JP2002085087A - シチジン５’−トリリン酸の製造法及びその応用 - Google Patents
シチジン５’−トリリン酸の製造法及びその応用Info
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- JP2002085087A JP2002085087A JP2001193361A JP2001193361A JP2002085087A JP 2002085087 A JP2002085087 A JP 2002085087A JP 2001193361 A JP2001193361 A JP 2001193361A JP 2001193361 A JP2001193361 A JP 2001193361A JP 2002085087 A JP2002085087 A JP 2002085087A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】安価なシチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）か
ら簡便かつ効率的にシチジン５’−トリリン酸（ＣＴ
Ｐ）を合成する方法およびＣＴＰを消費する酵素反応を
利用した化合物の製造法を提供する。 【解決手段】反応系にアデノシン５’−トリリン酸（Ａ
ＴＰ）及びアデノシン５’−ジリン酸（ＡＤＰ）を添加
することなく、シチジン５’−モノリン酸キナーゼ、ポ
リリン酸キナーゼ及びポリリン酸を使用してシチジン
５’−モノリン酸（ＣＭＰ）からシチジン５’−トリリ
ン酸（ＣＴＰ）を製造する方法に関する。
ら簡便かつ効率的にシチジン５’−トリリン酸（ＣＴ
Ｐ）を合成する方法およびＣＴＰを消費する酵素反応を
利用した化合物の製造法を提供する。 【解決手段】反応系にアデノシン５’−トリリン酸（Ａ
ＴＰ）及びアデノシン５’−ジリン酸（ＡＤＰ）を添加
することなく、シチジン５’−モノリン酸キナーゼ、ポ
リリン酸キナーゼ及びポリリン酸を使用してシチジン
５’−モノリン酸（ＣＭＰ）からシチジン５’−トリリ
ン酸（ＣＴＰ）を製造する方法に関する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、反応系にアデノシ
ン５’−トリリン酸（ＡＴＰ）及びアデノシン５’−ジ
リン酸（ＡＤＰ）を添加することなく、シチジン５’−
モノリン酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ及びポリリン
酸を使用してシチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）から
シチジン５’−トリリン酸（ＣＴＰ）を製造する方法及
びその応用に関するものである。
ン５’−トリリン酸（ＡＴＰ）及びアデノシン５’−ジ
リン酸（ＡＤＰ）を添加することなく、シチジン５’−
モノリン酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ及びポリリン
酸を使用してシチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）から
シチジン５’−トリリン酸（ＣＴＰ）を製造する方法及
びその応用に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】近年の遺伝子操作技術の進展により、さ
まざまな酵素を安価で大量に調製することが可能となっ
た。このことにより、従来、微生物菌体を用いた微生物
変換あるいは発酵生産により合成されてきた有用生理活
性物質が酵素反応により安価に製造することが可能とな
ってきている。生体内におけるヌクレオチド誘導体は種
々の生理活性を有しており、医薬品あるいはその原料と
して利用されている。また、ヌクレオチド誘導体の一種
である糖ヌクレオチドは、糖鎖の酵素合成のための基質
としてその需要が高まってきている。
まざまな酵素を安価で大量に調製することが可能となっ
た。このことにより、従来、微生物菌体を用いた微生物
変換あるいは発酵生産により合成されてきた有用生理活
性物質が酵素反応により安価に製造することが可能とな
ってきている。生体内におけるヌクレオチド誘導体は種
々の生理活性を有しており、医薬品あるいはその原料と
して利用されている。また、ヌクレオチド誘導体の一種
である糖ヌクレオチドは、糖鎖の酵素合成のための基質
としてその需要が高まってきている。
【０００３】糖ヌクレオチドを含むヌクレオチド誘導体
を酵素を利用して合成しようとする場合、ほとんどのケ
ースにおいて、高エネルギー物質であるヌクレオシド
５’−トリリン酸（ＮＴＰ）がその基質となる。ＮＴＰ
は、現在安価なヌクレオシド５’−モノリン酸（ＮＭ
Ｐ）あるいは核酸塩基から化学的にあるいは微生物的に
合成されているが、化学的合成の場合、危険な薬物の使
用が必要であり、それに即した合成設備が必要となる。
さらに、目的物であるＮＴＰの分離精製が容易でないと
いった問題も指摘されていた。また、微生物的合成の場
合、多大な微生物菌体培養設備が必要であり、さらに化
学的合成と同様に目的物の分離精製が容易でないという
問題がある。このため、従来の化学的あるいは微生物的
な方法では、糖ヌクレオチドを初めとするヌクレオチド
誘導体を安価に製造することは事実上不可能なことであ
った。
を酵素を利用して合成しようとする場合、ほとんどのケ
ースにおいて、高エネルギー物質であるヌクレオシド
５’−トリリン酸（ＮＴＰ）がその基質となる。ＮＴＰ
は、現在安価なヌクレオシド５’−モノリン酸（ＮＭ
Ｐ）あるいは核酸塩基から化学的にあるいは微生物的に
合成されているが、化学的合成の場合、危険な薬物の使
用が必要であり、それに即した合成設備が必要となる。
さらに、目的物であるＮＴＰの分離精製が容易でないと
いった問題も指摘されていた。また、微生物的合成の場
合、多大な微生物菌体培養設備が必要であり、さらに化
学的合成と同様に目的物の分離精製が容易でないという
問題がある。このため、従来の化学的あるいは微生物的
な方法では、糖ヌクレオチドを初めとするヌクレオチド
誘導体を安価に製造することは事実上不可能なことであ
った。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】一般に、ＮＭＰを基質
として、酵素的にリン酸化してＮＴＰを合成し、さらに
生成したＮＴＰを基質として糖ヌクレオチドなどのヌク
レオチド誘導体が合成できれば、１ポットで、しかも比
較的安価に各種ヌクレオチド誘導体の合成が可能である
と期待される。酵素反応によりリン酸化を行う場合、多
くの場合、ＡＴＰがエネルギー供与体あるいはリン酸供
与体として必要である。そのため、ＡＴＰを酵素反応系
に添加したり、効率的なＡＴＰの再生系と組み合わせる
ことが不可欠である。
として、酵素的にリン酸化してＮＴＰを合成し、さらに
生成したＮＴＰを基質として糖ヌクレオチドなどのヌク
レオチド誘導体が合成できれば、１ポットで、しかも比
較的安価に各種ヌクレオチド誘導体の合成が可能である
と期待される。酵素反応によりリン酸化を行う場合、多
くの場合、ＡＴＰがエネルギー供与体あるいはリン酸供
与体として必要である。そのため、ＡＴＰを酵素反応系
に添加したり、効率的なＡＴＰの再生系と組み合わせる
ことが不可欠である。
【０００５】しかしながら、ＡＴＰの安価な合成法は現
時点で確立されておらず、市販されているＡＴＰは極め
て高価である。また、ＡＴＰの再生系としては、ホスホ
クレアチンとホスホクレアチンキナーゼとの組み合わ
せ、あるいはホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キ
ナーゼとの組み合わせなどが実験室レベルで使用される
が、基質、酵素とも極めて高価であるため実用的ではな
い。したがって、酵素触媒によりＮＭＰからＮＴＰを生
成させるには、高価なＡＴＰの利用もしくはＡＴＰの再
生系が必要であるため、高価なＡＴＰあるいはＡＴＰ再
生系を使用しない、安価なＮＴＰの合成法の開発が望ま
れていた。
時点で確立されておらず、市販されているＡＴＰは極め
て高価である。また、ＡＴＰの再生系としては、ホスホ
クレアチンとホスホクレアチンキナーゼとの組み合わ
せ、あるいはホスホエノールピルビン酸とピルビン酸キ
ナーゼとの組み合わせなどが実験室レベルで使用される
が、基質、酵素とも極めて高価であるため実用的ではな
い。したがって、酵素触媒によりＮＭＰからＮＴＰを生
成させるには、高価なＡＴＰの利用もしくはＡＴＰの再
生系が必要であるため、高価なＡＴＰあるいはＡＴＰ再
生系を使用しない、安価なＮＴＰの合成法の開発が望ま
れていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ポリリン
酸キナーゼを研究する過程で、（１）ポリリン酸をリン
酸ドナーとして、ポリリン酸キナーゼがＡＤＰ以外のヌ
クレオシド５’―ジリン酸（ＮＤＰ）をリン酸化してＮ
ＴＰを生成させる活性を有すること、および（２）ポリ
リン酸をリン酸ドナーとして、ポリリン酸キナーゼとア
デニレートキナーゼとが協調してＡＭＰからＡＤＰ、続
けてＡＴＰに変換されることを見いだし、それぞれ特許
出願した（ＷＯ９８／２２６１４、ＷＯ９８／４８０３
１）。
酸キナーゼを研究する過程で、（１）ポリリン酸をリン
酸ドナーとして、ポリリン酸キナーゼがＡＤＰ以外のヌ
クレオシド５’―ジリン酸（ＮＤＰ）をリン酸化してＮ
ＴＰを生成させる活性を有すること、および（２）ポリ
リン酸をリン酸ドナーとして、ポリリン酸キナーゼとア
デニレートキナーゼとが協調してＡＭＰからＡＤＰ、続
けてＡＴＰに変換されることを見いだし、それぞれ特許
出願した（ＷＯ９８／２２６１４、ＷＯ９８／４８０３
１）。
【０００７】本発明者らは、さらに検討を重ねた結果、
ポリリン酸をリン酸ドナーとして、シチジン５’−モノ
リン酸キナーゼ（ＣＭＰキナーゼ）もポリリン酸キナー
ゼと協調することでＣＭＰをリン酸化してＣＤＰを生産
し、続けてＣＴＰに変換する活性を有することを見出し
た。
ポリリン酸をリン酸ドナーとして、シチジン５’−モノ
リン酸キナーゼ（ＣＭＰキナーゼ）もポリリン酸キナー
ゼと協調することでＣＭＰをリン酸化してＣＤＰを生産
し、続けてＣＴＰに変換する活性を有することを見出し
た。
【０００８】一般に、下記式に示すように、ＣＭＰキナ
ーゼを用いてＣＭＰをＣＤＰに変換しようとする場合に
はＡＴＰが必須であり、かつ、ＣＭＰキナーゼがリン酸
ドナーとしてポリリン酸を利用できないことは当業者の
常識となっていたことからすると、上記知見はまったく
予想外のことであった。
ーゼを用いてＣＭＰをＣＤＰに変換しようとする場合に
はＡＴＰが必須であり、かつ、ＣＭＰキナーゼがリン酸
ドナーとしてポリリン酸を利用できないことは当業者の
常識となっていたことからすると、上記知見はまったく
予想外のことであった。
【式１】ＣＭＰ ＋ ＡＴＰ → ＣＤＰ ＋ ＡＤＰ
【０００９】したがって、本発明は、ＣＴＰの酵素的製
造法であって、反応系にＡＴＰ及びＡＤＰを添加するこ
となく、ＣＭＰキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ及びポリ
リン酸を使用してＣＭＰからＣＴＰを製造する方法に関
するものである。また、本発明は、ＣＴＰを消費する酵
素反応を利用した化合物の製造法において、反応系にＡ
ＴＰ及びＡＤＰを添加することなく、ＣＭＰキナーゼ、
ポリリン酸キナーゼ及びポリリン酸を使用してＣＭＰか
らＣＴＰを生成させ、当該酵素反応に供給することを特
徴とする当該化合物の製造法に関するものである。
造法であって、反応系にＡＴＰ及びＡＤＰを添加するこ
となく、ＣＭＰキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ及びポリ
リン酸を使用してＣＭＰからＣＴＰを製造する方法に関
するものである。また、本発明は、ＣＴＰを消費する酵
素反応を利用した化合物の製造法において、反応系にＡ
ＴＰ及びＡＤＰを添加することなく、ＣＭＰキナーゼ、
ポリリン酸キナーゼ及びポリリン酸を使用してＣＭＰか
らＣＴＰを生成させ、当該酵素反応に供給することを特
徴とする当該化合物の製造法に関するものである。
【００１０】さらに、本発明は、ＣＴＰを消費する酵素
反応を利用した化合物の製造法において、反応系にＡＴ
Ｐ及びＡＤＰを添加することなく、ＣＭＰキナーゼ、ポ
リリン酸キナーゼ及びポリリン酸を使用して、消費した
ＣＴＰを再生しながら当該酵素反応を行うことを特徴と
する当該化合物の製造法に関するものである。さらにま
た、本発明は、ＣＭＰキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ及
びポリリン酸を組み合わせてなる、反応系にＡＴＰ及び
ＡＤＰを添加することなく、ＣＭＰからＣＴＰを合成す
る系に関するものである。
反応を利用した化合物の製造法において、反応系にＡＴ
Ｐ及びＡＤＰを添加することなく、ＣＭＰキナーゼ、ポ
リリン酸キナーゼ及びポリリン酸を使用して、消費した
ＣＴＰを再生しながら当該酵素反応を行うことを特徴と
する当該化合物の製造法に関するものである。さらにま
た、本発明は、ＣＭＰキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ及
びポリリン酸を組み合わせてなる、反応系にＡＴＰ及び
ＡＤＰを添加することなく、ＣＭＰからＣＴＰを合成す
る系に関するものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明で使用するポリリン酸キナ
ーゼ及びＣＭＰキナーゼは、いずれも公知の酵素であ
り、大腸菌由来のものに限定されず、動物由来、植物由
来、大腸菌以外の微生物由来などのものを使用すること
ができる。特に、酵素の調製の簡便さなどの点から微生
物由来のポリリン酸キナーゼおよびＣＭＰキナーゼが使
用に好都合である。
ーゼ及びＣＭＰキナーゼは、いずれも公知の酵素であ
り、大腸菌由来のものに限定されず、動物由来、植物由
来、大腸菌以外の微生物由来などのものを使用すること
ができる。特に、酵素の調製の簡便さなどの点から微生
物由来のポリリン酸キナーゼおよびＣＭＰキナーゼが使
用に好都合である。
【００１２】また、近年の遺伝子組換え技術を利用して
ポリリン酸キナーゼ遺伝子またはＣＭＰキナーゼ遺伝子
をクローン化し、大腸菌などを宿主としてポリリン酸キ
ナーゼまたはＣＭＰキナーゼを大量生産させ、当該組み
換え菌より上記二種類の酵素をそれぞれ調製することも
可能である（J. Biol. Chem., 267, 22556-22561 (199
2)、J. Biol.Chem., 271, 2856-2862 (1996)）。
ポリリン酸キナーゼ遺伝子またはＣＭＰキナーゼ遺伝子
をクローン化し、大腸菌などを宿主としてポリリン酸キ
ナーゼまたはＣＭＰキナーゼを大量生産させ、当該組み
換え菌より上記二種類の酵素をそれぞれ調製することも
可能である（J. Biol. Chem., 267, 22556-22561 (199
2)、J. Biol.Chem., 271, 2856-2862 (1996)）。
【００１３】反応系に添加するポリリン酸キナーゼおよ
びＣＭＰキナーゼは、当該活性を有する限りどのような
形態であってもかまわない。具体的には、微生物の菌
体、該菌体の処理物または該処理物から得られる酵素調
製物などを例示することができる。微生物の菌体の調製
は、当該微生物が生育可能な培地を用い、常法により培
養後、遠心分離等で集菌する方法で行うことができる。
具体的に、バシラス属または大腸菌類に属する細菌を例
に挙げ説明すれば、培地としてはブイヨン培地、ＬＢ培
地（１％トリプトン、０．５％イーストエキス、１％食
塩）または２×ＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％イ
ーストエキス、０．５％食塩）などを使用することがで
き、当該培地に種菌を接種後、３０〜５０℃で１０〜５
０時間程度必要により撹拌しながら培養し、得られた培
養液を遠心分離して微生物菌体を集菌することによりポ
リリン酸キナーゼ活性またはＣＭＰキナーゼ活性を有す
る微生物菌体を調製することができる。
びＣＭＰキナーゼは、当該活性を有する限りどのような
形態であってもかまわない。具体的には、微生物の菌
体、該菌体の処理物または該処理物から得られる酵素調
製物などを例示することができる。微生物の菌体の調製
は、当該微生物が生育可能な培地を用い、常法により培
養後、遠心分離等で集菌する方法で行うことができる。
具体的に、バシラス属または大腸菌類に属する細菌を例
に挙げ説明すれば、培地としてはブイヨン培地、ＬＢ培
地（１％トリプトン、０．５％イーストエキス、１％食
塩）または２×ＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％イ
ーストエキス、０．５％食塩）などを使用することがで
き、当該培地に種菌を接種後、３０〜５０℃で１０〜５
０時間程度必要により撹拌しながら培養し、得られた培
養液を遠心分離して微生物菌体を集菌することによりポ
リリン酸キナーゼ活性またはＣＭＰキナーゼ活性を有す
る微生物菌体を調製することができる。
【００１４】微生物の菌体処理物としては、上記微生物
菌体を機械的破壊（ワーリングブレンダー、フレンチプ
レス、ホモジナイザー、乳鉢などによる）、凍結融解、
自己消化、乾燥（凍結乾燥、風乾などによる）、酵素処
理（リゾチームなどによる）、超音波処理、化学処理
（酸、アルカリ処理などによる）などの一般的な処理法
に従って処理して得られる菌体の破壊物または菌体の細
胞壁もしくは細胞膜の変性物を例示することができる。
酵素調製物としては、上記菌体処理物からポリリン酸キ
ナーゼ活性またはＣＭＰキナーゼ活性を有する画分を通
常の酵素の精製手段（塩析処理、等電点沈澱処理、有機
溶媒沈澱処理、透析処理、各種クロマトグラフィー処理
など）を施して得られる粗酵素または精製酵素を例示す
ることができる。
菌体を機械的破壊（ワーリングブレンダー、フレンチプ
レス、ホモジナイザー、乳鉢などによる）、凍結融解、
自己消化、乾燥（凍結乾燥、風乾などによる）、酵素処
理（リゾチームなどによる）、超音波処理、化学処理
（酸、アルカリ処理などによる）などの一般的な処理法
に従って処理して得られる菌体の破壊物または菌体の細
胞壁もしくは細胞膜の変性物を例示することができる。
酵素調製物としては、上記菌体処理物からポリリン酸キ
ナーゼ活性またはＣＭＰキナーゼ活性を有する画分を通
常の酵素の精製手段（塩析処理、等電点沈澱処理、有機
溶媒沈澱処理、透析処理、各種クロマトグラフィー処理
など）を施して得られる粗酵素または精製酵素を例示す
ることができる。
【００１５】まず本発明は、ポリリン酸キナーゼ及びＣ
ＭＰキナーゼを用い、反応系にＡＴＰ及びＡＤＰを添加
することなく、ポリリン酸をリン酸ドナーとしてＣＭＰ
からＣＴＰを製造する方法、およびＣＭＰキナーゼ、ポ
リリン酸キナーゼ及びポリリン酸を組み合わせてなる、
反応系にＡＴＰ及びＡＤＰを添加することなく、ＣＭＰ
からＣＴＰを合成する系に関するものである。
ＭＰキナーゼを用い、反応系にＡＴＰ及びＡＤＰを添加
することなく、ポリリン酸をリン酸ドナーとしてＣＭＰ
からＣＴＰを製造する方法、およびＣＭＰキナーゼ、ポ
リリン酸キナーゼ及びポリリン酸を組み合わせてなる、
反応系にＡＴＰ及びＡＤＰを添加することなく、ＣＭＰ
からＣＴＰを合成する系に関するものである。
【００１６】反応に添加するＣＭＰはいずれも市販され
ており、このような市販品を使用することができる。使
用濃度としては、例えば１〜２００ｍＭ、好ましくは１
０〜１００ｍＭの範囲から適宜設定することができる。
また、リン酸ドナーとしてのポリリン酸も市販のものが
使用できる。使用濃度としては、無機リン酸に換算して
１〜１０００ｍＭ、好ましくは１０〜２００ｍＭの範囲
から適宜設定することができる。また、重合度の高いポ
リリン酸を使用することにより、ＣＴＰの合成をより加
速することができ、そのようなポリリン酸としては、１
００以上、好ましくは５００以上のリン酸が重合したポ
リリン酸を例示することができる。
ており、このような市販品を使用することができる。使
用濃度としては、例えば１〜２００ｍＭ、好ましくは１
０〜１００ｍＭの範囲から適宜設定することができる。
また、リン酸ドナーとしてのポリリン酸も市販のものが
使用できる。使用濃度としては、無機リン酸に換算して
１〜１０００ｍＭ、好ましくは１０〜２００ｍＭの範囲
から適宜設定することができる。また、重合度の高いポ
リリン酸を使用することにより、ＣＴＰの合成をより加
速することができ、そのようなポリリン酸としては、１
００以上、好ましくは５００以上のリン酸が重合したポ
リリン酸を例示することができる。
【００１７】ＣＴＰの合成反応は、ｐＨ４〜１０の範囲
の適当な緩衝液中にＣＭＰ及びポリリン酸を添加し、さ
らに０．００１ユニット／ｍｌ以上、好ましくは０．０
０１〜１０ユニット／ｍｌのポリリン酸キナーゼ、及び
０．０１ユニット／ｍｌ以上、好ましくは０．０１〜１
００ユニット／ｍｌ以上のＣＭＰキナーゼを添加し、２
０℃以上、好ましくは３０〜４０℃で１〜５０時間程、
必要により撹拌しながら反応させることにより実施でき
る。このようにして得られたＣＴＰは、公知の方法（た
とえば、イオン交換クロマトグラフィーなど）にて単離
精製することができる。
の適当な緩衝液中にＣＭＰ及びポリリン酸を添加し、さ
らに０．００１ユニット／ｍｌ以上、好ましくは０．０
０１〜１０ユニット／ｍｌのポリリン酸キナーゼ、及び
０．０１ユニット／ｍｌ以上、好ましくは０．０１〜１
００ユニット／ｍｌ以上のＣＭＰキナーゼを添加し、２
０℃以上、好ましくは３０〜４０℃で１〜５０時間程、
必要により撹拌しながら反応させることにより実施でき
る。このようにして得られたＣＴＰは、公知の方法（た
とえば、イオン交換クロマトグラフィーなど）にて単離
精製することができる。
【００１８】また、本発明は、ＣＴＰを消費する酵素反
応を利用した化合物の製造法において、反応系にＡＴＰ
及びＡＤＰを添加することなく、ＣＭＰキナーゼ、ポリ
リン酸キナーゼ及びポリリン酸を使用してＣＭＰからＣ
ＴＰを生成させる本発明のＣＴＰ合成系を適応し、当該
酵素反応にＣＴＰを供給あるいは消費されたＣＴＰを再
生させることを特徴とする当該化合物の製造法に関する
ものである。
応を利用した化合物の製造法において、反応系にＡＴＰ
及びＡＤＰを添加することなく、ＣＭＰキナーゼ、ポリ
リン酸キナーゼ及びポリリン酸を使用してＣＭＰからＣ
ＴＰを生成させる本発明のＣＴＰ合成系を適応し、当該
酵素反応にＣＴＰを供給あるいは消費されたＣＴＰを再
生させることを特徴とする当該化合物の製造法に関する
ものである。
【００１９】本発明のＣＴＰ合成系が適用可能なＣＴＰ
を消費する酵素反応系としては、ＣＴＰを消費する酵素
反応であれば特に限定されるものではなく、たとえば、
ＣＭＰシアル酸合成系（ＣＴＰ生成系、Ｎ−アセチルノ
イラミン酸及びＣＭＰシアル酸合成酵素の組み合わせ、
図１）、ＣＤＰコリン合成系（ＣＴＰ生成系、ホスホコ
リン及びコリンホスフェートシチジルトランスフェラー
ゼの組み合わせ、図２）などを例示することができる。
このようなＣＴＰ合成系と酵素反応とのカップリング条
件は、小規模試験にて適宜決定すればよく、また目的化
合物の単離精製も公知の方法により行うことができる。
を消費する酵素反応系としては、ＣＴＰを消費する酵素
反応であれば特に限定されるものではなく、たとえば、
ＣＭＰシアル酸合成系（ＣＴＰ生成系、Ｎ−アセチルノ
イラミン酸及びＣＭＰシアル酸合成酵素の組み合わせ、
図１）、ＣＤＰコリン合成系（ＣＴＰ生成系、ホスホコ
リン及びコリンホスフェートシチジルトランスフェラー
ゼの組み合わせ、図２）などを例示することができる。
このようなＣＴＰ合成系と酵素反応とのカップリング条
件は、小規模試験にて適宜決定すればよく、また目的化
合物の単離精製も公知の方法により行うことができる。
【００２０】
【発明の効果】本発明により、安価なＣＭＰから簡便か
つ効率的にＣＴＰを合成することが可能となった。従っ
て、このＣＴＰ合成系をＣＴＰを消費する酵素反応系と
組み合わせて用いることにより、効率的に目的とする化
合物を合成することが可能となった。
つ効率的にＣＴＰを合成することが可能となった。従っ
て、このＣＴＰ合成系をＣＴＰを消費する酵素反応系と
組み合わせて用いることにより、効率的に目的とする化
合物を合成することが可能となった。
【００２１】
【実施例】以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明
するが、本発明がこれに限定されないことは明らかであ
る。また、実施例におけるＤＮＡの調製、制限酵素によ
る切断、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ連結、並びに
大腸菌の形質転換法は全て「Molecular cloning」（Man
iatisら編、Cold Spring Harbor Laboratory, ColdSpri
ng Harbor, New York (1982)）に従って行った。また、
制限酵素、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼは宝酒造（株）より入手した。さらに、
反応液中のヌクレオチド類の定量にはＨＰＬＣ法により
行った。具体的には、分離にはＹＭＣ社製のＯＤＳ−Ａ
Ｑ３１２カラムを用い、溶出液として０．５Ｍリン酸一
カリウム溶液を用いた。
するが、本発明がこれに限定されないことは明らかであ
る。また、実施例におけるＤＮＡの調製、制限酵素によ
る切断、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ連結、並びに
大腸菌の形質転換法は全て「Molecular cloning」（Man
iatisら編、Cold Spring Harbor Laboratory, ColdSpri
ng Harbor, New York (1982)）に従って行った。また、
制限酵素、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼは宝酒造（株）より入手した。さらに、
反応液中のヌクレオチド類の定量にはＨＰＬＣ法により
行った。具体的には、分離にはＹＭＣ社製のＯＤＳ−Ａ
Ｑ３１２カラムを用い、溶出液として０．５Ｍリン酸一
カリウム溶液を用いた。
【００２２】実施例１ （１）大腸菌ポリリン酸キナーゼの調製 大腸菌Ｋ１２株ＪＭ１０９菌（宝酒造より入手）の染色
体ＤＮＡを斉藤と三浦の方法（Biochim. Biophys. Act
a., 72, 619 (1963)）で調製した。このＤＮＡをテン
ペレートとして、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡ
を常法に従って合成し、ＰＣＲ法により大腸菌ポリリン
酸キナーゼ（ｐｐｋ）遺伝子を増幅した。
体ＤＮＡを斉藤と三浦の方法（Biochim. Biophys. Act
a., 72, 619 (1963)）で調製した。このＤＮＡをテン
ペレートとして、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡ
を常法に従って合成し、ＰＣＲ法により大腸菌ポリリン
酸キナーゼ（ｐｐｋ）遺伝子を増幅した。
【００２３】プライマー（Ａ）：5'-TACCATGGGTCAGGAAA
AGCTATA-3' プライマー（Ｂ）：5'-ATGGATCCTTATTCAGGTTGTTCGAGTGA
-3'
AGCTATA-3' プライマー（Ｂ）：5'-ATGGATCCTTATTCAGGTTGTTCGAGTGA
-3'
【００２４】ＰＣＲによるｐｐｋ遺伝子の増幅は、反応
液１００ｍｌ中（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネシ
ウム、０．００１％ゼラチン、テンペレートＤＮＡ
０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）（Ｂ）各々０．２
μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ ２．５ユ
ニット）をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉ
ｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙ
ｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニーリ
ング（５５℃、１．５分）、ポリメライゼーション（７
２℃、１．５分）のステップを２５回繰り返すことによ
り行った。
液１００ｍｌ中（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネシ
ウム、０．００１％ゼラチン、テンペレートＤＮＡ
０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）（Ｂ）各々０．２
μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ ２．５ユ
ニット）をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ Ｉ
ｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙ
ｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニーリ
ング（５５℃、１．５分）、ポリメライゼーション（７
２℃、１．５分）のステップを２５回繰り返すことによ
り行った。
【００２５】遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロ
ロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍
容のエタノールを添加してＤＮＡを沈殿させた。沈殿回
収したＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方
法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．
０ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵
素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで切断し、同じく制限酵素Ｎ
ｃｏＩ及びＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９
９Ａ（Pharmacia Biotech 社より入手）とＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌Ｊ
Ｍ１０９菌を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形
質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ−ＰＰＫを単離した。
ｐＴｒｃ−ＰＰＫは、ｐＴｒｃ９９Ａのｔｒｃプロモー
ター下流のＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ切断部位に大腸菌ｐｐ
ｋ遺伝子を含有するＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片
が挿入されたものである。
ロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍
容のエタノールを添加してＤＮＡを沈殿させた。沈殿回
収したＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方
法に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．
０ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵
素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで切断し、同じく制限酵素Ｎ
ｃｏＩ及びＢａｍＨＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９
９Ａ（Pharmacia Biotech 社より入手）とＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌Ｊ
Ｍ１０９菌を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形
質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ−ＰＰＫを単離した。
ｐＴｒｃ−ＰＰＫは、ｐＴｒｃ９９Ａのｔｒｃプロモー
ター下流のＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ切断部位に大腸菌ｐｐ
ｋ遺伝子を含有するＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片
が挿入されたものである。
【００２６】プラスミドｐＴｒｃ−ＰＰＫを保持する大
腸菌ＪＭ１０９菌を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン
を含有する２ｘＹＴ培地３００ｍｌに植菌し、３７℃で
振とう培養した。４ｘ１０8菌／ｍｌに達した時点で、
培養液に終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、
さらに３０℃で５時間振とう培養を続けた。培養終了
後、遠心分離（９，０００ｘｇ，１０分）により菌体を
回収し、３０ｍｌの緩衝液（５ｍＭ ＥＤＴＡ含有５０
ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．５））に懸濁した後、超音
波処理を行い、菌体を破砕し、さらに遠心分離（２０，
０００ｘｇ、１０分）により菌体残さを除去した。
腸菌ＪＭ１０９菌を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン
を含有する２ｘＹＴ培地３００ｍｌに植菌し、３７℃で
振とう培養した。４ｘ１０8菌／ｍｌに達した時点で、
培養液に終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、
さらに３０℃で５時間振とう培養を続けた。培養終了
後、遠心分離（９，０００ｘｇ，１０分）により菌体を
回収し、３０ｍｌの緩衝液（５ｍＭ ＥＤＴＡ含有５０
ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．５））に懸濁した後、超音
波処理を行い、菌体を破砕し、さらに遠心分離（２０，
０００ｘｇ、１０分）により菌体残さを除去した。
【００２７】このように得られた上清画分を５ｍＭ 塩
化マグネシウム及び１ｍＭ ２−メルカプトエタノール
を含有する５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．８）に対して
透析を行い、粗酵素液とした。粗酵素液を硫安塩析及び
イオン交換クロマトグラフィー処理を行い、ポリリン酸
キナーゼを精製し、酵素標品とした。酵素標品における
ポリリン酸キナーゼの比活性は、０．６ユニット／ｍｇ
蛋白質であった。
化マグネシウム及び１ｍＭ ２−メルカプトエタノール
を含有する５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．８）に対して
透析を行い、粗酵素液とした。粗酵素液を硫安塩析及び
イオン交換クロマトグラフィー処理を行い、ポリリン酸
キナーゼを精製し、酵素標品とした。酵素標品における
ポリリン酸キナーゼの比活性は、０．６ユニット／ｍｇ
蛋白質であった。
【００２８】なお、ポリリン酸キナーゼ活性の単位（ユ
ニット）は、以下に示す方法で測定、算出した。すなわ
ち、５ｍＭ 塩化マグネシウム、１００ｍＭ 硫安、５ｍ
ＭＡＤＰ、及びポリリン酸（無機リン酸として１００
ｍＭ）を含有する２５ ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．８）に酵素標品を添加して、３７℃で保温すること
で反応を行い、１００℃、１分間の熱処理により反応を
停止させる。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
を用いて反応液中のＡＴＰを定量し、３７℃で１分間に
１μｍｏｌｅのＡＴＰを生成する活性を１単位（ユニッ
ト）とする。
ニット）は、以下に示す方法で測定、算出した。すなわ
ち、５ｍＭ 塩化マグネシウム、１００ｍＭ 硫安、５ｍ
ＭＡＤＰ、及びポリリン酸（無機リン酸として１００
ｍＭ）を含有する２５ ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．８）に酵素標品を添加して、３７℃で保温すること
で反応を行い、１００℃、１分間の熱処理により反応を
停止させる。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
を用いて反応液中のＡＴＰを定量し、３７℃で１分間に
１μｍｏｌｅのＡＴＰを生成する活性を１単位（ユニッ
ト）とする。
【００２９】（２）大腸菌ＣＭＰキナーゼの調製 用いたプライマー及びクローニングに用いた制限酵素が
異なる以外は、大腸菌ポリリン酸キナーゼと同様の方法
で大腸菌よりＣＭＰキナーゼ遺伝子をＰＣＲにより増幅
し、ｐＴｒｃ９９ＡのＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ切断部位に
クローニングした。なお、用いたプライマーと作製され
たプラスミド名は以下の通りである。 プライマー（Ｃ）：5'- TACCATGGAGATAAAGATGACGGCAATT
-3' プライマー（Ｄ）：5'- ATGGATCCTGCAAATTCGGTCGCTTATG
C -3'プラスミド：ｐＴｒｃ―ＣＭＫ
異なる以外は、大腸菌ポリリン酸キナーゼと同様の方法
で大腸菌よりＣＭＰキナーゼ遺伝子をＰＣＲにより増幅
し、ｐＴｒｃ９９ＡのＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ切断部位に
クローニングした。なお、用いたプライマーと作製され
たプラスミド名は以下の通りである。 プライマー（Ｃ）：5'- TACCATGGAGATAAAGATGACGGCAATT
-3' プライマー（Ｄ）：5'- ATGGATCCTGCAAATTCGGTCGCTTATG
C -3'プラスミド：ｐＴｒｃ―ＣＭＫ
【００３０】ＣＭＰキナーゼは、ポリリン酸キナーゼの
調製と同様の方法で、生産と精製を行った。調製された
ＣＭＰキナーゼの酵素活性は３７ユニット／ｍｇ蛋白質
であった。なお、ＣＭＰキナーゼ活性の単位（ユニッ
ト）は次の方法で測定、算出した。すなわち、５０ｍＭ
ヘペス（Hepes）緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ
硫酸アンモニウム、１０ｍＭ 塩化マグネシウム、５ｍ
Ｍ ＣＭＰ、１０ｍＭ ＡＴＰの条件下で３０℃で保温
することにより反応を行い、１分間煮沸することにより
酵素を失活させる。ＨＰＬＣにより反応液中のＣＤＰを
定量し、３０℃で１分間に１μｍｏｌｅのＣＤＰを生成
する活性を１単位（ユニット）とする。
調製と同様の方法で、生産と精製を行った。調製された
ＣＭＰキナーゼの酵素活性は３７ユニット／ｍｇ蛋白質
であった。なお、ＣＭＰキナーゼ活性の単位（ユニッ
ト）は次の方法で測定、算出した。すなわち、５０ｍＭ
ヘペス（Hepes）緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ
硫酸アンモニウム、１０ｍＭ 塩化マグネシウム、５ｍ
Ｍ ＣＭＰ、１０ｍＭ ＡＴＰの条件下で３０℃で保温
することにより反応を行い、１分間煮沸することにより
酵素を失活させる。ＨＰＬＣにより反応液中のＣＤＰを
定量し、３０℃で１分間に１μｍｏｌｅのＣＤＰを生成
する活性を１単位（ユニット）とする。
【００３１】（３）ポリリン酸キナーゼとＣＭＰキナー
ゼによるＣＭＰからのＣＤＰ及びＣＴＰの合成 ポリリン酸キナーゼ ０．０４ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ＣＭ
Ｐキナーゼ ０．３ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、５０ｍＭ トリス
塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ 硫酸アンモニウ
ム、１０ｍＭ 塩化マグネシウム、５ｍＭ ＣＭＰ、ポリ
リン酸（無機リン酸として７５ｍＭ）の組成からなる反
応液を３７℃で１２時間インキュベートした。その結
果、ＣＤＰ及びＣＴＰが４．１ｍＭ生成した。
ゼによるＣＭＰからのＣＤＰ及びＣＴＰの合成 ポリリン酸キナーゼ ０．０４ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ＣＭ
Ｐキナーゼ ０．３ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、５０ｍＭ トリス
塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ 硫酸アンモニウ
ム、１０ｍＭ 塩化マグネシウム、５ｍＭ ＣＭＰ、ポリ
リン酸（無機リン酸として７５ｍＭ）の組成からなる反
応液を３７℃で１２時間インキュベートした。その結
果、ＣＤＰ及びＣＴＰが４．１ｍＭ生成した。
【００３２】実施例２ （１）ポリリン酸キナーゼとＣＭＰキナーゼによるＣＭ
ＰからのＣＴＰの合成 ポリリン酸キナーゼ ０．０８ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ＣＭ
Ｐキナーゼ １０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、１００ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ 硫酸アンモニウ
ム、２０ｍＭ 塩化マグネシウム、５ｍＭ ＣＭＰ、ポ
リリン酸（無機リン酸として７５ｍＭ）の組成からなる
反応液を３７℃で１６時間インキュベートした。経時的
に反応液の分析を行った結果を図３に示す。該反応によ
り、２．５ｍＭのＣＴＰが生成し、対ＣＭＰモル収率は
５０％であった。
ＰからのＣＴＰの合成 ポリリン酸キナーゼ ０．０８ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ＣＭ
Ｐキナーゼ １０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、１００ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ 硫酸アンモニウ
ム、２０ｍＭ 塩化マグネシウム、５ｍＭ ＣＭＰ、ポ
リリン酸（無機リン酸として７５ｍＭ）の組成からなる
反応液を３７℃で１６時間インキュベートした。経時的
に反応液の分析を行った結果を図３に示す。該反応によ
り、２．５ｍＭのＣＴＰが生成し、対ＣＭＰモル収率は
５０％であった。
【００３３】実施例３ （１）ＣＭＰシアル酸合成酵素の調製 先のポリリン酸キナーゼ遺伝子と同様の方法でＣＭＰシ
アル酸合成酵素遺伝子をクローニングし、ｐＴｒｃ−ｓ
ｉａＢを得た。ただし、染色体ＤＮＡは、 Haemophilus
influenzae （ATCC9795）を用い、ＰＣＲ用のプライマ
ーは下記の（Ｅ）（Ｆ）を用い、ｐＴｒｃ９９Ａへのク
ローニングには ＮｃｏＩとＰｓｔＩを用いた。 プライマー（Ｅ）：5'-TGCCATGGTGAAAATAATAATGACAAGAA
-3' プライマー（Ｆ）：5'-AACTGCAGGTGCAGATCAAAAGTGCGGCC
-3'
アル酸合成酵素遺伝子をクローニングし、ｐＴｒｃ−ｓ
ｉａＢを得た。ただし、染色体ＤＮＡは、 Haemophilus
influenzae （ATCC9795）を用い、ＰＣＲ用のプライマ
ーは下記の（Ｅ）（Ｆ）を用い、ｐＴｒｃ９９Ａへのク
ローニングには ＮｃｏＩとＰｓｔＩを用いた。 プライマー（Ｅ）：5'-TGCCATGGTGAAAATAATAATGACAAGAA
-3' プライマー（Ｆ）：5'-AACTGCAGGTGCAGATCAAAAGTGCGGCC
-3'
【００３４】ＣＭＰシアル酸合成酵素は、ポリリン酸キ
ナーゼと同様の方法で生産させ、粗酵素液を調製した。
得られた粗酵素液は、硫安塩析及びイオン交換クロマト
グラフィー及びゲル濾過処理を行い、ＣＭＰシアル酸合
成酵素を精製し、酵素標品とした。酵素標品におけるＣ
ＭＰシアル酸合成酵素の比活性は、６．５ ユニット／
ｍｇ蛋白質であった。
ナーゼと同様の方法で生産させ、粗酵素液を調製した。
得られた粗酵素液は、硫安塩析及びイオン交換クロマト
グラフィー及びゲル濾過処理を行い、ＣＭＰシアル酸合
成酵素を精製し、酵素標品とした。酵素標品におけるＣ
ＭＰシアル酸合成酵素の比活性は、６．５ ユニット／
ｍｇ蛋白質であった。
【００３５】なお、ＣＭＰシアル酸合成酵素活性の測定
と単位の算出は次の方法で行った。すなわち、５ｍＭ
ＣＴＰ、５ｍＭ Ｎ−アセチルノイラミン酸、２０ｍＭ
塩化マグネシウムを含有する１００ｍＭトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ８．０）に酵素標品を添加し、３７℃で保温
することで反応を行い、等量の７０％エタノールを添加
して反応を停止させる。高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）を用いて反応液中のＣＭＰシアル酸を定量
し、３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのＣＭＰシアル酸を
生成する活性を１単位（ユニット）とする。
と単位の算出は次の方法で行った。すなわち、５ｍＭ
ＣＴＰ、５ｍＭ Ｎ−アセチルノイラミン酸、２０ｍＭ
塩化マグネシウムを含有する１００ｍＭトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ８．０）に酵素標品を添加し、３７℃で保温
することで反応を行い、等量の７０％エタノールを添加
して反応を停止させる。高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）を用いて反応液中のＣＭＰシアル酸を定量
し、３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのＣＭＰシアル酸を
生成する活性を１単位（ユニット）とする。
【００３６】（２）ＣＭＰからのＣＭＰシアル酸の酵素
合成 ポリリン酸キナーゼ ０．０８ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ＣＭ
Ｐキナーゼ １０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ＣＭＰシアル酸合
成酵素 ０．２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ピロホスファター
ゼ（シグマ社）１．０ｕｎｉｔ／ｍｌ、１００ｍＭ ト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ 硫酸アンモ
ニウム、２０ｍＭ 塩化マグネシウム、１５ｍＭ ＣＭ
Ｐ、１５ｍＭ Ｎ―アセチルノイラミン酸、ポリリン酸
（無機リン酸として１５０ｍＭ）の組成からなる反応液
を３７℃で２２時間インキュベートした。経時的に反応
液の分析を行った結果を図４に示す。該反応により、
９．５ｍＭのＣＭＰシアル酸が生成し、対ＣＭＰモル収
率は６３％であった。
合成 ポリリン酸キナーゼ ０．０８ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ＣＭ
Ｐキナーゼ １０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ＣＭＰシアル酸合
成酵素 ０．２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ピロホスファター
ゼ（シグマ社）１．０ｕｎｉｔ／ｍｌ、１００ｍＭ ト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ 硫酸アンモ
ニウム、２０ｍＭ 塩化マグネシウム、１５ｍＭ ＣＭ
Ｐ、１５ｍＭ Ｎ―アセチルノイラミン酸、ポリリン酸
（無機リン酸として１５０ｍＭ）の組成からなる反応液
を３７℃で２２時間インキュベートした。経時的に反応
液の分析を行った結果を図４に示す。該反応により、
９．５ｍＭのＣＭＰシアル酸が生成し、対ＣＭＰモル収
率は６３％であった。
【００３７】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> YAMASA CORPORATION <120> Process for producing cytidine 5'-triphosphate and application of the same <130> YP2001-009 <140> <141> <160> 6 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of ppk gene <400> 1 taccatgggt caggaaaagc tata 24 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of ppk gene <400> 2 atggatcctt attcaggttg ttcgagtga 29 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of cmk gene <400> 3 taccatggag ataaagatga cggcaatt 28 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of cmk gene <400> 4 atggatcctg caaattcggt cgcttatgc 29 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of siaB gene <400> 5 tgccatggtg aaaataataa tgacaagaa 29 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of siaB gene <400> 6 aactgcaggt gcagatcaaa agtgcggcc 29
【００３８】
【図１】図１は、本発明におけるＣＭＰシアル酸（ＣＭ
Ｐ−ＮｅｕＡｃ）合成系（ＣＴＰ生成系、Ｎ−アセチル
ノイラミン酸及びＣＭＰシアル酸合成酵素の組み合わ
せ）の反応スキームを示したものである。
Ｐ−ＮｅｕＡｃ）合成系（ＣＴＰ生成系、Ｎ−アセチル
ノイラミン酸及びＣＭＰシアル酸合成酵素の組み合わ
せ）の反応スキームを示したものである。
【図２】図２は、本発明におけるＣＤＰコリン（ＣＤＰ
−Ｃｈｏｌｉｎｅ）合成系（ＣＴＰ生成系、ホスホコリ
ン及びコリンホスフェートシチジルトランスフェラーゼ
の組み合わせ）の反応スキームを示したものである。
−Ｃｈｏｌｉｎｅ）合成系（ＣＴＰ生成系、ホスホコリ
ン及びコリンホスフェートシチジルトランスフェラーゼ
の組み合わせ）の反応スキームを示したものである。
【図３】図３は、ＣＭＰからのＣＤＰ及びＣＴＰ合成に
おける化合物の経時的変化を示したものである。
おける化合物の経時的変化を示したものである。
【図４】図４は、ＣＭＰからのＣＭＰシアル酸合成にお
ける化合物の経時的変化を示したものである。
ける化合物の経時的変化を示したものである。
Claims (4)
- 【請求項１】 シチジン５’−トリリン酸の酵素的製造
法であって、反応系にアデノシン５’−トリリン酸及び
アデノシン５’−ジリン酸を添加することなく、シチジ
ン５’−モノリン酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ及び
ポリリン酸を使用してシチジン５’−モノリン酸からシ
チジン５’−トリリン酸を製造する方法。 - 【請求項２】 シチジン５’−トリリン酸を消費する酵
素反応を利用した化合物の製造法において、反応系にア
デノシン５’−トリリン酸及びアデノシン５’−ジリン
酸を添加することなく、シチジン５’−モノリン酸キナ
ーゼ、ポリリン酸キナーゼ及びポリリン酸を使用してシ
チジン５’−モノリン酸からシチジン５’−トリリン酸
を生成させ、当該酵素反応に供給することを特徴とする
当該化合物の製造法。 - 【請求項３】 シチジン５’−トリリン酸を消費する酵
素反応を利用した化合物の製造法において、反応系にア
デノシン５’−トリリン酸及びアデノシン５’−ジリン
酸を添加することなく、シチジン５’−モノリン酸キナ
ーゼ、ポリリン酸キナーゼ及びポリリン酸を使用して消
費したシチジン５’−トリリン酸を再生しながら当該酵
素反応を行うことを特徴とする当該化合物の製造法。 - 【請求項４】 シチジン５’−モノリン酸キナーゼ、ポ
リリン酸キナーゼ及びポリリン酸を組み合わせてなる、
反応系にアデノシン５’−トリリン酸及びアデノシン
５’−ジリン酸を添加することなく、シチジン５’−モ
ノリン酸からシチジン５’−トリリン酸を合成する系。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001193361A JP2002085087A (ja) | 2000-07-12 | 2001-06-26 | シチジン５’−トリリン酸の製造法及びその応用 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000210635 | 2000-07-12 | ||
| JP2000-210635 | 2000-07-12 | ||
| JP2001193361A JP2002085087A (ja) | 2000-07-12 | 2001-06-26 | シチジン５’−トリリン酸の製造法及びその応用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002085087A true JP2002085087A (ja) | 2002-03-26 |
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|---|---|---|---|
| JP2001193361A Pending JP2002085087A (ja) | 2000-07-12 | 2001-06-26 | シチジン５’−トリリン酸の製造法及びその応用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002085087A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3892731A1 (en) * | 2020-04-08 | 2021-10-13 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Enzymatic method for preparation of cmp-neu5ac |
| CN115895993A (zh) * | 2022-12-29 | 2023-04-04 | 江苏香地化学有限公司 | 一种促进胞嘧啶核苷三磷酸合成的方法 |
| JP7574316B2 (ja) | 2020-04-08 | 2024-10-28 | マックス プランク ゲゼルシャフト ツゥアー フェデルゥン デル ヴィッセンシャフテン エー フォー | ＣＭＰ－Ｎｅｕ５ＡＣの調製のための酵素的方法 |
-
2001
- 2001-06-26 JP JP2001193361A patent/JP2002085087A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3892731A1 (en) * | 2020-04-08 | 2021-10-13 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Enzymatic method for preparation of cmp-neu5ac |
| WO2021204898A1 (en) * | 2020-04-08 | 2021-10-14 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Enzymatic method for preparation of cmp-neu5ac |
| JP7574316B2 (ja) | 2020-04-08 | 2024-10-28 | マックス プランク ゲゼルシャフト ツゥアー フェデルゥン デル ヴィッセンシャフテン エー フォー | ＣＭＰ－Ｎｅｕ５ＡＣの調製のための酵素的方法 |
| CN115895993A (zh) * | 2022-12-29 | 2023-04-04 | 江苏香地化学有限公司 | 一种促进胞嘧啶核苷三磷酸合成的方法 |
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