CN1219063C - 一种耐高温木聚糖酶和编码该酶的基因 - Google Patents

Abstract

本发明公开了由海栖热袍菌MSB8(Thermotoga maritima MSB8)基因组DNA借助PCR扩增而得到的木聚糖酶B基因(xylanase B gene，xynB)，和构建表达载体在大肠杆菌中表达出该基因编码的重组木聚糖酶。该酶的最适反应温度为90℃，在中性和偏碱性环境中热稳定性好，木聚糖酶酶活力是纤维素酶活力的1100倍以上。该酶作为助漂剂应用于制浆造纸行业表现出良好的应用前景。水解木聚糖的主要产物以木二糖为主，适合分解半纤维素中的木聚糖生产功能性低聚木糖。

Description

一种耐高温木聚糖酶和编码该酶的基因

发明领域

本发明涉及一种木聚糖酶，编码该酶的基因和含有该基因的表达载体。

发明背景

半纤维素是仅次于纤维素之后含量第二丰富的可利用自然资源，其主要成分是木聚糖。β-1，4-内切木聚糖酶(EC.3.2.1.8)能够以内切方式作用于木聚糖主链产生不同长度的木寡糖和少量的木糖，是木聚糖降解酶中最关键的酶。木聚糖酶可广泛应用于生物转化、食品、饲料、医药、能源、造纸、纺织等行业。木聚糖酶可以由多种微生物产生，但由于一般微生物所产的木聚糖酶为中低温或偏酸性，在工业应用上受到了很大限制。

耐热或耐高温木聚糖酶在工业应用中有很多优点，因此近年来国外关于这方面的专利文献报道较多。例如，USP5,395,765、USP5,437,992、USP5,489,526、USP5,738,384、USP5,888,802、USP5,871,730、USP5,916,795、USP6,083,733、USP6,132,716，揭示耐高温木聚糖酶的来源、重组酶及其应用。中国专利公开CN1074935公开了一种生物漂白用木聚糖酶、CN1126784公开了一种利用木聚糖酶改善草浆性能的工艺、CN1170429公开了一种含有木聚糖酶的清洗组合物。另外，CN1143387公开了一种热稳定性木聚糖酶，介绍的木聚糖酶在80℃以上有活性。CN1266903A公开了一种重组木聚糖酶、其制备方法及应用，介绍的是借助PCR扩增荧光假单胞菌(Psmdomonas fhomem)中的木聚糖酶基因得到的重组木聚糖酶；CN00814240.8公开了改进G/11家族木聚糖酶的稳定性并且扩展其pH范围的方法，介绍的里氏木霉(Trichoderma reesei)木聚糖酶XYNII基因。

发明内容

本发明是基于本发明的发明人的下述发现而完成的：由于应用木聚糖酶的许多工业过程中，通常是在高温条件下进行，需要木聚糖酶具有良好的热稳定性。耐热菌往往培养困难，有的还需要在高温厌氧条件下培养，产酶量低而且酶系复杂，很难得到纯酶。已经证明海栖热袍菌MSB8产生的酶系比较复杂，属于纤维素和半纤维素降解酶系的有8种。水解木聚糖的微生物所产生的酶系比较复杂，大多微生物都产生一种以上的木聚糖酶。分子遗传学的研究发现这些微生物本身都含有一种以上的木聚糖酶基因。这也是木聚糖酶多样性的主要原因。极端嗜热菌栖热袍菌属(Thermotoga)的T.maritima sp.strain FjSS3-B.1和T.neapolitana都具有3个不同的木聚糖酶基因。迄今，关于海栖热袍菌MSB8木聚糖酶的研究都仅限于第一个木聚糖酶(基因为xynA)。例如，xynA基因已被克隆和表达在大肠杆菌中，纯化的克隆酶表现出很高的热稳定性，最适温度和pH值分别为90℃和pH6.2。还有一些报道研究木聚糖酶XynA的耐热机理和多功能区域。尚未见到海栖热袍菌MSB8的第二个木聚糖酶的报道。基于以上情况，在本发明以海栖热袍菌MSB8的基因组DNA为模板，借助PCR扩增而得到海栖热袍菌MSB8的第二个木聚糖酶基因，该产物被命名为xynB，随后将此DNA片段插入质粒中，进行xynB基因进行克隆、表达和重组酶的制备。

根据许多糖苷键水解酶催化区域的氨基酸序列组成和疏水簇分析，可将其分成许多族。目前已知所有的木聚糖酶都属于F/10或G/11族，不同木聚糖酶分子在其氨基酸组成的数目上相差很大，但它们的催化区在大小上比较一致，同一族中的木聚糖酶催化区域具有较高的同源性。本发明涉及的耐高温木聚糖酶B是一新型的木聚糖酶。测定的重组xynB基因序列如图2所示(SEQ ID NO：1)，由1074对碱基组成，编码358个氨基酸如图3所示(SEQ ID NO：2)，计算分子量约为41,938kDa。通过对本发明涉及的耐高温木聚糖酶B氨基酸序列比较分析，根据已知木聚糖酶蛋白质氨基酸的同源性调查，发现XynB与T.sp.strain FjSS3-B.1的XynA的同源性最大，达到85％(85％identity，accession No.U33060)，与T.neapolitana的XynB同源性次之，为82％(82％identity，accession No.Z49961)。与其它木聚糖酶的同源性小于43％。另外，从xynB基因序列和编码氨基酸与其它木聚糖酶基因序列和编码氨基酸相比较，还可以看出该酶属于F/10族木聚糖酶，并且只含有一个单一功能区。

本发明涉及的耐高温木聚糖酶B的性能不同于已知的木聚糖酶，该酶的最适反应温度为90℃，在中性和偏碱性环境中热稳定性好，木聚糖酶酶活力是纤维素酶活力的1100倍以上，在迄今发现的耐高温木聚糖酶中是最高的。水解木聚糖的主要产物以木二糖为主，适合分解半纤维素中的木聚糖生产功能性低聚木糖。

本发明的一个目的是提供一种耐高温重组木聚糖酶。

本发明的另一个目的是提供一种编码本发明的木聚糖酶的基因。

本发明的一个目的是提供一种含有本发明的基因的表达载体。

本发明提供了一种编码本发明的木聚糖酶的基因，该基因具有选自下组的核苷酸序列：

(4)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

(5)由于遗传密码的简并性，不同于SEQ ID NO：1但编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：1所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；

(6)在严谨杂交条件下仍能够与上述(1)或(2)中的序列杂交，但同时编码具有活性的木聚糖酶的核苷酸序列。

严谨杂交条件是指，将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS)中，65℃预杂交30min；弃预杂交液，加入杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS，同位素标记的核苷酸片段)，65℃杂交12hr；弃杂交液，加入洗膜液I(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，5％SDS)，65℃洗膜2次，每次30min；加入洗膜液II(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，1％SDS)，65℃洗膜30min。

本发明还提供了一种木聚糖酶，该酶具有上述的核苷酸序列编码的氨基酸序列，或者最好具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

本发明还提供了含有如上所述的DNA序列的重组表达质粒，所述的重组表达质粒为含有以上所述的DNA序列的重组表达质粒pET28a/xynB。

附图简要描述

图1为本发明的耐高温木聚糖酶重组基因在大肠杆菌中的表达模式；

图2为本发明的耐高温重组木聚糖酶B基因的DNA序列；

图3为本发明的耐高温重组木聚糖酶B的氨基酸序列；

图4为本发明的提纯各步的SDS-PAGE，其中，Lanes M，10kDa梯度标准蛋白；lane 0，热处理后；lane 1，Ni-NTA亲和层析活力峰；lane 2，Q-sepharose离子交换层析活力峰；lanes 3和4，Mono-Q离子交换层析活力峰；

图5为本发明的耐高温重组木聚糖酶B的pH稳定性(70℃(...)和100℃(-))，其中，使用不同缓冲体系分别在70℃(...)和100℃(-)保温30min，再测定剩余酶活力。所用缓冲体系分别为：Citrate(◆)，Acetate(■)，MES(△)，MOPS(×)，Phosphate(*)，HEPES(●)，Tris-HCl(o)，CHES(-)和Piperdine(+)；

图6为本发明的耐高温重组木聚糖酶B对天然底物的水解特性，其中，lane X，为木糖，木二糖，木三糖的混合物；min.或h中的数字为水解时间分钟或小时。

实施例

实施例1海栖热袍菌基因组DNA的提取

采用海栖热袍菌(Thermotoga maritima MSB8，德国菌种保藏中心，DSM3109)新鲜湿菌体20g，悬于10mL 50mMTris缓冲液中(pH8.0)，加入少量溶菌酶和8mL 0.25mM EDTA(PH8.0)，混匀后在37℃放置20min，然后加入2mL 10％SDS，55℃放置5min，分别用等体积酚、氯仿各抽提一次，取最后一次的上清液，加入2倍体积乙醇，回收DNA。再分别用70％和无水乙醇洗，沉淀溶于0.5mL TE缓冲液(pH8.0，10mMTris，1mM EDTA)，加入10mg/mLRNase3μL，37℃保温1h，分别用等体积酚、氯仿各抽提一次，上清液加入2倍体积乙醇，回收DNA，分别用70％乙醇和无水乙醇洗，真空冷冻干燥，用超纯水溶解。

实施例2木聚糖酶基因xynB的扩增

设计一对引物，引物上引入能插入pET28a(+)质粒(Novagen)的Nco I-Hind III酶切位点。所使用引物TM-XynB-Nco I-FWD和TM-XynB-Hind-His-REV的序列分别如下所示：

TM-XynB-Nco I-FWD：5′-CCATGGAAA TATTACCTTCTGTGTGAT

TM-XynB-Hind-His-REV：5′-AAGCTTT CTTTCTTCTATCTTTTTCTC CA

在设计TM-XynB-Nco I-FWD正向引物时，考虑到在表达载体中C-末端带6×His标签，这样翻译后从Nco I酶切位点第二个氨基酸由K变为E。根据引物设计的这一突变确保目的基因克隆于开放阅读框内，同时具有ATG起始密码子和6×His标签序列，而不会发生开放阅读框漂移。

以海栖热袍菌的基因组DNA为模板，采用聚合酶进行PCR扩增，PCR扩增反应混合物为：Template DNA，1μl；10×KOD-Plus buffer，2.5μl；2mM dNTP，2.5μl；25mM MgSO₄，1.5μl；100pM Forward primer，0.5μl；100pM Reverse primer，0.5μl；1Unit/μl KOD-Plus，0.5μl；H₂O，16μl；反应混合物总体积为25μl。

PCR扩增反应的条件为：循环参数为98℃，5min；98℃，30seconds，62℃，1min和68℃，1min，22个循环后68℃延伸10min.，然后冷却至4℃，反应完成后，进行琼脂糖凝胶电泳。在紫外下照射，切下目标DNA，然后采用QIAquick Gel Extraction kit(QIAGEN公司)从琼脂糖凝胶中回收DNA，即为扩增出的xynB基因DNA片段。

实施例3 PCR产物的克隆和DNA序列测定

PCR扩增反应之后，本发明采用拓扑TA克隆将xynB基因片段克隆到pCR-2.1Topo质粒载体上，用菌落PCR方法筛选带有重组子的菌落。然后，使用pCR-2.1Topo质粒载体上的标准引物序列作为引物测xynB基因的DNA序列，将含有xynB基因序列的质粒提纯供进一步亚克隆和表达用。

本发明采用末端终止法(毛细管电泳荧光法)测序，测序所用试剂为the Dye Terminor Cycle sequencing kit(Perkin-Elmer，USA)。测序反应混合物组成为：Terminator Ready Reaction Mix，4μl；Plasmid Solution，3μl；Forward or Reverse primer，1.5μl；H₂O，1.5μl；反应混合物总体积为10μl。先进行测序循环反应，反应的循环参数为98℃，5min；98℃，15Seconds；50℃，5Seconds和60℃，4min，25个循环后冷却至4℃。

反应结束之后，添加2.0μl 3M NaAc(pH4.6)、50μl 95％乙醇和12.5μl水，混合均匀。在室温下静置15min.，以15,000rpm离心20min.，弃去上清液，再加入70％乙醇洗涤沉淀，以15,000rpm离心5min.，弃去上清液。真空干燥沉淀，然后加入12μl TSR(Template SuppressionReagent)混匀，置95～96℃下保温2min.，迅速放入冰水中冷却数分钟，转移至测序专用小管中。最后用Applied Biosystems 310 Genetic Analyser测序，数据分析使用GENETIX program软件。

实施例4木聚糖酶基因xynB的亚克隆和在大肠杆菌中的表达

在具体实施例中所使用的表达基因载体为pET28a(+)，是常用的表达载体之一，靶基因克隆于pET28a(+)载体上，使其表达置于T7噬菌体强启动子转录及翻译信号控制之下。图1为xynB基因的克隆和在大肠杆菌中的表达模式；图2为重组质粒模式图。由于Thermotoga属的基因在大肠杆菌中表达较难，研究设计使xynB基因的C末端带有6×His标签，这样表达出的目标蛋白质带有6×His标签，利用6×His标签与Ni-NTA的亲和性，可将表达出的重组蛋白进行亲和层析提纯，这样可方便快速地纯化表达的酶。Nco I-Hind III酶切位点pET28a(+)载体的编码了羧基端His标签，可以用羧肽酶除去His标签，但需要合理控制酶切条件。实际上，在蛋白质分子上接上6×His纯化标签，这种修饰对蛋白质的表达、折叠和生物学活性均无影响。

提取含有xynB基因序列的Topo克隆的质粒pCR2.1-Topo 10/xynB，分别用一对限制性内切酶Nco I-Hind III酶切，在紫外下照射，观察电泳后的琼脂糖凝胶，并迅速切下目标DNA。然后采用QIAquick Gel Extractionkit(QIAGEN公司)从琼脂糖凝胶中回收DNA，回收的DNA片段即为所要插入的xynB基因。采用同样酶切方法制备pET28a(+)载体，将制备好的xynB基因片段和pET28a(+)载体按一定比例混合，并加入ligationHigh T4 DNA ligase kit(TOYOBO公司)在16℃下连接4小时。然后用电穿孔法转入感受态细胞E.coli BL21，将100μl菌液涂在含卡那霉素抗性的LB平板上，于37℃过夜培养。将生长出的单菌落标号，采用菌落PCR筛选带重组质粒的菌落。提取几个阳性菌落的质粒，进行双酶切电泳。采用实施例中3所介绍的方法进行DNA序列测定(使用pET28a(+)载体引物)，最终确定所表达基因的全序列。同时确定阳性克隆菌落，经诱导培养后进行酶的表达实验。将完全正确且符合要求的菌落作为菌种保存备用。

实施例5重组木聚糖酶B的表达、纯化与特性

新鲜制备100ml含有重组质粒的E coli BL21，接种于1000ml含有50μg/ml卡那霉素的Luria-Bertani broth(LB)培养基，在30℃的摇床中培养，摇床转速为150rpm。测定培养液在600nm下的吸光度的变化，当吸光度达0.5～0.6时，加入1ml的1M IPTG诱导，再继续培养16小时。用高速冷冻离心机将培养液在4℃下以8000rpm离心10min，收获细菌沉淀，用50ml磷酸缓冲溶液(50mM，pH8.0)悬浮。在冰水浴中，用超声破碎机破碎细菌细胞，将破碎液在4℃下以16000rpm离心10min，所得上清液即为粗酶液。

粗酶液先经70℃加热10min的热处理，除去不耐热的杂蛋白和其它杂质。接下来用Ni-NTA亲和柱层析可除去不带有6×His tag的杂蛋白。最后应用两步离子交换柱层析(Q-sepharose和Mono-Q)将酶最终提纯，得到了电泳纯的木聚糖酶XynB。纯化过程中酶纯度的鉴定和分子量的测定采用SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)方法进行，见图4。按Laemmli(U.K.Laemmli et al，Nature 227，1970)方法进行蛋白质样品的电泳，分离胶浓度10％，浓缩胶浓度3％，使用PAGEL NPU-12.5L电泳槽(ATTO，公司)。样品溶液先与Tris/HCl上样缓冲液混合，沸水浴加热3分钟。电泳后的分离胶用考马斯亮蓝R-250染色。蛋白质标准用10kDaprotein ladder。根据样品和标准蛋白的SDS-PAGE图，测定样品和标准蛋白的相对迁移值R_f值，用标准蛋白的R_f值对分子量的对数作标准曲线。由纯酶样品的R_f值，可求得其分子量MW(Molecular Weight)。SDS-PAGE表明木聚糖酶XynB的相对分子量42kDa，与理论推算的分子量(42,067Da)相吻合。

实施例6重组木聚糖酶B的特性

本发明测定酶活力的标准方法为：以1.15％的RBB-木聚糖(RemazolBrilliant Blue-R-D-xylan，SIGMA，Germany)为底物，在50mM pH6.14 MES缓冲液中50℃下保温20min.。标准反应混合物(100μl)组成为1.15％的RBB-木聚糖50μl、200mM MES缓冲液25μl和合理稀释的酶溶液25μl。加入100％乙醇200μl终止酶反应，同时沉淀残留底物。然后在室温下至少静置15min.，混合物以15,000rpm离心5min.，取上清液。用分光光度计测定595nm下的吸光度值(Abs) OD₅₉₅。空白的操作与上述一样，只是以25μl水代替合理稀释的酶溶液。1个酶活力单位(unit)定义为：在上述实验条件下，每分钟导致ΔOD₅₉₅＝1所需的酶量定义为1个酶活力单位。

重组木聚糖酶B的最适pH为6.14，在pH5.14～8.20能保持最高活力的50％。在最适pH6.14下的最适酶反应温度为90℃。重组木聚糖酶B表现出很高的pH稳定性和热稳定性，而且在碱性范围内比酸性范围内更稳定。考虑到缓冲溶液本身的缓冲能力和影响，试验采用不同pH的缓冲溶液配制反应体系。大多数木聚糖酶属酸性木聚糖酶，不仅最适pH在酸性范围内，而且pH稳定范围也较窄。在不同温度下(70和100℃)XynB的pH稳定性如图5所示，令人感兴趣的是该酶表现出很高的pH稳定性，而且在碱性范围内比酸性范围内更稳定。在70℃下，pH5.5～11.5，甚至在100℃下，pH6.5～8.5范围内也都很稳定。这种在中性偏碱性范围稳定的特性有利于工业应用。

实施例7重组木聚糖酶B的动力学参数

根据Lawson et a1等介绍的方法，采用人工合成含对硝基苯(pNP，p-nitrophenyl)的底物，以不同浓度的pNP-β-D-xylobioside、pNP-β-D-xylopyranoside、pNP-β-D-cellobioside、pNP-α-L-arabinopyranoside和pNP-β-D-fucopyranoside，浓度范围尽量在0.5～2.0Km之间，在30℃pH6.14的50mM MES缓冲液中测定酶反应的速率。用Beckman分光光度计(ModelDU640，USA，比色槽带水浴恒温装置)每15秒监测405nm下的吸光度值(Abs) OD₄₀₅。用Line Weaver-Burk作图法，使用“Grafit”分析软件求得米氏常数Km、最大反应速度V_max和催化常数kcat及其标准偏差。这里，1个酶活力单位(unit)定义为：在上述实验条件下，每分钟形成1μmole对硝基苯所需的酶量定义为1个酶活力单位。

采用上述方法测定和计算出该酶对其底物的动力学参数，列于表1。可以看出，pNP-β-D-xylobioside的Km值非常小，仅0.0095±0.0006mM，说明酶与该底物的亲和力非常大。pNP-β-D-xylopyranoside、pNP-β-D-cellobioside、pNP-α-L-arabinopyranoside和pNP-β-D-fucopyranoside的Km值分别为10.4±0.6、3.6±0.25、10.2±0.9和12.9±1.2mM。值得一提的是，XynB水解pNP-β-D-xylobioside的催化常数(k_cat/K_m)为1730mM^-1.s^-1，比其它底物大得多，是目前同样条件下所见报道的最大值，是水解pNP-β-D-cellobioside的催化常数(1.56mM^-1.s^-1)的1109倍。这也说明虽然XynB作用底物广泛，但对纤维素中的糖苷键作用小，完全可以应用于制浆造纸行业。

                      表1 XynB的动力学参数

底物	Km(mM)	kcat(s-1)	kcat/Km(mM-1·s-1)
				pNP-β-xylobiosidepNP-β-D-xylopyranosidepNP-β-D-cellobiosidepNP-α-L-arabinopyranosidepNP-β-D-fucopyranoside	0.0095±0.000610.4±0.63.6±0.310.2±0.912.9±1.2	16.4±1.12.67±0.085.65±0.171.80±0.080.36±0.02	1730±1000.26±0.0081.56±0.060.14±0.0050.028±0.002

实施例8重组木聚糖酶B对天然底物的水解特性

反应混合物中包括：1％桦木木聚糖(Sigama)、50mM MES缓冲液(pH6.14)和合理稀释的纯酶。在90℃保温反应12h，定期取样脱除其中的离子，然后用薄层层析分析水解产物。标准为木寡糖混合物包括木糖、木二糖和木三糖。水解产物的分析采用薄层层析法(TLC，)，硅胶板使用Merck Silica Gel 60F 254(E.Merck，Darmstadt，Germany)。薄层层析采用上层法展层，展层2～4次，展层剂为乙腈∶水(85∶15，体积比)。将展层好的硅胶板在5％的硫酸甲醇溶液中浸沾一下，然后放入烤炉中焙烤数分钟，不同的糖类便呈现在硅胶板上。如附图6所示，水解木聚糖的主要产物以木二糖为主，最高可达70％左右，适合分解半纤维素中的木聚糖生产功能性低聚木糖。

                            序列表

<110>中国农业大学

<120>一种耐高温木聚糖酶和编码该酶的基因

<130>I020532

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1074

<212>DNA

<213>Thermotoga maritima

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1074)

<223>

<400>1

atg gaa ata tta cct tct gtg ttg atc ctt ttg ttg gga tgt gtt cca     48

Met Glu Ile Leu Pro Ser Val Leu Ile Leu Leu Leu Gly Cys Val Pro

1               5                   10                  15

gtt ttc agc tct cag aat gta tct ctg aga gaa ctc gca gaa aag ctg     96

Val Phe Ser Ser Gln Asn Val Ser Leu Arg Glu Leu Ala Glu Lys Leu

            20                  25                  30

aac atc tat att ggt ttt gcc gca atc aac aac ttt tgg tct ctt tcc    144

Asn Ile Tyr Ile Gly Phe Ala Ala Ile Asn Asn Phe Trp Ser Leu Ser

        35                  40                  45

gac gca gaa aag tac atg gaa gtt gca aga aga gaa ttc aac atc ctg    192

Asp Ala Glu Lys Tyr Met Glu Val Ala Arg Arg Glu Phe Asn Ile Leu

    50                  55                  60

acc cct gag aac cgg atg aag tgg gat acg att cat cca gaa aga gac    240

Thr Pro Glu Asn Arg Met Lys Trp Asp Thr Ile His Pro Glu Arg Asp

65                  70                  75                  80

aga tac aat ttc act ccc gca gaa aaa cac gtt gag ttt gca gaa gaa    288

Arg Tyr Asn Phe Thr Pro Ala Glu Lys His Val Glu Phe Ala Glu Glu

                85                  90                  95

aac gac atg atc gtg cat gga cac act ctt gtc tgg cac aac cag ctt    336

Asn Asp Met Ile Val His Gly His Thr Leu Val Trp His Asn Gln Leu

            100                 105                 110

cct gga tgg atc act ggt aga gaa tgg aca aag gaa gaa ctt ttg aac      384

Pro Gly Trp Ile Thr Gly Arg Glu Trp Thr Lys Glu Glu Leu Leu Asn

        115                 120                 125

gtt ctt gaa gac cac ata aaa acg gtg gtg tct cat ttc aaa ggt aga      432

Val Leu Glu Asp His Ile Lys Thr Val Val Ser His Phe Lys Gly Arg

    130                 135                 140

gtg aag atc tgg gat gtg gtg aac gaa gcg gtg agc gat tct gga acc      480

Val Lys Ile Trp Asp Val Val Asn Glu Ala Val Ser Asp Ser Gly Thr

145                 150                 155                 160

tac agg gaa agc gtg tgg tac aag acg atc ggt cct gaa tac att gaa      528

Tyr Arg Glu Ser Val Trp Tyr Lys Thr Ile Gly Pro Glu Tyr Ile Glu

                165                 170                 175

aaa gcg ttc aga tgg gcg aaa gaa gcc gat cca gat gcg att ctc atc      576

Lys Ala Phe Arg Trp Ala Lys Glu Ala Asp Pro Asp Ala Ile Leu Ile

            180                 185                 190

tac aac gac tac agc ata gaa gaa atc aac gca aaa tcg aac ttc gtc      624

Tyr Asn Asp Tyr Ser Ile Glu Glu Ile Asn Ala Lys Ser Asn Phe Val

        195                 200                 205

tac aac atg ata aaa gag ctg aaa gaa aag gga gta cct gtt gat gga      672

Tyr Asn Met Ile Lys Glu Leu Lys Glu Lys Gly Val Pro Val Asp Gly

    210                 215                 220

ata gga ttt cag atg cac ata gac tac aga ggg ctc aat tat gac agt      720

Ile Gly Phe Gln Met His Ile Asp Tyr Arg Gly Leu Asn Tyr Asp Ser

225                 230                 235                 240

ttc aga agg aat ttg gag aga ttt gcg aaa ctc ggt ctt caa ata tac      768

Phe Arg Arg Asn Leu Glu Arg Phe Ala Lys Leu Gly Leu Gln Ile Tyr

                245                 250                 255

atc aca gag atg gat gtg aga att cct ctc agt ggt tcg gag gag tat      816

Ile Thr Glu Met Asp Val Arg Ile Pro Leu Ser Gly Ser Glu Glu Tyr

            260                 265                 270

tat ttg aaa aaa cag gct gaa gtt tgt gcg aag atc ttc gat ata tgc      864

Tyr Leu Lys Lys Gln Ala Glu Val Cys Ala Lys Ile Phe Asp Ile Cys

        275                 280                 285

ttg gac aac cct gca gtt aaa gcg atc cag ttt tgg gga ttc aca gac      912

Leu Asp Asn Pro Ala Val Lys Ala Ile Gln Phe Trp Gly Phe Thr Asp

    290                 295                 300

aaa tac tcc tgg gtt ccc ggc ttt ttc aaa ggg tac ggg aaa gcg ttg      960

Lys Tyr Ser Trp Val Pro Gly Phe Phe Lys G1y Tyr Gly Lys Ala Leu

305                 310                 315                 320

ctc ttc gat gag aat tac aac ccc aag cct tgt tat tac gcg ata aaa     1008

Leu Phe Asp Glu Asn Tyr Asn Pro Lys Pro Cys Tyr Tyr Ala Ile Lys

                325                 330                 335

gag gtg ctg gag aaa aag ata gaa aga aag ctt gcg gcc gca ctc gag     1056

Glu Val Leu Glu Lys Lys Ile Glu Arg Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu

            340                 345                 350

cac cac cac cac cac cac                                             1074

His His His His His His

        355

<210>2

<211>358

<212>PRT

<213>Thermotoga maritima

<400>2

Met Glu Ile Leu Pro Ser Val Leu Ile Leu Leu Leu Gly Cys Val Pro

1               5                   10                  15

Val Phe Ser Ser Gln Asn Val Ser Leu Arg Glu Leu Ala Glu Lys Leu

            20                  25                  30

Asn Ile Tyr Ile Gly Phe Ala Ala Ile Asn Asn Phe Trp Ser Leu Ser

        35                  40                  45

Asp Ala Glu Lys Tyr Met Glu Val Ala Arg Arg Glu Phe Asn Ile Leu

    50                  55                  60

Thr Pro Glu Asn Arg Met Lys Trp Asp Thr Ile His Pro Glu Arg Asp

65                  70                  75                  80

Arg Tyr Asn Phe Thr Pro Ala Glu Lys His Val Glu Phe Ala Glu Glu

                85                  90                  95

Asn Asp Met Ile Val His Gly His Thr Leu Val Trp His Asn Gln Leu

            100                 105                 110

Pro Gly Trp Ile Thr Gly Arg Glu Trp Thr Lys Glu Glu Leu Leu Asn

        115                 120                 125

Val Leu Glu Asp His Ile Lys Thr Val Val Ser His Phe Lys Gly Arg

    130                 135                 140

Val Lys Ile Trp Asp Val Val Asn Glu Ala Val Ser Asp Ser Gly Thr

145                 150                 155                 160

Tyr Arg Glu Ser Val Trp Tyr Lys Thr Ile Gly Pro Glu Tyr Ile Glu

                165                 170                 175

Lys Ala Phe Arg Trp Ala Lys Glu Ala Asp Pro Asp Ala Ile Leu Ile

            180                 185                 190

Tyr Asn Asp Tyr Ser Ile Glu Glu Ile Asn Ala Lys Ser Asn Phe Val

        195                 200                 205

Tyr Asn Met Ile Lys Glu Leu Lys Glu Lys Gly Val Pro Val Asp Gly

    210                 215                 220

Ile Gly Phe Gln Met His Ile Asp Tyr Arg Gly Leu Asn Tyr Asp Ser

225                 230                 235                 240

Phe Arg Arg Asn Leu Glu Arg Phe Ala Lys Leu Gly Leu Gln Ile Tyr

                245                 250                 255

Ile Thr Glu Met Asp Val Arg Ile Pro Leu Ser Gly Ser Glu Glu Tyr

            260                 265                 270

Tyr Leu Lys Lys Gln Ala Glu Val Cys Ala Lys Ile Phe Asp Ile Cys

        275                 280                 285

Leu Asp Asn Pro Ala Val Lys Ala Ile Gln Phe Trp Gly Phe Thr Asp

    290                 295                 300

Lys Tyr Ser Trp Val Pro Gly Phe Phe Lys Gly Tyr Gly Lys Ala Leu

305                 310                 315                 320

Leu Phe Asp Glu Asn Tyr Asn Pro Lys Pro Cys Tyr Tyr Ala Ile Lys

                325                 330                 335

Glu Val Leu Glu Lys Lys Ile Glu Arg Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu

            340                 345                 350

His His His His His His

        355

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ccatggaaat attaccttct gtgtgat                                          27

<210>4

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

aagctttctt tcttctatct ttttctcca                                        29

Claims (4)

1.一种编码木聚糖酶的基因，该基因具有选自下组的核苷酸序列：

(1)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

(2)由于遗传密码的简并性，不同于SEQ ID NO：1但编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：1所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列。

2.一种木聚糖酶，它具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

3.一种重组表达质粒，它含有权利要求1所述的基因。

4.按照权利要求4所述的质粒，它是图1所示的pET28a/xynB。

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