CN1334868A - 多肽 - Google Patents

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Abstract

具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽或应用缺失、添加、插入或替换中的至少一种方法,而缺失、添加、插入或替换一或多个氨基酸而得到具有纤维二糖水解酶活性的多肽。

Description

多肽
技术领域
本发明涉及多肽，更具体地，具有纤维素降解活性的多肽，其有助于生物量的有益应用。本发明也涉及通过基因工程对产生上述多肽有用的基因。
发明背景
纤维素用(C6H10O5)n表示。含有纤维素并作为主要成分的物质有，以树木为例，如松树、香柏、山毛榉和白杨；以茎和韧皮为例，如大麻、纸灌木、稻杆、蔗渣和谷壳；种子绒毛如棉花；旧纸张例如报纸、杂志和起皱的厚纸板废纸；其他的纤维废物；还有纤维素粉和类似物。近来，办公室的旧纸张开始增多。
纤维素分子的结构是D-吡喃葡萄糖通过β-1，4键相连并且没有侧链。因此，纤维素由葡萄糖组成，其可作为用于酒精发酵的原材料。如果能将纤维素降解为葡萄糖，从旧纸张或纤维废物中，制造用作燃料或类似物的酒精就将成为可能。
已经将通过酸方法或酶方法将纤维素水解为葡萄糖作为降解(糖化)纤维素的方法。在酸方法中，将纤维素与盐酸或硫酸接触，剧烈降解纤维团块。因为难于适当判定该水解状态，在强酸存在的情况下，此产生的葡萄糖可继续反应。因此，该酸方法具有难以高产量回收葡萄糖或类似的问题。所以，现在还没有实际应用该酸方法。相反地，应用纤维素水解酶的酶方法具有高度反应选择性，并且就环境保护而言是有优势的。因此该酶方法已成为水解方法的主要方法。多种方法已有报道[Wood，B.E.，等人，生物技术进展(BiothechnologyProgress)，13：223-237(1997)；美国专利号5，508，183；ZhaoXin，等人，酶微生物技术(Enzyme Microbial Technology)，15：62-65(1993)，等等]。
纤维素水解酶，例如有：内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)、β-D-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)、外切-1，4-β-D-葡糖苷酶(EC3.2.1.74)和纤维二糖水解酶(EC3.2.1.91)。内切葡聚糖酶的推荐名称是纤维素酶，并且该系统名称是1，4-(1，3，1，4)-β-D-葡聚糖3(4)-葡聚糖水解酶。
经常将含有内切葡聚糖酶、β-D-葡糖苷酶、外切-1，4-β-D-葡糖苷酶、维维水解酶和类似物的混合物用于水解纤维素。这些酶协同作用于纤维素，将其降解成葡萄糖。已知有多种关于该作用方式的学说。Murao等人，已经推荐以下模型。首先，通过内切葡聚糖酶作用，将断裂导入纤维素的非-结晶区域。在破坏该晶体时，纤维二糖水解酶作用于该裂隙。通过内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶的作用产生寡糖。通过β-D-葡糖苷酶的作用将寡糖降解，产生葡萄糖[Sawao Murao等人，“纤维素酶(Cellulase)”，pp.102-104，Kodansha(May10，1987)]
大多数情况下，纤维素不以单纤维素链的形式存在。形成许多纤维素链通过氢键结合的结构。在此结构中，有其中许多纤维素链密集积聚的结晶区域和其中纤维素链散置的非-结晶区域。在酶方法的水解反应中，限速步骤是在结晶区域分离和分散许多纤维素链的步骤。相应地，在高温下进行酶降解反应具有以下好处：(1)因为纤维素晶体易于破坏，该反应高效进行；(2)各种细菌污染的危险性很小；并且(3)在需要加热的工业过程中，在酶反应之前毋需冷却。
已知取自激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)的β-D-葡糖苷酶、取自热球菌SP.的β-D-葡糖苷酶、内切葡聚糖酶和取自海栖热袍菌(Thermotoga Maritima)、取自那不勒斯栖热袍菌(ThermotogaNeapolitana)及其类似菌的内切葡聚糖酶和β-D-葡糖苷酶为取自极嗜热生物的纤维素水解酶。[Bauer等人，现代生物技术评论(CurrentOpinion In Biotechnology)，9：141-145]。描述取自极嗜热生物的β-D-葡糖苷酶基因克隆，例如，见美国专利号5,744,345。描述取自极嗜热生物的内葡聚糖酶基因克隆，例如，见WO97/44361。
已经从嗜热菌、栖热袍菌sp.EJSS-B.1分离出纤维二糖水解酶[Ruttersmith，等人，生物化学杂志(Biochemical Journal)，277：887-890(1991)]。因为该酶的纤维二糖的抑制常数(Ki)是低的(0.2mM)，所以该酶易于产生抑制作用。应用4-甲基繖形基-β-D-纤维二糖苷作为底物的特异活性的是3.6U/mg。而且，因为该细菌需在高温厌氧状况下进行培养，大量地工业生产该酶是困难的。再者，该酶不能通过基因工程产生，因为还未克隆编码该酶的基因。
发明目的
本发明的该主要目的是提供对纤维二糖具有高抑制常数和具有热抵抗性的纤维二糖水解酶，以及低成本生产上述纤维二糖水解酶的方法。发明概述
已经测定出全部堀越热球菌OT3(Pyrococcus Horikoshii OT3)基因组DNA的核苷酸序列[Kawarabayasi，等人，DNA研究(DNAResearch)，5：55-76(1998)；Kawarabayasi，等人，DNA研究，5：147-155(1998)]。已经公布一些蛋白质在氨基酸序列中，与由各自开放阅读框架获得的蛋白质具有同源性。(http：//www.bio.nite.go.jp/ot3db_index.html)。根据与编码在此目录中已知纤维素水解酶的核酸同源性的比较，已经预言在堀越热球菌OT3基因组中编码例如α-淀粉酶、α-甘露糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、β-D-糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶和内切葡聚糖酶多肽的开放阅读框架的存在。但是还未预言与编码已知的纤维二糖水解酶的核酸具有同源性的开放阅读框架的存在。
经过深入细致的研究，本发明者发现在堀越热球菌OT3基因组中存在编码具有纤维二糖水解酶酶活性的多肽的开放阅读框架(PH1171)。意想不到地是，证实尽管其与多种内切葡聚糖酶包括取自古细菌AEPIIIa的内葡聚糖酶具有同源性，具有通过该开放阅读框架编码的氨基酸序列的多肽具有纤维二糖水解酶活性。而且本发明者已经建立通过基因工程产生该多肽的方法。因此，本发明已经成功完成。
本发明提供如下内容：
(1)具有SEQ ID NO：1氨基酸序列，或具有在SEQ ID NO：1氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基缺失、加入、插入和/或替换所得氨基酸序列的多肽，并且其具有纤维二糖水解酶活性；
(2)上述(1)中的多肽，其具有热稳定性纤维二糖水解酶活性；
(3)编码上述(1)或(2)中的多肽的核酸；
(4)上述(3)中的核酸，其具有SEQ ID NO：2核苷酸序列；
(5)编码具有纤维二糖水解酶活性的多肽的核酸，其能在严格的条件下与上述(3)中的核酸序列杂交；
(6)上述(5)中的核酸，其编码具有热稳定性纤维二糖水解酶活性的多肽；
(7)含有上述(3)至(6)中任一项的核酸的重组DNA；
(8)用上述(7)中的重组DNA转化的转化体；
(9)产生上述(1)中多肽的方法，该方法包括培养上述(8)中的转化体和从培养物中收集具有纤维二糖水解酶活性的多肽；
(10)降解通过β-1，4键相连的D-吡喃葡萄糖聚合物的方法，该方法包括使上述(1)中的多肽作用于通过β-1，4键相连的D-吡喃葡萄糖聚合物，以释放纤维二糖；
(11)具有纤维二糖水解酶活性和对纤维二糖的抑制常数Ki大于或等于10mM的多肽；和
(12)上述(11)中的多肽，其在95℃ 5小时的处理后，能保持20％或更多的纤维二糖水解酶活性。
附图简述
图1：图示本发明之多肽的CMC-降解活性与反应pH的关系。
图2：图示本发明之多肽的CMC-降解活性与反应温度的关系。
图3：图示反应混合物中NaCL浓度对本发明之多肽的CMC-降解活性的影响。
图4：图示当该多肽在95℃加热10分钟时，该处理pH与本发明之多肽的CMC-降解活性的关系。
图5：图示当该多肽在95℃加热时，该处理时间与本发明之多肽的CMC-降解活性的关系。
图6：图示本发明之多肽的pNPC-降解活性与本发明之多肽用量的关系。
图7：图示多种试剂对本发明之多肽的pNPC-降解活性的影响。
发明详述
1.本发明之多肽
本发明之多肽的特征是具有SEQ ID NO：1氨基酸序列，或具有在SEQ ID NO：1氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基缺失、加入、插入和/或替换所得氨基酸序列，并且具有纤维二糖水解酶活性。
在此处应用，纤维二糖水解酶活性是指水解由β-1，4键相连的D-吡喃葡萄糖组成的多糖或寡糖、由β-1，4键相连的D-葡萄糖的二糖中的糖苷键以产生纤维二糖的活性，但是不水解在纤维素中的糖苷键。通过已知的方法，举例说明用于检测纤维二糖水解酶活性的方法，其中应用磷酸膨胀纤维素作为底物进行酶反应，并且通过薄层硅胶层析证实在反应中纤维二糖的存在。
本发明之多肽具有纤维二糖水解酶活性。该多肽可具有其它糖苷酶活性，例如内切葡聚糖酶活性和β-D-糖苷酶活性。
在一实施例中，具有热稳定性纤维二糖水解酶活性是本发明之多肽的特征。
本文中所用“热抵抗性”是指多肽具有酶活性，在一段需要降解纤维素的时间内，从生物量生产酒精的工业进程中，其在高温情况下进行温育时不发生不可逆变性。本文所用不可逆变性是指永久和完全的酶活性的丧失。下文中，具有热抵抗性的纤维二糖水解酶活性是指热稳定性纤维二糖水解酶活性。尽管未特意对本发明加以限定，在75℃ 20分钟、95℃ 10分钟或95℃ 5小时的处理后，具有SEQ ID NO：1氨基酸序列的该多肽保持80％或更多的纤维二糖水解酶活性。而且，在如90℃或更高，或100℃或更高的高温条件下，该多肽仍表现出纤维二糖水解酶。在95℃ 5小时的处理后，具有热稳定性纤维二糖水解酶活性的本发明之多肽，保持优选地20％或更多的、更优选地40％或更多的、最优选地80％或更多的纤维二糖水解酶活性。
作为本发明该多肽实施例的具有SEQ ID NO：1氨基酸序列的多肽，具有从，例如磷酸膨胀纤维素或纤维寡糖中产生纤维二糖的活性。该多肽热稳定性纤维二糖水解酶活性的最佳pH为5到6.5。在65℃到113℃该多肽表现热稳定性纤维二糖水解酶活性。该多肽具有高热抵抗性。在底物存在时，在pH6、95℃下，加热5小时后，其保持大约90％的活性。在另外加热24小时后，大约80％的该活性得以保持。在无底物时，在95℃、pH5-7将该多肽加热10分钟时，该活性未曾降低。应用4-甲基繖形基-β-D-纤维二糖苷作为底物，在98℃、pH6.0下20分钟的反应中，当进行该提纯的多肽的纤维二糖水解酶活性测定时，该比活性为17.0U/mg。
该多肽可作用于羧甲基纤维素(CMC)或纤维寡糖。也可以将糖还原端的量作为指数，检测该多肽的纤维二糖水解酶活性，其还原端是以CMC或纤维寡糖作为底物产生的。该多肽也作用于发色团底物，例如对硝基苯基-β-D-纤维二糖苷，或作用于荧光底物，例如，4-甲基繖形基-β-D-纤维二糖苷。因此通过检测反应中产生的发色团或荧光物质的量，可方便地检测该多肽的纤维二糖水解酶活性。
在0.5-1.0M NaCl存在的情况下，该多肽表现最大热稳定性纤维二糖水解酶活性。无NaCl存在，该多肽表现在0.5M NaCl存在情况下的大约80％的表现活性。在2.5M NaCl存在的情况下，该多肽表现在0.5M NaCl存在情况下的大约60％的表现活性。因此，NaCl浓度对热稳定性纤维二糖水解酶活性的影响是很小的。
在一实施方案中，反应产物，例如，纤维二糖或葡萄糖对本发明之多肽的纤维二糖水解酶活性的抑制作用是很小的。该多肽对纤维二糖的抑制常数(Ki)优选大于或等于10mM，更优选大于或等于30mM，最优选大于或等于100mM。例如，含有SEQ ID NO：1氨基酸序列的本发明之多肽对纤维二糖的抑制常数为212mM。在本发明之前，未知有对纤维二糖具有如此高抑制常数的多肽。几乎没有发现葡萄糖对该活性的抑制。而且，与未存在这些试剂时相比，0.5mM Fe3+、Cu2+或Zn2+抑制大约90％的该活性，或1mM Co3+、Ca2+、Mg2+或乙二胺四乙酸抑制大约50％的该活性。几乎未发现10mM二硫苏糖醇对该活性的抑制作用。
只要其表现纤维二糖水解酶活性，本发明之多肽包括具有在SEQID NO：1氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基的缺失、添加、插入和/或替换得来的氨基酸序列的多肽。
在自然发生的蛋白质中可产生突变，例如，在氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入、添加或替换。由于编码该蛋白质DNA的多态性或突变，或由于在体内或合成后提纯时蛋白质的修饰，可产生这些突变。但是，已知如果这些突变的部分表现对该蛋白质的活性或结构的保留不重要的话，这些突变蛋白质可表现与那些无突变的蛋白质实质相等的生理或生物活性。
对蛋白质而言，将突变人工地引入蛋白质的氨基酸序列中是可行的。在此情况下，可能产生更多的突变。例如，已知用丝氨酸替换人白介素-2(IL-2)氨基酸序列中的半胱氨酸残基得到的多肽保留白介素-2的活性(科学(Science)，224：1431(1984))。
而且，已知某些蛋白质具有对它们的活性非绝对必要的肽区域。例如，这些肽区域可以是细胞外分泌的蛋白质中的信号肽或蛋白酶前体中发现的前序列。在翻译后或转化为活性蛋白质时，将多数此类区域去除。此蛋白质具有与未去除该区域的蛋白质不同的一级结构，但是最终表现相等的功能。该SEQ ID NO：1氨基酸序列是将SEQ ID NO：5氨基酸序列的N-端28个氨基酸残基的信号域去除后得到的序列。具有SEQ ID NO：6核苷酸序列的核酸，编码具有SEQ ID NO：5氨基酸序列的多肽。当培养具有含此核酸载体的大肠埃希氏杆菌时，将该信号肽从该表达多肽中去除，并且产生具有SEQ ID NO：1氨基酸序列的多肽。
当通过基因工程生产蛋白质时，可将与靶蛋白质活性无关的肽链添加在该蛋白质的氨基端或羧基端。例如，为了增加靶蛋白质的表达水平，可以制备融合蛋白质，其中将在所用宿主中高表达的蛋白质的部分氨基端区域添加在该氨基端区域。可选择地，为促进该表达蛋白质的提纯，在该靶蛋白质的氨基或羧基端可添加对特定物质具有亲和力的肽。如果其对靶蛋白质的活性没有有害影响的话，可保持该添加的多肽的添加。如果需要的话，通过适宜的处理，为能够将其从靶蛋白质中去除，可对其进行操作，比如，应用蛋白酶的限制性酶切。
这样，只要其具有纤维二糖水解酶活性，具有在此处所示氨基酸序列(SEQ ID NO：1)中一个或多个氨基酸残基缺失、插入、添加和/或替换后得到的氨基酸序列的多肽包括在本发明之内。优选地，该多肽具有热稳定性纤维二糖水解酶活性和对纤维二糖的高抑制常数。
例如通过，(1)从产生本发明之多肽的微生物的培养物中提纯，或(2)从含有编码本发明之多肽的核酸的转化体的培养物中提纯，能够产生本发明之多肽。
(1)从产生本发明之多肽的微生物的培养物中提纯
例如，堀越热球菌OT3(JCM9974)是产生本发明之多肽的微生物，其可以在日津(物理和化学研究所)买到。
在适宜该微生物生长的条件下培养该微生物。优选地，应用增加兴趣多肽表达水平的培养条件。根据用于提纯蛋白质的传统方法，提纯在细胞中或培养物中产生的兴趣多肽。
可将传统用于培养超嗜热菌的方法用于上述的细菌株的培养。将细菌株可利用的营养成分加入培养基中。例如，淀粉可用作碳源，胰胨、蛋白胨和酵母提取物可作为氮源。可将金属盐，例如，镁盐、钠盐或铁盐加入培养基中作为微量元素。而且，例如，将人工海水用于培养基的制备可以是有益的。需要不含固体缓冲剂的干净培养基。应用此培养基，通过检测培养物的浊度，可随时进行细胞生长的检测。
该培养可以是直立式或旋转式培养。例如，可应用如在应用和环境微生物(Applied and Environmental Microbiology)55：2086-2088(1992)中描述的透析培养方法。一般地，该培养温度优选95℃。培养大约16小时后，明显数量的多肽常常在培养物中积聚。为使多肽的生产能力最大化，依据该细胞或所用培养基的成分来判定该培养状态是优选的。
为获取多肽，首先制备无细胞提取物。例如，通过离心、滤过或类似方法，从培养物中收集细胞，然后破坏细胞，可制备无细胞提取物。可从超声处理、应用磁珠破裂、用裂解酶处理、应用表面活性剂和类似物处理的方法中，选择提取该目标酶的高效的细胞破裂方法。如果该多肽分泌至培养物中，通过硫酸铵盐析、超滤或类似的方法使该多肽浓缩。该浓缩的多肽用作无细胞提取物。传统的提纯蛋白质的方法可用于将多肽从获得的无细胞培养物中分离。例如，可将硫酸铵盐析、离子交换层析、疏水层析、凝胶滤过层析及类似的方法结合应用。
(2)从含有编码本发明之多肽核酸的重组DNA转化的转化体培养物中进行的提纯
典型的编码本发明之多肽的核酸序列如SEQ ID NO：2中所示。从SEQ ID NO：2核苷酸序列推算的本发明之多肽的氨基酸序列见于SEQ ID NO：1中。这样，关于本发明获得的多肽典型的氨基酸序列见于SEQ ID NO：1中。
该转化的宿主不局限于某一种，例如可以是，大肠埃希氏杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母和丝状真菌。
例如，应用含有pECEL211的大肠埃希氏杆菌BL21、在T7启动子下游连接SEQ ID NO：6的质粒可获得本发明之多肽。从SEQ ID NO：6核苷酸序列推算的本发明之多肽的氨基酸序列见于SEQ ID NO：5中。将用pECEL211转化的大肠埃希氏杆菌JM109命名为大肠埃希氏杆菌JM109/pECEL211，并于1998年12月11日将其保藏在通商产业省工业技术院生命工学人体技术研究所，日本茨城县筑波市东1丁目1番3号，保藏号为FERM P-17075，1999年11月15日根据布达佩斯条约转为国际保藏，保藏号为FERM BP-6939。
在传统培养条件下，如，37℃下在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基(10g/l胰胨、5g/l酵母提取物、5g/l NaCl、pH7.2)中，通过培养具有pECEL211的大肠埃希氏杆菌BL21(DE3)直至对数生长期，向其加入终浓度0.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷，并且在15℃下再行培养，可在培养细胞中表达该多肽。
在培养后，通过离心收集细胞，应用超声破坏细胞并通过离心收集上清液，可将该上清液用作无细胞提取物。可将该无细胞提取物用于酶反应。通过应用已知的方法，例如，离子交换层析、凝胶滤过、疏水层析、硫酸铵盐析，可以从该无细胞培养物中提纯本发明之多肽。自然地，也可以将部分提纯的产物用于酶反应。因为具有pECEL211的大肠埃希氏杆菌BL21(DE3)表达的本发明之多肽是高度热稳定性的，该培养细胞和/或该无细胞提取物，可以在，例如，在95℃加热10分钟以便提纯。
或者，通过例如具有pNCEL101的枯草芽孢杆菌DB104可获取本发明之多肽，该质粒中SEQ ID NO：2 DNA与枯草芽孢杆菌蛋白酶启动子下游相连。具体地，通过在传统条件下，如在含有10μg/ml卡那霉素的LB培养基中37℃过夜，培养具有pNCEL101的枯草芽孢杆菌DB104，可在培养物中积聚本发明之多肽。通过上述应用大肠埃希氏杆菌作为宿主用于生产的已知方法，可在培养物中提纯本发明之多肽。
如上所述，当在常温(例如37℃)下应用编码该多肽的核酸表达本发明之多肽时，产生的表达产物保持活性、热抵抗性及类似性质。也就是说，即使在与原有生产细胞的生长温度明显不同的温度下表达本发明之多肽，本发明之多肽能表现出其固有的更加规则的结构。
2.本发明的核酸
本发明的核酸是编码上述本发明之多肽的核酸。具体地，例证是(1)编码一种多肽的核酸，该多肽具有SEQ ID NO：1氨基酸序列，或具有在SEQ ID NO：1氨基酸序列中缺失、添加、插入和/或替换一个或多个氨基酸残基所得到的氨基酸序列，并且该多肽具有纤维二糖水解酶活性；(2)具有SEQ ID NO：2核苷酸序列的核酸；(3)编码具有纤维二糖水解酶活性的多肽，在严格条件下能与上述(1)或(2)中的核酸杂交的核酸。
本文中所指的核酸意为单链或双链DNA或RNA。
如果上述(2)中所述的核酸是RNA的话，其表示的核苷酸序列是SEQ ID NO：2核苷酸序列，其中用U替换T。
例如，可以通过以下方法获取本发明的核酸。
如上所述，为得到本发明之多肽，可以从堀越热球菌OT3(JCM9974，日津)中分离上述(2)的含有SEQ ID NO：2核苷酸序列的核酸。
而且，以编码本发明提供之多肽的核酸的核苷酸序列为基础，可获取编码具有与本发明之多肽相似的纤维二糖水解酶活性的多肽的核酸。具体地，可通过应用编码本发明之多肽的核酸或该核酸的一部分作为探针进行杂交，或应用引物进行基因扩增方法如PCR，来筛选编码具有细胞生物水解活性之多肽的DNA。通过这样的方法，可获得上述(1)和(3)中的核酸。
通过上述方法，可获取仅含有部分兴趣核酸的核酸片段。在这种情况下，通过下面的方法可获得完整的兴趣核酸。测定所得核酸片段的核苷酸序列以确认该片段为兴趣核酸的一部分。应用该核酸片段或其部分作为探针进行杂交。或者，应用以该核酸片段的核苷酸序列为基础而合成的引物进行PCR。
“严格条件下的杂交”是指能够例如，在以下条件下进行杂交。固定有核酸的膜与探针在含有0.5％SDS、0.1％的牛血清白蛋白(BSA)、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、0.1％菲可400和0.01％变性鲑精核酸的6×SSC(1×SSC、0.15M NaCl、0.015柠檬酸钠，pH7.0)中，50℃下温育12-20小时。温育后，在含有0.5％SDS的2×SSC中，37℃下洗涤该膜，其间，使SSC浓度降至0.1×，温度升至50℃直至所固定的核酸信号能够与背景区分开来，然后检测该探针。如上所述测定由所得的新核酸编码的蛋白质的活性，从而确认该核酸是否为目标核酸。
另外，向该核酸插入合适的表达载体或类似物以构建含有本发明之核酸的重组DNA。然后产生含有该重组DNA的转化体。该转化体可用于工业生产该多肽。
如上所述，本发明也包括不同于此处所发现之核苷酸序列的核苷酸序列，只要其编码具有纤维二糖水解酶活性的多肽。
已知每一氨基酸由1-6个定义基因中的氨基酸的密码子(3联体碱基)来确定。这样，根据其氨基酸序列，许多核酸可编码一特定的氨基酸序列。自然条件下的核酸并不稳定。常常在核苷酸序列中产生突变。核酸中产生的突变可能不会改变所编码的氨基酸序列(此命名为沉默突变)。在这种情况下，编码相同氨基酸的不同核酸得以产生。这样，不能否认在含有编码一特定氨基酸序列的独立核酸的有机体传代过程中，可产生编码相同氨基酸序列的多种核酸。还有，应用基因工程的多种方法不难人工产生编码相同氨基酸序列的多种核酸。
例如，如果原来编码靶蛋白质的核酸中所用的密码子，在通过基因工程(的方法)产生该蛋白质的所用宿主中使用率很低的话，该蛋白质表达水平可能很低。在这种情况下，为了增加靶蛋白质的表达水平而不改变该编码的氨基酸序列，人工地将该密码子转换成在宿主中常用的密码子(例如，JP-B7-102146)。如上所述，当然能人工制备多种编码一特定氨基酸序列的多种核酸。它们也可以在自然条件下产生。
3.应用本发明之多肽降解通过β-1，4键相连的D-吡喃葡萄糖聚合体的方法
可将本发明之多肽用于从通过β-1，4键相连的D-吡喃葡萄糖聚合物释放纤维二糖。在本发明中对通过β-1，4键相连的D-吡喃葡萄糖聚合体中葡萄糖的聚合化程度没有特别限定。该聚合物包括纤维三糖和纤维素。用SEQ ID NO：1表示的本发明之多肽是高度热稳定性的。其可更有效地降解纤维素，部分由于通过加热与底物的结构变化相协同的效应。
具体地，通过例如，使具有SEQ ID NO：1氨基酸序列的多肽与底物98℃下在50mM MES-NaOH缓冲剂中(pH6.0)的反应，可释放纤维二糖。自然地，根据底物的类型(纤维素、纤维四糖、等等)，该反应条件可以变化。可将本发明之多肽加入自由状态的底物悬浮液中。但是，如果该多肽与固定在适宜载体上的底物反应的话，反应后该多肽容易复原。
而且，通过共同应用热稳定的内葡聚糖酶、外-1，4-β-D-糖苷酶、β-D-糖苷酶与本发明之多肽，高效地降解纤维素为D-葡萄糖是可能的。
实施例
下面的实施例还详细地说明本发明，但无意于限定其范围。
在本文描述的操作中，包括质粒DNAs的制备和限制性酶切在内的基础操作按T.Maniatis等人(eds)，分子克隆：实验室手册第二版(1989)冷泉港实验室中所述进行。除非另外说明，大肠埃希氏杆菌JM109或HB101用作利用大肠埃希氏杆菌构建质粒的宿主，并且在37℃富氧情况下，应用含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基(1％胰胨、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl、pH7.0)或通过向LB培养基中加入浓度为1.5％的琼脂并固化该产生的混合物而制备的LB平板进行培养。
实施例1
含有堀越热球菌OT3基因组中开放阅读框架PH1171的重组DNA的构建。
(1)含有开放阅读框架PH1171的DNA的制备。
依据堀越热球菌OT3基因组的核苷酸序列合成含有SEQ ID NO：3的核苷酸序列的寡核苷酸1171FN和含有SEQ ID NO：4的核苷酸序列的寡核苷酸1171RA，以便通过PCR，以堀越热球菌OT3基因组DNA作为模板获取含有开放阅读框架PH1171的约1.6-Kb的扩增DNA片段。
在95℃JCM目录(Riken)所述的培养基中培养堀越热球菌OT3JCM9974(购自Riken)16小时。从培养的细胞中提纯基因组DNA。
为了获取含有开放阅读框架PH1171的DNA，以寡核苷酸1171FN和1171RA作为引物对，上述基因组DNA作为模板进行PCR。依据TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)所附的实验方法进行该PCR，方法如下：94℃ 0.5分钟进行25个循环、50℃ 2分钟和94℃ 1.5分钟。将该PCR产物进行琼脂糖胶电泳。将约1.6kb的扩增DNA片段提取和纯化。对所得DNA的核苷酸序列进行分析表明，该DNA含有开放阅读框架PH1171。
(2)重组DNA pECEL101的构建
用限制酶StuI和AvaI(均来自Takara Shuzo)酶切上述(1)中获取的约1.6kb的扩增的DNA片段，用T4 DNA聚合酶(TakaraShuzo)切平末端并进行琼脂糖胶电泳。然后将大约1.5kb的扩增的DNA片段提取和纯化。另一方面，用限制酶BamHI(Takara Shuzo)酶切pET21a(Novagen)，用碱性磷酸酶(Takara Shuzo)将其去磷酸化并用T4 DNA聚合酶切平末端。应用DNA连接酶(Takara Shuzo)将该平端DNA片段连接。该连接混合物用于转化大肠埃希杆菌JM109。筛选几个转化体，并且纯化含在各自转化体中的质粒DNAs。制备质粒DNAs的限制酶图谱，以筛选其中开放阅读框架PH1171在载体中与T7启动子具有相同插入方向的质粒DNA。将所选的质粒DNA命名为pECEL101。
(3)重组DNA pECEL211的构建
按下面的方法制备由上述(1)中所得约1.6-kb的扩增DNA片段和pET21d(Novagen)组成的重组DNA。
上述(1)中所得约1.6kb的扩增DNA片段用AvaI酶切，用T4 DNA聚合酶切平末端并用限制酶NcoI(Takara Shuzo)酶切以使PH1171的第一个密码子操作性地置于pET21d中T7启动子的下游。另一方面，pET21d用BamHI酶切，T4 DNA聚合酶切平末端，NcoI酶切并用碱性磷酸酶去磷酸化。
应用DNA连接酶连接上述方法处理的该两DNA片段。该连接混合物用于转化大肠埃希氏杆菌JM109。筛选几个转化体，并进行培养。纯化各自转化体中含有的质粒DNAs。制备质粒DNAs的限制酶图谱，以筛选PH1171插入的质粒DNA。将所选的质粒DNA命名为pECEL211。含pECEL211的大肠埃希氏杆菌JM109命名为大肠埃希氏杆菌JM109/pECEL211，保藏于通商产业省工业技术院生命工学和人体技术研究所，保藏号为FERM BP-6939。
实施例2
本发明之多肽的生产。
(1)多肽的表达
将实施例1(3)制备的pECEL211或作为载体对照的pET21d用于转化大肠埃希氏杆菌BL21(DE3)(Novagen)。将每一产生的转化体分别接种于5ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，并且在37℃富氧情况下过夜培养。在1％的浓度下，将该培养物接种到相同的新鲜的培养基中，并且在37℃富氧情况下培养。当浊度达到OD600＝0.4-0.7时，加入异丙基-β-D-硫吡喃半乳糖苷(IPTG，TakaraShuzo)使之终浓度为1mM。在15℃下再过夜培养该细胞。培养后，通过离心收集细胞，将其悬浮于0.5ml 100mM柠檬酸钠缓冲剂(pH5.0)中并用超声破碎。通过离心收集上清，将其用作无细胞提取物。
用纤维素水解酶比如内切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶降解纤维素时，新产生葡萄糖残基的还原端。然后，根据Park和Johnson的方法测量单位反应时间内中还原端的增加量，该方法使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物，以便证实大肠埃希氏杆菌提取物中是否存在具有新生成葡萄糖残基还原端的纤维素之水解活性的多肽。
通过将CMC(Sigma)以1％的浓度溶解于100mM的柠檬酸钠(pH5.0)来制备CMC溶液。将50μl CMC溶液和50μl用100mM的柠檬酸钠(pH5.0)稀释的无细胞提取物混合一起，上覆矿物油。在98℃下温育60分钟后，离心收集水层。将10μl反应混合物、90μl水、100μl碳酸氰化物溶液和100μl 0.05％氰化铁钾水溶液混合一起，沸水中反应15分钟。碳酸氰化物溶液的制备方法是将5.3g碳酸钠和0.65g氰化钾溶于1升水中。该反应混合物于500μl铁铝溶液混合。该铁铝溶液的制备方法是将1.5g铁铝和1g十二烷基磺酰钠(SDS)溶于1升0.15N的硫酸中。产生的混合物在室温下平衡15分钟。然后在690nm测量吸收度。测定还原端的含量，根据已知浓度的葡萄糖标准曲线求出相应的葡萄糖浓度。
一单位(U)的CMC-降解活性定义为在上述反应体系中一分钟内提高相当于1μmol葡萄糖的还原能量的活性。
按照上述方法测定的相应的无细胞提取物的CMC-降解活性如表1所示。表1表示在98℃下上述制备的无细胞提取物的CMC-降解活性。表1
质粒 CMC-降解活性(mU/ml)
 pECEL211     640
 pET21d
如表1所示，在转化有pECEL211的大肠埃希氏杆菌的无细胞提取物中明显检测到了CMC-降解活性，而转化有pET21d的大肠埃希氏杆菌的无细胞提取物中未检测到CMC-降解活性。这样，自堀越热球菌OT3中的开放阅读框架PH1171表达的多肽具有新产生葡萄糖残基还原端之纤维素水解活性。
(2)所表达多肽的纤维素水解活性的鉴别
在测定前，如下制备表达多肽溶液。
将含有pECEL211的大肠埃希氏杆菌(DE3)接种到10ml含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜。将培养物接种到1升同样的培养基中，37℃培养2.5小时。冰上冷却培养管。向其内加入IPTG至终浓度0.1mM。在20℃下培养细胞过夜。通过离心收集细胞，将其悬浮于50ml 20mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)并超声。离心所得上清经95℃处理10分钟，再离心得到上清。这样得到的上清用作以下实验中的表达多肽溶液。
如下鉴定表达多肽的纤维素水解活性。具体地，可使该表达多肽溶液与多种底物作用。然后在薄层层析上鉴定产物。
首先将磷酸膨胀纤维素作为底物。如下制备磷酸膨胀纤维素。
将2g Avicel SF(Asahi Kasei)缓慢加入50ML 85％的冰冷磷酸中。将该混合物在冰上搅拌并间或进行超声以溶解Avicel SF。将该溶液倒入1.5升冰水中。通过离心收集纤维素凝胶。为去除磷酸将纤维素凝胶在水中冲洗6次，将其悬浮于40ml 0.1M柠檬酸钠缓冲液中，并在随后的实验中用作磷酸膨胀纤维素。
将75μl该表达多肽溶液加入75μl的磷酸膨胀纤维素中。该混合物在98℃反应8小时。60μl的乙腈加入等量的该反应混合物中并混合。在低压力下，将通过离心获取的上清蒸发变干。将该残余物溶解于10μl的水中。取2μl该溶液用于硅胶薄层层析。应用硅胶60F254(Merck)作为薄层板并且将乙醇∶丁醇∶水＝5∶5∶1作为显影溶剂来进行两次显影。在显影后将地衣酚-硫酸试剂喷至该薄层板上并且应用热板将该板加热以观察斑点。通过在22.8ml硫酸中溶解400mg地衣酚(Sigma)，并加入水使之总量达200ml来制备地衣酚-硫酸试剂。
结果，证实生成了纤维二糖。
其次，将多种寡糖作为底物。
通过将纤维二糖(Sigma)、纤维三糖、纤维四糖或纤维五糖(后三者购自Seikagaku公司)溶解于0.1M MES-NaOH缓冲剂(pH6.0)中使之浓度为1％(W/V)来制备寡糖溶液。将25μl的每一寡糖溶液加到25μl的10-、50-或250-倍用MES缓冲液稀释的该表达多肽的稀释液中。该混合物在98℃反应20分钟。用MES缓冲液替换该稀释的表达多肽溶液或该寡糖溶液加到混合物中，在同样的时间进行反应以作为对照。如上述的将磷酸膨胀纤维素用作底物的情况，将在反应后通过离心获得的1μl上清液进行硅胶-薄层层析。以纤维二糖、纤维三糖或纤维四糖作底物时，进行两次显影。以纤维五糖作底物时，进行三次显影。
不添加该表达多肽溶液，检测作为反应底物的纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖和纤维五糖的斑点。当不向反应中加入底物时，未检测到斑点。当加入该表达多肽溶液和其中一种底物进行反应时，除纤维二糖外，每一寡糖产生比完整底物的RF值大的斑点物质。该物质的数量依据所添加的表达多肽的量而增加。
如上所述应用寡糖作为底物，进行反应，只是该表达多肽溶液稀释率为10，并且反应时间为2小时。如上所述在硅胶薄层层析上分析通过离心该反应混合物获取的上清液。
结果，除纤维二糖外的底物几乎完全消耗。纤维三糖、纤维四糖产生纤维二糖。纤维五糖产生纤维三糖和纤维二糖。对每一作为底物的寡糖来说，主要的降解产物为纤维二糖。
这些结果证实，堀越热球菌OT3基因组中的开放阅读框架PH1171表达的多肽具有纤维二糖水解酶活性。
实施例3
本发明多肽的纤维二糖水解酶活性的物理和化学特性
在此实施例中应用实施例2-(2)中制备的本发明的多肽溶液。以下列活性测定纤维二糖水解酶活性：1)依据Park和Johnson方法，通过检测应用CMC作为底物产生的纤维二糖的量作为还原糖的量，测定的CMC-降解活性；2)通过检测应用pNPC作为底物产生的纤维二糖的量作为对硝基苯酚的量，测定的对硝基苯基-β-D-纤维二糖苷(pNPC)-降解活性；3)通过检测应用4-MUC作为底物产生的纤维二糖的量作为4-甲基繖形酮(4-MU)的量，测定的4-甲基繖形酮基-β-D-纤维二糖苷(pNPC)-降解活性。
(1)对反应pH的依赖(关系)
制备如下缓冲剂。pH为2.8、3.8、4.9或6.0的0.2M的柠檬酸钠缓冲剂、pH为4.6、5.5或6.5的MES-NaOH缓冲剂、pH为5.6、6.6或7.7的0.2M的Tris-HCl缓冲剂和pH为7.7、8.7或9.8的0.2M的甘氨酸-NaOH缓冲剂。在80℃检测pH。
将50μl本发明之多肽50倍的水稀释液、25μl的2％CMC水溶液和25μl一种上述的缓冲剂混合一起。该混合物在98℃反应20分钟。依据Park和Johnson方法，检测通过离心该反应混合物获取的上清液中所含的还原糖的量，并且计算该CMC-降解活性。
结果如图1所示。图1阐述反应pH和CMC-降解活性之间的关系。该横轴代表pH，纵轴代表CMC-降解活性(相对值，％)。空心圆(○)、实心圆(●)、空心方块(□)和实心方块(■)分别代表柠檬酸钠缓冲剂、MES-NaOH缓冲剂、Tris-HCl缓冲剂和甘氨酸-NaOH缓冲剂的结果。
本发明的多肽在pH4.9-6.5表现最大活性。
(2)对反应温度的依赖(关系)
将50μl在0.1M MES-NaOH缓冲剂(pH6.0)中的1％CMC溶液加入到50μl用0.1M MES-NaOH缓冲剂(pH6.0)稀释的本发明多肽的稀释液中。该混合物在37、65、98、108或113℃反应20分钟。依据Park和Johnson方法，通过检测产生的还原糖的量来测定的CMC-降解活性。
结果见图2。图2阐述反应温度和本发明之多肽的CMC-降解活性之间的关系。该横轴代表反应温度(℃)，纵轴代表CMC-降解活性(相对值，％)。
在108℃本发明之多肽表现最大的CMC-降解活性，在90℃时表现大约80％最大活性和在80℃时表现大约60％最大活性。
(3)盐浓度效应
用水或1、2、3、4或5M NaCl将本发明之多肽溶液稀释50倍。将50μl在0.1M MES-NaOH缓冲剂(pH6.0)中的1％CMC溶液加入到50μl一种本发明之多肽溶液的稀释液中。该混合物在98℃反应20分钟。依据Park和Johnson方法，通过检测产生的还原糖的量来测定CMC-降解活性。
结果见图3。图3阐述NaCl浓度和本发明之多肽的CMC-降解活性之间的关系。该横轴代表NaCl浓度(M)，纵轴代表CMC-降解活性(相对值，％)。
在0.5-0.6M NaCl存在时，本发明之多肽表现最大CMC-降解活性。
(4)pH稳定性
将25μl本发明之多肽的溶液和25μl在实施例3-(1)中制备的缓冲剂一起混合。该混合物在95℃加热10分钟。将50μl在0.1MMES-NaOH缓冲剂(pH6.0)中的1％CMC溶液加入到50μl该加热的混合物的50倍水稀释液中。该混合物在98℃反应20分钟。依据Park和Johnson方法，检测通过离心该反应混合物获取的上清液中所含的还原糖的量，并且计算该CMC-降解活性。
结果见图4。图4阐述该多肽在95℃加热10分钟时，pH和其保留的CMC-降解活性之间的关系。该横轴代表加热时的pH，纵轴代表保留的CMC-降解活性(U/ml)。空心圆(○)、实心圆(●)、空心方块(□)和实心方块(■)分别代表柠檬酸钠缓冲剂、MES-NaOH缓冲剂、Tris-HCl缓冲剂和甘氨酸-NaOH缓冲剂的结果。
在pH5-7时，本发明之多肽的CMC-降解活性表现最大稳定性。
(5)热稳定性
将CMC溶解于0.1M MES-NaOH缓冲剂(pH6.0)中以制备1％的CMC溶液(pH6.0)。将50μl MES缓冲剂加入到本发明之多肽的溶液中。在95℃加热0、1、5或24小时。将50μl 1％的CMC溶液加入通过离心该加热的混合物获取的上清液与MES缓冲剂的50-、200-或500-倍的稀释液中。该混合物在98℃反应20分钟。依据Park和Johnson方法，通过检测在该反应混合物中所含的还原糖的量来测定的CMC-降解活性。
结果见图5。图5阐述热处理-时间和在加热后该保留活性之间的关系。该横轴代表热处理-时间(小时)，纵轴代表加热后的保留活性(％)。
在95℃加热24小时后，本发明之多肽保留约90％的CMC-降解活性。
(6)对合成底物的降解活性
将50μl 0.1M MES-NaOH缓冲剂(pH6.0)中的10mM pNPC加入到50μl本发明之多肽溶液或其2-、5-、10-或20-倍用0.1M MES-NaOH缓冲剂(pH6.0)稀释的稀释液中。该混合物在98℃反应20分钟。依据释放的对硝基苯酚(pNP)的量，检测通过离心获取的上清液的405nm的吸收率，以测定pNPC-降解活性。
结果见图6。图6阐述本发明之多肽溶液的稀释率和每一稀释液pNPC-降解活性之间的关系。该横轴代表该稀释率的倒数，纵轴代表pNPC-降解活性(mU/ml)。
该pNPC-降解活性依据本发明多肽溶液浓度(的增加)而增加。
(7)葡萄糖和纤维二糖的抑制作用
含有0、10、20、50、100或200mM葡萄糖或0、5、10、25或50mM纤维二糖、0.4、0.8、1.2或1.6mM pNPC和本发明多肽溶液的50mM MES-NaOH缓冲剂(pH6.0)在98℃反应20分钟，并且检测405nm吸收率。对应葡萄糖或纤维二糖的浓度(横轴)标记405nm吸收率(纵轴)的倒数。测定通过连接各自的pNPC浓度的点获取的线的交叉点。通过倒转交叉点在横轴上的值的正或负号来测定抑制常数Ki。
因为葡萄糖对本发明多肽的pNPC-降解活性的抑制作用很小，因此不可能计算Ki。另一方面，纤维二糖的Ki为212mM。
(8)多种试剂的作用
含有0、0.5、1、2或10mM CoCl2、CuCl2、CaCl2、FeCl3、ZnCl2、MgCl2、二硫苏糖醇(DTT)或乙二胺四乙酸(EDTA)、5mM对硝基苯基-β-D-纤维二糖苷(pNPC，Sigma)和本发明多肽溶液的50mMMES-NaOH缓冲剂在98℃反应20分钟，并且检测405nm吸收率。应用对硝基苯酚(pNP)浓度和在405nm吸收率之间关系的标准曲线来计算pNPC-降解活性。将本发明之多肽的一个单位(U)的pNPC降解活性定义为，一分钟内，在上述的反应混合物中释放1μmmolpNP的量。
结果见图7。图7阐述多种试剂pNPC-降解活性之间的关系。该横轴代表该试剂的浓度，纵轴代表pNPC-降解活性(相对值，％)。在图7中，空心圆(○)、实心圆(●)空心方块(□)、实心方块(■)、空心三角(△)、实心三角(▲)、空心菱形(◇)和实心菱形(◆)分别代表CoCl2、CuCl2、CaCl2、FeCl3、ZnCl2、MgCl2、DTT或EDTA。
DTT不抑制本发明多肽的pNPC-降解活性。浓度为0.5mM的Cu2+、Fe3+或Zn2+抑制(该多肽)大约90％的活性。浓度为1mM的Co2+、Ca2+、Mg2+或EDTA抑制(该多肽)大约50％的活性。
(9)本发明之多肽的提纯
除了热处理为75℃ 20分钟外，如实施例2-(2)所述的方法制备表达多肽溶液。
应用HiTrap Q柱(pharmacia)对通过离心所加热的上清而获取的上清液进行阴离子交换层析。将该样品加到两个系列连接的5mlHiTrap Q柱上。20分钟内用自50mM MES-NaOH缓冲液(pH6.0)至含有200mM NaCl的同一缓冲液的线性梯度液洗脱，流速2ml/分钟。将50μl 6mM 4-MUC溶液(溶于100mM MES-NaOH缓冲液(pH6.0))加到50μl相应组分的系列稀释液之一中。该混合物在98℃反应20分钟。以355nm为激发波长，460nm为发射波长测量荧光。根据释放的4-MU的量来计算4-MUC降解活性。
应用HiTrap苯琼脂糖6快速柱(低分子量)(Pharmacia)对经该阴离子交换柱层析的活性组分进行疏水柱层析。将饱和的硫酸铵加到经该阴离子交换柱层析的活性组分中至20％的饱和度。将该混合物加到已用20％的硫酸铵平衡的疏水柱上(1ml体积)。15分钟内应用自含20％饱和度的硫酸铵的MES缓冲液至无硫酸铵的MES缓冲液的线性梯度液洗脱，流速1ml/分钟。在用约0％饱和硫酸铵洗脱的组分中检测4-MUC降解活性。
(10)比活性的测定
将2ml经疏水柱层析的活性组分通过超滤脱盐、冻干，然后在气相HCl存在的情况下135℃水解3小时。使水解物溶于100μl水。用氨基酸分析仪(L-8500 Hitachi)对50μl该溶液进行分析发现所分析的样本含有3.61μg蛋白质。对具有60MU 4-MUC降解活性的相应多肽进行氨基酸分析。这样，测得比活性为17.0U/mg。这样获得的提纯多肽在物理和化学性质上与实施例3中所测的(性质)类似。
(11)N-端氨基酸序列分析
按照常规方法对实施例3中制备的提纯多肽进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，在含10mM DTT的100mM琥珀酸盐缓冲液(pH5.8)中冲洗该凝胶，然后在含1mM 4-MUC的100mM琥珀酸盐缓冲液(pH5.8)中，60℃反应一小时。340nm紫外线照射该凝胶，观察荧光带。
按照半干印迹法将凝胶中的蛋白质转移到聚偏乙烯双氟化物(PVDF)膜上。该膜用考马斯亮蓝(CBB)染色。切下一部分PVDF膜。此部分对应于具有4-MUC降解活性的带并已用CBB染色。用肽测序仪分析N-端氨基酸序列。
N-端六个氨基酸残基的序列为Glu-Asn-Thr-Thr-Tyr-Gln。如前所证明，在大肠埃希氏杆菌中表达的本发明之多肽N-端28个氨基酸残基已得以去除。
实施例4
应用枯草芽孢杆菌生产本发明的多肽
(1)构建枯草芽孢杆菌表达载体
构建如WO 97/21823所述的质粒pNAPS1，用HindIII(TakaraShuzo)酶切并进行琼脂胶电泳。按照传统方法，从琼脂胶中提取和纯化大约4.5Kb的含有源于枯草芽孢杆菌的复制起点、枯草芽孢杆菌蛋白酶基因启动子和编码枯草芽孢杆菌蛋白酶分泌信号之序列的DNA片段。用HindIII酶切pUC119(Takara Shuzo)并且用碱性磷酸酶将其去磷酸化。用DNA连接酶将这些DNA片段连接。按照传统的方法，进行大肠埃希氏杆菌的转化、转化体的培养和质粒的提取和纯化。从这些获取的质粒中，筛选其中插入该4.5Kb的DNA片段从而使pUC119中的lac启动子和枯草芽孢杆菌蛋白酶基因启动子方向相反的质粒，并将其命名为pUC119-BV。
用BamHI酶切在实施例1中构建的pECEL101并进行琼脂胶电泳。按照传统的方法，从该琼脂胶中，提取和纯化开放阅读框架PH1171中编码从19位亮氨酸残基到终末端密码子部分片段的大约1.5Kb的DNA片段。用BamHI酶切上述方法获得的pUC119-BV并进行琼脂胶电泳。按照传统方法，从琼脂胶中提取和纯化大约4.5Kb的含有源于枯草芽孢杆菌的复制起点和类似物的DNA片段。用DNA连接酶将这些DNA片段连接。按照传统的方法，进行枯草芽孢杆菌DB104的转化、转化体的培养和质粒的提取和纯化。
从这些获取的质粒中，筛选其中插入与该载体中枯草芽孢杆菌蛋白酶基因启动子方向相同的开放阅读框架PH1171的质粒，并将其命名为pNECEL101。质粒pNECEL101编码在枯草芽孢杆菌中构成性表达的枯草芽孢杆菌蛋白酶基因启动子之下游的融合多肽。在该融合多肽中，来源于该载体、包括由在N-端29个氨基酸残基组成的枯草芽孢杆菌蛋白酶分泌性信号序列在内的31个氨基酸残基的前导序列与始于19位亮氨酸残基的PH1171相连。当该质粒分泌时，获取与在该载体中的枯草芽孢杆菌蛋白酶基因启动子相反的方向而插入开放阅读框架PH1171的质粒和该载体自身连接得到的质粒，并将它们分别命名为pNCEL001和pNBV。这些质粒用作检测表达的载体对照。
(2)本发明之多肽的表达
在含有10μg/ml卡那霉素的LB培养基中温育和在富氧情况下37℃过夜培养如上述方法获得的用pNCEL101、pNCEL001或pNBV转化的枯草芽孢杆菌DB104。如实施例2-(1)所述应用得到的培养物代替该无细胞提取物，检测在培养物中的CMC-降解活性。
具体地，将50μl一种枯草芽孢杆菌转化体培养物和50μl在100mM柠檬酸钠缓冲剂中的1％CMC溶液一起混合，并且在该混合物上覆盖矿物油。在98℃孵育60分钟后，将该混合物离心并重新获取上清液。按照如实施例2-(1)所述的Park和Johnson方法，检测该反应混合物的还原能。应用pNCEL101转化的枯草芽孢杆菌DB104的培养物的反应混合物，明显地比应用自身-连接载体来源的质粒pNBV转化的DB104的培养物的反应混合物(对照)，表现较高的还原能。依据还原能而计算的CMC-降解活性为0.63mU/ml培养物，该还原能通过减去对照组的值并转化为相应的葡萄糖的量来测定。对以相反方向插入PH1171的质粒pNCEL001而言，只发现与pNBV相等的还原能。
实施例5
应用本发明之多肽对纸张的降解
将25mg的Kimwipe(Crecia)约1mm2的小片。将480μl 50mMMES-NaOH(pH6.0)和20μl同样的缓冲剂或在实施例2-(1)中制备的pECEL211转化的大肠埃希氏杆菌的无细胞提取物加入其中。该混合物在95℃反应66个小时。将100μl乙腈加入到50μl离心获取的上清中。通过离心去掉不可溶的物质。在减压下将该上清液蒸发致干。将该残留物再重新溶解于10μl 50％的乙腈水溶液中。将1μl的该溶液用于如实施例2-(1)中所述的硅胶薄层层析。
结果，只有在加入了用pECEL211转化的大肠埃希氏杆菌的无细胞提取物的标本中，观察到具有与纤维二糖相同RF值的点。
工业应用
本发明提供具有纤维二糖水解酶活性的多肽。本发明之多肽具有高度耐热性并且能高效降解纤维素。由于通过与来源于极度嗜热菌的内切葡聚糖酶、外切-1，4-β-D-葡糖苷酶和β-D-葡糖苷酶联合应用，本发明之多肽能高效地从纤维素中生产葡萄糖，因此可方便地利用纤维素-类型的生物量。
序列表
SEQ ID NO：3：命名为1171FN的寡核苷酸引物，设计用以扩增含有开放阅读框架PH1171的1.6-kb的DNA片段。
SEQ ID NO：4：命名为1171RA的寡核苷酸引物，设计用以扩增含有开放阅读框架PH1171的1.6-kb的DNA片段。

Claims (12)

1.一种具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列或具有通过在SEQ IDNO：1氨基酸序列中缺失、加入、插入和/或替换一个或多个氨基酸残基所得到的氨基酸序列的多肽，其具有纤维二糖水解酶活性。
2.权利要求1的多肽，其具有热稳定性的纤维二糖水解酶活性。
3.一种编码权利要求1或2之多肽的核酸。
4.权利要求3的核酸，其具有SEQ ID NO：2的核苷酸序列。
5.一种编码具有纤维二糖水解酶活性的多肽的核酸，它在严格情况下能与权利要求3中的核酸杂交。
6.权利要求5的核酸，其编码具有热稳定的纤维二糖水解酶活性的多肽。
7.一种含有权利要求3-6中任一项的核酸的重组DNA。
8.一种用权利要求7的重组DNA转化的转化体。
9.一种生产权利要求1的多肽的方法，该方法包括培养权利要求8中的转化体和从培养物中收集具有纤维二糖水解酶活性的多肽。
10.一种降解通过β-1，4键相连的D-吡喃葡萄糖聚合物的方法，该方法包括使权利要求1或2中的多肽，作用于通过β-1，4键相连的D-吡喃葡萄糖聚合物，以释放纤维二糖。
11.一种具有纤维二糖水解酶活性和对纤维二糖的抑制常数Ki大于或等于10mM的多肽。
12.权利要求11的多肽，其在95℃处理5小时后能保持20％或更多的纤维二糖水解酶活性。
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