟乙酰神经氨酸、3-脱氧-D-甘露-辛酮糖酸(KDO)、3-脱氧-D-甘油-D-半乳糖基-2-尤罗索尼克酸(KDN)、芹菜糖、Bacillosamine、黄夹竹桃糖、阿可弗里糖、磁麻糖、胞壁酸、N-乙酰胞壁酸、N-羟乙酰胞壁酸、3-脱氧-lyxo-庚糖酸、酮脱氧辛酸和酮脱氧壬酸。优选地，单糖或单糖单元属于α-和β-D/L-碳水化合物的以下组，其包括或由以下组成：

α-D-吡喃核糖、α-D-阿拉伯吡喃糖、α-D-吡喃木糖、α-D-吡喃来苏糖、α-D-吡喃阿洛糖、α-D-吡喃阿卓糖、α-D-吡喃葡萄糖、α-D-吡喃甘露糖、α-D-吡喃葡萄糖、α-D-吡喃艾多糖、α-D-吡喃半乳糖、α-D-吡喃塔洛糖、α-D-吡喃阿洛酮糖、α-D-吡喃果糖、α-D-吡喃山梨糖、α-D-吡喃塔格糖、α-D-呋喃核糖、α-D-呋喃阿拉伯糖、α-D-呋喃木糖、α-D-呋喃来苏糖、α-D-呋喃阿洛糖、α-D-呋喃阿卓糖、α-D-呋喃葡萄糖、α-D-呋喃甘露糖、α-D-呋喃古洛糖、α-D-呋喃艾多糖、α-D-呋喃半乳糖、α-D-呋喃塔洛糖、α-D-呋喃阿洛酮糖、α-D-呋喃果糖、α-D-呋喃山梨糖、α-D-呋喃塔格糖、α-D-呋喃木糖、α-D-呋喃核糖、α-D-呋喃苏糖、α-D-吡喃鼠李糖、α-D-呋喃红糖、α-D-葡萄糖胺、α-D-N-乙酰-葡萄糖胺、α-D-吡喃葡萄糖醛酸、α-D-氨基半乳糖、α-D-N-乙酰-氨基半乳糖、α-D-甘露糖胺、α-D-N-乙酰-甘露糖胺、α-D-神经氨酸、α-D-N-乙酰神经氨酸、α-D-N-羟乙酰神经氨酸、α-3-脱氧-D-甘露-辛酮糖酸(KDO)、α-3-脱氧-D-甘油-D-半乳糖基-2-尤罗索尼克酸(KDN)、β-D-吡喃核糖、β-D-阿拉伯吡喃糖、β-D-吡喃木糖、β-D-吡喃来苏糖、β-D-吡喃阿洛糖、β-D-吡喃阿卓糖、β-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃艾多糖、β-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃塔洛糖、β-D-吡喃阿洛酮糖、β-D-吡喃果糖、β-D-吡喃山梨糖、β-D-吡喃塔格糖、β-D-呋喃核糖、β-D-呋喃阿拉伯糖、β-D-呋喃木糖、β-D-呋喃来苏糖、β-D-吡喃鼠李糖、β-D-呋喃阿洛糖、β-D-呋喃阿卓糖、β-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃艾多糖、β-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃塔洛糖、β-D-呋喃阿洛酮糖、β-D-呋喃果糖、β-D-呋喃山梨糖、β-D-呋喃塔格糖、β-D-呋喃木糖、β-D-呋喃核糖、β-D-呋喃苏糖、β-D-呋喃红糖、β-D-葡萄糖胺、β-D-N-乙酰-葡萄糖胺、β-D-吡喃葡萄糖醛酸、β-D-氨基半乳糖、β-D-N-乙酰-氨基半乳糖、β-D-甘露糖胺、β-D-N-乙酰-甘露糖胺、β-D-神经氨酸、β-D-N-乙酰神经氨酸、β-D-N-羟乙酰神经氨酸、β-3-脱氧-D-甘露-辛酮糖酸(KDO)、β-3-脱氧-D-甘油-D-半乳糖基-2-尤罗索尼克酸(KDN)、α-L-吡喃核糖、α-L-阿拉伯吡喃糖、α-L-吡喃木糖、α-L-吡喃来苏糖、α-L-吡喃阿洛糖、α-L-吡喃阿卓糖、α-L-吡喃葡萄糖、α-L-吡喃甘露糖、α-L-吡喃葡萄糖、α-L-吡喃艾多糖、α-L-吡喃半乳糖、α-L-吡喃塔洛糖、α-L-吡喃阿洛酮糖、α-L-吡喃果糖、α-L-吡喃山梨糖、α-L-吡喃塔格糖、α-L-吡喃鼠李糖、α-L-呋喃核糖、α-L-阿拉伯呋喃糖、α-L-呋喃木糖、α-L-呋喃来苏糖、α-L-呋喃阿洛糖、α-L-呋喃阿卓糖、α-L-呋喃葡萄糖、α-L-呋喃甘露糖、α-L-呋喃古洛糖、α-L-呋喃艾多糖、α-L-呋喃半乳糖、α-L-呋喃塔洛糖、α-L-呋喃阿洛酮糖、α-L-呋喃果糖、α-L-呋喃山梨糖、α-L-呋喃塔格糖、α-L-呋喃木糖、α-L-呋喃核糖、α-L-呋喃苏糖、α-L-呋喃红糖、α-L-葡萄糖胺、α-L-吡喃葡萄糖醛酸、β-L-吡喃核糖、β-L-阿拉伯吡喃糖、β-L-吡喃木糖、β-L-吡喃来苏糖、β-L-吡喃阿洛糖、β-L-吡喃阿卓糖、β-L-吡喃葡萄糖、β-L-吡喃甘露糖、β-L-吡喃葡萄糖、β-L-吡喃艾多糖、β-L-吡喃半乳糖、β-L-吡喃塔洛糖、β-L-吡喃阿洛酮糖、β-L-吡喃果糖、β-L-吡喃山梨糖、β-L-吡喃塔格糖、β-L-呋喃核糖、β-L-呋喃阿拉伯糖、β-L-呋喃木糖、β-L-呋喃来苏糖、β-L-呋喃阿洛糖、β-L-呋喃阿卓糖、β-L-呋喃葡萄糖、β-L-呋喃甘露糖、β-L-呋喃古洛糖、β-L-呋喃艾多糖、β-L-呋喃半乳糖、β-L-呋喃塔洛糖、β-L-呋喃阿洛酮糖、β-L-呋喃果糖、β-L-呋喃山梨糖、β-L-呋喃塔格糖、β-L-呋喃木糖、β-L-呋喃核糖、β-L-呋喃苏糖、β-L-呋喃红糖、β-L-葡萄糖胺、β-L-吡喃葡萄糖醛酸和β-L-吡喃鼠李糖。

糖进一步任选地被修饰以携带酰胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、羰基、硫代羰基、羧基、硫代羧基、酯、硫酯、醚、环氧基、羟烷基、亚烷基、亚苯基、烯基、亚氨基、酰亚胺、异脲、硫代氨基甲酸酯、硫脲和/或尿素部分。

优选地，“糖”是人乳寡糖，包括乳糖、N-乙酰-乳糖胺、乳糖-N-二碳糖、2'-岩藻糖乳糖、3-岩藻糖乳糖(3-FL)、乳糖-N-四糖(LNT)、乳糖-N-新四糖(LNnT)、二岩藻糖乳糖(DiFL)、乳糖-N-三糖II(LNT-II)、乳糖-N-岩藻糖戊糖I(LNFP I)、乳糖-N-岩藻糖戊糖III(LNFP III)、乳糖-N-岩藻糖戊糖V(LNFPV)。

如本文所用，术语“糖肽”是指含有共价附着于构成肽的氨基酸残基侧链的碳水化合物部分的肽。碳水化合物部分形成侧链并且是连接到丝氨酸或苏氨酸残基的羟基的O-糖苷或连接到天冬酰胺残基的酰氨基氮的N-糖苷。

如本文所用，术语“糖蛋白”是指含有共价附着于构成多肽的氨基酸残基侧链的碳水化合物部分的多肽。碳水化合物部分形成侧链并且是连接到丝氨酸或苏氨酸残基的羟基的O-糖苷或连接到天冬酰胺残基的酰氨基氮的N-糖苷。

如本文所用，术语“糖脂”是指含有通过糖苷键与疏水性部分结合的一个或多个单糖部分的化合物。糖脂由单糖基二酰甘油(MGDG)、二糖基二酰甘油(DGDG)、三甲基-β-丙氨酸二酰甘油和舒法喹啉二酰甘油(sulphaquinovosyldiacyl-glycerol)组成。存在具有各种可能的骨架分子结构(例如酰基甘油、鞘氨醇、神经酰胺(N-酰基鞘氨醇)和甾醇)的不同糖脂类别。

特别地，神经节苷脂是由鞘糖脂(神经酰胺和寡糖)与连接在糖链上的一个或多个N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)组成的分子。神经节苷脂的类型包括LM1、GM1、GM1b和GM2，其包含一个N-乙酰神经氨酸；GD1a、GalNAc-GD1a、GD1b、GD2和GD3，其包含两个N-乙酰神经氨酸；GT1a和GT3，其包含三个N-乙酰神经氨酸；以及GQ1b，其包含四个N-乙酰神经氨酸。

如本文所用，术语“蛋白质”是指含有或缺乏共价附着于构成多肽的氨基酸残基侧链的碳水化合物部分的多肽，包括非糖基化蛋白质和糖基化蛋白质。

如本文所用，术语“肽”是指含有或缺乏共价附着于构成肽的氨基酸残基侧链的碳水化合物部分的肽，包括非糖基化肽和糖基化肽。

如本文所用，术语"生物缀合物"是指由至少两个相互共价结合的分子组成的分子构建体并且所述分子中至少一个是生物分子，也即生物体中存在的对一种或多种典型生物学过程必需的分子。示例性地，生物缀合物是由共价偶联至载体蛋白的碳水化合物抗原组成的碳水化合物缀合疫苗，和抗体药物缀合物。

如本文所用，术语"碳水化合物缀合疫苗"是指含有与免疫原性载体共价结合的碳水化合物抗原的缀合物。碳水化合物抗原能够是但不限于细菌荚膜糖，病毒糖蛋白的糖，孢子虫或寄生物的糖抗原，病原真菌的糖抗原，或对癌细胞特异性的糖抗原。免疫原性载体能够是但不限于，选自类毒素的载体蛋白，包括破伤风类毒素(TT)，白喉类毒素(DT)，交叉反应物质197(CRM₁₉₇)，未分型流感嗜血杆菌(H.influenzae)的蛋白D，脑膜炎奈瑟菌荚膜类型B的外膜蛋白复合物(OMPC)，铜绿假单胞菌的外毒素A(EPA)，艰难梭菌(C.difficile)毒素A(CDTA)，肺炎球菌蛋白，例如肺炎球菌表面蛋白A(PspA)，肺炎球菌组氨酸三联体D(PhtD)，解毒的肺炎球菌自溶酶(dPly)，和spr96/2021，金黄色葡萄球菌(S.aureus)α毒素和Shiga毒素1b。

如本文所用，术语"固体支持物"是指不溶的官能化的物质，酶或其它试剂可以直接或经由携带锚定基团的连接体对其附着或固定的，使得酶可以容易地与过量试剂、可溶反应产品、副产物或溶剂(通过洗涤、过滤、离心等)分离。固体支持物能够由下述构成：有机聚合物例如聚苯乙烯，聚乙烯，聚丙烯，聚氟乙烯，聚氧乙烯和聚丙烯酰胺，及其共聚物和接枝物。固体支持物还能够是无机物，例如玻璃，二氧化硅，可控孔玻璃(CPG)，反相二氧化硅或金属，例如金或铂。固体支持物还能够由磁性颗粒组成。用于酶固定的合适支持材料的概览参见Zdarta等人Catalysts 2018,8,92和Datta等人,Biotech2013 3:1–9。

固体支持物的构造可以呈下述形式：珠子、整块材料(monolith)、球体、粒子、粒子床、纤维垫、颗粒、凝胶、膜、中空纤维膜、混合基质膜或表面。表面能够是平面的，基本上是平面的或非平面的。固体支持物能够是多孔的或无孔的，并且能够具有膨胀或非膨胀特征。固体支持物能够经配置呈下述形式：孔、凹陷，或其它容器，器皿，特征或位置。

包括：

一组酶，所述酶包括N-酰基葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)、N-乙酰神经氨酸裂解酶(NAL)、N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)、尿苷激酶(UDK)、单磷酸尿苷激酶和多磷酸激酶3(PPK3)；

其中所述尿苷激酶(UDK)将胞苷原位转移至单磷酸胞苷(CMP)。

在优选实施方案中，如本文所公开的，该组酶共固定在固体支持物上。

换言之，本发明涉及一种产生胞苷5′-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸(CMP-Neu5Ac，1)的方法

包括：

B)将所述溶液和所述一组酶混合并使所得混合物反应以产生胞苷5′-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸(CMP-Neu5Ac)，

其中所述尿苷激酶(UDK)将胞苷原位转移至单磷酸胞苷(CMP)。

在本发明方法中，CMP、CDP以及CTP均由胞苷原位形成(见下文)。优选地，该组酶共固定在固体支持物上。

包括：

其中在步骤B)中CMP、CDP以及CTP均在原位形成，并且尿苷激酶(UDK)将胞苷原位转移至单磷酸胞苷(CMP)。

优选地，该组酶共固定在固体支持物上。令人惊讶的是，与使用非固定的酶的方法和使用在不同固体支持物上单独固定的酶的方法相比，该组酶的共固定强烈增强了酶级联反应的效率。

优选地，将该组酶共固定在可重复使用的、机械稳定的固体支持物上，从而增加或保留每种酶的大部分活性。

在步骤B)中，在包含N-酰基葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)、N-乙酰神经氨酸裂解酶(NAL)、N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)、尿苷激酶(UDK)、单磷酸尿苷激酶和多磷酸激酶3(PPK3)的一组酶的存在下，在所得溶液反应以产生胞苷5′-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸(CMP-Neu5Ac)的过程中，进行以下级联反应：

(a)由N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)在N-酰基葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)的催化下形成N-乙酰-D-甘露糖胺(ManNAc)，

(b)由ManNAc和丙酮酸盐在N-乙酰神经氨酸裂解酶(NAL)的催化下形成N-乙酰-D-神经氨酸(Neu5Ac)，

(c)由胞苷和5'-三磷酸腺苷(ATP)在尿苷激酶(UDK)的催化下形成5’-单磷酸胞苷(CMP)，

(d)由5’-单磷酸胞苷(CMP)和5'-三磷酸腺苷(ATP)在单磷酸尿苷激酶的催化下形成5’-二磷酸胞苷(CDP)，

(e)由5’-二磷酸胞苷(CDP)和多磷酸盐在多磷酸激酶3(PPK3)的催化下形成5’-三磷酸胞苷(CTP)；

(e')由步骤(c)和(d)中产生的5'-二磷酸腺苷(ADP)和多磷酸盐在多磷酸激酶3(PPK3)的催化下再生5'-三磷酸腺苷(ATP)；和

(f)通过在N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)的催化下N-乙酰-D-神经氨酸(Neu5Ac)与5'-三磷酸胞苷(CTP)的反应形成胞苷5′-单磷酸-N-乙酰神经氨酸(CMP-Neu5Ac)。

包括：

B)将所述溶液和所述一组酶混合并使所得溶液反应以通过以下过程产生胞苷5′-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸(CMP-Neu5Ac)：

(f)通过在N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)的催化下N-乙酰-D-神经氨酸(Neu5Ac)与5'-三磷酸胞苷(CTP)的反应形成胞苷5′-单磷酸-N-乙酰神经氨酸(CMP-Neu5Ac)，

其中所述一组酶共固定在固体支持物上；并且所述尿苷激酶(UDK)在所述步骤(c)中将胞苷原位转移至单磷酸胞苷(CMP)。

在N-乙酰-D-神经氨酸(Neu5Ac)与5’-三磷酸胞苷(CTP)在N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)催化下的反应中，焦磷酸盐(PPi)作为副产物形成。虽然焦磷酸盐在水溶液中不稳定，但它只能缓慢水解为无机磷酸盐(Pi)。众所周知，高浓度的焦磷酸盐抑制参与胞苷5’-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸(CMP-Neu5Ac)产生的N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)的活性。

因此，在本发明的一个实施方案中，该组酶进一步包含无机二磷酸酶(PPA)，本发明涉及产生胞苷5′-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸(CMP-Neu5Ac，1)的方法

包括：

一组酶，所述酶包括N-酰基葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)、N-乙酰神经氨酸裂解酶(NAL)、N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)、尿苷激酶(UDK)、单磷酸尿苷激酶、多磷酸激酶3(PPK3)和无机二磷酸酶(PPA)；

其中所述尿苷激酶(UDK)将胞苷原位转移至单磷酸胞苷(CMP)。优选地，该组酶共固定在固体支持物上。

在步骤B)中，在包含N-酰基葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)、N-乙酰神经氨酸裂解酶(NAL)、N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)、尿苷激酶(UDK)、单磷酸尿苷激酶、多磷酸激酶3(PPK3)和无机二磷酸酶(PPA)的一组酶的存在下，在所得溶液反应以产生胞苷5′-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸(CMP-Neu5Ac)的过程中，进行以下级联反应：

(e')由步骤(c)和(d)中产生的5'-二磷酸腺苷(ADP)和多磷酸盐在多磷酸激酶3(PPK3)的催化下再生5'-三磷酸腺苷(ATP)；

(f)通过在N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)的催化下N-乙酰-D-神经氨酸(Neu5Ac)与5'-三磷酸胞苷(CTP)的反应形成胞苷5′-单磷酸-N-乙酰神经氨酸(CMP-Neu5Ac)；和

(g)步骤(f)中产生的焦磷酸盐在无机二磷酸酶(PPA)的催化下转化为磷酸盐。

包括：

(d)由5’-单磷酸胞苷(CMP)和5'-三磷酸腺苷(ATP)在单磷酸尿苷(UMP)激酶的催化下形成5’-二磷酸胞苷(CDP)，

(f)通过在N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)的催化下N-乙酰-D-神经氨酸(Neu5Ac)与5'-三磷酸胞苷(CTP)的反应形成胞苷5′-单磷酸-N-乙酰神经氨酸(CMP-Neu5Ac)，和

(g)步骤(f)中产生的焦磷酸盐在无机二磷酸酶(PPA)的催化下转化为磷酸盐，

其中所述尿苷激酶(UDK)在所述步骤(c)中将胞苷原位转移至单磷酸胞苷(CMP)。优选地，该组酶共固定在固体支持物上。

已知ATP可用作N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)的激活剂(Ignacio G.BRAVO等人,Biochem.J,2001,258,pp568-598)，相反，AMP和ADP抑制N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)的活性。

在本发明的方法中，5'-三磷酸腺苷(ATP)由步骤(c)和(d)中产生的5'-二磷酸腺苷(ADP)和多磷酸盐在多磷酸激酶3(PPK3)的催化下再生。

因此，另外，该组酶还包括单结构域多磷酸激酶2(1DPPK2)和/或双结构域多磷酸激酶2(2DPPK2)。

此外，可以通过加入1D-PPK2和/或2D-PPK2来扩展级联，以激活AMP磷酸化为ADP和ADP磷酸化为ATP。此外，可以通过添加1D-PPK2和/或2D-PPK2来扩展级联，以抑制磷酸腺苷的频繁水解。

单结构域多磷酸激酶2(1D-PPK2)和/或双结构域多磷酸激酶2(2D-PPK2)优选也与上述酶在相同的固体支持物上共固定。

由于在本文所述的本发明的方法中ATP由ADP和多磷酸盐连续再生，因此CMP-Neu5NAc的产生可以用催化量的ATP进行。

因此，在本发明的一个实施方案中，该组酶进一步包含无机二磷酸酶(PPA)，并且本发明涉及产生胞苷5′-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸(CMP-Neu5Ac，1)的方法。

包括：

一组酶，所述酶包括N-酰基葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)、N-乙酰神经氨酸裂解酶(NAL)、N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)、尿苷激酶(UDK)、单磷酸尿苷激酶、多磷酸激酶3(PPK3)、无机二磷酸酶(PPA)、单结构域多磷酸激酶2(1DPPK2)和/或双结构域多磷酸激酶2(2DPPK2)；

B)混合所述溶液和所述一组酶，以及使所得溶液反应以产生胞苷5′-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸(CMP-Neu5Ac)，

包括：

B)混合所述溶液和所述一组酶，并使所得溶液反应以通过以下过程产生胞苷5′-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸(CMP-Neu5Ac)：

(h)在单结构域多磷酸激酶2(1DPPK2)和/或双结构域多磷酸激酶2(2DPPK2)的催化下AMP磷酸化为ADP和ADP磷酸化为ATP；

在本文所述的本发明的方法中，多磷酸盐作为唯一的能量载体，并且在使用多磷酸激酶3(PPK3)从ADP再生ATP中用作磷酸源。通过向本发明的方法的酶级联反应中加入1-结构域多磷酸激酶(1D-PPK)(其也催化ADP磷酸化为ATP)，优选1-结构域多磷酸激酶2(1D-PPK2)，可增强ATP的再生。此外，磷酸核苷例如ADP在水性介质中不稳定，倾向于快速水解。为了避免水解为AMP而损失ADP，可将催化AMP磷酸化为ADP的2-结构域多磷酸激酶(2D-PPK)优选2-结构域多磷酸激酶2(2D-PPK2)与1D-PPK一起添加或单独添加到本发明的酶级联反应中。

多磷酸盐能够与最初不溶于水性介质的金属离子(例如，Ca²⁺,Mg²⁺,Mn²⁺,Fe^2+/3+)形成稳定的水溶性复合物。由于特定多磷酸盐螯合特定金属离子的能力随着多磷酸盐的链长度的增加而降低，因此在本发明中优选长链多磷酸盐。更优选的是具有至少14个磷酸残基的多磷酸盐。最优选的是具有至少25个磷酸残基的多磷酸盐。

如上所述，可以通过添加N-乙酰-葡萄糖胺脱乙酰酶来扩展本发明方法的级联反应，以便由D-葡萄糖胺(GlcN)和乙酸盐单独或原位产生N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)。

在一些实施方案中，在步骤A)中，N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)在N-乙酰-葡萄糖胺脱乙酰酶的存在下由D-葡萄糖胺(GlcN)和乙酸盐单独或原位产生。

在步骤A)中，在N-乙酰-葡萄糖胺脱乙酰酶的存在下，由D-葡萄糖胺(GlcN)和乙酸盐单独或原位产生N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)。

因此，在一些情况下，可以在步骤A)之前单独执行额外的步骤A1)，具体如下：

因此，上述用于产生CMP-Neu5Ac的任何本发明的方法包括步骤A)之前的附加步骤A1)并随后执行步骤A)和B)。

在另一种情况下，N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)由D-葡萄糖胺(GlcN)和乙酸盐在N-乙酰-葡萄糖胺脱乙酰酶的存在下原位产生。

因此，上述用于产生CMP-Neu5Ac的任何本发明的方法包括替代步骤A')和B’)。最重要的是，在步骤B')中，N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)将按以下方式原位形成：

(a')由D-葡萄糖胺(GlcN)和乙酸盐在N-乙酰-葡萄糖胺脱乙酰酶的催化下形成N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)。

包括：

其中尿苷激酶(UDK)将胞苷原位转移至5′-单磷酸胞苷(CMP)。

在步骤B')中，在包含N-乙酰-葡萄糖胺脱乙酰酶、N-酰基葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)、N-乙酰神经氨酸裂解酶(NAL)、N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)、尿苷激酶(UDK)、单磷酸尿苷激酶和多磷酸激酶3(PPK3)的一组酶的存在下，在所得溶液反应以产生胞苷5′-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸(CMP-Neu5Ac)的过程中，进行以下级联反应：

(a')由D-葡萄糖胺(GlcN)和乙酸盐在N-乙酰-葡萄糖胺脱乙酰酶的催化下形成N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)，

包括：

一组酶，所述酶包括N-乙酰-葡萄糖胺脱乙酰酶、N-酰基葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)、N-乙酰神经氨酸裂解酶(NAL)、N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)、尿苷激酶(UDK)、单磷酸尿苷激酶和多磷酸激酶3(PPK3)；

B')将所述溶液和所述一组酶混合并使所得溶液反应以通过以下过程产生胞苷5′-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸(CMP-Neu5Ac)：

优选地，该组酶还包括无机二磷酸酶(PPA)，并且本发明涉及产生胞苷5′-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸(CMP-Neu5Ac，1)的方法

包括：

一组酶，所述酶包括N-乙酰-葡萄糖胺脱乙酰酶、N-酰基葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)、N-乙酰神经氨酸裂解酶(NAL)、N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)、尿苷激酶(UDK)、单磷酸尿苷激酶和多磷酸激酶3(PPK3)和无机二磷酸酶(PPA)；

其中尿苷激酶(UDK)将胞苷原位转移至5'-单磷酸胞苷(CMP)。优选地，该组酶共固定在固体支持物上。

换句话说，用于产生胞苷5′-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸(CMP-Neu5Ac，1)的方法

包括：

此外，本发明涉及一种产生胞苷5′-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸(CMP-Neu5Ac，1)的方法

包括：

A’)提供包含D-葡萄糖胺、乙酸盐、丙酮酸盐、多磷酸盐、胞苷和5'-三磷酸腺苷(ATP)的溶液，和

一组酶，所述酶包括N-乙酰-葡萄糖胺脱乙酰酶、N-酰基葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)、N-乙酰神经氨酸裂解酶(NAL)、N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)、尿苷激酶(UDK)、单磷酸尿苷激酶、多磷酸激酶3(PPK3)、无机二磷酸酶(PPA)、单结构域多磷酸激酶2(1DPPK2)和/或双结构域多磷酸激酶2(2DPPK2)；

B')混合所述溶液和所述一组酶，以及使所得溶液反应以产生胞苷5′-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸(CMP-Neu5Ac)，

包括：

在一些实施方案中，步骤B)中得到的溶液的pH值在5.0-10.0的范围内，优选5.5-9.5，更优选6.0-9.0，更优选6.5-9.0，最优选7.0-9.0。

优选地，所得溶液是pH值在5.0-10.0的范围内，优选5.5-9.5，更优选6.0-9.0，更优选6.5-9.0，最优选7.0-9.0的缓冲溶液。

缓冲溶液包括酸中的至少一种和碱中的至少一种。优选的磺酸中的至少一种选自柠檬酸、[三(羟甲基)甲氨基]丙磺酸(TAPS)、2-(双(2-羟乙基)氨基)乙酸(Bicine)、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸(Tricine)、3-[N-三(羟甲基)-甲氨基]-2-羟丙磺酸(TAPSO)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、2-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)-丙-2-基]氨基]乙磺酸(TES)、3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)、哌嗪-N,N′-双(2-乙磺酸(PIPES)、2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)。

优选碱中的至少一种选自金属氢氧化物、金属碳酸盐、金属碳酸氢盐、金属磷酸盐、金属二磷酸盐；更优选氢氧化钠、氢氧化钙、氢氧化钾、碳酸氢钠、碳酸钠、碳酸钙、碳酸钾、磷酸一钠、磷酸一钙、磷酸一钾、磷酸一镁、磷酸二钠、磷酸钙和磷酸钾。

适当浓度的Mg²⁺作为辅因子有助于单磷酸尿苷(UMP)激酶的完全激活。

在一些实施方案中，本发明的方法中得到的溶液进一步包含Mg²⁺，其浓度范围为0.1mM至500mM、0.1mM至200mM、优选10至100mM、更优选50至100mM、最优选20mM至50mM。优选地，Mg²⁺的来源是溴化镁、氯化镁、碳酸镁、磷酸一镁、磷酸镁、硫酸镁及其水合物。

任选地，所得溶液还包括还原剂，例如2-巯基乙醇和二硫苏糖醇(DTT)。

反应溶液的反应温度影响酶促级联反应的效率。因此，在本发明的方法中，步骤B)的最佳反应温度在20℃至65℃、优选25℃至60℃、仍优选25℃至55℃、更优选30℃至55℃、更优选35℃至55℃和最优选34℃至50℃的范围内。

在本发明中，N-乙酰-D-葡萄糖胺的浓度在1mM至5000mM的范围内，优选1mM至4000mM，更优选2mM至4500mM，更优选5mM至3000mM，最优选10mM至2000mM；和/或丙酮酸盐的浓度在1mM至5000mM的范围内，优选2mM至4000mM，更优选5mM至3000mM，更优选10mM至3000mM，最优选20mM至2000mM；和/或胞苷的浓度在0.1mM至2000mM的范围内，优选1mM至1000mM，更优选1mM至500mM，和/或5'-三磷酸腺苷(ATP)的浓度在0.001mM至100mM的范围内，优选0.01mM至100mM，更优选0.1mM至500mM，更优选0.1mM至100mM，最优选0.1mM至40mM：

包括：

其中所述尿苷激酶(UDK)将胞苷原位转移至单磷酸胞苷(CMP)；

其中N-乙酰-D-葡萄糖胺的浓度在1mM至5000mM的范围内；和/或丙酮酸盐的浓度在1mM至5000mM的范围内；和/或胞苷的浓度在0.1mM至2000mM的范围内；和/或5'-三磷酸腺苷(ATP)的浓度在0.001mM至100mM的范围内。优选地，N-乙酰-D-葡萄糖胺的浓度在1mM至2000mM的范围内；和/或丙酮酸盐的浓度在1mM至2000mM的范围内；和/或胞苷的浓度在0.1mM至2000mM的范围内；和/或5'-三磷酸腺苷(ATP)的浓度在0.01mM至100mM的范围内。更优选N-乙酰-D-葡萄糖胺的浓度在1mM至2000mM的范围内，和丙酮酸盐的浓度在1mM至2000mM的范围内，和胞苷的浓度在0.1mM至2000mM的范围内，和5'-三磷酸腺苷(ATP)的浓度在0.01mM至100mM的范围内。优选地，该组酶共固定在固体支持物上。

在本发明方法的一些实施方案中，N-乙酰-D-葡萄糖胺的浓度在1mM至500mM的范围内；和/或丙酮酸盐的浓度在1mM至500mM的范围内；和/或胞苷的浓度在1mM至500mM的范围内；和/或5'-三磷酸腺苷(ATP)的浓度在2mM至40mM的范围内。

包括：

其中所述尿苷激酶(UDK)将胞苷原位转移至单磷酸胞苷(CMP)；

其中N-乙酰-D-葡萄糖胺的浓度在1mM至500mM的范围内；和/或丙酮酸盐的浓度在1mM至500mM的范围内；和/或胞苷的浓度在1mM至500mM的范围内；和/或5'-三磷酸腺苷(ATP)的浓度在2mM至40mM的范围内。优选地，N-乙酰-D-葡萄糖胺的浓度在1mM至500mM的范围内，和丙酮酸盐的浓度在1mM至500mM的范围内，和胞苷的浓度在1mM至500mM的范围内，和5'-三磷酸腺苷(ATP)的浓度在2mM至40mM的范围内。优选地，该组酶共固定在固体支持物上。

优选地，在本发明的方法中，N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)和丙酮酸盐的比例在1:1至1:10000、1:1至1:5000、1:1至1:2000、1:1至1:1000或1:1至1:100的范围内。丙酮酸盐是指丙酮酸钠，或者，备选地使用丙酮酸。

更优选地，在本发明的方法中，N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)和丙酮酸盐的比例在1:1至1:20的范围内，优选1:1至1:15，更优选1:1至1:10，更优选1至1:5，最优选1:1至1:2。丙酮酸盐是指丙酮酸钠，或者，备选地使用丙酮酸。

优选地，在本发明的方法中，N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)和胞苷的比例在1:1至100:1的范围内，优选1:1至50:1，更优选1:1至30:1，更优选1:1至20:1，最优选1:1至15:1。

优选地，在本发明的方法中，D-葡萄糖胺(GlcN)和乙酸盐的比例在1:1至1:10000、1:1至1:5000、1至1:2000、1:1至1:1000或1:1至1:100的范围内。乙酸盐是指乙酸锂、乙酸钠、乙酸钾，或者，备选地使用乙酸。

优选地，在本发明的方法中，5'-三磷酸腺苷(ATP)和胞苷的比例在1:1至1:2000的范围内，优选1:2至1:1000，更优选1:4至1:1000，最优选1:10至1:500。

在本发明方法的优选实施方案中，

N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)和丙酮酸盐的比例在1:1至1:50的范围内；

N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)和胞苷的比例在1:1至100:1的范围内；

5'-三磷酸腺苷(ATP)和胞苷的比例在1:1至1:100的范围内；和

5'-三磷酸腺苷(ATP)和多磷酸盐的比例在1:1至1:200的范围内；和/或

N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)的浓度在20-3000mM的范围内；和

丙酮酸盐的浓度在20-3000mM的范围内；和

胞苷的浓度在1-50mM的范围内；和

5'-三磷酸腺苷(ATP)的浓度在0.001-10mM的范围内；和

多磷酸盐的浓度在1-30mM的范围内。

在本文公开的方法的另一个优选实施方案中，

N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)和丙酮酸盐的比例在1:1至1:20的范围内；

N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)和胞苷的比例在1:1至30:1的范围内；

5'-三磷酸腺苷(ATP)和胞苷的比例在1:1至1:20的范围内；和

5'-三磷酸腺苷(ATP)和多磷酸盐的比例在1:1至1:50的范围内；和/或

N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)的浓度在20-2000mM的范围内；和

丙酮酸盐的浓度在20-2000mM的范围内；和

胞苷浓度在1-20mM的范围内；和

5'-三磷酸腺苷(ATP)的浓度在0.01-10mM的范围内；和

多磷酸盐的浓度在1-20mM的范围内。

在本文公开的方法的另一个优选实施方案中，

N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)与丙酮酸盐的比例在1:1至1:2的范围内；

N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)与胞苷的比例在1:1至15:1的范围内；

5'-三磷酸腺苷(ATP)和胞苷的比例在1:1至1:10的范围内；和

5'-三磷酸腺苷(ATP)和多磷酸盐的比例在1:1至1:5的范围内；和/或

N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)的浓度在20-1000mM的范围内；和

丙酮酸盐的浓度在20-1000mM的范围内；和

胞苷的浓度在1-15mM的范围内；和

5'-三磷酸腺苷(ATP)的浓度在0.1-10mM的范围内；和

多磷酸盐的浓度在1-10mM的范围内。

在本发明的一个方面，本发明涉及产生胞苷5′-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸(CMP-Neu5Ac，1)的方法

包括：

其中所述尿苷激酶(UDK)将胞苷原位转移至单磷酸胞苷(CMP)；

其中N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)和丙酮酸盐的比例在1:1至1:50的范围内，N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)和胞苷的比例在1:1至100:1的范围内，5'-三磷酸腺苷(ATP)和胞苷的比例在1:1至1:100的范围内，和5'-三磷酸腺苷(ATP)和多磷酸盐的比例在1:1至1:200的范围内。优选地，N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)和丙酮酸盐的比例在1:1至1:20的范围内，N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)和胞苷的比例在1:1至30:1的范围内，5'-三磷酸腺苷(ATP)和胞苷的比例在1:1至1:20的范围内，和5'-三磷酸腺苷(ATP)和多磷酸盐的比例在1:1至1:50的范围内。更优选地，N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)和丙酮酸盐的比例在1:1至1:2的范围内，N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)和胞苷的比例在1:1至15:1的范围内，5'-三磷酸腺苷(ATP)和胞苷的比例在1:1至1:10的范围内，和5'-三磷酸腺苷(ATP)和多磷酸盐的比例在1:1至1:5的范围内。优选地，该组酶共固定在固体支持物上。

在本发明中，N-酰基葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)包含SEQ ID NO：1中所示的至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％的氨基酸序列。最优选的是，N-酰基葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)包含与SEQ ID NO：1中所示相同的氨基酸序列。

N-乙酰神经氨酸裂解酶(NAL)包含SEQ ID NO：2中所示的至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％的氨基酸序列。最优选的是，N-乙酰神经氨酸裂解酶(NAL)包含与SEQ ID NO：2中所示相同的氨基酸序列。

N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)获自微生物，包括灰仓鼠(Cricetulusgriseus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、亨氏热纤梭菌(Hungateiclostridiumthermocellum)、溶血曼海姆菌(Mannheimia haemolytica)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)、麦奇钩吻鲑(Oncorhynchus mykiss)、Pelophylax esculentus、鱼发光杆菌(Photobacterium leiognathi)、褐家鼠(Rattus norvegicus)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)和野猪(Sus scrofa)；小鼠；和虹鳟。优选地，N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶来源于脑膜炎奈瑟菌CSS。任选地，脑膜炎奈瑟菌CSS具有以下至少一种突变：Q104A、R165A、Q166A、N175A、Y179A、F192A和F193A。

因此，N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)包含SEQ ID NO：3中所示的至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％的氨基酸序列。最优选的是，N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)包含与SEQ ID NO：3中所示相同的氨基酸序列。

尿苷激酶(UDK)包含SEQ ID NO：4中所示的至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％的氨基酸序列。最优选的是，所述尿苷激酶(UDK)包含与SEQ ID NO：4中所示相同的氨基酸序列。

单磷酸尿苷激酶(URA6)包含SEQ ID NO：5中所示的至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％的氨基酸序列。最优选地，单磷酸尿苷激酶(URA6)包含与SEQ ID NO：5中所示相同的氨基酸序列。

多磷酸激酶3(PPK3)包含SEQ ID NO：6中所示的至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％的氨基酸序列。最优选地，多磷酸激酶3(PPK3)包含与SEQ ID NO：6中所示相同的氨基酸序列。

无机二磷酸酶(PPA)包含SEQ ID NO：7中所示的至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％的氨基酸序列。最优选地，无机二磷酸酶(PPA)包含与SEQ ID NO：7中所示相同的氨基酸序列。

双结构域多磷酸激酶2(2D-PPK2)包含SEQ ID NO：8中所示的至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％的氨基酸序列。最优选的是，双结构域多磷酸激酶2(2D-PPK2)包含与SEQ ID NO：8中所示相同的氨基酸序列。

单结构域多磷酸激酶2(1D-PPK2)包含SEQ ID NO：9中所示的至少80％，优选至少85％，优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少98％的氨基酸序列。最优选地，单结构域多磷酸激酶2(1D-PPK2)包含与SEQ ID NO：9中所示相同的氨基酸序列。

因此，本发明优选涉及产生胞苷5′-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸(CMP-Neu5Ac，1)的方法

包括：

其中所述尿苷激酶(UDK)将胞苷原位转移至单磷酸胞苷(CMP)；和

其中所述N-酰基葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)包含SEQ ID NO：1中所示的至少80％的氨基酸序列；

N-乙酰神经氨酸裂解酶(NAL)包含SEQ ID NO：2中所示的至少80％的氨基酸序列；

N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)包含SEQ ID NO：3中所示的至少80％的氨基酸序列；

尿苷激酶(UDK)包含SEQ ID NO：4中所示的至少80％的氨基酸序列；

单磷酸尿苷激酶(URA6)包含SEQ ID NO：5中所示的至少80％的氨基酸序列；和

多磷酸激酶3(PPK3)包含SEQ ID NO：6中所示的至少80％的氨基酸序列；

优选地，

其中N-酰基葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)包含SEQ ID NO：1中所示的至少85％的氨基酸序列；

N-乙酰神经氨酸裂解酶(NAL)包含SEQ ID NO：2中所示的至少85％的氨基酸序列；

N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)包含SEQ ID NO：3中所示的至少85％的氨基酸序列；

尿苷激酶(UDK)包含SEQ ID NO：4中所示的至少85％的氨基酸序列；

单磷酸尿苷激酶(URA6)包含SEQ ID NO：5中所示的至少85％的氨基酸序列；和

多磷酸激酶3(PPK3)包含SEQ ID NO：6中所示的至少85％的氨基酸序列；

还优选地，

其中N-酰基葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)包含SEQ ID NO：1中所示的至少90％的氨基酸序列；

N-乙酰神经氨酸裂解酶(NAL)包含SEQ ID NO：2中所示的至少90％的氨基酸序列；

N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)包含SEQ ID NO：3中所示的至少90％的氨基酸序列；

尿苷激酶(UDK)包含SEQ ID NO：4中所示的至少90％的氨基酸序列；

单磷酸尿苷激酶(URA6)包含SEQ ID NO：5中所示的至少90％的氨基酸序列；和

多磷酸激酶3(PPK3)包含SEQ ID NO：6中所示的至少90％的氨基酸序列；

更优选地，

其中N-酰基葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)包含SEQ ID NO：1中所示的至少95％的氨基酸序列；

N-乙酰神经氨酸裂解酶(NAL)包含SEQ ID NO：2中所示的至少95％的氨基酸序列；

N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)包含SEQ ID NO：3中所示的至少95％的氨基酸序列；

尿苷激酶(UDK)包含SEQ ID NO：4中所示的至少95％的氨基酸序列；

单磷酸尿苷激酶(URA6)包含SEQ ID NO：5中所示的至少95％的氨基酸序列；和

多磷酸激酶3(PPK3)包含SEQ ID NO：6中所示的至少95％的氨基酸序列；

更优选地，

其中N-酰基葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)包含SEQ ID NO：1中所示的至少98％的氨基酸序列；

N-乙酰神经氨酸裂解酶(NAL)包含SEQ ID NO：2中所示的至少98％的氨基酸序列；

N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)包含SEQ ID NO：3中所示的至少98％的氨基酸序列；

尿苷激酶(UDK)包含SEQ ID NO：4中所示的至少98％的氨基酸序列；

单磷酸尿苷激酶(URA6)包含SEQ ID NO：5中所示的至少98％的氨基酸序列；和

多磷酸激酶3(PPK3)包含SEQ ID NO：6中所示的至少98％的氨基酸序列。

在一个实施方案中，本发明涉及一种产生胞苷5′-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸(CMP-Neu5Ac，1)的方法

包括：

其中所述尿苷激酶(UDK)将胞苷原位转移至单磷酸胞苷(CMP)；和

其中N-酰基葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)包含SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列；

尿苷激酶(UDK)包含SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列；

单磷酸尿苷激酶(URA6)包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列；和

多磷酸激酶3(PPK3)包含SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列。优选地，该组酶共固定在固体支持物上。

在进一步应用无机二磷酸酶(PPA)的情况下，本发明涉及一种产生胞苷5′-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸(CMP-Neu5Ac，1)的方法

包括：

其中所述尿苷激酶(UDK)将胞苷原位转移至单磷酸胞苷(CMP)；

尿苷激酶(UDK)包含SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列；

单磷酸尿苷激酶(URA6)包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列；

多磷酸激酶3(PPK3)包含SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列；和

无机二磷酸酶(PPA)包含SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列。优选地，该组酶共固定在固体支持物上。

通过向本发明的方法的酶级联反应中加入1-结构域多磷酸激酶(1D-PPK)(其也催化ADP磷酸化为ATP)，优选1-结构域多磷酸激酶2(1D-PPK2)，可增强ATP的再生。此外，磷酸核苷例如ADP在水性介质中不稳定，倾向于快速水解。为了避免水解为AMP而损失ADP，可将催化AMP磷酸化为ADP的2-结构域多磷酸激酶(2D-PPK)优选2-结构域多磷酸激酶2(2D-PPK2)与1D-PPK一起添加或单独添加到本发明的酶级联反应中。

在进一步应用无机二磷酸酶(PPA)、单结构域多磷酸激酶2(1D-PPK2)和/或双结构域多磷酸激酶2(2DPPK2)的情况下，本发明涉及产生胞苷5′-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸(CMP-Neu5Ac，1)的方法

包括：

其中所述尿苷激酶(UDK)将胞苷原位转移至单磷酸胞苷(CMP)；

尿苷激酶(UDK)包含SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列；

单磷酸尿苷激酶(URA6)包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列；

多磷酸激酶3(PPK3)包含SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列；

无机二磷酸酶(PPA)包含SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列；

双结构域多磷酸激酶2(2DPPK2)包含SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列；和

单结构域多磷酸激酶2(1D-PPK2)包含SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列。优选地，该组酶共固定在固体支持物上。

优选地，用于产生胞苷5′-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸(CMP-Neu5Ac，1)的方法的反应时间在0.1至48小时的范围内，优选0.2至35小时，更优选0.5至30小时，最优选1至24小时。

优选地，在进行用于产生胞苷5′-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸(CMP-Neu5Ac，1)的方法的过程中，将所得反应溶液以10至5000rpm，优选50至2000rpm，更优选100至1000rpm，最优选200至500rpm搅拌。

优选地，将该组酶共固定在可重复使用的、机械稳定的固体支持物上，从而增加或保留每种酶的大部分活性。因此，在本发明的方法中，该组酶优选地循环使用。

任选地，在执行本文所述的方法之后，用还原剂例如DTT或2-巯基乙醇处理该组酶，以保持每种酶的活性。

在本发明的另一方面，用于产生胞苷5′-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸的方法包括另外的步骤C)：

C)通过离子交换色谱或纳滤分离步骤B)后产生的胞苷5′-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸(CMP-Neu5Ac)。

优选地，使用阴离子交换树脂(例如Dowex 1×8)的甲酸盐形式进行离子交换色谱。用碳酸氢盐(例如碳酸氢铵)水溶液梯度洗脱色谱柱。碳酸氢铵的使用阻止了极不耐酸的CMP-Neu5Ac的水解，以及将其作为铵盐提供。过量的碳酸氢铵很容易使其通过凝胶过滤柱(例如Bio-Gel P-2)来去除。

包括：

C)通过离子交换色谱分离步骤B)后产生的胞苷5′-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸(CMP-Neu5Ac)；

任选地，用于产生胞苷5′-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸的方法包括另外的步骤C’)：

C')通过冷冻干燥法来干燥步骤C)后获得的分离的胞苷5′-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸(CMP-Neu5Ac)。

包括：

C')通过冷冻干燥法来干燥步骤C)后获得的分离的胞苷5′-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸(CMP-Neu5Ac)，

在步骤C)中还分离了过量的起始物料，并将其在下一个反应循环中直接重复用于反应。优选地，N-乙酰-D-葡萄糖胺和/或胞苷可被分离和在下一个反应循环中重复使用。

可替代地，N-酰基-葡萄糖胺可由底物D-葡萄糖胺、乙酸盐原位形成。在这种情况下，本发明涉及一种产生胞苷5′-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸(CMP-Neu5Ac，1)的方法

包括：

C)通过离子交换色谱分离步骤B')后产生的胞苷5′-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸(CMP-Neu5Ac)；

任选地，产生胞苷5′-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸的方法包括：

用于产生胞苷5′-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸(CMP-Neu5Ac)的本发明的方法优选用一组共固定的酶进行。因此，本发明还涉及一组酶，所述酶包括N-酰基葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)、N-乙酰神经氨酸裂解酶(NAL)、N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)、尿苷激酶(UDK)、单磷酸尿苷激酶和多磷酸激酶3(PPK3)，其中该组酶优选共固定在固体支持物(更优选用环氧基团官能化的聚合物)上。

优选地，所述一组酶包括：

N-酰基葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)包含SEQ ID NO：1中所示的至少80％的氨基酸序列；

多磷酸激酶3(PPK3)包含SEQ ID NO：6中所示的至少80％的氨基酸序列，

其中该组酶共固定在固体支持物(优选用环氧基团官能化的聚合物)上。

更优选地，所述一组酶包括：

尿苷激酶(UDK)包含SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列；

单磷酸尿苷激酶(URA6)包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列；

多磷酸激酶3(PPK3)包含SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列。

任选地，本发明的一组酶还包括无机二磷酸酶(PPA)。在一些实施方案中，所述一组酶包括N-酰基葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)、N-乙酰神经氨酸裂解酶(NAL)、N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)、尿苷激酶(UDK)、单磷酸尿苷激酶和多磷酸激酶3(PPK3)以及无机二磷酸酶(PPA)，其中所述一组酶共固定在固体支持物(优选用环氧基团官能化的聚合物)上。

优选地，所述一组酶包括：

单磷酸尿苷激酶(URA6)包含SEQ ID NO：5中所示的至少80％的氨基酸序列；

多磷酸激酶3(PPK3)包含SEQ ID NO：6中所示的至少80％的氨基酸序列；和

无机二磷酸酶(PPA)包含SEQ ID NO：7中所示的至少80％的氨基酸序列。

优选地，其中所述N-酰基葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)包含SEQ ID NO：1中所示的至少85％的氨基酸序列；

单磷酸尿苷激酶(URA6)包含SEQ ID NO：5中所示的至少85％的氨基酸序列；

多磷酸激酶3(PPK3)包含SEQ ID NO：6中所示的至少85％的氨基酸序列；和

无机二磷酸酶(PPA)包含SEQ ID NO：7中所示的至少85％的氨基酸序列，

还优选地，其中所述N-酰基葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)包含SEQ ID NO：1中所示的至少90％的氨基酸序列；

单磷酸尿苷激酶(URA6)包含SEQ ID NO：5中所示的至少90％的氨基酸序列；

多磷酸激酶3(PPK3)包含SEQ ID NO：6中所示的至少90％的氨基酸序列；和

无机二磷酸酶(PPA)包含SEQ ID NO：7中所示的至少90％的氨基酸序列；

更优选地，其中N-酰基葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)包含SEQ ID NO：1中所示的至少95％的氨基酸序列；

单磷酸尿苷激酶(URA6)包含SEQ ID NO：5中所示的至少95％的氨基酸序列；

所述多磷酸激酶3(PPK3)包含SEQ ID NO：6中所示的至少95％的氨基酸序列；和

无机二磷酸酶(PPA)包含SEQ ID NO：7中所示的至少95％的氨基酸序列；

更优选地，其中N-酰基葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)包含SEQ ID NO：1中所示的至少98％的氨基酸序列；

单磷酸尿苷激酶(URA6)包含SEQ ID NO：5中所示的至少98％的氨基酸序列；

所述多磷酸激酶3(PPK3)包含SEQ ID NO：6中所示的至少98％的氨基酸序列；和

无机二磷酸酶(PPA)包含SEQ ID NO：7中所示的至少98％的氨基酸序列。

最优选地，所述一组酶包括：

尿苷激酶(UDK)包含SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列；

单磷酸尿苷激酶(URA6)包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列；

多磷酸激酶3(PPK3)包含SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列；和

无机二磷酸酶(PPA)包含SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列。

任选地，本发明的一组酶还包括无机二磷酸酶(PPA)、单结构域多磷酸激酶2(1D-PPK2)和/或双结构域多磷酸激酶2(2D-PPK2)。在一些实施方案中，所述一组酶包括N-酰基葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)、N-乙酰神经氨酸裂解酶(NAL)、N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)、尿苷激酶(UDK)、单磷酸尿苷激酶和多磷酸激酶3(PPK3)、无机二磷酸酶(PPA)、单结构域多磷酸激酶2(1D-PPK2)和/或双结构域多磷酸激酶2(2D-PPK2)，其中所述一组酶共固定在固体支持物(优选用环氧基团官能化的聚合物)上。

优选地，所述一组酶包括：

所述多磷酸激酶3(PPK3)包含SEQ ID NO：6中所示的至少80％的氨基酸序列；

无机二磷酸酶(PPA)包含SEQ ID NO：7中所示的至少80％的氨基酸序列；

双结构域多磷酸激酶2(2DPPK2)包含SEQ ID NO：8中所示的至少80％的氨基酸序列。

单结构域多磷酸激酶2(1D-PPK2)包含SEQ ID NO：9中所示的至少80％的氨基酸序列，

优选地，所述一组酶包括：

N-酰基葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)包含SEQ ID NO：1中所示的至少85％的氨基酸序列；

无机二磷酸酶(PPA)包含SEQ ID NO：7中所示的至少85％的氨基酸序列；

双结构域多磷酸激酶2(2DPPK2)包含SEQ ID NO：8中所示的至少85％的氨基酸序列。

单结构域多磷酸激酶2(1D-PPK2)包含SEQ ID NO：9中所示的至少85％的氨基酸序列，

还优选地，所述一组酶包括：

N-酰基葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)包含SEQ ID NO：1中所示的至少90％的氨基酸序列；

双结构域多磷酸激酶2(2DPPK2)包含SEQ ID NO：8中所示的至少90％的氨基酸序列。

单结构域多磷酸激酶2(1D-PPK2)包含SEQ ID NO：9中所示的至少90％的氨基酸序列，

更优选地，所述一组酶包括：

N-酰基葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)包含SEQ ID NO：1中所示的至少95％的氨基酸序列；

双结构域多磷酸激酶2(2DPPK2)包含SEQ ID NO：8中所示的至少95％的氨基酸序列。

单结构域多磷酸激酶2(1D-PPK2)包含SEQ ID NO：9中所示的至少95％的氨基酸序列，

其中该组酶共固定在固体支持物(优选用环氧基团官能化的聚合物)上，

更优选地，所述一组酶包括：

N-酰基葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)包含SEQ ID NO：1中所示的至少98％的氨基酸序列；

多磷酸激酶3(PPK3)包含SEQ ID NO：6中所示的至少98％的氨基酸序列；

无机二磷酸酶(PPA)包含SEQ ID NO：7中所示的至少98％的氨基酸序列；

双结构域多磷酸激酶2(2DPPK2)包含SEQ ID NO：8中所示的至少98％的氨基酸序列。

单结构域多磷酸激酶2(1D-PPK2)包含SEQ ID NO：9中所示的至少98％的氨基酸序列，

最优选地，所述一组酶包括：

尿苷激酶(UDK)包含SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列；

单磷酸尿苷激酶(URA6)包含SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列；

多磷酸激酶3(PPK3)包含SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列；和

无机二磷酸酶(PPA)包含SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列。

双结构域多磷酸激酶2(2DPPK2)包含SEQ ID NO：8中所示的氨基酸序列。

单结构域多磷酸激酶2(1D-PPK2)包含SEQ ID NO：9中所示的氨基酸序列，

任选地，如上所述的任何一组酶还包含N-乙酰-葡萄糖胺脱乙酰酶。

然后将酶固定在固体支持物上，使其保留其活性、底物特异性、立体选择性和/或其他性质。合适的固体支持物是例如珠子、整块材料、球体、粒子、粒子床、纤维垫、颗粒、凝胶、膜、中空纤维膜、混合基质膜、表面或其他固相材料。

令人惊讶的是，发现与未固定的或单独固定的酶相比，一组酶的共固定导致产生胞苷5’-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸(CMP-Neu5Ac)的生产率更高。因此，优选地，本文所述的本发明的方法中使用的酶共固定在固体支持物上。

酶固定的方法在本领域中是众所周知的。酶可非共价或共价结合，例如吸附、共价结合、离子结合、金属结合、交联或结晶。用于将酶缀合和固定到固体支持物(例如树脂、膜、珠子、玻璃等)上的各种方法在本领域中是众所周知的，并且描述于例如：Yi等人,ProcessBiochemistry 2007,42,895；Martin等人,Applied Microbiology and Biotechnology2007,76,843；Koszelewski等人,Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,2010,63,39；Truppo等人,Org.Process Res.Dev.,2011,15,1033；Hermanson,G.T.,Bioconjugate Techniques,第2版,Academic Press(2008)；Mateo等人,BiotechnologyProgress,2002,18,629；和Bioconjugation Protocols:Strategies and Methods,Methods in Molecular Biology,C.M.Niemeyer ed.,Humana Press(2004)。

在本文所述的本发明的方法中使用的酶，即N-酰基葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)、N-乙酰神经氨酸裂解酶(NAL)、N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)、尿苷激酶(UDK)、单磷酸尿苷激酶和多磷酸激酶3(PPK3)、无机二磷酸酶(PPA)、1-结构域多磷酸激酶2(1DPPK2)、2-结构域多磷酸激酶2(2DPPK2)和焦磷酸酶是本领域技术人员熟知的，并且可以通过本领域技术人员熟知的任何方法获得。

特别地，酶可在包括细菌培养物(例如大肠杆菌)、病毒和噬菌体培养物以及真核细胞培养物的微生物培养物中过表达、从其分离或通过重组方法从其制备。本文描述的本发明的方法不限于来自实验部分中描述的来源的酶。因此，本发明的方法可以使用利用通用蛋白表达或分离技术从各种来源获得的上述酶来执行。此外，本领域技术人员熟知将酶的制备适应于使用该方法的特定应用。例如，上述酶可通过使用非动物源性细菌生长培养基(例如包含来自大豆的胰蛋白胨的Luria-Bertani肉汤)在大肠杆菌中表达。

通过细胞匀浆或细胞裂解获得的含酶溶液(其通常经过离心和过滤以去除细胞碎片)可直接用于将酶固定在固体支持物上。因此，无需进一步的纯化步骤或分离步骤，并且粗细胞裂解物或细胞匀浆可用于将酶固定在固体支持物上，使其保持其活性、底物特异性、立体选择性和/或其他特性。

用于固定本发明的方法中使用的酶的固体支持物包括但不限于珠子、整块材料、球体、粒子、粒子床、纤维垫、颗粒、凝胶、膜、中空纤维膜、混合基质膜或表面。优选地，固体支持物具有珠子的形式。

特别地，固体支持物由珠子或树脂组成，所述珠子或树脂包含具有环氧化物官能团、具有氨基环氧化物官能团、具有乙二胺官能团、具有氨基C2官能团、具有氨基C6官能团、具有阴离子/氨基C6间隔官能团的聚合物。优选地，固体支持物由孔径为

至

的多孔珠子组成。

特别优选用环氧化物官能团官能化的固体支持物。进一步优选的固体支持物包括但不限于具有乙二胺官能团、具有环氧官能团并进一步用疏水基团(例如丁基、辛基、甲基、苯基)官能化，例如具有环氧化物官能团和丁基官能团、具有氨基C2间隔官能团、具有氨基C6间隔官能团或其他氨基间隔基例如氨基C3间隔基、氨基C4间隔基、氨基C5间隔基、氨基C7间隔基、具有环氧官能团、具有阴离子/氨基C6间隔官能团、具有阴离子/叔胺官能团、阴离子/季胺官能团、具有阳离子/磺酸官能团、具有羧酸酯官能团、具有苯基官能团、具有十八烷基官能团、具有苯乙烯/甲基官能团的固体支持物、大孔树脂或珠子。固体支持物可由聚合物材料、非聚合物材料(例如硅胶)组成。固体支持物可由聚合物材料组成，包括但不限于聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸、丙烯酸聚合物、聚苯乙烯、苯乙烯、苯乙烯/甲基丙烯酸酯及其混合物。

可用于固定本发明的方法中使用的酶的固体支持物的实例包括但不限于珠子或树脂，其包含具有环氧化物官能团的聚甲基丙烯酸酯、具有氨基环氧化物官能团的聚甲基丙烯酸酯、具有乙二胺官能团的聚甲基丙烯酸酯、具有环氧化物官能团并进一步用疏水基团(例如丁基、辛基、甲基、苯基)官能化的聚甲基丙烯酸酯、例如具有环氧化物官能团和丁基官能团的聚甲基丙烯酸酯、具有氨基C2间隔官能团的聚甲基丙烯酸酯、具有氨基C6间隔官能团的聚甲基丙烯酸酯、具有环氧官能团的聚丙烯酸、具有环氧官能团的丙烯酸聚合物、具有阴离子/氨基C6间隔官能团的聚丙烯酸、具有阴离子/叔胺官能团的聚丙烯酸、具有阴离子/季胺官能团的聚苯乙烯、具有阳离子/磺酸官能团的聚苯乙烯、具有羧酸酯官能团的聚丙烯酸、具有苯基官能团的聚苯乙烯、具有十八烷基官能团的聚甲基丙烯酸酯、具有苯乙烯/甲基官能团的聚苯乙烯、具有Ni-NTA官能团的磁性二氧化硅颗粒或具有磁铁矿核心和具有Ni-NTA官能团的右旋糖酐壳的磁性纳米颗粒、大孔苯乙烯或苯乙烯/甲基丙烯酸酯的大孔树脂或珠子。虽然原则上本领域已知的任何合适的固体支持物可用于本发明的方法，但由于上述原因，不优选Ni琼脂糖珠子或Ni NTA琼脂糖树脂。可用于固定本发明的方法中使用的酶的示例性固体支持物包括但不限于Sepabeads/ReliZyme(Resindion):EC-EP，包括EC-EP/S和EC-EP/M，EP403/M，EP403/S HFA403M，HFA403S，HG403，EP400/SS EC-HG，EC-HFA，EC-EA/M，EA403/S和EC-HA包括EC-HA/S和EC-HA/M；Immobeads(ChiralVision)Imm150P，IB-COV1，IB-COV2，IB-COV3，IB-ANI1，IB-ANI2，IB-ANI3，IB-ANI4，IB-CAT1，IB-ADS1，IB-ADS2，IB-ADS3和IB-ADS4，IB-CAT-1，IB-ANI-1，IB-ANI-2，IB-ANI-3，IB-ANI-4；Eupergit(

GmbH&Co.KG)和磁性颗粒(micromod GmbH):Nano-mag，Sicastar-6和Sicastar-1.5，酶固定树脂Lifetech^TM(Purolite):环氧丙烯酸酯:ECR8215，ECR8215F，ECR8215M，ECR8206，ECR8206F，ECR8206M，ECR8204，ECR8204F，ECR8204M，ECR8209，ECR8209F，ECR8209M，ECR8285，ECR8285F，ECR8285M，氨基C2或C6甲基丙烯酸酯:ECR8305，ECR8305F，ECR8305M，ECR8309，ECR8309F，ECR8309M，ECR8315，ECR8315F，ECR8315M，ECR8404，ECR8404F，ECR8404M，ECT8409，ECT8409F，ECT8409M，ECR8415，ECR8415F，ECR8415M，大孔树脂ECR1090，ECR1091，ECR1091M，ECR1061，ECR1030，ECR1030F，ECR8806F；离子树脂ECR1504，ECR1508，ECR1604，ECR1640和磁性颗粒(micromod GmbH):Nano-mag-D和Sicastar-M-CT。

对于用于产生CMP-Neu5Ac的珠子或树脂的重复使用和/或再循环，优选导致在其上固定酶的机械稳定的珠子或树脂的固体支持材料，并且对于产生CMP-Neu5Ac的方法的连续工艺，其是更优选的。机械稳定的固体支持物的特征在于耐磨损、机械应力，并且适合于大量循环，例如至少10个、更优选至少12个、更优选至少14个、更优选至少16个、更优选至少18个、最优选至少20个循环。可以显示，通过共价结合固体支持物来固定酶提供机械稳定的珠子或树脂，已证明其特别适合于用于产生CMP-Neu5Ac的具有固定的酶的树脂或珠子的重复使用和/或再循环。

令人惊讶的是，已经发现使用允许待固定的酶的共价结合的包含具有环氧化物官能团的聚合物(例如但不限于具有环氧化物官能团的聚甲基丙烯酸酯、具有氨基环氧化物官能团的聚甲基丙烯酸酯、具有乙二胺官能团的聚甲基丙烯酸酯、具有环氧化物官能团和丁基官能团的聚甲基丙烯酸酯、具有环氧官能团的聚丙烯酸、具有环氧官能团的丙烯酸聚合物)的珠子或树脂，可获得机械稳健的树脂或磁珠子。

因此，对于来自粗细胞裂解物或粗细胞匀浆的一组酶的共固定，和对于保留共固定的所有酶的大部分活性或增加其活性，以及对于用于产生CMP-Neu5Ac的珠子或树脂的重复使用和/或再循环，以及对于用于产生CMP-Neu5Ac的方法的连续工艺，在其上固定酶的珠子或树脂形式的可重复使用的、机械稳定的固体支持物是优选的。固体支持物的特征在于(除其他外)耐磨损、机械应力，并且适合于大量循环，例如至少10个、更优选至少12个、更优选至少14个、更优选至少16个、更优选至少18个、最优选至少20个循环。可以显示，通过共价结合固体支持物来固定酶提供机械稳定的珠子或树脂，已证明其特别适合于用于产生CMP-Neu5Ac的具有固定的酶的树脂或珠子的重复使用和/或再循环，其允许来自粗细胞裂解物的一组酶的共固定，并保留共固定的所有酶的大部分活性或增加其活性。令人惊讶的是，已经发现使用允许待固定的酶的共价结合的包含环氧化物官能团、氨基环氧化物官能团、乙二胺官能团或环氧化物官能团和疏水性基团(例如丁基、辛基、甲基、苯基、丁基官能团)的珠子或树脂，可以获得稳健的固体树脂或珠子。

环氧活化树脂或磁珠子允许酶与树脂或珠子之间的多点共价结合。优选地，树脂骨架由具有0.01nm至10000nm或

至

的孔隙率的甲基丙烯酸酯组成。在优选实施方案中，环氧官能化树脂或珠子(例如环氧甲基丙烯酸酯树脂或珠子)的孔隙率可以为30nm至60nm。在优选实施方案中，环氧甲基丙烯酸酯树脂或珠子的孔隙率可以为40nm至60nm。在优选实施方案中，环氧官能化树脂或珠子例如环氧甲基丙烯酸酯树脂或珠子的孔隙率可以为50nm至60nm。在优选实施方案中，环氧官能化树脂或珠子例如环氧甲基丙烯酸酯树脂或珠子的孔隙率可以为60nm至120nm。在优选实施方案中，环氧官能化树脂或珠子例如环氧甲基丙烯酸酯树脂或珠子的孔隙率可以为120nm至180nm。环氧官能化树脂或珠子例如环氧甲基丙烯酸酯树脂或珠子可与不同蛋白质基团(例如氨基、硫醇、酚)形成非常稳定的共价键，优选在非常温和的pH和温度条件下。树脂优选地是机械稳定的，并且具有固定的酶的树脂可以优选地用于搅拌罐或柱反应器中。

氨基树脂，例如氨基C2官能化树脂或氨基C6官能化树脂，或其他氨基树脂，例如氨基C3、氨基C4、氨基C5、氨基C7等，例如但不限于氨基C2甲基丙烯酸酯树脂或氨基C6甲基丙烯酸酯树脂，可以例如通过戊二醛预活化，然后用于酶的共价固定。醛基团与酶的氨基的反应形成希夫碱，其导致多点共价结合。还可以通过与硼氢化合物还原来实现连接。因此，通过交联步骤，可逆的固定可变得不可逆：酶可吸附到载体上，然后通过使用例如戊二醛交联。交联的酶或交联的酶可以像网一样覆盖载体。氨基官能化树脂例如氨基C2甲基丙烯酸酯树脂或氨基C6甲基丙烯酸酯树脂优选具有30nm至180nm或

至

的范围内的孔隙率。在优选实施方案中，氨基官能化树脂例如氨基C2甲基丙烯酸酯树脂或珠子或氨基C6甲基丙烯酸酯树脂或珠子的孔隙率可以为30nm至60nm。在优选实施方案中，氨基官能化树脂例如氨基C2甲基丙烯酸酯树脂或珠子或氨基C6甲基丙烯酸酯树脂或珠子的孔隙率可以为60nm至120nm。在优选实施方案中，氨基官能化树脂例如氨基C2甲基丙烯酸酯树脂或珠子或氨基C6甲基丙烯酸酯树脂或珠子的孔隙率可以为120nm至180nm。

不可逆固定的另一种方法是羟基官能团的活化，例如对于1,2-二醇官能化树脂或珠子。

因此，特别优选的是包含具有环氧化物官能团的聚甲基丙烯酸酯和具有氨基环氧化物官能团的聚甲基丙烯酸酯的珠子或树脂。优选地，包含具有环氧化物官能团的聚甲基丙烯酸酯的珠子或树脂是亲水性的。共价酶固定是特别优选的。在优选实施方案中，珠子或树脂不用非极性基团例如丁基或十八烷基官能化。在优选实施方案中，树脂或珠子是亲水性的。

优选地，甲基丙烯酸酯聚合物具有珠子的形式。优选地，珠子的粒径在150μm-300μm的范围内。优选地，甲基丙烯酸酯聚合物是多孔的，其孔径为

在一个实施方案中，甲基丙烯酸酯聚合物具有低孔隙率，其孔径为

在一个实施方案中，甲基丙烯酸酯聚合物具有高孔隙率，其孔径为

在一个实施方案中，甲基丙烯酸酯聚合物进一步用丁基官能化。在一个实施方案中，甲基丙烯酸酯聚合物进一步用疏水基团例如丁基、甲基、苯基、辛基官能化。

优选地，固体支持物由选自以下的树脂或珠子组成：sepabeads(Resindion)：EC-EP、EP403/M、EP403/S、HFA403、EA403、HA403、EC-EA/M和EC-HA；immobeads(ChiralVision)IB-COV1、IB-COV2、IB-COV3、IB-ANI1、IB-ANI1、IB-CAT1、

(

GmbH&Co.KG)、酶固定的树脂(Purolite)：环氧丙烯酸酯：ECR8215，ECR8215F，ECR8215M，ECR8206，ECR8206F，ECR8206M，ECR8204，ECR8204F，ECR8204M，ECR8209，ECR8209F，ECR8209M，ECR8285，ECR8285F，ECR8285M，氨基C2或C6甲基丙烯酸酯：ECR8305，ECR8305F，ECR8305M，ECR8309，ECR8309F，ECR8309M，ECR8315，ECR8315F，ECR8315M，ECR8404，ECR8404F，ECR8404M，ECT8409，ECT8409F，ECT8409M，ECR8415，ECR8415F，ECR8415M。

优选地，固体支持物由选自以下的树脂或珠子组成：sepabeads(Resindion)：EC-EP、EP403、EP403/M、EP403/S、EC-HFA、HFA403、HFA403/M、HFA 403/S、immobeads(ChiralVision)IB-COV2、IB-COV3、(Purolite)ECR8215、ECR8215F、ECR8215M、ECR8204F、ECR8204M、ECR8204、ECR8209F、ECR8209M、ECR8209；

(

GmbH&Co.KG)。

包括：

其中，该组酶共固定在固体支持物上，固体支持物由选自以下的树脂或珠子组成：sepabeads(Resindion)：EC-EP、EP403、EP403/M、EP403/S、EC-HFA、HFA403、HFA403/M、HFA403/S、immobeads(ChiralVision)IB-COV2、IB-COV3、(Purolite)ECR8215、ECR8215F、ECR8215M、ECR8204F、ECR8204M、ECR8204、ECR8209F、ECR8209M、ECR8209；

并且尿苷激酶(UDK)将胞苷原位转移至单磷酸胞苷(CMP)。

因此，本发明还涉及一种产生胞苷5′-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸(CMP-Neu5Ac，1)的方法

包括：

其中，该组酶共固定在固体支持物上；该组酶共固定在固体支持物上，固体支持物由选自以下的树脂或珠子组成：sepabeads(Resindion)：EC-EP、EP403、EP403/M、EP403/S、EC-HFA、HFA403、HFA403/M、HFA 403/S、immobeads(ChiralVision)IB-COV2、IB-COV3、(Purolite)ECR8215、ECR8215F、ECR8215M、ECR8204F、ECR8204M、ECR8204、ECR8209F、ECR8209M、ECR8209；Eupergit(

GmbH&Co.KG)；并且尿苷激酶(UDK)将胞苷原位转移至单磷酸胞苷(CMP)。

包括：

优选地，酶共固定在用环氧基团官能化的聚合物上，其可在反应器中在多次运行或循环中使用。优选地，共固定在固体支持物上的酶可在至少3个循环中使用，更优选在至少4个循环中使用，更优选在至少5个循环中使用，更优选在至少6个循环中使用，更优选在至少7个循环中使用，更优选在至少8个循环中使用，更优选在至少9个循环中使用，更优选在至少10个循环中使用，更优选在至少12个循环中使用，更优选在至少14个循环中使用，更优选在至少16个循环中使用，更优选在至少18个循环中使用，更优选在至少20个循环中使用，更优选在至少25个循环中使用，更优选在至少25个循环中使用，更优选在至少30个循环中使用，并且最优选在至少50个循环中使用。优选地，酶共固定在固体支持物上，并且可用于至少3-10，优选5-12，更优选7-14，更优选9-16，甚至更优选至少10-20个运行或循环。

在优选实施方案中，具有共固定的一组酶的环氧珠子或树脂通常允许在超过3个循环，优选地超过5个循环，优选地超过10个循环，优选地甚至超过20个循环中的CMP-Neu5Ac合成。在如此大量的循环中的CMP-Neu5Ac的合成是该工艺的显著改进，并且在现有技术中之前未报告。

本发明的另一方面涉及一组酶，所述酶包括N-酰基葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)、N-乙酰神经氨酸裂解酶(NAL)、N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)、尿苷激酶(UDK)、单磷酸尿苷激酶和多磷酸激酶3(PPK3)，其中所述一组酶共固定在固体支持物上，固体支持物由选自以下的树脂或珠子组成：sepabeads(Resindion)：EC-EP、EP403、EP403/M、EP403/S、EC-HFA、HFA403、HFA403/M、HFA 403/S、immobeads(ChiralVision)IB-COV2、IB-COV3、(Purolite)ECR8215、ECR8215F、ECR8215M、ECR8204F、ECR8204M、ECR8204、ECR8209F、ECR8209M、ECR8209；Eupergit(

本发明的另一方面还涉及一组酶，其包含N-酰基葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)、N-乙酰神经氨酸裂解酶(NAL)、N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)、尿苷激酶(UDK)、单磷酸尿苷激酶和多磷酸激酶3(PPK3)、无机二磷酸酶(PPA)，其中该组酶共固定在固体支持物上，固体支持物由选自以下的树脂或珠子组成：sepabeads(Resindion)：EC-EP、EP403、EP403/M、EP403/S、EC-HFA、HFA403、HFA403/M、HFA 403/S、immobeads(ChiralVision)IB-COV2、IB-COV3、(Purolite)ECR8215、ECR8215F、ECR8215M、ECR8204F、ECR8204M、ECR8204、ECR8209F、ECR8209M、ECR8209；Eupergit(

本发明的另一方面还涉及一组酶，所述酶包括N-酰基葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)、N-乙酰神经氨酸裂解酶(NAL)、N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)、尿苷激酶(UDK)、单磷酸尿苷激酶和多磷酸激酶3(PPK3)、无机二磷酸酶(PPA)、单结构域多磷酸激酶2(1DPPK2)和/或双结构域多磷酸激酶2(2DPPK2)，其中所述一组酶共固定在固体支持物上，固体支持物由选自以下的树脂或珠子组成：sepabeads(Resindion)：EC-EP、EP403、EP403/M、EP403/S、EC-HFA、HFA403、HFA403/M、HFA 403/S、immobeads(ChiralVision)IB-COV2、IB-COV3、(Purolite)ECR8215、ECR8215F、ECR8215M、ECR8204F、ECR8204M、ECR8204、ECR8209F、ECR8209M、ECR8209；Eupergit(

本发明还涉及一种用于产生Neu5酰化即唾液酸化生物分子的方法，所述方法包括：

i)执行如上所述的方法以获得CMP-Neu5Ac，

唾液酸转移酶(E2.4.99)属于糖基转移酶家族29(CAZY GT_29)，其由具有多种已知活性的酶组成。大约有20种不同的唾液酸转移酶，其可根据它们作用于的受体结构和它们形成的糖连接类型进行区分。例如，一组唾液酸转移酶以α-2,3连接将唾液酸添加至半乳糖，而其他唾液酸转移酶以α-2,6连接将唾液酸添加至半乳糖(Gal)或N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。一种特殊类型的唾液酸转移酶以α-2,8连接将唾液酸添加至其他唾液酸单元，形成被称为聚唾液酸的结构。与其他糖基转移酶一样，唾液酸转移酶的表达在细胞分化和肿瘤转化过程中发生显著的修饰；在某些情况下，这种变化诱导表型改变。

因此，本发明还涉及一种产生Neu5酰化即唾液酸化生物分子的方法，所述方法包括：

i)执行如上所述的方法以获得CMP-Neu5Ac，

其中所述生物分子是糖、糖肽、糖蛋白、糖脂、聚糖、肽、蛋白质、抗体、抗体药物缀合物、碳水化合物缀合疫苗、病毒、病毒样颗粒、病毒疫苗或类黄酮，并且唾液酸转移酶选自：β-半乳糖酰胺α-2,6-唾液酸转移酶(EC2.4.99.1)、α-N-乙酰氨基半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶(EC2.4.99.3)、β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶(EC2.4.99.4)、N-乙酰乳糖铵α-2,3-唾液酸转移酶(EC2.4.99.6)、α-N-乙酰-神经氨酸苷α-2,8-唾液酸转移酶(EC2.4.99.8)和乳糖神经酰胺α-2,3-唾液酸转移酶(EC2.4.99.9)。

此外，在一些实施方案中，生物分子包含半乳糖苷(Gal)、氨基半乳糖苷(GalN)、N-乙酰氨基半乳糖苷(GalNAc)、神经氨酸苷、N-乙酰神经氨酸苷(Neu5Ac)、N-羟乙酰神经氨酸苷、3-脱氧-D-甘油-D-半乳糖基-2-尤罗索尼克酸(KDN)和N-乙酰氨基乳糖苷(Gal-β-1-3-GlcNAc)部分中的任一个作为末端基团。

更优选地，生物分子是糖肽、糖蛋白或抗肿瘤疫苗，其包含T抗原(Gal-β-1-3-GalNAc-α-1-O-)或Tn-抗原(GalNAc-α-1-O-)；或包含Gal-β-1-4-GlcNAc-β-1-O-的糖脂。

i)执行如上所述的方法以获得CMP-Neu5Ac，

其中所述生物分子是糖、糖肽、糖蛋白、糖脂、聚糖、肽、蛋白质、抗体、抗体药物缀合物、碳水化合物缀合疫苗、病毒、病毒样颗粒、病毒疫苗或类黄酮，并且该生物分子含有半乳糖苷(Gal)、氨基半乳糖苷(GalN)、N-乙酰氨基半乳糖苷(GalNAc)、神经氨酸苷、N-乙酰神经氨酸苷(Neu5Ac)、N-羟乙酰神经氨酸苷、3-脱氧-D-甘油-D-半乳糖基-2-尤罗索尼克酸(KDN)和N-乙酰氨基乳糖苷(Gal-β-1-3-GlcNAc)部分中的任一个作为末端基团。

执行如上所述的方法以获得CMP-Neu5Ac的步骤i)是指用于产生胞苷5′-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸(CMP-Neu5Ac，1)的所有上述方法

i)执行如上所述的方法以获得CMP-Neu5Ac，包括：

其中所述尿苷激酶(UDK)将胞苷原位转移至单磷酸胞苷(CMP)；和

其中所述生物分子是糖、糖肽、糖蛋白、糖脂、聚糖、肽、蛋白质、抗体、抗体药物缀合物、碳水化合物缀合疫苗、病毒、病毒样颗粒、病毒疫苗或类黄酮。优选地，该组酶共固定在固体支持物上。

ii)执行如上所述的方法以获得CMP-Neu5Ac，包括：

其中所述尿苷激酶(UDK)将胞苷原位转移至单磷酸胞苷(CMP)；

iii)将步骤i)后获得的CMP-Neu5Ac与生物分子反应，其通过在唾液酸转移酶的存在下去除CMP基团而与生物分子的羟基形成O-糖苷键，

优选地，本发明还涉及用于产生Neu5酰化即唾液酸化生物分子的方法，所述方法包括：

i)执行如上所述的方法以获得CMP-Neu5Ac，包括：

其中所述尿苷激酶(UDK)将胞苷原位转移至单磷酸胞苷(CMP)；

其中所述尿苷激酶(UDK)将胞苷原位转移至单磷酸胞苷(CMP)；和

i)执行如上所述的方法以获得CMP-Neu5Ac，包括：

其中所述尿苷激酶(UDK)将胞苷原位转移至单磷酸胞苷(CMP)；和

其中所述生物分子是糖、糖肽、糖蛋白、糖脂、聚糖、肽、蛋白质、抗体、抗体药物缀合物、碳水化合物缀合疫苗或类黄酮。优选地，该组酶共固定在固体支持物上。

优选地，所述糖是人乳寡糖，包括乳糖、N-乙酰-乳糖胺、乳糖-N-二碳糖、2'-岩藻糖乳糖、3-岩藻糖乳糖(3-FL)、乳糖-N-四糖(LNT)、乳糖-N-新四糖(LNnT)、二岩藻糖乳糖(DiFL)、乳糖-N-三糖II(LNT-II)、乳糖-N-岩藻糖戊糖I(LNFP I)、乳糖-N-岩藻糖戊糖III(LNFP III)、乳糖-N-岩藻糖戊糖V(LNFPV)。

因此，本发明涉及一种用于产生Neu5酰化生物分子的方法，所述方法包括：

i)执行如上所述的方法以获得CMP-Neu5Ac，

ii)将步骤i)后获得的CMP-Neu5Ac与生物分子反应，

其中所述生物分子是人乳寡糖，包括乳糖、N-乙酰-乳糖胺、乳糖-N-二碳糖、2'-岩藻糖乳糖、3-岩藻糖乳糖(3-FL)、乳糖-N-四糖(LNT)、乳糖-N-新四糖(LNnT)、二岩藻糖乳糖(DiFL)、乳糖-N-三糖II(LNT-II)、乳糖-N-岩藻糖戊糖I(LNFP I)、乳糖-N-岩藻糖戊糖III(LNFP III)、乳糖-N-岩藻糖戊糖V(LNFPV)。

i)执行如上所述的方法以获得CMP-Neu5Ac，包括：

其中所述尿苷激酶(UDK)将胞苷原位转移至单磷酸胞苷(CMP)；

其中所述尿苷激酶(UDK)将胞苷原位转移至单磷酸胞苷(CMP)；和

ii)将步骤i)后获得的CMP-Neu5Ac与生物分子反应，

i)执行如上所述的方法以获得CMP-Neu5Ac，包括：

其中所述尿苷激酶(UDK)将胞苷原位转移至单磷酸胞苷(CMP)；和

ii)将步骤i)后获得的CMP-Neu5Ac与生物分子反应，

优选地，碳水化合物缀合疫苗包含选自以下的糖：脑膜炎奈瑟菌血清型B糖、溶血性巴斯德菌A2糖、无乳链球菌糖和杜克雷嗜血杆菌糖。

优选地，糖脂是包含半乳糖神经酰胺部分的鞘糖脂。特别地，Neu5乙酰化糖脂是在糖链上连接有一个或多个N-乙酰神经氨酸，Neu5Ac)的神经节苷脂。神经节苷脂的类型包括LM1、GM1、GM1b和GM2，其包含一个N-乙酰-神经氨酸；GD1a、GalNAc-GD1a、GD1b、GD2和GD3，其包含两个N-乙酰神经氨酸；GT1a和GT3，其包含三个N-乙酰-神经氨酸；以及GQ1b，其包含四个N-乙酰神经氨酸。

优选地，治疗性蛋白是免疫球蛋白超家族的蛋白质。优选地，免疫球蛋白超家族的蛋白质是抗体。优选地，抗体是单克隆抗体、包括双特异性单克隆抗体和基于抗体的药物。优选地，抗体并不是完全Neu5酰化的。优选地，治疗性蛋白选自：

3F8，8H9，阿西莫单抗，阿伐苏单抗(Ascrinvacumab)，阿塞珠单抗，阿特珠单抗，阿度尤单抗(Atidortoxumab)，阿替奴单抗(Atinuma)，阿托木单抗，阿维鲁单抗，维汀-阿妥昔珠单抗(Azintuxizumab vedotin)，巴匹珠单抗，巴利昔单抗，巴维昔单抗，BCD-100，贝妥莫单抗，贝戈洛单抗(Begelomab)，Belantamab mafodotin，贝利木单抗，Bemarituzuma，苯拉珠单抗，贝度尤单抗(Berlimatoxumab)，贝迈奇单抗(Bermekimab)，博司利单抗(Bersanlimab)，柏替木单抗，贝索单抗，贝伐珠单抗，贝洛托舒单抗(Bezlotoxumab)，比西单抗，比玛卢单抗(Bimagrumab)，比美吉珠单抗，泊特埃单抗(Birtamimab)，Bivatuzumabmertansine，Bleselumab，兰妥莫单抗，布隆妥维单抗，布索珠单抗，伯考赛珠单抗(Bococizumab)，布雷库单抗(Brazikumab)，维布妥昔单抗，布雷奴单抗，布罗芦单抗，布洛赛珠单抗(Brolucizumab)，布隆妥珠单抗(Brontictuzumab)，布罗索尤单抗(Burosumab)，卡比利珠单抗(Cabiralizumab)，Camidanlumab tesirine，卡瑞利珠单抗，卡那奴单抗，坎妥珠单抗美登素，坎妥珠单抗拉坦素，卡拉西单抗(Caplacizumab)，卡罗单抗喷地肽，卡芦单抗，卡罗妥昔单抗(Carotuximab)，卡妥索单抗，cBR96-多柔比星免疫缀合物，西利珠单抗，西米普利单抗，阿姆白介素-2-瑟妥珠单抗(Cergutuzumab amunaleukin)，培舍珠单抗，西利单抗(Cetrelimab)，西妥昔单抗，赛必妥单抗，Cirmtuzumab，泊西他珠单抗，西妥木单抗，克拉扎珠单抗，克立昔单抗，泰坦-克利妥珠单抗，考曲妥珠单抗，培汀-考非妥珠单抗(Cofetuzumab pelidotin)，雷星-考妥昔单抗(Coltuximab ravtansine)，可那木单抗，康赛珠单抗(Concizumab)，Cosfroviximab，CR6261，克瑞珠单抗，Crizanlizumab，克罗特度单抗(Crotedumab)，Cusatuzumab，达西珠单抗，达克珠单抗，达罗托株单抗，培化达匹利珠单抗，达妥木单抗，德屈库单抗，登赛珠单抗(Demcizumab)，玛汀-地宁妥珠单抗，地舒单抗，玛汀-迪妥昔珠单抗，德尔罗妥单抗生物素(Derlotuximab biotin)，地莫单抗，迪扎米珠单抗(Dezamizumab)，地努妥昔单抗(Dinutuximab)，地利伏单抗(Diridavumab)，多玛洛珠单抗(Domagrozumab)，阿托度莫单抗，Dostarlima，曲齐妥单抗，DS-8201，度戈妥珠单抗(Duligotuzumab)，度普利尤单抗(Dupilumab)，德瓦鲁单抗(Durvalumab)，度司妥单抗，度妥昔珠单抗，依美昔单抗，依库珠单抗，埃巴单抗，依决洛单抗，依法珠单抗，依芬古单抗(Efungumab)，埃迪鲁单抗(Eldelumab)，依来努单抗(Elezanumab)，依更妥单抗，依妥珠单抗，艾西莫单抗，依米妥珠单抗(Emactuzumab)，Emapalumab，Emibetuzumab，艾米珠单抗，Enapotamabvedotin，依那妥珠单抗，Enfortumab vedotin，培化恩莫单抗，依诺妥珠单抗(Enoblituzumab)，依诺凯组单抗(Enokizumab)，依诺苏单抗，恩妥昔单抗，西依匹莫单抗，依帕珠单抗，Eptinezumab，厄瑞奴单抗(Erenumab)，厄利珠单抗，厄妥索单抗(Ertumaxomab)，埃达珠单抗，艾替利单抗，依曲利珠单抗，Evinacumab，依洛尤单抗(Evolocumab)，艾韦单抗，Fanolesomab，法拉莫单抗，Faricimab，法妥珠单抗，法司努单抗(Fasinumab)，FBTA05，泛维珠单抗，非扎奴单抗，Fibatuzumab，非拉妥珠单抗，芬妥木单抗，非利伏单抗(Firivumab)，法兰妥单抗(Flanvotumab)，Fletikumab，伏妥珠单抗(Flotetuzumab)，芳妥珠单抗，福雷芦单抗，福拉韦单抗，Fremanezumab，非苏木单抗，弗洛西单抗，夫卢维单抗(Frunevetmab)，福拉奴单抗，伏妥昔单抗，Galcanezumab，加利昔单抗，Gancotama，加尼妥单抗，更汀芦单抗，伽妥珠单抗(Gatipotuzumab)，加维莫单抗，格迪伏单抗(Gedivumab)，吉妥珠单抗奥加米星，吉伏珠单抗，吉维单抗(Gilvetmab)，瑾司鲁单抗(Gimsilumab)，吉妥昔单抗，Glembatumumab vedotin，戈利木单抗，戈米利昔单抗，Gosuranemab，古塞库单抗，Ianalumab，伊巴珠单抗，IBI308，替伊莫单抗，艾芦库单抗，Idarucizumab，Ifabotuzumab，伊戈伏单抗，Iladatuzumab vedotin，IMAB362，伊玛鲁单抗(Imalumab)，Imaprelimab，英西单抗，伊马曲单抗(Imgatuzumab)，Inclacumab，雷英妥昔单抗，Indusatumab vedotin，伊奈利珠单抗(Inebilizumab)，英利昔单抗，伊诺莫单抗，伊珠单抗奥加米星，英妥木单抗，Iomab-B，伊匹木单抗，伊妥木单抗，艾萨妥昔单抗(Isatuximab)，Iscalimab，艾司妥单抗(Istiratumab)，伊利珠单抗，伊卡珠单抗，凯利昔单抗，拉贝珠单抗，拉妥珠单抗(Lacnotuzumab)，Ladiratuzumab vedotin，兰帕利珠单抗(Lampalizumab)，Lanadelumab，兰洛珠单抗，恩星-拉妥昔单抗(Laprituximabemtansine)，拉韦昔单抗(Larcaviximab)，来瑞珠单抗，来马索单抗，Lendalizumab，伦韦单抗，仑兹鲁单抗(Lenzilumab)，乐德木单抗，Leronlimab，来索伏单抗(Lesofavumab)，来利珠单抗(Letolizumab)，来沙木单抗，利韦单抗，Lifastuzumab vedotin，利格利珠单抗(Ligelizumab)，Lilotomab satetraxetan，林妥珠单抗，利瑞鲁单抗(Lirilumab)，洛迪赛珠单抗(Lodelcizumab)，洛吉维单抗(Lokivetmab)，Loncastuximab tesirine，Lorvotuzumab mertansine，维汀-罗妥昔珠单抗(Losatuxizumab vedotin)，卢卡木单抗，培化鲁利珠单抗(Lulizumab pegol)，鲁昔单抗，鲁妥珠单抗(Lumretuzumab)，Lupartumabamadotin，鲁吉珠单抗(Lutikizumab)，马帕木单抗，玛格妥昔单抗(Margetuximab)，马塔西单抗(Marstacima)，马司莫单抗，马妥珠单抗，玛弗利木单抗(Mavrilimumab)，美泊珠单抗，美替木单抗，米拉珠单抗，明瑞莫单抗，Mirikizumab，Mirvetuximab soravtansine，米妥莫单抗，扎妥昔单抗(Modotuximab)，莫格利珠单抗，莫那利珠单抗(Monalizumab)，莫罗木单抗，Mosunetuzumab，莫维珠单抗，帕西妥莫单抗，莫罗单抗-CD3，他那可单抗，那美芦单抗，他那莫单抗，恩星-那妥昔单抗(Naratuximab emtansine)，纳奈妥单抗，那他珠单抗，那赛昔珠单抗(Navicixizumab)，那韦伏单抗(Navivumab)，那昔妥单抗(Naxitamab)，奈巴库单抗，奈妥木单抗，奈莫利珠单抗(Nemolizumab)，NEOD001，奈瑞莫单抗，奈伐苏单抗(Nesvacumab)，尼塔奇单抗(Netakimab)，尼妥珠单抗，Nirsevimab，纳武单抗，巯诺莫单抗，奥托萨昔单抗(Obiltoxaximab)，Obinutuzumab，奥卡妥珠单抗(Ocaratuzumab)，奥瑞珠单抗，奥度莫单抗，奥法木单抗，奥拉妥单抗，奥来鲁单抗(Oleclumab)，奥仑达利珠单抗(Olendalizumab)，奥洛珠单抗，奥马珠单抗，Omburtamab，OMS721，奥那妥珠单抗，昂妥昔珠单抗(Ontuxizumab)，奥瓦利单抗(Onvatilimab)，奥匹努单抗(Opicinumab)，莫妥珠单抗，奥戈伏单抗，奥替苏单抗(Orticumab)，奥昔珠单抗，Otilimab，奥乐妥珠单抗(Otlertuzumab)，奥塞芦单抗，奥扎奈珠单抗(Ozanezumab)，奥利珠单抗，帕昔单抗，帕利珠单抗，Pamrevlumab，帕木单抗，Pankomab，帕巴库单抗，帕萨妥珠单抗(Parsatuzumab)，帕考珠单抗，帕妥昔珠单抗(Pasotuxizumab)，帕替珠单抗，帕曲妥单抗(Patritumab)，PDR001，派姆单抗，Pemtumomab，Perakizumab，培妥珠单抗，培克珠单抗，匹地利珠单抗(Pidilizumab)，维汀-匹那妥珠单抗(Pinatuzumab vedotin)，平妥莫单抗(Pintumomab)，普拉鲁单抗(Placulumab)，洛扎利珠单抗(Plozalizumab)，Pogalizumab，Polatuzumabvedotin，泊奈珠单抗，珀韦昔单抗(Porgaviximab)，Prasinezumab，Prezalizumab，普立昔单抗，瑞托萨昔单抗(Pritoxaximab)，普林木单抗，PRO140，奎利珠单抗(Quilizumab)，雷妥莫单抗，雷曲妥单抗，雷韦单抗，雷泮赛珠单抗(Ralpancizumab)，雷莫芦单抗，雷奈维单抗(Ranevetmab)，雷珠单抗，Ravagalimab，Ravulizumab，雷昔库单抗，瑞法奈珠单抗(Refanezumab)，瑞加韦单抗，Relatlimab，壬托鲁单抗(Remtolumab)，瑞利珠单抗，利妥木单抗，利努苏单抗(Rinucumab)，瑞莎珠单抗，利妥昔单抗，培戈-利伐巴珠单抗，Rmab，罗妥木单抗，罗来度单抗，若奇单抗(Romilkimab)，罗莫单抗(Romosozumab)，隆利珠单抗，洛曼妥珠单抗(Rosmantuzumab)，Rovalpituzumab tesirine，罗维珠单抗，洛利昔珠单抗(Rozanolixizumab)，卢利珠单抗，SA237，戈沙妥珠单抗(Sacituzumab govitecan)，沙马珠单抗，Samrotamab vedotin，Sarilumab，萨特利珠单抗(Satralizumab)，沙妥莫单抗喷地肽，司库奴单抗，塞鲁单抗(Selicrelumab)，瑟瑞妥单抗(Seribantumab)，瑟托萨昔单抗(Setoxaximab)，Setrusumab，司韦单抗，SGN-CD19A，SHP647，西罗珠单抗，西法木单抗，塞妥昔单抗，辛妥珠单抗(Simtuzumab)，西利珠单抗，Sirtratumab vedotin，西鲁库单抗，Sofituzumab vedotin，苏兰珠单抗，索利托单抗(Solitomab)，Sonepcizumab，松妥珠单抗，Spartalizumab，司他芦单抗，硫索单抗，舒他伏单抗(Suptavumab)，苏替莫单抗(Sutimlimab)，舒维珠单抗，苏托舒单抗(Suvratoxumab)，他贝芦单抗，Tacatuzumabtetraxetan，他度珠单抗，塔妥珠单抗(Talacotuzumab)，他利珠单抗，坦妥维单抗(Tamtuvetmab)，他尼珠单抗，帕他莫单抗，他瑞妥单抗(Tarextumab)，他利昔珠单抗(Tavolimab)，替非珠单抗，阿替莫单抗，Telisotuzumab vedotin，替妥莫单抗，替奈昔单抗，替利珠单抗，Tepoditamab，替妥木单抗，特度鲁单抗(Tesidolumab)，Tetulomab，Tezepelumab，TGN1412，替布利珠单抗(Tibulizumab)，替加珠单抗，替曲吉珠单抗(Tildrakizumab)，替米妥珠单抗(Timigutuzumab)，替莫鲁单抗(Timolumab)，替瑞利尤单抗(Tiragotumab)，替雷利珠单抗，Tisotumab vedotin，TNX-650，托珠单抗，托木妥昔单抗(Tomuzotuximab)，托利珠单抗，托萨托舒单抗(Tosatoxumab)，托西莫单抗，托维妥单抗(Tovetumab)，曲罗芦单抗，曲妥珠单抗，恩特曲妥珠单抗，TRBS07，曲利珠单抗，曲美木单抗，曲戈卢单抗(Trevogrumab)，西莫白介素单抗，妥韦单抗，乌妥昔单抗，乌洛鲁单抗(Ulocuplumab)，乌瑞芦单抗，乌珠单抗，乌司奴单抗，乌托鲁单抗(Utomilumab)，Vadastuximab talirine，Vanalimab，维汀-万多妥珠单抗(Vandortuzumab vedotin)，万替妥单抗(Vantictumab)，伐努赛珠单抗(Vanucizumab)，伐利昔单抗，伐利苏单抗(Varisacumab)，伐立鲁单抗(Varlilumab)，伐利珠单抗，维多珠单抗，维妥珠单抗，维帕莫单抗，维森库单抗，维西珠单抗，Vobarilizumab，伏洛昔单抗，珀伽利珠单抗(Vonlerolizumab)，Vopratelimab，Vorsetuzumab mafodotin，伏妥莫单抗，伏那吉珠单抗(Vunakizumab)，珍妥珠单抗(Xentuzumab)，XMAB-5574，扎芦木单抗，扎木单抗，Zatuximab，泽妥珠单抗(Zenocutuzumab)，齐拉木单抗，Zolbetuximab(＝IMAB36，Claudiximab)，和阿佐莫单抗。

优选地，类黄酮包括黄酮、黄酮醇、缬草酮(valvanones)、二氢黄酮醇(falavanonols)、黄烷黄烷醇、黄二醇和异黄酮、异黄烷、异黄二醇、异黄烯和香豆雌酚(coumestans)和紫檀烷，更优选所述类黄酮是O-糖基化的。

Neu5Ac可能潜在地转移至病毒以及与以下病毒相关的病毒样颗粒和疫苗。

附图说明

图1:(A)显示了由低成本底物N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)、丙酮酸盐、多磷酸盐和胞苷酶促合成CMP-Neu5Ac的多酶级联。反应级联包括(a)由N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)形成N-乙酰-D-甘露糖胺(ManNAc)，(b)由ManNAc和丙酮酸盐形成N-乙酰-D-神经氨酸(Neu5Ac)，(c)由胞苷和5'-三磷酸腺苷(ATP)形成5’-单磷酸胞苷(CMP)，(d)由CMP和ATP形成5’-二磷酸胞苷(CDP)，(e)由CDP和多磷酸盐(PolyP_n)形成5’-三磷酸胞苷(CTP)，和(f)Neu5Ac与CTP反应生成CMP-Neu5Ac。任选地，可通过添加1D-PPK2以协助ADP转化为ATP来扩展级联。此外，可通过添加2D-PPK2以激活AMP磷酸化为ADP来扩展级联。此外，可以通过添加1D-PPK2和2D-PPK2以抑制磷酸腺苷的频繁水解来扩展级联。

(B)显示了由底物D-葡萄糖胺(GlcN)和乙酸盐酶促合成CMP-Neu5Ac的多酶级联。在该级联中，进一步添加了步骤(a')。(a')由D-葡萄糖胺(GlcN)和乙酸盐在N-乙酰葡萄糖胺脱乙酰酶的催化下形成N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)。

图2：显示了由低成本底物N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)、丙酮酸盐、多磷酸盐和胞苷酶促合成CMP-Neu5Ac的多酶级联。任选地，可通过添加无机二磷酸酶(PPA)以水解抑制N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)活性的焦磷酸盐PP_i来扩展级联。

图3：通过HPAEC-UV色谱图定量CMP-Neu5Ac。

A)CMP-Neu5Ac的定量的HPAEC-UV色谱图。CMP-Neu5Ac的浓度曲线在30小时后显示饱和。

B)4分钟反应时间后CMP-Neu5Ac(和其他反应物)的定量的HPAEC-UV色谱图。

C)30小时反应时间后CMP-Neu5Ac(和其他反应物)的定量的HPAEC-UV色谱图。

图4显示了酶的序列列表。

(A)来自多变三离藻(Trichormus variabilis)的AGE家族差向异构酶/异构酶；

(B)来自多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)(菌株Pm70)的N-乙酰神经氨酸裂解酶(NANA)；

(C)来自脑膜炎奈瑟菌血清组B(菌株MC58)的N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)；

(D)来自大肠杆菌(菌株K12)的尿苷激酶(UDK)；

(E)来自拟南芥的UMP-CMP激酶3(URA6)；

(F)来自波氏玫瑰杆菌(Ruegeria pomeroyi)(菌株ATCC 700808/DSM 15171/DSS-3)的多磷酸盐:NDP磷酸转移酶3(PPK3)；

(G)来自多杀性巴氏杆菌(菌株Pm70)的无机焦磷酸酶(PPA)；

(H)来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(菌株ATCC 15692/DSM 22644/CIP 104116/JCM 14847/LMG 12228/1C/PRS 101/PAO1)的2-结构域多磷酸激酶2(2D-PPK2)＝多磷酸盐:AMP磷酸转移酶。

(I)来自铜绿假单胞菌(菌株ATCC 15692/DSM 22644/CIP 104116/JCM 14847/LMG12228/1C/PRS 101/PAO1)的1-结构域多磷酸激酶2(1D-PPK2)＝多磷酸盐:ADP磷酸转移酶；Uniprot-ID：Q9I154

图5显示了从混合含有过表达的酶的生物质开始到在固体支持物上进行CMP-Neu5Ac的合成反应的完整CMP-Neu5Ac级联的工作流程图。该工作流程也适用于筛选用于酶固定的各种固体支持物。

图6显示了孵育过夜后测量的反应D1的色谱图。

图7显示了孵育过夜后测量的反应D2的色谱图。

图8显示了反应E的色谱图：CMP-Neu5Ac的合成。CTP对AGE的强抑制作用。

图9显示了孵育40小时后反应F1-F4的色谱图。反应F1-F4中反应物的初始浓度描述于表12。

图10显示了实验G的随时间推移的浓度。显示了由胞苷、GlcNAc和丙酮酸盐酶促合成CMP-Neu5Ac。

图11显示了当使用EC-EP树脂作为固体支持物时，在多个循环中使用共固定的酶(NmCSS、PPK3和URA6)在实验A中产生CMP-Neu5Ac。

图12显示了当使用IBCOV-1树脂作为固体支持物时，在多个循环中使用共固定的酶(NmCSS、PPK3和URA6)在实验A中产生CMP-Neu5Ac。

图13显示了当使用IBCOV-2树脂作为固体支持物时，在多个循环中使用共固定的酶(NmCSS、PPK3和URA6)在实验A中产生CMP-Neu5Ac。

图14显示了当使用IBCOV-3树脂作为固体支持物时，在多个循环中使用共固定的酶(NmCSS、PPK3和URA6)在实验A中产生CMP-Neu5Ac。

图15显示了当使用EP403/M树脂作为固体支持物时，在多个循环中使用共固定的酶(NmCSS、PPK3和URA6)在实验A中产生CMP-Neu5Ac。

图16显示了当使用Eupergit树脂作为固体支持物时，在多个循环中使用共固定的酶(NmCSS、PPK3和URA6)在实验A中产生CMP-Neu5Ac。

图17显示了当使用ECR8215F树脂作为固体支持物时，在多个循环中使用共固定的酶(NmCSS、PPK3和URA6)在实验A中产生CMP-Neu5Ac。

图18显示了当ECR8285树脂用作固体支持物时，在多个循环中使用共固定的酶(NmCSS、PPK3和URA6)在实验A中产生CMP-Neu5Ac。

图19显示了当使用HFA403/M树脂作为固体支持物时，在多个循环中使用共固定的酶(NmCSS、PPK3和URA6)在实验A中产生CMP-Neu5Ac。

图20显示了当使用ECR8209F树脂作为固体支持物时，在多个循环中使用共固定的酶(NmCSS、PPK3和URA6)在实验A中产生CMP-Neu5Ac。

图21显示了当使用ECR8204F树脂作为固体支持物时，在多个循环中使用共固定的酶(NmCSS、PPK3和URA6)在实验A中产生CMP-Neu5Ac。

图22显示了当使用HFA403/S树脂作为固体支持物时，在多个循环中使用共固定的酶(NmCSS、PPK3和URA6)在实验A中产生CMP-Neu5Ac。

图23显示了当使用HFA/S树脂作为固体支持物时，在多个循环中使用共固定的酶(NmCSS、PPK3和URA6)在实验A中产生CMP-Neu5Ac。

图24显示了当使用403/S树脂作为固体支持物时，在多个循环中使用共固定的酶(NmCSS、PPK3和URA6)在实验A中产生CMP-Neu5Ac。

图25显示了当使用EP400/SS树脂作为固体支持物时，在多个循环中使用共固定的酶(NmCSS、PPK3和URA6)在实验A中产生CMP-Neu5Ac。

图26：6.6小时后由CMP、Neu5Ac、PolyP_n和催化量的ATP以100mL规模合成CMP-Neu5Ac的HPAEC-UV色谱图。

图27：Neu5酰化产物LSTc和DSLNnT的质谱图。

图28：6'-SL的合成：反应终点时反应的A.色谱图和B.MS光谱。

包括下述实施例以展示本发明的优选实施方案。本领域技术人员应认识到，下文实施例中公开的技术代表发明人发现在本发明实施当中效果良好的技术，从而能够视为构成其实施的优选模式。然而，鉴于本公开内容，本领域技术人员应理解能够在所公开的特定实施方案中进行许多变化并且仍然获得类似或相似的结果而不背离本发明的主旨和范围。

参考本说明书，本发明各种方面的进一步修饰和备选实施方案对本领域技术人员来说将是明显的。相应地，本说明书仅解释为示例性并且用于教导本领域技术人员实施本发明的一般方式的意图。应理解在本文中显示和描述的本发明的形式被视为实施方案的例子。要素和物质可以代替本文说明和描述的那些，部分和过程可以颠倒，并且本发明的某些特征可以独立使用，在获得本发明说明书的益处之后对本领域技术人员来说所有都是明显的。在本文描述的要素中可以进行改变而不背离下文权利要求中描述的本发明的主旨和范围。

实施例

缩略词和首字母缩略词

AGE N-乙酰-D-葡萄糖胺差向异构酶/异构酶

ADP 5'-二磷酸腺苷

AMP 5'-单磷酸腺苷

ATP 5'-三磷酸腺苷

dH₂O 去离子水

CMP 5’-单磷酸胞苷

CDP 5’-二磷酸胞苷

CTP 5’-三磷酸胞苷

CSS N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶

NmCSS 脑膜炎奈瑟菌血清组B(菌株MC58)的N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶

NAL N-乙酰神经氨酸裂解酶或N-乙酰神经氨酸丙酮酸裂解酶

GlcN D-葡萄糖胺

GlcNAc N-乙酰-D-葡萄糖胺

ManNAc N-乙酰-D-甘露糖胺

Neu5Ac N-乙酰-D-神经氨酸或5-(乙酰氨基)-3,5-二脱氧-D-甘油-α-D-半乳糖基-壬-2-酮吡喃糖酸(ulopyranosonic acid)

CMP-Neu5Ac 胞苷5’-单磷酸N-乙酰-D-神经氨酸

PolyP 多磷酸盐

PPi 焦磷酸盐

Pi 磷酸盐

PPK2 多磷酸激酶2

PPK3 多磷酸激酶3

1D-PPK2 1-结构域多磷酸激酶2，多磷酸盐：ADP磷酸转移酶

2D-PPK2 2-结构域多磷酸激酶2，多磷酸盐：AMP磷酸转移酶

URA6 单磷酸尿苷激酶

PPA 无机焦磷酸酶

PmPpA 多杀性巴氏杆菌无机焦磷酸酶

化学品和试剂

除非另有说明，所有化学品和试剂均购自Sigma-Aldrich和CarboSynth，并且具有可获得的最高的纯度。固体支持物购自Resindion、ChiralVision、

GmbH&Co.KG和micromod GmbH。

实施例1:酶的制备

将每种质粒分别转化至大肠杆菌BL21中，然后在含选择标记物的LB琼脂平板上培养。对于每种酶表达，遵循以下方案：

将琼脂平板的单个菌落在LB培养基和选择标记物中在37℃下孵育过夜。通过采用来自过夜培养物的100的接种因子并在含1mM MgSO₄和选择标记物的TB培养基中在37℃下孵育至OD₆₀₀0.8来制备主培养物。通过加入0.4mM IPTG并在16℃下培养约20小时诱导基因表达。通过以7000×g离心30分钟收获细胞。然后，将细胞沉淀重悬于裂解缓冲液中。通过高压匀浆(800-1000psi)进行细胞裂解。将细胞裂解物以7000xg离心30分钟，并通过0.8μm过滤器过滤。通过镍亲和色谱纯化酶(见以下载玻片)。

表1:本实施例中使用的酶

酶纯化

将清澈细胞裂解物上样至

系统的Ni-NTA亲和色谱柱上。用20％洗脱缓冲液洗涤色谱柱。使用洗脱缓冲液洗脱酶。用3kDa Amicon过滤器浓缩和透析酶溶液(以去除咪唑)，然后在-20℃下储存在储存缓冲液中。

裂解/结合缓冲液(A)、洗脱缓冲液(B)和储存缓冲液(C)的缓冲液组成

表2：裂解/结合缓冲液(A)

表3：洗脱缓冲液(B)

表4：储存缓冲液(C)

质粒和储备培养物

携带具有基因序列的质粒(具有卡那霉素抗性的pET28a)的所有大肠杆菌培养物的储备液可从早期研究中获得[1，2]。储备液含50％甘油，并在-20℃下储存。

基因及相应蛋白序列获自UniProt数据库：AGE(WP_011320279.1)、NAL(Q9CKB0)、CSS(P0A0Z7)、UDK(P0A8F4、URA6(O04905)、PPA(P57918)、PPK3(Q5LSN8)、2DPPK2(Q9HYF1)和1DPPK2(Q92SA6)。质粒购自商业化供应商(BioCat GmbH)：

表5：实验中使用的酶和质粒

酶	载体	选择标记物
			AGE	pET-28a(+)	卡那霉素
NANA	pET-22b(+)	氨苄西林
			UDK	pET-28a(+)	卡那霉素
CSS	pET-100/D-topO	氨苄西林
			URA6	pET-28a(+)	卡那霉素
PPK3	pET-28a(+)	卡那霉素
			PmPPA	pET-28a(+)	卡那霉素
1D-PPK2	pET-28a(+)	卡那霉素
			2D-PPK2	pET-28a(+)	卡那霉素

PPA(PmPpA；携带C端六组氨酸标签(His-tag)的酶)、PPK3和URA6(N端His标签)。将质粒转化到大肠杆菌中后，分离DNA，并通过基因测序检查构建体的准确性(EurofinsGenomics，Ebersberg，Germany)。

1.Mahour,R.,等人,Establishment of a five-enzyme cell-free cascade forthe synthesis of uridine diphosphate N-acetylglucosamine.Journal ofBiotechnology,2018.283:p.120-129.

2.Rexer,T.F.T.,等人,One pot synthesis of GDP-mannose by a multi-enzyme cascade for enzymatic assembly of lipid-linkedoligosaccharides.Biotechnology and Bioengineering,2018.115(1):p.192-205.

一锅级联反应

固定的酶通常可与溶液分离并重复使用。此外，它们可能表现出更高的活性，并可用于广泛的工艺，例如填充床反应器中的连续合成。针对CMP-Neu5Ac多酶级联的共固定测试了广泛的市售固体支持物。

反应

在恒温混匀仪中在35℃在450rpm摇动下以150μL体积在1.5mL安全锁定的Eppendorf小瓶中进行级联反应。

·将所有酶混合至一个小瓶中。

·通过混合酶、缓冲液和反应物开始反应。

·为了分析反应的时间进程，在每个时间点，等分取样3μL

样品，通过加入297μL冷(4℃)dH2O淬灭，并立即通过阴离子交换色谱进行测量。

测量

采用配备UV(260nm)和脉冲安培检测器(PAD)的高效阴离子交换色谱(HPAEC)测量反应物的浓度。对于分析物分离和定量，开发了不连续梯度洗脱方法，并使用无孔膜柱CarboPac PA200(250×2mm)在0.5mL/min的系统流速下进行了经验证的色谱分离。HPAEC系统(ICS5000)以及所有色谱柱、组件和软件均购自Thermo Scientific(Waltham，USA)。

酶固定

值得注意的是，由于对酶固定的知识不足以预测最佳固体支持物，因此寻找最佳固体支持物始终取决于实验性试验和错误。

令人惊讶的发现是，当共固定在广泛的环氧树脂支持物上时，多酶级联显示出活性。所测试并显示活性的环氧树脂支持物在支持物基质、粒径、孔径和环氧乙烷含量方面存在差异。其中通过疏水吸附、离子相互作用或与戊二醛的共价交联固定的酶的其他固体支持物显示极少或无活性，这意味着五种关键酶中的至少一种几乎没有活性至无活性。此外，当使用大量不同比例的蛋白质与固体支持物时，多酶级联在环氧树脂支持物上具有活性。对于CMP-Neu5Ac的合成，负载酶的许多环氧树脂支持物可在超过20个反应循环中使用，而无需将酶重新固定在支持物上。测试的环氧树脂支持物汇总在表7中。

表7：测试的环氧树脂(包括氨基环氧树脂)支持物的选择

实验A

广泛的市售固体支持物(见表7)针对酶NmCSS、PPK3和URA6的共固定进行了测试，用于CMP-Neu5Ac合成(见图1)，并评价了它们对CMP-Neu5Ac合成的影响。

为了测试各种负载酶的珠子上的多酶级联反应，加入了给定质量的每种树脂(见表1)。

向珠子加入100μL反应缓冲液(见下文)，在30℃和550rpm下孵育20h。然后，分析上清液的CMP-Neu5Ac。然后通过HPAEC-UV/PAD测量CMP-Neu5Ac浓度。

结果：

令人惊讶地发现，与未固定的或单独固定的酶相比，一组酶的共固定导致产生胞苷5’-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸(CMP-Neu5Ac)的生产率更高。因此，优选地，本文所述的本发明的方法中使用的酶共固定在固体支持物上。令人惊讶的是，具有酶的珠子可在超过11个循环中使用(见图11-25)。

表8：实验A补料溶液中反应物的浓度

底物	浓度(mM)
		Neu5NAc	5
CMP	5
		ATP	5
PolyP<sub>25</sub>	30
		MgCl<sub>2</sub>	-
HEPES	-

实验C-概念验证

为检查是否可以使用设计的途径在一锅反应中产生CMP-Neu5Ac，进行了具有下表中详述浓度的反应。随时间推移测量反应物的浓度(见下文的在4分钟和30小时后的色谱图)。如下文色谱图所示，产生了CMP-Neu5Ac。CMP-Neu5Ac的浓度时间进程如下所示。

表9：补料溶液中反应物的浓度

结果

结果表明，通过使用该组酶，可成功地从GlcNAc、丙酮酸盐和胞苷产生CMP-Neu5Ac。

实验D-增加的底物浓度

在实验D中，在较高底物浓度下进行了两个级联反应(含PPA的D1和不含PPA的D2)(初始浓度见下文)。孵育过夜后，通过HPAEC-UV检测法测量反应物浓度。

通过级联反应成功合成了CMP-Neu5Ac。然而，检测到相当大浓度的CMP、CDP和CTP，表明较低的产率。

表10A：反应D1的反应物的初始浓度-不含PPA的级联反应(见图6)

表10B：反应D2的反应物的初始浓度-具有PPA的级联反应(见图7)

实验E-CTP对AGE的抑制

如从文献所知，CTP抑制AGE。我们在从GlcNAc和CTP开始合成CMP-Neu5Ac的反应中独立验证了这一点(见下文)。初始底物和酶浓度见下表。

在过夜反应中检测到极少的CMP-Neu5Ac，证实了CTP对AGE的抑制作用(见下文色谱图)。

方案1:缩短从GlcNAc和CTP开始合成CMP-Neu5Ac的途径，以检测CTP对AGE的抑制作用。

表11:实验E的初始底物和酶浓度(另见图8)

实验F-增加产率

已知CTP抑制AGE，并且ATP激活AGE。然而，通过调节初始底物和酶浓度，可以优化产率和产物浓度。减少胞苷增加产率，但降低CMP-Neu5Ac终浓度。在实验D中，胞苷-ATP-PolyP的比例保持恒定(1-0.3-0.8)，同时增加胞苷浓度(初始浓度见下文)。

孵育40小时后，反应F1和F2导致胞苷几乎完全转化为CMP-Neu5Ac，如图9所示。

表12：反应F1-F4的初始浓度(另见图9)

实验G

进行了额外的反应，测量了随时间推移的浓度(初始浓度见下文)。反应显示相对于约25mM(16g/L)的胞苷和CMP-Neu5Ac滴度，胞苷、GlcNAc和丙酮酸盐以约75％的产率转化为CMP-Neu5Ac。

表13：实验G的初始浓度(另见图10)

实施例H：以100mL规模同时产生用于合成CMP-Neu5Ac的酶

为了从CMP、Neu5Ac、PolyP_n和催化量的ATP产生CMP-Neu5Ac，产生了一种单一菌株，在其中同时过表达所有三种酶。本工作中使用的基因和载体如下所示：

表14：用于在一种单一菌株中产生级联的酶和载体。

通过高压匀浆器将来自200mL培养物的生物质在含25mM Tris-HCl(pH 7.1)、400NaCl和5％甘油的40mL裂解缓冲液中裂解。离心后，使用含有过表达的酶的上清液启动合成反应。在转瓶中进行100mL规模反应。反应基质含有150mM Tris-HCl(pH 8.5)、75mMMgCl₂、50mM CMP、51mM Neu5Ac、5mM ATP、16mM PolyP_n。在37℃和50rpm下孵育6.6h后，生成CMP-Neu5Ac，终浓度为45.3mM(27.8g/L)，产率为约90％。生产率为4.2g/(L*h)。反应结束时反应混合物的色谱图见图26。

实施例3：级联的偶联

级联可与唾液酸转移酶偶联，以将CMP-Neu5Ac转移至受体分子。受体分子可以是例如单克隆抗体。对于偶联，可以添加可溶性唾液酸转移酶，可将唾液酸转移酶共固定在相同的支持物上和/或可以将唾液酸转移酶固定在额外的支持物上，然后加入反应中。

实施例4：Neu5酰化生物分子的产生

通过首先在一锅多酶级联反应中产生CMP-Neu5Ac，然后将其与生物分子底物以及唾液酸转移酶混合以将Neu5Ac从CMP-Neu5Ac转移至底物，来促进Neu5酰化生物分子的合成。在以下实施例中，生物分子是人乳寡糖(HMO)。

方法

所有实验均在1.5mL Eppendorf安全锁管中进行，并在37℃在摇动(550rpm)下进行。对于化合物的鉴别，采用使用脉冲安培检测器(PAD)的高效阴离子色谱(HPAEC)。HPAEC系统配有Dionex^TMCarboPac^TMPA200保护柱和分析柱(串联，Thermo Scientifc，USA)。使用具有不同浓度的氢氧化钠和乙酸钠的水溶液作为洗脱液。

用于质谱的样品制备：

在对样品进行质谱(MS)前，进行了棉花亲水相互作用液相色谱(HILIC)，以去除溶液中的盐。简而言之，将15μL样品与85μL 100％乙腈(ACN)混合。200μL移液器吸头的约五分之一填充棉花。然后用水洗涤棉花，以去除任何污染。用85％ACN平衡后，通过上下吸移上样样品，然后进行使用85％ACN和1％三氟乙酸(TFA)的洗涤步骤(5次)。用50μL水分三步从棉花基质中洗脱寡糖(最终体积:150μL)。

质谱：

使用UltraFlextreme基质辅助激光解吸/电离飞行时间(MALDI-TOF)-MS(BrukerDaltonics，Germany)分析HMO和糖核苷酸。对于HMO的分析，使用与10mg/mL TA30(在由70％H₂O组成的溶液中的2mM NaCl，补充了0.1％TFA和30％ACN)混合的“super-DHB”(Merck，Germany)作为基质。简而言之，将1μL基质点样至AnchorChip 384BC MALDI靶标板(BrukerDaltonics)上，并通过空气干燥。然后，向斑点加入1μL的样品等分试样。干燥后，每个斑点加入0.2μL乙醇，以允许迅速且均匀的重结晶。分别在正离子和负离子反射器模式下测量HMO和糖核苷酸分析。使用右旋糖酐梯度对正离子模式进行校准。

酶制备：

基因及其来源和使用的载体的列表描述于表15。LOBSTR大肠杆菌(Kerafast，USA)菌株用作表达宿主。将含有质粒的细胞在补充1.5mM MgSO₄和选择标记物的极好肉汤培养基中在37℃下培养。在OD为0.8-1时，通过加入0.4mM IPTG诱导基因表达，然后在16℃下孵育20-24小时(对于α-2,6-唾液酸转移酶为15℃)。

表15.用于异源表达的基因及其来源和使用的质粒的列表

培养结束时，通过离心(7000×g，30分钟)沉淀细胞，并通过高压匀浆(800-1000psg下通过3至5次)裂解。然后，通过离心(7000×g，45分钟)和将上清液通过0.45μm乙酸纤维素过滤器过滤去除细胞碎片。对于酶的纯化，使用通用的His-tag纯化方法。结合(裂解)缓冲液为：50mM MOPS(pH 7.5)、10mM MgCl₂、300mM NaCl、5％甘油和10mM咪唑。洗脱缓冲液为50mM MOPS(pH 7.5)、10mM MgCl₂、300mM NaCl、5％甘油和250mM咪唑。

洗脱后，将含有感兴趣的酶的级分合并在一起。使用3kDa Amicon过滤器单元进行缓冲液置换和酶浓度分析。将酶与甘油以1:1的比例混合，并在-20℃下储存。

实施例4-1:唾液酸乳糖-N-新四糖c(LSTc)和二唾液酸乳糖-N-新四糖(DSLNnT)的产生

使用前面描述的级联反应在一锅多酶反应中产生CMP-Neu5Ac(反应条件见表16)。然后，将后者的等分试样(70μL)与含有LNnT、碱性磷酸酶(30个单位)和α-2,6-唾液酸转移酶(α-2,6-ST)的缓冲(Tris-HCl)溶液(198μL，pH 8.5)混合。通过MALDI-TOF-MS确认了LSTc和DSLNnT的产生(见图27)。

表16：产生CMP-Neu5Ac的反应条件。

实施例4-2：6'-唾液酸乳糖(6'-SL)的产生

对于由乳糖和CMP-Neu5Ac合成6'-SL，将70μL先前详细描述的含有CMP-Neu5Ac作为产物的一锅反应混合物(见表16)与乳糖(20mM)、MnCl₂(20mM)、Tris-HCl(150mM-pH 8)和0.3μg/μLα-2,6-ST混合至最终体积为200μL。通过反应终点时反应混合物的HPAEC色谱图和MS/MS光谱证实了6'-SL的成功产生(见图28)。

序列表

<110> 马克斯·普朗克科学促进学会

<120> 用于制备CMP-Neu5Ac的酶促方法

<130> GAR-P04171WO

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 392

<212> PRT

<213> 多变三离藻(Trichormus variabilis)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(392)

<223> AGE家族差向异构酶/异构酶

<400> 1

Met Gly Lys Asn Leu Gln Ala Leu Ala Gln Leu Tyr Lys Asn Ala Leu

1 5 10 15

Leu Asn Asp Val Leu Pro Phe Trp Glu Asn Tyr Ser Leu Asp Ser Glu

20 25 30

Gly Gly Tyr Phe Thr Cys Leu Asp Arg Gln Gly Lys Val Tyr Asp Thr

35 40 45

Asp Lys Phe Ile Trp Leu Gln Asn Arg Gln Val Trp Thr Phe Ser Met

50 55 60

Leu Cys Asn Gln Leu Glu Lys Arg Glu Asn Trp Leu Lys Ile Ala Arg

65 70 75 80

Asn Gly Ala Lys Phe Leu Ala Gln His Gly Arg Asp Asp Glu Gly Asn

85 90 95

Trp Tyr Phe Ala Leu Thr Arg Gly Gly Glu Pro Leu Val Gln Pro Tyr

100 105 110

Asn Ile Phe Ser Asp Cys Phe Ala Ala Met Ala Phe Ser Gln Tyr Ala

115 120 125

Leu Ala Ser Gly Glu Glu Trp Ser Lys Asp Val Ala Met Gln Ala Tyr

130 135 140

Asn Asn Val Leu Arg Arg Lys Asp Asn Pro Lys Gly Lys Tyr Thr Lys

145 150 155 160

Thr Tyr Pro Gly Thr Arg Pro Met Lys Ala Leu Ala Val Pro Met Ile

165 170 175

Leu Ala Asn Leu Thr Leu Glu Met Glu Trp Leu Leu Pro Gln Glu Thr

180 185 190

Leu Glu Asn Val Leu Ala Ala Thr Val Gln Glu Val Met Gly Asp Phe

195 200 205

Leu Asp Gln Glu Arg Gly Leu Met Tyr Glu Asn Val Ala Pro Asp Gly

210 215 220

Ser His Ile Asp Cys Phe Glu Gly Arg Leu Ile Asn Pro Gly His Gly

225 230 235 240

Ile Glu Ala Met Trp Phe Ile Met Asp Ile Ala Arg Arg Lys Asn Asp

245 250 255

Ser Lys Thr Ile Asn Gln Ala Val Asp Val Val Leu Asn Ile Leu Asn

260 265 270

Phe Ala Trp Asp Asn Glu Tyr Gly Gly Leu Tyr Tyr Phe Met Asp Ala

275 280 285

Ala Gly His Pro Pro Gln Gln Leu Glu Trp Asp Gln Lys Leu Trp Trp

290 295 300

Val His Leu Glu Ser Leu Val Ala Leu Ala Met Gly Tyr Arg Leu Thr

305 310 315 320

Gly Arg Glu Val Cys Trp Glu Trp Tyr Gln Lys Met His Asp Tyr Ser

325 330 335

Trp Gln His Phe Ala Asp Pro Glu Tyr Gly Glu Trp Phe Gly Tyr Leu

340 345 350

Asn Arg Arg Gly Glu Val Leu Leu Asn Leu Lys Gly Gly Lys Trp Lys

355 360 365

Gly Cys Phe His Val Pro Arg Ala Leu Tyr Leu Cys Trp Gln Gln Phe

370 375 380

Glu Ala Leu Ser Leu Gln Ser Ala

385 390

<210> 2

<211> 293

<212> PRT

<213> 多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(293)

<223> N-乙酰神经氨酸裂解酶(NAL)

<400> 2

Met Lys Asn Leu Lys Gly Ile Phe Ser Ala Leu Leu Val Ser Phe Asn

1 5 10 15

Ala Asp Gly Ser Ile Asn Glu Lys Gly Leu Arg Gln Ile Val Arg Tyr

20 25 30

Asn Ile Asp Lys Met Lys Val Asp Gly Leu Tyr Val Gly Gly Ser Thr

35 40 45

Gly Glu Asn Phe Met Leu Ser Thr Glu Glu Lys Lys Glu Ile Phe Arg

50 55 60

Ile Ala Lys Asp Glu Ala Lys Asp Glu Ile Ala Leu Ile Ala Gln Val

65 70 75 80

Gly Ser Val Asn Leu Gln Glu Ala Ile Glu Leu Gly Lys Tyr Ala Thr

85 90 95

Glu Leu Gly Tyr Asp Ser Leu Ser Ala Val Thr Pro Phe Tyr Tyr Lys

100 105 110

Phe Ser Phe Pro Glu Ile Lys His Tyr Tyr Asp Ser Ile Ile Glu Ala

115 120 125

Thr Gly Asn Tyr Met Ile Val Tyr Ser Ile Pro Phe Leu Thr Gly Val

130 135 140

Asn Ile Gly Val Glu Gln Phe Gly Glu Leu Tyr Lys Asn Pro Lys Val

145 150 155 160

Leu Gly Val Lys Phe Thr Ala Gly Asp Phe Tyr Leu Leu Glu Arg Leu

165 170 175

Lys Lys Ala Tyr Pro Asn His Leu Ile Trp Ala Gly Phe Asp Glu Met

180 185 190

Met Leu Pro Ala Ala Ser Leu Gly Val Asp Gly Ala Ile Gly Ser Thr

195 200 205

Phe Asn Val Asn Gly Val Arg Ala Arg Gln Ile Phe Glu Leu Thr Gln

210 215 220

Ala Gly Lys Leu Lys Glu Ala Leu Glu Ile Gln His Val Thr Asn Asp

225 230 235 240

Leu Ile Glu Gly Ile Leu Ala Asn Gly Leu Tyr Leu Thr Ile Lys Glu

245 250 255

Leu Leu Lys Leu Asp Gly Val Glu Ala Gly Tyr Cys Arg Glu Pro Met

260 265 270

Thr Lys Glu Leu Ser Pro Glu Lys Val Ala Phe Ala Lys Glu Leu Lys

275 280 285

Ala Lys Tyr Leu Ser

290

<210> 3

<211> 228

<212> PRT

<213> 脑膜炎奈瑟菌(血清组B)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(228)

<223> N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)

<400> 3

Met Glu Lys Gln Asn Ile Ala Val Ile Leu Ala Arg Gln Asn Ser Lys

1 5 10 15

Gly Leu Pro Leu Lys Asn Leu Arg Lys Met Asn Gly Ile Ser Leu Leu

20 25 30

Gly His Thr Ile Asn Ala Ala Ile Ser Ser Lys Cys Phe Asp Arg Ile

35 40 45

Ile Val Ser Thr Asp Gly Gly Leu Ile Ala Glu Glu Ala Lys Asn Phe

50 55 60

Gly Val Glu Val Val Leu Arg Pro Ala Glu Leu Ala Ser Asp Thr Ala

65 70 75 80

Ser Ser Ile Ser Gly Val Ile His Ala Leu Glu Thr Ile Gly Ser Asn

85 90 95

Ser Gly Thr Val Thr Leu Leu Gln Pro Thr Ser Pro Leu Arg Thr Gly

100 105 110

Ala His Ile Arg Glu Ala Phe Ser Leu Phe Asp Glu Lys Ile Lys Gly

115 120 125

Ser Val Val Ser Ala Cys Pro Met Glu His His Pro Leu Lys Thr Leu

130 135 140

Leu Gln Ile Asn Asn Gly Glu Tyr Ala Pro Met Arg His Leu Ser Asp

145 150 155 160

Leu Glu Gln Pro Arg Gln Gln Leu Pro Gln Ala Phe Arg Pro Asn Gly

165 170 175

Ala Ile Tyr Ile Asn Asp Thr Ala Ser Leu Ile Ala Asn Asn Cys Phe

180 185 190

Phe Ile Ala Pro Thr Lys Leu Tyr Ile Met Ser His Gln Asp Ser Ile

195 200 205

Asp Ile Asp Thr Glu Leu Asp Leu Gln Gln Ala Glu Asn Ile Leu Asn

210 215 220

His Lys Glu Ser

225

<210> 4

<211> 213

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(213)

<223> 尿苷激酶(UDK)

<400> 4

Met Thr Asp Gln Ser His Gln Cys Val Ile Ile Gly Ile Ala Gly Ala

1 5 10 15

Ser Ala Ser Gly Lys Ser Leu Ile Ala Ser Thr Leu Tyr Arg Glu Leu

20 25 30

Arg Glu Gln Val Gly Asp Glu His Ile Gly Val Ile Pro Glu Asp Cys

35 40 45

Tyr Tyr Lys Asp Gln Ser His Leu Ser Met Glu Glu Arg Val Lys Thr

50 55 60

Asn Tyr Asp His Pro Ser Ala Met Asp His Ser Leu Leu Leu Glu His

65 70 75 80

Leu Gln Ala Leu Lys Arg Gly Ser Ala Ile Asp Leu Pro Val Tyr Ser

85 90 95

Tyr Val Glu His Thr Arg Met Lys Glu Thr Val Thr Val Glu Pro Lys

100 105 110

Lys Val Ile Ile Leu Glu Gly Ile Leu Leu Leu Thr Asp Ala Arg Leu

115 120 125

Arg Asp Glu Leu Asn Phe Ser Ile Phe Val Asp Thr Pro Leu Asp Ile

130 135 140

Cys Leu Met Arg Arg Ile Lys Arg Asp Val Asn Glu Arg Gly Arg Ser

145 150 155 160

Met Asp Ser Val Met Ala Gln Tyr Gln Lys Thr Val Arg Pro Met Phe

165 170 175

Leu Gln Phe Ile Glu Pro Ser Lys Gln Tyr Ala Asp Ile Ile Val Pro

180 185 190

Arg Gly Gly Lys Asn Arg Ile Ala Ile Asp Ile Leu Lys Ala Lys Ile

195 200 205

Ser Gln Phe Phe Glu

210

<210> 5

<211> 202

<212> PRT

<213> 拟南芥

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(202)

<223> UMP-CMP激酶3

<400> 5

Met Gly Ser Val Asp Ala Ala Asn Gly Ser Gly Lys Lys Pro Thr Val

1 5 10 15

Ile Phe Val Leu Gly Gly Pro Gly Ser Gly Lys Gly Thr Gln Cys Ala

20 25 30

Tyr Ile Val Glu His Tyr Gly Tyr Thr His Leu Ser Ala Gly Asp Leu

35 40 45

Leu Arg Ala Glu Ile Lys Ser Gly Ser Glu Asn Gly Thr Met Ile Gln

50 55 60

Asn Met Ile Lys Glu Gly Lys Ile Val Pro Ser Glu Val Thr Ile Lys

65 70 75 80

Leu Leu Gln Lys Ala Ile Gln Glu Asn Gly Asn Asp Lys Phe Leu Ile

85 90 95

Asp Gly Phe Pro Arg Asn Glu Glu Asn Arg Ala Ala Phe Glu Lys Val

100 105 110

Thr Glu Ile Glu Pro Lys Phe Val Leu Phe Phe Asp Cys Pro Glu Glu

115 120 125

Glu Met Glu Lys Arg Leu Leu Gly Arg Asn Gln Gly Arg Glu Asp Asp

130 135 140

Asn Ile Glu Thr Ile Arg Lys Arg Phe Lys Val Phe Leu Glu Ser Ser

145 150 155 160

Leu Pro Val Ile His Tyr Tyr Glu Ala Lys Gly Lys Val Arg Lys Ile

165 170 175

Asn Ala Ala Lys Pro Ile Glu Ala Val Phe Glu Glu Val Lys Ala Ile

180 185 190

Phe Ser Pro Glu Ala Glu Lys Val Glu Ala

195 200

<210> 6

<211> 301

<212> PRT

<213> 波氏玫瑰杆菌(Ruegeria pomeroyi)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(301)

<223> 多磷酸盐:NDP磷酸转移酶3(PPK3)

<400> 6

Met Asn Arg Asn Gly Ser Thr Lys Asp Pro Arg Arg Met Thr Gly Ala

1 5 10 15

Ala Thr Gly Glu Ile Ser Arg Tyr Phe Asn Asp Lys Ala Pro Lys Asp

20 25 30

Ile Arg Arg Ala Ile Glu Lys Ala Asp Lys Asp Asp Ile Leu Ser Thr

35 40 45

Thr Tyr Pro Tyr Asp Ala Glu Met Thr Ala Lys Asp Tyr Arg Ala Gln

50 55 60

Met Glu Ala Leu Gln Ile Glu Leu Val Lys Leu Gln Ala Trp Ile Lys

65 70 75 80

Gln Ser Gly Ala Arg Val Ala Leu Leu Phe Glu Gly Arg Asp Ala Ala

85 90 95

Gly Lys Gly Gly Thr Ile Lys Arg Phe Arg Glu Asn Leu Asn Pro Arg

100 105 110

Gly Ala Arg Val Val Ala Leu Ser Lys Pro Thr Glu Ala Glu Arg Ser

115 120 125

Gln Trp Tyr Phe Gln Arg Tyr Ile Gln His Leu Pro Ser Ala Gly Glu

130 135 140

Leu Val Phe Tyr Asp Arg Ser Trp Tyr Asn Arg Gly Val Val Glu His

145 150 155 160

Val Phe Gly Trp Cys Asp Glu Glu Gln Arg Glu Arg Phe Phe Arg Gln

165 170 175

Val Met Pro Phe Glu His Asp Leu Val Asp Asp Gly Ile His Leu Phe

180 185 190

Lys Phe Trp Leu Asn Val Gly Arg Ala Glu Gln Leu Arg Arg Phe His

195 200 205

Asp Arg Glu Arg Asp Pro Leu Lys Gln Trp Lys Leu Ser Pro Val Asp

210 215 220

Ile Ala Gly Leu Asp Lys Trp Glu Ala Tyr Thr Thr Ala Ile Ser Gln

225 230 235 240

Thr Leu Thr Arg Ser His Ser Asp Arg Ala Pro Trp Thr Val Ile Arg

245 250 255

Ser Asp Asp Lys Lys Arg Ala Arg Leu Ala Ala Ile Arg Thr Val Leu

260 265 270

Ser Gly Ile Asp Tyr Asp Asn Lys Asp Arg Ala Ala Val Gly Gln Pro

275 280 285

Asp Ala Ala Ile Cys Gly Gly Pro Asp Ile Trp Asp Ala

290 295 300

<210> 7

<211> 175

<212> PRT

<213> 多杀性巴氏杆菌

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(175)

<223> 无机焦磷酸酶(PPA)

<400> 7

Met Gly Leu Glu Thr Val Pro Ala Gly Lys Ala Leu Pro Asp Asp Ile

1 5 10 15

Tyr Val Val Ile Glu Ile Pro Ala Asn Ser Asp Pro Ile Lys Tyr Glu

20 25 30

Val Asp Lys Glu Ser Gly Ala Leu Phe Val Asp Arg Phe Met Ala Thr

35 40 45

Ala Met Phe Tyr Pro Ala Asn Tyr Gly Tyr Val Asn Asn Thr Leu Ser

50 55 60

Leu Asp Gly Asp Pro Val Asp Val Leu Val Pro Thr Pro Tyr Pro Leu

65 70 75 80

Gln Pro Gly Ser Val Ile Arg Cys Arg Pro Val Gly Val Leu Lys Met

85 90 95

Thr Asp Glu Ala Gly Ser Asp Ala Lys Val Val Ala Val Pro His Ser

100 105 110

Lys Leu Thr Lys Glu Tyr Asp His Ile Lys Asp Val Asn Asp Leu Pro

115 120 125

Ala Leu Leu Lys Ala Gln Ile Gln His Phe Phe Glu Ser Tyr Lys Ala

130 135 140

Leu Glu Ala Gly Lys Trp Val Lys Val Asp Gly Trp Glu Gly Val Asp

145 150 155 160

Ala Ala Arg Gln Glu Ile Leu Asp Ser Phe Glu Arg Ala Lys Lys

165 170 175

<210> 8

<211> 505

<212> PRT

<213> 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(505)

<223> 多磷酸盐:AMP磷酸转移酶(2D-PPK2)

<400> 8

Met Val Phe Glu Ser Ala Glu Val Gly His Ser Ile Asp Lys Asp Thr

1 5 10 15

Tyr Glu Lys Ala Val Ile Glu Leu Arg Glu Ala Leu Leu Glu Ala Gln

20 25 30

Phe Glu Leu Lys Gln Gln Ala Arg Phe Pro Val Ile Ile Leu Ile Asn

35 40 45

Gly Ile Glu Gly Ala Gly Lys Gly Glu Thr Val Lys Leu Leu Asn Glu

50 55 60

Trp Met Asp Pro Arg Leu Ile Glu Val Gln Ser Phe Leu Arg Pro Ser

65 70 75 80

Asp Glu Glu Leu Glu Arg Pro Pro Gln Trp Arg Phe Trp Arg Arg Leu

85 90 95

Pro Pro Lys Gly Arg Thr Gly Ile Phe Phe Gly Asn Trp Tyr Ser Gln

100 105 110

Met Leu Tyr Ala Arg Val Glu Gly His Ile Lys Glu Ala Lys Leu Asp

115 120 125

Gln Ala Ile Asp Ala Ala Glu Arg Phe Glu Arg Met Leu Cys Asp Glu

130 135 140

Gly Ala Leu Leu Phe Lys Phe Trp Phe His Leu Ser Lys Lys Gln Leu

145 150 155 160

Lys Glu Arg Leu Lys Ala Leu Glu Lys Asp Pro Gln His Ser Trp Lys

165 170 175

Leu Ser Pro Leu Asp Trp Lys Gln Ser Glu Val Tyr Asp Arg Phe Val

180 185 190

His Tyr Gly Glu Arg Val Leu Arg Arg Thr Ser Arg Asp Tyr Ala Pro

195 200 205

Trp Tyr Val Val Glu Gly Ala Asp Glu Arg Tyr Arg Ala Leu Thr Val

210 215 220

Gly Arg Ile Leu Leu Glu Gly Leu Gln Ala Ala Leu Ala Thr Lys Glu

225 230 235 240

Arg Ala Lys Arg Gln Pro His Ala Ala Pro Leu Val Ser Ser Leu Asp

245 250 255

Asn Arg Gly Leu Leu Asp Ser Leu Asp Leu Gly Gln Tyr Leu Asp Lys

260 265 270

Asp Ala Tyr Lys Glu Gln Leu Ala Ala Glu Gln Ala Arg Leu Ala Gly

275 280 285

Leu Ile Arg Asp Lys Arg Phe Arg Gln His Ser Leu Val Ala Val Phe

290 295 300

Glu Gly Asn Asp Ala Ala Gly Lys Gly Gly Ala Ile Arg Arg Val Thr

305 310 315 320

Asp Ala Leu Asp Pro Arg Gln Tyr His Ile Val Pro Ile Ala Ala Pro

325 330 335

Thr Glu Glu Glu Arg Ala Gln Pro Tyr Leu Trp Arg Phe Trp Arg His

340 345 350

Ile Pro Ala Arg Arg Gln Phe Thr Ile Phe Asp Arg Ser Trp Tyr Gly

355 360 365

Arg Val Leu Val Glu Arg Ile Glu Gly Phe Cys Ala Pro Ala Asp Trp

370 375 380

Leu Arg Ala Tyr Gly Glu Ile Asn Asp Phe Glu Glu Gln Leu Ser Glu

385 390 395 400

Tyr Gly Ile Ile Val Val Lys Phe Trp Leu Ala Ile Asp Lys Gln Thr

405 410 415

Gln Met Glu Arg Phe Lys Glu Arg Glu Lys Thr Pro Tyr Lys Arg Tyr

420 425 430

Lys Ile Thr Glu Glu Asp Trp Arg Asn Arg Asp Lys Trp Asp Gln Tyr

435 440 445

Val Asp Ala Val Gly Asp Met Val Asp Arg Thr Ser Thr Glu Ile Ala

450 455 460

Pro Trp Thr Leu Val Glu Ala Asn Asp Lys Arg Phe Ala Arg Val Lys

465 470 475 480

Val Leu Arg Thr Ile Asn Asp Ala Ile Glu Ala Ala Tyr Lys Lys Asp

485 490 495

Lys Leu Glu His His His His His His

500 505

<210> 9

<211> 324

<212> PRT

<213> 铜绿假单胞菌

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(324)

<223> 多磷酸盐:ADP磷酸转移酶(1D-PPK2)

<400> 9

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Asp Ser Tyr Gly Asp Thr Ser Gly Arg Ile Gly

20 25 30

Arg Asp Trp Leu Asp Arg His Asp Glu Glu Leu Glu Gln Glu Leu Leu

35 40 45

Asp Asp Glu Leu Asn Leu Asp Glu Leu Phe Gly Pro Glu Gln Glu Asp

50 55 60

Ala Pro Gly Glu Leu Ser Arg Arg Arg Tyr Phe Arg Glu Leu Phe Arg

65 70 75 80

Leu Gln Arg Glu Leu Val Lys Leu Gln Asn Trp Val Val His Thr Gly

85 90 95

His Lys Val Val Ile Leu Phe Glu Gly Arg Asp Ala Ala Gly Lys Gly

100 105 110

Gly Val Ile Lys Arg Ile Thr Gln Arg Leu Asn Pro Arg Val Cys Arg

115 120 125

Val Ala Ala Leu Pro Ala Pro Asn Asp Arg Glu Gln Thr Gln Trp Tyr

130 135 140

Phe Gln Arg Tyr Val Ser His Leu Pro Ala Gly Gly Glu Ile Val Leu

145 150 155 160

Phe Asp Arg Ser Trp Tyr Asn Arg Ala Gly Val Glu Arg Val Met Gly

165 170 175

Phe Cys Asn Asp Glu Gln Tyr Glu Glu Phe Phe Arg Ser Val Pro Glu

180 185 190

Phe Glu Lys Met Leu Ala Arg Ser Gly Ile Gln Leu Leu Lys Tyr Trp

195 200 205

Phe Ser Ile Ser Asp Ala Glu Gln His Leu Arg Phe Leu Ser Arg Ile

210 215 220

His Asp Pro Leu Lys Gln Trp Lys Leu Ser Pro Met Asp Leu Glu Ser

225 230 235 240

Arg Arg Arg Trp Glu Ala Tyr Thr Lys Ala Lys Glu Thr Met Leu Glu

245 250 255

Arg Thr His Ile Pro Glu Ala Pro Trp Trp Val Val Gln Ala Asp Asp

260 265 270

Lys Lys Arg Ala Arg Leu Asn Cys Ile His His Leu Leu Gln Gln Met

275 280 285

Pro Tyr Arg Glu Val Pro Gln Pro Pro Val His Leu Pro Glu Arg Leu

290 295 300

Arg His Ala Asp Tyr Val Arg His Pro Thr Pro Gly Glu Ile Ile Val

305 310 315 320

Pro Glu Val Tyr

Claims

1.用于制备胞苷5′-单磷酸-N-乙酰-神经氨酸(CMP-Neu5Ac，1)的方法

包括：

一组酶，包括N-酰基葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)、N-乙酰神经氨酸裂解酶(NAL)、N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)、尿苷激酶(UDK)、单磷酸尿苷激酶(URA6)和多磷酸激酶3(PPK3)；

其中

所述尿苷激酶(UDK)将胞苷原位转移至单磷酸胞苷(CMP)。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述一组酶还包括无机二磷酸酶(PPA)。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述一组酶还包括单结构域多磷酸激酶2(1D-PPK2)和/或双结构域多磷酸激酶2(2D-PPK2)。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所得溶液的pH值在7.0-9.0的范围内。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，

其中N-乙酰-D-葡萄糖胺的浓度在1mM至5000mM的范围内；和/或丙酮酸盐的浓度在1mM至5000mM的范围内；和/或胞苷的浓度在0.1mM至2000mM的范围内；和/或5'-三磷酸腺苷(ATP)的浓度在0.001mM至100mM的范围内。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中N-乙酰-D-葡萄糖胺和胞苷的比例在1:1至100:1的范围内。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所得溶液还包括浓度在0.1mM至200mM的范围内的Mg²⁺。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述酶中的每一种具有以下氨基酸序列：

单结构域多磷酸激酶2(1D-PPK2)包含SEQ ID NO：9中所示的至少80％的氨基酸序列。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中固体支持物由珠子或树脂组成，所述珠子或树脂包含具有环氧化物官能团、具有氨基环氧化物官能团、具有乙二胺官能团、具有氨基C2官能团、具有氨基C6官能团、具有阴离子/氨基C6间隔官能团的聚合物。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)和丙酮酸盐的比例在1:1至1:50的范围内；

N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)和胞苷的比例在1:1至100:1的范围内；

5'-三磷酸腺苷(ATP)和胞苷的比例在1:1至1:100的范围内；和

N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)的浓度在20-3000mM的范围内；

丙酮酸盐的浓度在20-3000mM的范围内；

胞苷的浓度在1-500mM的范围内；

5'-三磷酸腺苷(ATP)的浓度在0.001-10mM的范围内；和

多磷酸盐的浓度在1-30mM的范围内。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述一组酶直接共固定在来自细胞裂解物或细胞匀浆的固体支持物上。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中在步骤A)中，N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)在N-乙酰-葡萄糖胺脱乙酰酶的存在下由D-葡萄糖胺(GlcN)和乙酸盐单独或原位产生。

13.一种产生Neu5酰化的生物分子的方法，包括：

i)执行权利要求1-12中任一项所述的方法以获得CMP-Neu5Ac，

其中所述生物分子是糖、糖肽、糖蛋白、糖脂、聚糖、肽、蛋白质、抗体、抗体药物缀合物、碳水化合物缀合疫苗、病毒、病毒样颗粒、病毒疫苗或类黄酮。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述生物分子包含半乳糖苷(Gal)、氨基半乳糖苷(GalN)、N-乙酰氨基半乳糖苷(GalNAc)、神经氨酸苷(Neu)、N-乙酰神经氨酸苷(Neu5Ac)、N-羟乙酰神经氨酸苷、3-脱氧-D-甘油-D-半乳糖基-2-尤罗索尼克酸(KDN)和N-乙酰氨基乳糖苷(Gal-β-1-3-GlcNAc)部分中的任一种作为末端基团。

15.一组酶，其包括包含以下的一组酶：N-酰基-葡萄糖胺2-差向异构酶(AGE)、N-乙酰神经氨酸裂解酶(NAL)、N-酰基神经氨酸胞苷酰转移酶(CSS)、尿苷激酶(UDK)、单磷酸尿苷激酶(URA6)和多磷酸激酶3(PPK3)，其中所述一组酶通过共价键共固定在聚合物上。

16.根据权利要求15所述的一组酶，还包括无机二磷酸酶(PPA)、单结构域多磷酸激酶2(1D-PPK2)和/或双结构域多磷酸激酶2(2D-PPK2)。

17.根据权利要求15或16所述的一组酶，还包括N-乙酰-葡萄糖胺脱乙酰酶。