CN101048500B - 红褐肉座菌cbh1纤维素酶的新变体 - Google Patents

红褐肉座菌cbh1纤维素酶的新变体 Download PDF

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Abstract

此处描述红褐肉座菌(H.jecorina)的一种Ce17酶CBH I的变体。本发明提供了具有改善的热稳定性和可逆性的纤维二糖水解酶。

Description

红褐肉座菌CBH1纤维素酶的新变体
                相关申请的交叉引用
[01]本申请要求对2002年8月16日提交的美国临时申请No.60/404,063(Attorney Docket No.GC772P)、2003年3月27日提交的美国临时申请No.60/458,853(Attorney Docket No.GC772-2P)、2003年3月21日提交的美国临时申请No.60/456,368(Attorney DocketNo.GC793P)和2003年3月27日提交的美国临时申请No.60/458,696(Attorney Docket No.GC793-2P)的优先权，此处引用全文作为参考。
关于在联邦政府赞助下的研究与开发所产生发明的权利的声明
[02]本工作的一部分由在美国能源部主合同No.DE-AC36-99G010337下的国家再生能源实验室(National RenewableEnergy Laboratory)转包合同No.ZCO-0-30017-01提供资助。因此，美国政府能够在本发明中具有某些权利。
                      发明领域
[03]本发明涉及变体纤维二糖水解酶、以及分离的编码具有纤维二糖水解酶活性的多肽的核酸序列。本发明还涉及包括该核酸序列的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及用于生产重组变体CBH多肽的方法。
                      参考文献
1.Sheehan和Himmel Biotechnology Progress 15，pp 817-827(1999)
2.Matti Linko Proceedings of the Second TRICEL Symposiumon Trichoderma reesei Cellulases and Other Hydrolases pp 9-11(1993)
3.Tuula T.Teeri Trends in Biotechnology 15，pp 160-167(1997)
4.T.T.Teeri等，Spec.Publ.-R.Soc.Chem.，246(RecentAdvances in Carbohydrate Bioengineering)，pp 302-308.(1999)
5.PDB reference 20VW：Sulzenbacher，G.，Schulein，M.，Davies，G.J.Biochemistry 36 pp.5902(1997)
6.PDB referencelA39：Davies，G.J.，Ducros，V.，Lewis，R.J.，Borchert，T.V.，Schulein，M.Journal of Biotechnology 57pp.91(1997)
7.PDB reference 6CEL：Divne，C.，Stahlberg，J.，Teeri，T.T.，Jones，T.A.Journal of Molecular Biology 275 pp.309(1998)
8.PDB reference 1 EG1：Kleywegt，G.J.，Zou，J.Y.，Divne，C.，Davies，G.J.，Sinning，I.，Stahlberg，J.，Reinikainen，T.，Srisodsuk，M.，Teeri，T.T.，Jones，T.A.Journal of MolecularBiology 272 pp.383(1997)
9.PDB reference 1 DY4(8CEL)：J.Stahlberg，H.Henriksson，C.Divne，R.Isaksson，G.Pettersson，G.Johansson，T.A.Jones
                        发明背景
[04]纤维素和半纤维素是通过光合作用产生的最为丰富的植物原料。他们可以被大量微生物降解并作为其能量来源，这些微生物包括产生能够将聚合体底物水解为单糖的细胞外酶的细菌、酵母和真菌(Aro等，J.Biol.Chem.，vol.276，no.26，pp.24309-24314，June 29，2001)。由于不可再生资源途径的限制，纤维素成为主要的可再生能量来源的潜力是巨大的(Krishna等，Bioresource Tech.77：193-196，2001)。纤维素通过生物途径的有效利用，是克服食物、饲料和燃料缺乏的途径(Ohmiyaet等，Biotechnol.Gen.Engineer.Rev.vol.14，pp.365-414，1997)。
[05]纤维素酶水解纤维素(β-1，4-葡聚糖或βD-葡萄糖苷联接)从而形成葡萄糖、纤维二糖、纤维寡糖等。纤维素酶通常分为三大类：内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)(“EG”)、外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)(“CBH”)和β-葡萄糖苷酶(β-D-葡萄糖苷葡糖水解酶；EC 3.2.1.21)(“BG”)。(Knowles等人，TIBTECH 5，255-261，1987；Shulein，Methodes Enzymol.，160，25，pp.234-243，1988)。内切葡聚糖酶主要作用于纤维素纤维的无定形部分，而纤维二糖水解酶也可以降解晶体纤维素(Nevalainen和Penttila，Mycota，303-319，1995)。因此，在纤维素酶系统中存在纤维二糖水解酶对于晶体纤维素的有效溶解是必需的(Suurnakki等，Cellulose 7：189-209，2000)。β-葡萄糖苷酶起到从纤维二糖、纤维寡糖和其他糖苷释放D-葡萄糖单元的作用(Freer，J.Biol.Chem.vol.268，no.13，pp.9337-9342，1993)。
[06]已知纤维素酶由许多细菌、酵母和真菌产生。某种真菌产生能够降解纤维素晶体形式的完整的纤维素酶系统，所以纤维素酶易于经发酵大量产生。由于许多酵母(例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))缺乏水解纤维素的能力，丝状真菌扮演了特殊的角色。见例如Aro等，2001；Aubert等，1988；Wood等，Methods in Enzymology，vol.160，no.9，pp.87-116，1988，以及Coughlan等，“ComparativeBiochemistry of Fungal and Bacterial Cellulolytic Enzyme Systems”Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation，pp.11-30，1988。
[07]CBH、EG和BG的真菌纤维素酶分类可以进一步扩展为每个分类内包括多种成分。例如，从多种真菌来源分离出多种CBH、EG和BG，这些真菌来源包括瑞氏木霉(Trichoderma reesei)这样含有两个CBH(即CBH I和CBH II)、至少八个EG(即EG I、EG II、EG III、EG IV、EG V、EG VI、EG VII和EG VIII)，以及至少五个BG(即BG1、BG2、BG3、BG4和BG5)的已知基因。
[08]为了将晶体纤维素有效的转化为葡萄糖，完整的纤维素酶系统是必需的，该系统包括来自CBH、EG和BG每个分类的成分，具有的单独成分在水解晶体纤维素中效率较低(Filho等，Can.J.Microbiol.42：1-5，1996)。在来自不同分类的纤维素酶成分之间，可以观察到协同关系。特别是EG型纤维素酶和CBH型纤维素酶协同相互作用，更有效的降解纤维素酶。见例如Wood，Biochemical Society Transactions，611thMeeting，Galway，vol.13，pp.407-410，1985。
[09]在纺织品处理中，对于加强去垢剂组合物清洁能力的目的、作为软化剂、用于改善棉织品的触感和外观等，纤维素酶是有帮助的，此点为本领域所公知(Kumar等，Textile Chemist and Colorist，29：37-42，1997)。
[10]含有纤维素酶、具有改善的清洁性能(美国专利No.4,435,307；GB App.Nos.2,095,275和2,094,826)、用于棉织品处理以改善纺织品触感和外观的清洁剂成分已得到描述(美国专利Nos.5,648,263，5,691,178，以及5,776,757；GB App.No.1,358,599；The ShizuokaPrefectural Hammamatsu Textile Industrial Research InstituteReport，Vol.24，pp.54-61，1986)。
[11]因此，在真菌和细菌中产生的纤维素酶得到显著的关注。特别是，木霉属物种(例如长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)或瑞氏木霉)的发酵显示产生完整的纤维素酶系统，能够降解纤维素的晶体形式。
[12]尽管纤维素酶组合物先前已有描述，仍然需要新的以及改进的纤维素酶组合物，用于家用清洁剂、石洗组合物或洗衣用清洁剂等。展示出改善性能的纤维素酶是特别的目的。
                        发明概述
[13]本发明提供一种分离的、此处鉴定为CHB I变体的纤维素酶蛋白质，以及编码CBH I变体的核酸。
[14]在一个实施方案中，本发明涉及一种CBH I纤维素酶变体，其中所述变体包括对应于红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)CBH I(SEQ IDNO：2)的S8、Q17、G22、T41、N49、S57、N64、A68、A77、N89、S92、N103、A112、S113、E193、S196、M213、L225、T226、P227、T246、D249、R251、Y252、T255、D257、D259、S278、S279、K286、L288、E295、T296、S297、A299、N301、E325、T332、F338、S342、F352、T356、Y371、T380、Y381、V393、R394、S398、V403、S411、G430、G440、T445、T462、T484、Q487和P491中之一或更多残基的位点的置换或缺失。在第一方面，本发明包括分离的编码具有纤维二糖水解酶活性的多肽的核酸，该多肽是家族7的糖基水解酶的变体，并且其中所述核酸编码由此核酸编码的多肽中对温度应激(stress)敏感的残基的置换，其中所述纤维二糖水解酶衍生自红褐肉座菌纤维二糖水解酶。在第二方面，本发明包括分离的编码具有纤维二糖水解酶活性的多肽的核酸，该多肽是家族7的糖基水解酶的变体，其中所述核酸在由所述核酸编码的多肽中实现酶加工的残基处编码置换，其中所述纤维二糖水解酶衍生自红褐肉座菌纤维二糖水解酶。在第三方面，本发明包括分离的编码具有纤维二糖水解酶活性的多肽的核酸，该多肽是家族7的糖基水解酶的变体，其中在由所述核酸编码的多肽中实现产物抑制的残基处所述核酸编码在此残基的置换，其中所述纤维二糖水解酶衍生自红褐肉座菌纤维二糖水解酶。
[15]在第二个实施方案中，本发明涉及一种CBH I纤维素酶变体，包括对应于红褐肉座菌CBH I(SEQ ID NO：2)的S8P、Q17L、G22D、T41I、N49S、S57N、N64D、A68T、A77D、N89D、S92T、N103I、A112E、S113(T/N/D)、E193V、S196T、M213I、L225F、T226A、P227(L/T/A)、T246(C/A)、D249K、R251A、Y252(A/Q)、T255P、D257E、D259W、S278P、S279N、K286M、L288F、E295K、T296P、S297T、A299E、N301(R/K)、E325K、T332(K/Y/H)、F338Y、S342Y、F352L、T356L、Y371C、T380G、Y381D、V393G、R394A、S398T、V403D、S411F、G430F、G440R、T462I、T484S、Q487L和/或P491L中之一或更多残基的位点的置换。在本实施方案的一个方面中，CBH I纤维素酶变体另外包括对应于来自红褐肉座菌的CBH I(SEQ ID NO：2)中T455的位点的缺失。在本实施方案的第二个方面，CBH I纤维素酶变体另外包括对应于红褐肉座菌的CBH I(SEQ ID NO：2)中残基382-393的残基缺失。
[16]在第三个实施方案中，本发明涉及一种CBH I纤维素酶变体，其中所述变体包括残基位点的置换，该位点对应于选自红褐肉座菌CBH I(SEQ ID NO：2)的S8P、N49S、A68T、A77D、N89D、S92T、S113(N/D)、L225F、P227(A/L/T)、D249K、T255P、D257E、S279N、L288F、E295K、S297T、A299E、N301K、T332(K/Y/H)、F338Y、T356L、V393G、G430F中的残基。
[17]在第四个实施方案中，本发明涉及一种基本由突变体组成的CBH I变体，该突变体选自红褐肉座菌CBH I(SEQ ID NO：2)的
i A112E/T226A；
ii S196T/S411F；
iii E295K/S398T；
iv T246C/Y371C；
v T41I加T445缺失；
vi A68T/G440R/P491L；
vii G22D/S278P/T296P；
viii T246A/R251A/Y252A；
ix T380G/Y381D/R394A；
x T380G/Y381D/R394A加382-393缺失；
xi Y252Q/D259W/S342Y；
xii S113T/T255P/K286M；
xiii P227L/E325K/Q487L；
xiv P227T/T484S/F352L；
xv Q17L/E193V/M213I/F352L；
xvi S8P/N49S/A68T/S113N；
xvii S8P/N49S/A68T/S113N/P227L；
xviii T41I/A112E/P227L/S278P/T296P；
xix S8P/N49S/A68T/A112E/T226A；
xx  S8P/N49S/A68T/A112E/P227L；
xxi S8P/T41I/N49S/A68T/A112E/P227L；
xxii  G22D/N49S/A68T/P227L/S278P/T296P；
xxiii S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/S278P/T296P；
xxiv  G22D/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/S278P/T296P；
xxv G22D/N49S/A68T/N103I/A112E/P227L/S278P/T296P；
xxvi  G22D/N49S/N64D/A68T/N103I/S113N/S278P/T296P；
xxvii S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/D249K/S278P/T296P；
xxviii S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/S278P/T296P/N301R；
xxix S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/D249K/S278P/T296P/N301R；
xxx S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S113N/P227L/D249K/S278P/T296P/N301R；
xxxi S8P/T41I/N49S/S57N/A68T/S113N/P227L/D249K/S278P/T296P/N301R；
xxxii S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S113N/P227L/D249K/S278P/N301R；
xxxiii S8P/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/V403D/T462I；
xxxiv S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/V403D/T462I；
xxxv S8P/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/S411F；
xxxvi S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/S411F；
xxxvii S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/S196T/P227L/D249K/T255P/S278P/T296P/N301R/E325K/S411F；
xxxviii S8P/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/S196T/P227L/D249K/T255P/S278P/T296P/N301R/E325K/V403D/S411F/T462I；
xxxix S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/S196T/P227L/D249K/T255P/S278P/T296P/N301R/E325K/V403D/S411F/T462I；
[18]在第五个实施方案中，本发明涉及包括变体CBH I的编码核酸的载体。在另一个方面涉及包括有效连接于调控序列的CBH I变体编码核酸的构建体。
[19]在第六个实施方案中，本发明涉及用包括CBH I变体的编码核酸的载体转化的宿主细胞。
[20]在第七个实施方案中，本发明涉及产生CBH I变体的方法，包括步骤：
(a)在适宜的培养条件下，在合适的培养基中培养转化了包括编码CBH I变体的核酸的载体的宿主细胞，产生CBH I变体；
(b)获得如上产生的CBH I变体。
[21]在第八个实施方案中，本发明涉及包括表面活性剂和CBH I变体的去垢剂组合物。在此实施方案的一个方面，该清洁剂是洗衣用清洁剂。在此实施方案的第二个方面，该清洁剂为餐具清洁剂。在本发明的第三个方面，此CBH I纤维素酶变体用于含纤维素纺织品、尤其是在石洗或靛青染色的粗斜纹棉布中的处理。
[22]在第九个实施方案中，本发明涉及包括CBH I变体的饲料添加剂。
[23]在第十个实施方案中，本发明涉及处理木质纸浆的方法，该方法包括将所述木质纸浆与CBH I变体接触。
[24]在第十一个实施方案中，本发明涉及将生物物质(biomass)转化为糖的方法，该方法包括将所述植物材料、蔬菜或农业废弃物与CBH I变体接触。
[25]在一个实施方案中，纤维素酶来源于真菌、细菌或放线菌类。在另一方面，纤维素酶来源于真菌。在最为优选的实施方案中，该真菌为丝状真菌。首选属于真子囊菌(Euascomycete)、特别是曲霉属物种、粘帚霉属物种(Gliocladium spp.)、镰孢菌属物种(Fusarium spp.)、支顶孢属物种(Acremonium spp.)、毁丝霉属物种(Myceliophtoraspp).、轮枝孢属物种(Verticillium spp.)、漆斑菌属物种(Myrotheciumspp.)或青霉属物种的丝状真菌。在本实施方案的另一个方面，此纤维素酶为纤维二糖水解酶。
[26]本发明的其他目的、特征和优点将在随后的详细描述中变得明晰。然而，应当理解，尽管指示了本发明优选的实施方案，详细描述和特定的实施例仅以说明形式给出，因为从此详细的描述中，对于本领域技术人员而言，在本发明范围和精神之内的多种改变和改良是显而易见的。
                    附图概述
[27]图1是来自红褐肉座菌的野生型Ce17A(CBH I)的核酸(下列；SEQ ID NO：1)和氨基酸序列(上列；SEQ ID NO：2)。
[28]图2为红褐肉座菌CBH I的三维结构。
[29]图3显示了Cel7家族可获得晶体结构的成员的氨基酸比对。序列为：20VW-尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)Cel7B、1A39-Humicolainsolens Cel7B、6CEL-红褐肉座菌Cel7A、1EG1-红褐肉座菌Cel7B。
[30]图4阐明了如此处描述进行比对和覆盖的四种Cel7同源物的催化域的晶体结构。
[31]图5A-M是八个单残基突变和五个多重突变体的核酸序列以及推论得到的氨基酸序列。
[32]图6A-D为pTrex2核酸序列。
[33]图7A和B描述了表达质粒pTEX的构建。
[34]｀图8A-J是Cel7家族全部42个成员的氨基酸比对。
[35]图9A是野生型和八种单残基变体的热性能表示。图9B是野生型和五种变体的热性能表示。图9B图例：Cel7A＝野生型红褐肉座菌CBH I；N301K＝N301K变体；334＝P227L变体；340＝S8P/N49S/A68T/S113N变体；350＝S8P/N49S/A68T/S113N/P227L变体；以及363＝S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/S278P/T296P变体。
[36]图10为pRAX1载体。除了插入构巢曲霉(Aspergillusnidulans)基因组DNA片段AMA1序列的5259个碱基对的HindIII片段之外，该载体以pGAPT2质粒为基础(Molecular Microbiology，1996，19：565-574)。碱基1至1134含有黑曲霉(Aspergillus niger)葡糖淀粉酶基因启动子。碱基3098至3356及4950至4971含有黑曲霉葡糖淀粉酶终止子。构巢曲霉pyrG基因作为真菌转化标志在3357至4949插入。具有可以插入基因的多克隆位点(MCS)。
[37]图11是pRAXdes2载体骨架。该载体以质粒载体pRAX1为基础。一个Gateway盒插入pRAX1载体(由环形质粒内的箭头指示)。该盒含有重组序列attR1和attR2以及选择标志catH和ccdB。该载体根据GatewayTM Cloning Technology中提供的指南制备：译本1中34-38页，而且只能在来自Invitrogen的大肠杆菌DB3.1中复制；在其他大肠杆菌宿主中，ccdB基因是致死性的。首先，使用含有attB1/2重组序列的引物制备PCR片段。该片段与pDONR201(由Invitrogen商业供应)重组；该载体含有attP1/2重组序列，重组位点之间有catH和ccdB。使用由Invitrogen提供的BP克隆酶(clonase enzyme)将PCR片段重组入这个所谓的ENTRY载体内，含有插入的PCR片段的克隆可以通过50μg/ml卡那霉素选择，因为表达ccdB的克隆不能存活。现在，att序列被改变，并被称为attL1和attL2。第二步是将此克隆与pRAXdes2载体(含有attR1和attR2，catH和ccdB在重组位点之间)重组。使用Invitrogen的LR克隆酶将来自ENTRY载体的插入物重组入目的载体。使用100μg/ml氨苄青霉素，仅有pRAXCBH1载体被选择，因为ccdB是致死性的，而ENTRY载体对氨苄青霉素敏感。使用这种方法，现在制备了表达载体，并可转化黑曲霉。
[38]图12提供pRAXdes2cbh1载体的图解，使用该载体在曲霉内表达编码CBH1变体的核酸。通过att序列的同源重组，编码CBH1酶的同系物或变体的核酸序列被克隆进入载体。
                            详细描述
[39]本发明将使用随后的定义和实施例、仅仅通过参考得以详细说明。此处提及的所有专利和出版物，包括所有在这些专利和出版物中公布的序列，被明确引用作为参考。
[40]除非在此另外定义，所有此处使用的技术和科学术语与本发明所属领域一般技术人员通常的理解具有相同的含义。Singleton等，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，2D ED.，JohnWiley and Sons，New York(1994)，以及Hale和Marham，THE HARPERCOLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY，Harper Perennial，NY(1991)为技术人员提供了含有本发明中使用的许多术语的通用词典。尽管任何与此处所述类似或相当的方法和材料可以用于实践或检测本发明，优选的方法和材料得以描述。数字范围包括定义该范围的数字。除非另外指出，核酸按照从5′到3′的方向从左向右写；氨基酸序列按照从氨基端到羧基端的方向从左向右写。从业者对本领域定义和术语特别可参考Sambrook等，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MAMUAL(SecondEdition)，Cold Spring Harbor Press，Plainview，N.Y.，1989，以及Ausubel FM等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley& Sons，New York，NY，1993。应当理解，由于本发明可能变化，因此不限定于所描述的特定的方法学、方案和试剂。
[41]此处提供的标题不是本发明多个方面或实施方案的限制，本发明的多个方面或实施方案应参考整个说明书而得到。因此，通过参考整个说明书，下面马上要定义的术语将得到更加充分的定义。
[42]为了描述和公布可能使用的、与本发明有关的组合物和方法学，此处所有列出的出版物在此明确引用作为参考。
I定义
[43]如此处所用的术语“多肽”，指由肽键连接的氨基酸残基单链组成的化合物。如此处所用的术语“蛋白质”，可以与术语“多肽”同义，或者额外指两种或更多多肽的复合物。
[44]“变体”意味着通过向C和N末端之一或两者增加一个或更多氨基酸、在氨基酸序列的一个或者许多不同位点置换一个或多个氨基酸、或者在蛋白质末端之一或两者、或在氨基酸序列的一个或更多位点删除一个或多个氨基酸，得以由前体蛋白质(例如天然蛋白)衍生的蛋白质。酶变体的制备优选通过如下步骤实现：修饰编码天然蛋白质的DNA序列，将此DNA序列转化进入适宜的宿主，以及表达经过修饰的DNA序列，以形成衍生酶。本发明的变体CBH I酶包括含有与前体酶氨基酸序列相比而言改变的氨基酸序列的肽，其中变体CBH酶保留了前体酶特有的分解纤维素的性质，但是在某些特定的方面可能具有改变的特性。例如，变体CBH酶可能具有升高的最适pH或升高的温度或氧化稳定性，但是将保留其纤维素分解活性的性质。预计根据本发明的变体可以得自编码纤维素酶变体CBH酶的DNA片段，其表达的纤维素酶衍生物的功能活性得以保留。例如，编码纤维素酶的DNA片段可以另外包括附加于纤维素酶DNA序列5′或3′末端、可以编码铰链或连接子的DNA片段或其部分，在此纤维素酶DNA序列中，编码的纤维素酶结构域的功能活性得以保留。
[45]“等价残基(Equivalent residues)”也可以通过测定与前体纤维素酶在三级结构水平的同源性得以定义，其中前体纤维素酶的三级结构已经X线晶体学测定。等价残基定义为：经过比对后，纤维素酶和红褐肉座菌CBH特定氨基酸残基的两个或两个以上主链原子的原子坐标(N与N，CA与CA，C与C以及O与O)在0.13nm内、优选0.1nm内的残基。在最佳模式得到确定并定位，纤维素酶蛋白质非氢原子与红褐肉座菌CBH I的原子坐标具有最大交迭之后，比对得以实现。最佳模型是在可以得到最高分辨率时，实验衍射数据具有最低R因子的晶体学模型。
Figure G03823928020070530D000131
[46]与红褐肉座菌CBH I的特定残基功能类似的等价残基定义为如下的纤维素酶氨基酸：他们采用某种构象，从而它们以某种方式改变、修饰或形成蛋白质结构、底物结合或催化，其中所述方式由红褐肉座菌CBHI的特定残基定义或造成。另外，他们是占据相似位置的纤维素酶(其三级结构已经通过X射线晶体学获得)残基，就此意义而言，尽管给定残基的主链原子可能不满足在占据同源位点基础上的等价的标准，该残基的至少两个侧链原子的原子坐标位于红褐肉座菌CBH相应侧链原子的0.13nm范围内。红褐肉座菌CBH I的晶体结构展示于图2中。
[47]术语“核酸分子”包括RNA、DNA和cDNA分子。应当理解，由于遗传密码子的兼并性，可以产生编码给定蛋白质(例如CBH I)的多个核酸序列。本发明考虑到编码CBH I的每个可能的核苷酸序列变体，基于遗传密码子的兼并性，所有这些变体都是可能的。
[48]“异源”核酸构建体或序列具有在其进行表达的细胞中为非天然的序列部分。关于调节序列，异源指不能天然行使调控相同基因的职责的调节序列(即启动子或增强子)，而该基因的表达目前正由此调节序列调控。通常，异源核酸序列不是细胞内生的，或不是其所存在的基因组的部分，而是通过传染、转染、转化、显微注射、电穿孔等加入细胞。“异源”核酸构建体可以含有调节序列/DNA编码序列组合，该组合与天然细胞中发现的调节序列/DNA编码序列组合相同或不同。
[49]此处所使用的术语“载体”，指为了在不同宿主细胞之间转移而设计的核酸构建体。“表达载体”指具有整合并在外源细胞表达异源DNA片段的能力的载体。许多原核和真核表达载体有商业供应。选择合适的表达载体在本领域技术人员的知识范围之内。
[50]因此，“表达盒”或“表达载体”是重组或合成产生的、含有一系列允许特定核酸在靶细胞转录的特定核酸元件的核酸构建体。重组表达盒可以整合到质粒、染色体、线粒体DNA、质粒DNA、病毒或核酸片段中。一般，除了其他序列，表达载体的重组表达盒部分还包括将要得到转录的核酸序列和启动子。
[51]此处所使用的术语“质粒”，指作为克隆载体使用的环形双链DNA构建体，在许多细菌和一些真核细胞中形成染色体外的自我复制基因元件。
[52]此处所使用的术语“选择标志编码核酸序列”，指能够在细胞内表达的核酸序列，此选择标志的表达给予含有该表达基因的细胞在相应选择试剂存在或在相应选择条件下的生长能力。
[53]此处所使用的术语“启动子”，指行使指导下游基因转录职责的核酸序列。启动子通常适合于目的基因在其中表达的宿主细胞。启动子及其他转录和翻译调控核酸序列(也称为“调节序列”)对于表达给定基因是必要的。总而言之，转录和翻译调控序列包括但是不限于启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列、以及增强子或激活序列。
[54]如此处定义的“嵌合基因”或“异源核酸构建体”指可能由包括调节元件在内的不同基因部分组成的非天然基因(即引入宿主的基因)。用于转化宿主细胞的嵌合基因构建体一般含有转录调控区(增强子)，此转录调控区有效连接于异源蛋白质编码序列，或者在选择标志嵌合基因中，有效连接于编码给予转化细胞抗生素抗性的蛋白质的选择标志基因。本发明中用于转化进入宿主细胞的一个典型嵌合基因，包括组成性的或可诱导的转录调控区、蛋白质编码序列和终止序列。如果需要分泌目的蛋白，嵌合基因构建体也可以包括编码信号肽的第二DNA序列。
[55]当核酸被置于与其他核酸序列的功能关系当中时，就是“有效连接的”。例如，如果作为参与多肽分泌的蛋白质原而表达，编码分泌性前导序列的DNA有效连接到编码多肽的DNA；如果影响序列转录，则启动子或增强子被认为有效连接到编码序列；或者如果被定位以帮助翻译，则核糖体结合位点被认为有效连接于编码序列。通常，“有效连接的”意味连接的DNA序列是邻近的，在分泌性前导序列的情况下，是邻近的并且是按阅读框连接的。然而，增强子不必是邻近的。连接通过在便利的限制位点连接得以完成。如果这样的位点不存在，合成的寡核苷酸接头、连接子或PCR引物得以按照传统实践使用。
[56]如此处所使用的，术语“基因”意为参与产生多肽链的DNA节段，可以或不可以包括编码区之前和之后的区域，例如5′非翻译区(5′UTR)或“前导区”序列和3′UTR或“尾区”序列，和编码片段(外显子)之间的插入序列(内含子)。
[57]总而言之，编码CBH I变体的核酸分子将在中到高严紧性条件下与此处提供的野生型序列SEQ ID NO：1杂交。然而，在某些情况下，持有显著不同的密码子利用的CBH I编码核酸序列得以使用，由该CBH I编码核酸序列编码的蛋白质具有与天然蛋白质相同或基本相同的氨基酸序列。例如，根据特定密码子被宿主利用的频率，编码序列可以得到修饰以帮助CBH I在特定的原核或真核表达系统中更快的表达。例如，Te′o等人(FEMS Microbiology Letters 190：13-19，2000)描述了用于在丝状真菌中表达的基因的优化。
[58]一个核酸序列可以认为与参考核酸序列是“可以选择性杂交的”，如果这两个序列在中到高严紧杂交和清洗条件下彼此特异性杂交。杂交条件以核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)为基础。例如，“最大严紧性”一般出现在约Tm-5℃(探针解链温度Tm的5度以下)；“高严紧性”约在Tm之下5-10度；“中度”或“中间严紧性”约在探针解链温度的10-20度之下；以及“低严紧性”约在解链温度Tm的20-25度以下。功能上，最大严紧性条件可以用于鉴定与杂交探针具有严格一致性或接近严格一致性的序列；而高严紧性条件用于鉴定与探针具有80％以上的序列一致性的序列。
[59]中度和高度严密性杂交条件为本领域所周知(见，例如，Sambrook等人，1989，第九及第十一章，以及Ausubel，F.M.等人，1993，此处明确的引用作为参考)。高严紧性条件的一个例子包括：在50％甲酰胺、5X SSC、5X Denhardt′s溶液、0.5％SDS和100μg/ml变性载体DNA中，约42℃杂交，继之在室温下以2XSSC和0.5％SDS清洗两次，以及在42℃以0.1XSSC和0.5％SDS附加清洗两次。
[60]当涉及细胞或载体时，此处所使用的“重组体”包括通过引入异源核酸序列被修饰的细胞或载体，或者从这样修饰的细胞中衍生的细胞。因此，例如，由于蓄意的人为干预的结果，重组体细胞表达与细胞的天然形式(非重组)中发现的不同形式的基因，或者表达天然细胞中异常表达、低表达或根本不表达的天然基因。
[61]涉及细胞时，此处所使用的术语“转化的”、“稳定转化的”或“转基因的”，意为细胞具有整合到其基因组中、或作为游离质粒而维持多代的非天然(异源的)核酸序列。
[62]此处所使用的术语“表达”，指以基因的核酸序列为基础的多肽产生过程。此过程包括转录和翻译。
[63]在将核酸序列插入细胞的上下文中，术语“转入的”意为“转染”、或“转化”或“转导”，包括核酸序列在真核或原核细胞中的整合，在这些细胞中，核酸序列可以整合到细胞基因组中(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)、转化为自主复制子、或得到瞬时表达(例如，转染的mRNA)。
[64]随后的术语“CBH I表达”指cbh I基因的转录和翻译，其产物包括前体RNA、mRNA、多肽、翻译后加工的多肽及其衍生物，包括相关物种的CBH I，例如康宁木霉(Trichoderma koningii)、红褐肉座菌(也已知为长枝木霉、瑞氏木霉或绿色木霉(Trichoderma viride))和Hypocrea schweinitzii。作为实例，CBH I表达的检验包括CBH I蛋白质的蛋白质印迹分析、Nothhern印迹分析和CBH I mRNA的反转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)检验、以及内切葡聚糖酶活性试验，如ShoemakerS.P.和Brown R.D.Jr.(Biochim.Biophys.Acta，1978，523：133-146)以及Schulen(Methods Enzymol.，160，25，pp.234-243，1988)中所说明。
[65]术语“可变剪接”指从单基因产生多种多肽同种型的过程，包括在加工一些但不是全部基因转录本的过程中将非连续外显子剪接到一起。因此，一个特定的外显子可以与任何一个或几个可变的外显子连接，形成信使RNA。可变剪接的mRNA产生部分相同而其他部分不同的多肽(“剪接变体”)。
[66]术语“信号序列”指位于蛋白质N末端部分帮助成熟形式的蛋白质分泌到细胞外的氨基酸序列。细胞外蛋白质的成熟形式缺少在分泌过程中被剪切掉的信号序列。
[67]术语“宿主细胞”意指含有载体并支持该表达构建体复制、和/或转录或转录和翻译(表达)的细胞。用于本发明的宿主细胞可以是原核细胞(例如大肠杆菌)或真核细胞(例如酵母、植物、昆虫、两栖动物或哺乳动物细胞)。一般而言，宿主细胞是丝状真菌。
[68]术语“丝状真菌”指被本领域专业人员识别的任何和所有丝状真菌。优选的真菌选自曲霉属、木霉属、镰孢属、金孢子菌属(Chrysosporium)、青霉属(Penicillium)、腐质霉属(Humicola)、脉孢菌属(Neurospora)或其选择性的有性形式，例如裸孢壳属(Emericella)、肉座菌属(Hypocrea)。已经证实，无性生殖的真菌瑞氏木霉是子囊菌红褐肉座菌的无性繁殖系。见KuhIs等人，PNAS(1996)93：7755-7760。
[69]术语“纤维寡糖”指含有2-8个葡萄糖单元、并具有β-1，4联接的寡糖族，例如纤维二糖。
[70]术语“纤维素酶”指能够将纤维素聚合体水解为较短的纤维寡糖低聚体、纤维二糖和/或葡萄糖的一类酶。许多纤维素酶的例子(例如外切葡聚糖酶、外切纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶和葡糖苷酶)已经从分解纤维素的生物(尤其包括真菌、植物和细菌)中获得。
[71]来自红褐肉座菌的CBH I是糖基水解酶家族7成员(由此而来Cel 7)，特别的，它是该家族在红褐肉座菌中鉴定的第一个成员(由此而来Cel 7A)。糖基水解酶家族7含有内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶/外切葡聚糖酶，CBH I为后者。因此，词语CBH I、CBHI-型蛋白质和Cel7纤维二糖水解酶在此可以互换使用。
[72]此处所用术语“纤维素结合域”指纤维素酶氨基酸序列中参与纤维素酶或其衍生物的纤维素结合活性的部分或该酶的一个区域。纤维素结合域通常通过将纤维素酶非共价结合于纤维素、纤维素衍生物或其他多糖等价物而行使其功能。纤维素结合域允许或帮助由结构独特的催化中心区域进行的纤维素纤维的水解，其功能一般不依赖于催化中心。因此，纤维素结合域不具有属于催化中心的显著的水解活性。换言之，纤维素结合域是纤维素酶蛋白质三级结构的结构元件，与具有催化活性的结构元件截然不同。纤维素结合域及纤维素结合模块在此处可以互换使用。
[73]此处所用术语“表面活性剂”指被本领域公认的任何具有表面活性性质的化合物。因此，例如，表面活性剂包括诸如那些通常发现于去垢剂中的阴离子、阳离子和非离子表面活性剂。阴离子表面活性剂包括线性或分支烷基苯磺酸盐；具有直链或分支烷基或烯基的烷基或烯基醚硫酸盐；烷基或烯基硫酸盐；烯属磺酸盐；以及烷基磺酸盐。两性表面活性剂包括季铵磺酸盐和内铵盐型两性表面活性剂。这种两性表面活性剂在同一个分子中带有阳性和阴性电荷基团。非离子表面活性剂可能包括聚氧化亚烷基醚和高级脂肪酸链烷醇酰胺或其氧化烯加合物、脂肪酸甘油单酯等。
[74]此处所用术语“含纤维素织物”指任何缝制的或未缝制的织物、纱、或纤维，它们使用含棉或不含棉纤维素制成，或用含棉或不含棉纤维素掺和物制成，包括天然和人造纤维素制品(例如黄麻、亚麻、苎麻、人造丝和lyocell)。
[75]此处所用术语“含棉织物”指由纯棉或包括棉织物、棉线、棉粗斜纹布、棉纱、原棉等棉掺和物制成的、缝制或未缝制的织物、纱或纤维。
[76]此处所用术语“石洗组合物”指用于石洗含纤维素织物的制剂。石洗组合物用于在销售之前、即制造过程中，修饰含纤维素织物。相反，去垢剂组合物意在清洁污染衣服，不用于制造过程。
[77]此处所用术语“去垢剂组合物”指意在用于污染的含纤维素织物的清洗介质中的混合物。在本发明上下文中，除纤维素酶和表面活性剂之外，这种组合物可能还包括附加的水解酶、助洗剂、漂白剂、漂白活化剂、上蓝剂、和荧光染料、结块抑制剂、掩蔽剂、纤维素酶活化剂、抗氧化剂和增溶剂。
[78]此处所用术语“cbh 1基因表达的减少或消除”意味着cbh1基因从基因组中缺失因此不能由重组宿主微生物表达；或cbh1基因经过修饰以致宿主微生物不能产生有功能的CBH1酶。
[79]术语“变体cbh1基因”或“变体CBH1”分别指红褐肉座菌cbh1基因的核酸序列经过删除、添加和/或操纵编码序列而改变，或所表达蛋白质的氨基酸序列经过修饰，所作修饰与本发明在此描述的一致。
[80]此处所用术语“提纯”通常指将含有转基因核酸或蛋白质的细胞进行生物化学纯化和/或柱层析。
[81]此处所用术语“活性”和“生物学活性”，指与特定蛋白质有关的生物学活性，并在此互换使用。例如，与蛋白酶有关的酶活性是蛋白质水解，因此，活性蛋白酶具有水解活性。随后，特定蛋白质的生物学活性指一般由本领域技术人员归因于该蛋白质的任何生物学活性。
[82]此处所用术语“富集的”意为所发现的CBH浓度相对大于野生型或天然存在的真菌纤维素酶组合物中所发现的CBH浓度。
[83]野生型真菌纤维素酶组合物是由天然存在的真菌源产生、并包括一个或更多BGL、CBH和EG成分的组合物，其中每种成分以真菌源产生的比率存在。因此，富集的CBH组合物将含有比率改变的CBH，其中CBH对于其他纤维素酶成分(即EG、β-葡糖苷酶和其他内切葡聚糖酶)的比率升高。可以使用任何本领域已知的方法增加CBH或降低(或消除)至少一种其他成分，从而提高该比率。
[84]因此，为了举例，可以使用在文献中充分发表的公认的分离技术，包括在合适pH的离子交换层析、亲和层析、尺寸排阻等，将天然存在的纤维素酶系统提纯为基本纯的成分。例如，在离子交换层析(通常为阴离子交换层析)中，可以通过pH梯度、或盐梯度、或pH梯度和盐梯度两者洗脱分离纤维素酶成分。纯化的CBH于是可以加到酶溶液中，形成富集的CBH溶液。也可以使用分子遗传学方法过表达CBH编码基因，提高微生物的CBH I产生量，可以同时借助于缺失一个或更多编码其他纤维素酶的基因。
[85]真菌纤维素酶可以含有一种以上CBH成分。不同成分通常具有不同的等电点，允许其通过离子交换层析等而分离。在酶溶液中，可以使用单独的CBH成分或CBH成分的组合。
[86]用于酶溶液中时，一般以足够容许从生物物质释放可溶性糖的最高速度的量，添加同系物或变体CBH 1成分。同系物或变体CBH 1成分的添加量依赖于将被糖化的生物物质的类型，这是易于被熟练技术人员确定的。然而，使用时，同系物或变体CBH 1相对于存在于纤维素酶组合物当中的任何EG型成分的重量百分比为自优选约1、优选约5、优选约10、优选约15、或优选约20重量百分比至优选约25、优选约30、优选约35、优选约40、优选约45或优选约50重量百分比。此外，优选的范围可以为约0.5至约15重量百分比、约0.5至约20重量百分比、从约1至约10重量百分比、从约1至约15重量百分比、从约1至约20重量百分比、从约1至约25重量百分比、从约5至约20重量百分比、从约5至约25重量百分比、从约5至约30重量百分比、从约5至约35重量百分比、从约5至约40重量百分比、从约5至约45重量百分比、从约5至约50重量百分比、从约10至约20重量百分比、从约10至约25重量百分比、从约10至约30重量百分比、从约10至约35重量百分比、从约10至约40重量百分比、从约10至约45重量百分比、从约10至约50重量百分比、从约15至约20重量百分比、从约15至约25重量百分比、从约15至约30重量百分比、从约15至约35重量百分比、从约15至约30重量百分比、从约15至约45重量百分比、从约15至约50重量百分比。
II  宿主生物
[87]丝状真菌包括真菌门和卵菌门亚类的所有丝状形式。丝状真菌以营养菌丝体为特征，营养菌丝体具有包括几丁质、葡聚糖、脱乙酰几丁质、甘露聚糖和其他复杂多糖的细胞壁，通过菌丝延长和专性需氧碳分解代谢进行营养生长。
[88]在本发明中，丝状真菌母细胞可以是(但是不限于)下列物种之一：木霉属，例如长枝木霉、绿色木霉、康宁木霉、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)；青霉属；腐质霉属(Humicola sp.)，包括Humicola insolens和灰色腐质霉(Humicola grisea)；金孢子菌属，包括C.lucknowense；粘帚霉属；曲霉属；镰刀霉属、脉孢菌、肉座菌属，以及裸孢壳霉(Emericella sp.)。此处所用术语“木霉属”或“木霉属物种”指先前或目前分类为木霉属的任何菌株。
[89]在一个优选的实施方案中，丝状真菌母细胞是黑曲霉、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、或构巢曲霉细胞。
[90]在另一个优选的实施方案中，丝状真菌母细胞是瑞氏木霉细胞。
III  纤维素酶
[91]纤维素酶是本领域已知的水解纤维素(β-1，4-葡聚糖或βD-葡糖苷连接)形成葡萄糖、纤维二糖、纤维寡糖等的酶。如前所述，纤维素酶通常分为三个主要类型：内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)(“EG”)、外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)(“CBH”)和β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)(“BG”)。(Knowles等人，TIBTECH 5，255-261，1987；Schulen，1988)。
[92]某些真菌产生完整的纤维素酶系统，包括外切纤维二糖水解酶或CBH型纤维素酶、内切葡聚糖酶或EG型纤维素酶和β-葡糖苷酶或BG型纤维素酶(Schulein，1988)。然而，这些系统有时缺乏CBH型纤维素酶，细菌纤维素酶一般也含有很少或没有CBH型纤维素酶。另外，已有显示，EG成分和CBH成分协同作用进而更有效的降解纤维素。见例如Wood，1985。不同成分，即在多组分或完整的纤维素酶系统中的多种内切葡聚糖酶和外切纤维二糖水解酶，通常具有不同的特性，例如等电点、分子量、糖基化程度、底物特异性和酶作用模式。
[93]认为内切葡聚糖酶型纤维素酶水解纤维素低结晶区域内部的β-1，4-糖苷键，外切纤维二糖水解酶型纤维素酶从纤维素的还原或非还原末端水解纤维二糖。内切葡聚糖酶成分的作用可以产生新的可以被外切纤维二糖水解酶成分识别的链末端，而大大帮助外切纤维二糖水解酶的作用。另外，已显示β-葡糖苷酶型纤维素酶催化烷基和/或芳基β-D-葡糖苷(例如甲基β-D葡萄糖苷和对硝基苯葡糖苷以及纤维二糖这类仅含有糖基的糖苷)的水解。这将葡萄糖作为单一产物而为微生物产生，减少或消除了抑制纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶的纤维二糖。
[94]也发现纤维素在去垢剂组合物当中的许多用途，包括增强清洁能力、作为软化剂和改善棉纤维触感。(Hemmpel，ITBDyeing/Printing/Finishing 3：5-14，1991；Tyndall，Textile Chemistand Colorist 24：23-26，1992；Kumar等，Textile Chemist and Colorist，29：37-42，1997)。虽然此机制并非本发明的部分，纤维素酶的软化和色彩保持特性(color restoration property)归结于纤维素酶组合物中碱性内切葡聚糖酶成分的作用，正如美国专利号5,648,263，5,691,178和5,776,757所示例，这些专利公布了含有纤维素酶组合物的去垢剂组合物，该纤维素酶组合物中富集了指定的碱性内切葡聚糖酶成分，与没有富集该成分的纤维素酶组合物相比，为服装的处理赋予了色彩保持和改进的软化性能。另外，在去垢剂组合物中使用这类碱性内切葡聚糖酶成分，显示弥补了去垢剂组合物的pH要求(例如，如美国专利号5,648,263，5,691,178和5,776,757中所说明，在7.5至10的碱性pH展现出最大活性)。
[95]也已显示，纤维素酶组合物降解含棉纤维，引起纤维强度损失的降低(美国专利号4,822,516)，导致在商业清洁剂中纤维素酶组合物应用的不畅。已有提示，与包括完整纤维素酶系统的组合物相比，包括内切葡聚糖酶成分的纤维素酶组合物显示含棉纤维强度损失的降低。
[96]还有显示纤维素酶在将纤维素生物物质降解为乙醇(其中纤维素酶将纤维素降解为葡萄糖，酵母或其他微生物另外将葡萄糖发酵为乙醇)、木浆处理(Pere等，1996)、作为饲料添加剂(WO 91/04673)和谷物湿磨中是有用的。
[97]多数CBH和EG具有由核心域组成的多域结构，该核心域通过连接肽与纤维素结合域(CBD)分离(Suurnakki等人，2000)。核心域含有活性位点，CBD通过将酶与纤维素结合而与纤维素相互作用(vanTilbeurgh等，1986；Tomme等，Eur.J.Biochem.170：575-581，1988)。CBD在晶体纤维素的水解中尤其重要。已经显示，当CBD缺失时，纤维二糖水解酶降解晶体纤维素的能力明显降低(Linder和Teeri，J.Biotechnol.57：15-28，1997)。然而，CBD的确切角色和作用机制仍然是假设。有提示说CBD仅仅是通过在纤维素表面增加效应酶浓度而增强了酶活性(Stahlberg等，Bio/Technol.9：286-290，1991)，和/或通过从纤维素表面松弛单纤维素链而增强酶活性(Tormo等，EMBO J.vol.15，no.21，pp.5739-5751，1996)。由于其核心蛋白质能够通过使用木瓜蛋白酶限制性蛋白质水解(Tomme等，1988)而轻松的产生，大部分关注纤维素酶结构域对不同底物的作用的研究已经使用纤维二糖水解酶的核心蛋白质进行。众多纤维素酶已在科学文献中加以说明，其示例包括：瑞氏木霉的纤维素酶：Shoemaker，S.等人，Bio/Technology，1：691-696，1983，公布CBHI；Teeri，T.等，Gene，51：43-52，1987，公布CBHII。来自木霉之外的种类的纤维素酶也得到说明，例如，Ooi等，Nucleic Acids Research，vol.18，no.19，1990公布了由棘孢曲霉产生的、编码内切葡聚糖酶F1-CMC的cDNA序列；Kawaguchi T等人，Gene173(2)：287-8，996，公布了来自棘孢曲霉的、编码β-葡糖苷酶1的cDNA克隆和序列；Sakamoto等，Curr.Genet.27：435-439，1995，公布了来自白曲霉(Aspergillus kawachii)IFO 4308的、编码内切葡聚糖酶CMCase-1的cDNA序列；Saarilahti等，Gene 90：9-14，1990，公布了来自胡萝卜欧文菌(Erwinia carotovara)的内切葡聚糖酶；Spilliaert R等人，Eur J Biochem.224(3)：923-30，1994，公布了来自Rhodothermus marinu的、编码热稳定的β-葡聚糖酶的bgIA的克隆和测序；以及Halldorsdottir S等，Appl Microbiol Biotechnol.49(3)：277-84，1998，公布一个来自糖基水解酶家族12的、编码热稳定纤维素酶的Rhodothermus marinus基因的克隆、测序和过表达。然而，仍然需要对具有改善特征(例如在热应激条件下或存在表面活性剂的条件下改善的性能、增加的特异性活性、改变的底物剪切模式、和/或体外高水平表达)的新纤维素酶进行鉴定和特征描述。
[98]包括不同量CBH型、EG型、和BG型纤维素酶的改进的新型纤维素酶组合物的发展，目的用于：(1)在显示出增强的清洁能力的去垢剂组合物中，作为软化剂行使功能，和/或改善棉织物触感(“石洗”或“生物磨光(biopolishing)”)；(2)用于将木质纸浆或其他生物物质降解为糖(例如，用于生物酒精生产)；和/或(3)用于饲料组合物。
IV  分子生物学
[99]在一个实施方案中，本发明提供变体CBH I基因的表达，该表达处于在丝状真菌中具有功能的启动子的控制之下。因此，本发明依赖于重组基因学中的常规技术。公布本发明中使用的普通方法的基础课本，包括Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(2nd ed.1989)；Kriegler，Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual(1990)；以及Ausubel等，eds.，Current Protocols in MolecularBiology(1994)。
A鉴定同源CBH1基因的方法
[100]野生型红褐肉座菌CBH1的核酸序列显示于图1中。本发明一个方面包括此处所述之编码CBH 1同系物的核酸分子。该核酸分子可以是DNA分子。
[101]可以用于分离编码CBH I的DNA序列的技术广为本领域所知，包括但是不限于使用同源DNA探针的cDNA和/或基因组文库筛选、以及使用活性试验或抗CBH I抗体的表达筛选。这些方法中的任何都可以发现于Sambrook等或在Current Protocols in Molecular Biology，F.Ausube等，ed.Greene Publishing and Wiley-Interscience，纽约(1987)(“Ausubel”)。
B CBH I核酸序列的突变方法
[102]本发明考虑任何本领域已知可以引入突变的方法。
[103]本发明涉及变体CBH 1的表达、纯化和/或分离及应用。优选通过利用来自红褐肉座菌cbh基因的重组方法制备这些酶。
[104]分离和克隆来自红褐肉座菌的cbh 1基因后，使用例如定点诱变等其他本领域已知的方法，造成与所表达的CBH 1变体中替代的氨基酸相对应的置换、添加或缺失。再次说明，定点诱变和其他在DNA水平引入氨基酸改变的方法可以在Sambrook等和Ausubel等的著作中找到。
[105]使用多种本领域已知的方法制备编码红褐肉座菌CBH1氨基酸序列变体的DNA。这些方法包括但是不限于定点诱变(或寡核苷酸介导的)、PCR诱变和早期制备的编码红褐肉座菌CBH1 DNA的盒式诱变。
[106]定点诱变是制备置换变体的首选方法。该技术广为本领域所知(见，例如Carter等，Nucleic Acids Res.13：4431-4443(1985)和Kunkel等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488(1987))。简而言之，在DNA定点诱变中，首先通过初始DNA单链与编码所需突变的寡核苷酸杂交而改变初始DNA。杂交后，使用DNA聚合酶，以杂交的寡核苷酸为引物，以初始的单链DNA为模板，合成完整的第二条链。编码所需突变的寡核苷酸由此整合入产生的双链DNA中。
[107]PCR诱变也适于制造初始多肽(即红褐肉座菌CBH1)的氨基酸序列变体。见Higuchi，PCR Protocols，pp.177-183(Academic Press，1990)；和Vallette等，Nuc.Acids Res.17：723-733(1989)。还有例如Cadwell等，PCR Methods and Applications，Vol 2，28-33(1992)。简而言之，当在PCR中使用小量模板DNA作为初始材料时，可以使用与模板DNA相应区域有微小差异的引物来产生相对大量的特定DNA片段，该DNA片段仅在引物与模板具有差异的位点不同于模板。
[108]另一个制备变体的方法盒式诱变，以Wells等，Gene 34：315-323(1985)中所描述的方法为基础。初始材料是含有将被突变的初始多肽DNA的质粒。确定初始DNA中将被突变的密码子。在确定的突变位点的每一侧，必须具有唯一的限制性核酸内切酶位点。如果不存在这样的限制性位点，可以通过上述寡核苷酸介导的突变方法将其引入到初始多肽DNA中合适的位点。在这些位点切割质粒DNA使其线性化。使用标准程序合成编码限制性位点之间、但是含有所需突变的DNA序列的双链寡核苷酸，其中的寡核苷酸双链为分别合成，并使用标准技术将其杂交在一起。该双链即为所提到的盒。将该盒设计为具有与线性质粒末端相容的5′和3′末端，以致其可以直接与质粒连接。该质粒现在含有突变的DNA序列。
[109]作为替代或补充，可以确定编码变体CBH I所需的氨基酸序列，并可以合成产生编码这样的氨基酸序列变体的核酸序列。
[110]这样制备的变体CBH I常常可以依赖纤维素酶的使用目的进行更多修饰。这些修饰可以涉及氨基酸序列的更多变化、异源多肽的融合和/或共价修饰。
V cbh1核酸及CBH1多肽
A变体cbh型核酸
[111]野生型红褐肉座菌CBH I核酸序列显示于图1中。本发明包括此处所描述之编码变体纤维素酶的核酸分子。核酸可以是DNA分子。
[112]分离和克隆CBH I后，使用例如定点诱变等其他本领域已知的方法，造成与所表达的CBH I变体中替代的氨基酸相对应的置换、添加或缺失。再次说明，定点诱变和其他在DNA水平引入氨基酸改变的方法可以在Sambrook等人和Ausubel等人的著作中找到。
[113]将编码CBH 1变体的DNA序列克隆到DNA构建体当中后，使用该DNA转化微生物。根据本发明，为了表达变体CBH 1的目的而被转化的微生物，可以有利的包括得自木霉属的菌株。因此，根据本发明，制备变体CBH 1纤维素酶的优选模式包括：使用DNA构建体转化木霉属宿主细胞，该构建体包括至少一个编码部分或全部的变体CBH 1的DNA片段。DNA构建体通常功能性附着于启动子。转化的宿主细胞于是在允许表达所需蛋白质的条件下生长。随后，将所需蛋白质产物纯化为基本同质。
[114]然而，事实上，编码变体CBH 1的特定DNA的最佳表达媒介物可能不同于红褐肉座菌。因此，也许在与变体CBH 1的来源生物具有系统发生相似性的转化宿主中表达蛋白质最为有利。在一个备选实施方案中，可以使用黑曲霉作为表达媒介。使用黑曲霉的转化技术，参见WO98/31821，其中所公布的内容在此完全引用作为参考。
[115]因此，仅出于说明目的提供关于木霉属物种表达系统的说明，并作为本发明表达变体CBH 1的一个选择。然而，如果合适，一个本领域技术人员可以倾向于在不同的宿主细胞中表达编码CBH 1的DNA，而且应当理解，在确定最佳的表达宿主中，应当考虑变体CBH 1的来源。另外，本领域的熟练工人能够利用本领域可利用的工具、通过常规技术为特定基因选择最佳表达系统。
B变体CBH 1多肽
[116]野生型红褐肉座菌CBH I的氨基酸序列显示于图1。变体CBH I多肽包括某位点的置换或缺失，该位点对应于红褐肉座菌CBH I的下列一个或多个残基：S8、Q17、G22、T41、N49、S57、N64、A68、A77、N89、S92、N103、A112、S113、E193、S196、M213、L225、T226、P227、T246、D249、R251、Y252、T255、D257、D259、S278、S279、K286、L288、E295、T296、S297、A299、N301、E325、T332、F338、S342、F352、T356、T371、T380、Y381、V393、R394、S398、V403、S411、G430、G440、T445、T462、T484、Q487和P491。此外，变体可以另外包括对应于红褐肉座菌CBH I的残基382-393的缺失。
[117]本发明中的变体CBH I具有衍生自前体CBH I氨基酸序列的氨基酸序列。CBH I变体的氨基酸序列通过前体氨基酸序列的一个或多个氨基酸的置换、缺失或插入而有别于前体CBH I氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，前体CBH I是红褐肉座菌CBH I。红褐肉座菌CBH I的成熟氨基酸序列显示于图1中。因此，本发明针对的CBH I变体，在位点上具有与红褐肉座菌CBH I特别确定的残基等价的氨基酸残基。如果CBH I同系物的残基(氨基酸)与红褐肉座菌CBH I的特定残基或残基的一部分同源(即，与一级或三级结构中的位置相对应)、或功能类似(即，具有相同或相似的化学或结构结合、反应或相互作用的功能能力)，则该残基等价于红褐肉座菌CBHI的残基。此处使用的编号方式意在与成熟CBH I的氨基酸序列的(如图1所示)一致。除了在前体CBH I内定位之外，此处还鉴定了对应于前体CBH I中造成前体CBH I在热应激下不稳定的氨基酸位点的特定残基，用于置换或缺失。氨基酸位点号码(例如+51)指为呈现在图1中的成熟红褐肉座菌CBH I指定的号码。
[118]本发明中变体CBH1具有衍生自前体红褐肉座菌CBH1氨基酸序列的氨基酸序列。CBH1变体的氨基酸序列通过前体氨基酸序列的一个或多个氨基酸的置换、缺失或插入而有别于前体CBH1氨基酸序列。红褐肉座菌CBH1的成熟氨基酸序列示于图1中。因此，本发明针对的CBH1变体，在位点上具有与红褐肉座菌CBH1特别确定的残基等价的氨基酸残基。如果CBH1变体的残基(氨基酸)与红褐肉座菌CBH1的特定残基或残基的一部分同源(即，与一级或三级结构中的位置相对应)、或功能类似(即，具有相同或相似的化学或结构结合、反应或相互作用的功能能力)，则该残基等价于红褐肉座菌CBH1的残基。此处使用的编号方式意在与成熟CBH1的氨基酸序列的(如图1所示)一致。除了在前体CBH1内定位之外，此处还鉴定了对应于前体CBH1中造成前体CBH1在热应激下不稳定的氨基酸位点的特定残基，用于置换或缺失。氨基酸位点号码(例如+51)指为呈现在图1中的成熟红褐肉座菌CBH1指定的号码。
[119]测定同源性的氨基酸序列比对优选使用“序列比较算法”测定。可以通过例如局部同源性算法(Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981))、同源性比对算法(Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970))、搜索相似性方法(Pearson和Lipman，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 85：2444(1988))、这些方法的计算机化执行(WisconsinGenetics Software Package中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)、视觉检测或MOE(Chemical Computing Group，Montreal Canada)执行用于比较的序列的最佳比对。
[120]一个适于确定序列相似性的算法的示例为BLAST算法，该算法在Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)中有说明。可以通过国家生物技术信息中心(<www.ncbi.nlm.nih.gov>)公共获得执行BLAST分析的软件。此算法包括，首先通过鉴定查询序列中长度W的字串，当和数据库序列中具有相同长度的字串比对时，该字串匹配或满足一些正值的阈分值T，从而确定高得分序列对(HSP)。这些最初的邻近命中字串作为起始点去寻找含有这些命中字串的较长的HSP。命中字串沿着进行比较的两个序列中的每个的方向延伸，只要累积比对分值能够增加。当如下情况时，命中字串的延伸停止：累积比对分值从达到的最大值降低数量X；累积分值达到或低于零；或到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLAST程序使用默认值为：字串长度(W)11，BLOSUM62得分矩阵(见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))比对(B)50，期望值(E)10，M′5，N′-4，以及比较两条链。
[121]BLAST算法然后对两个序列的相似性进行统计学分析(见。例如Karlin和Altschul，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 90：5873-5787(1993))。由BLAST提供的一种相似性度量是最小总概率(the smallestsum probability)(P(N))，该度量表示两个核苷酸或氨基酸序列随机发生匹配的概率。例如，在测试氨基酸序列与蛋白酶氨基酸序列的比较中，如果最小总概率低于约0.1，更优选低于约0.01，更优选低于约0.001，则认为这个氨基酸序列与该蛋白酶相似。
[122]附加的修饰CBH1纤维素酶稳定性的特定策略提供如下：
[123](1)降低主链去折叠的熵可以给酶引入稳定性。例如，脯氨酸残基的引入可以通过降低去折叠熵而显著的稳定蛋白质。(见，例如Watanabe等人，Eur.J.Biochem.226：277-283(1994))。类似地，甘氨酸残基没有β-碳原子，从而比其他许多残基具有大的多的骨架构象自由度。置换甘氨酸，优选用丙氨酸，可以降低去折叠熵并增加稳定性(见，例如Matthews等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84；6663-6667(1987))。此外，缩短外部环部分可能增加稳定性。已观察到嗜高热生物产生的蛋白质比其他嗜温同系物具有更短的外部环部分(见，例如Russel等人，Current Opinions in Biotechnology 6：370-374(1995))。二硫键的引入也可以有效的稳定不同的三级结构彼此的稳定性。因此，在可以接近现有半胱氨酸的位置引入半胱氨酸，或者引入可以形成二硫键的半胱氨酸对，可以改变CBH1变体的稳定性。
[124](2)通过增加侧链疏水性降低内部空穴，可以改变酶的稳定性。减少内部空穴的数量和体积，通过将疏水相互作用最大化和降低包装缺陷而增加酶稳定性(见，例如Matthews，Ann.Rev.Biochem.62；139-160(1993)；Burley等人，Science 229：23-29(1985)；Zuber，Biophys.Chem.29：171-179(1988)；Kellis等人，Nature 333：784-786(1988))。已知来自嗜热生物的多聚体蛋白质往往比其嗜温对等物具有更强的疏水性亚基界面，该界面具有更大的表面互补性(Russel等人，见上文)。本原理被认为可以应用于单体蛋白质结构域界面中。能够通过增加疏水性而改善稳定性的特定置换包括：赖氨酸到精氨酸、丝氨酸到丙氨酸、以及苏氨酸到丙氨酸(Russel等人，见上文)。置换为丙氨酸或脯氨酸的修饰可以增加侧链尺寸以及由此产生空穴的减少、更佳的包装和增加的疏水性。降低空穴大小、增加疏水性及改善CBH 1结构域之间界面互补性的置换，可以增加酶的稳定性。尤其是使用不同残基在这些位点对特定残基进行修饰，能够改善性能，所使用的残基选自苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸和异亮氨酸之中任何残基。
[125](3)平衡刚性二级结构(即α-螺旋和β-转角)中的电荷，可以增加稳定性。例如，以天冬氨酸上的负电荷中和螺旋N-末端的部分正电荷，可以增加该结构的稳定性(见，例如Eriksson等，Science 255：178-183(1992))。类似的，以正电荷中和螺旋C-末端的部分负电荷可以增加稳定性。去除正电荷与β-转角肽链N-末端的相互作用，将有效的赋予三级结构稳定性。以非正电荷残基置换，可以去除不受欢迎的正电荷同存在于转角的酰氨氮的相互作用。
[126](4)引入盐桥和氢键来稳定三级结构可能是有效的。例如，离子对相互作用(比如在天冬氨酸或谷氨酸与赖氨酸、精氨酸或组氨酸之间)可以引入强大的稳定效应，并且可以用于附着导致改善热稳定性的不同的三级结构元件。另外，带电残基/不带电残基氢键的数量，以及氢键的数量，通常可以改善热稳定性(见，例如Tanner等，Biochemistry35：2597-2609(1996))。以天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸或谷氨酰胺置换，可以通过骨架酰胺引入氢键。以精氨酸置换，可以改善盐桥，并将氢键引入羰基骨架中。
[127](5)消除不耐热残基一般能够增加热稳定性。例如，在高温下，天冬酰胺和谷氨酰胺对脱酰氨敏感，半胱氨酸则对氧化敏感。在敏感位点减少这些残基可以产生增加的热稳定性(Russel等，见上文)。以谷氨酰胺或半胱氨酸之外的任何残基置换或缺失，都可以通过消除不耐热残基而增加稳定性。
[128](6)配体结合的稳定或去稳定化赋予CBH1变体经过修饰的稳定性。例如，在应用本发明的基质中，一种成分可以结合于表面活性剂/CBH1变体特定的热敏感位点。通过置换修饰该位点，该成分对变体的结合可能加强或削弱。例如，可以使用苯丙氨酸或酪氨酸置换CBH1结合裂隙中的非芳香族残基，从而引入芳香族侧链的稳定，增加CBH1变体的稳定性；其中纤维素底物能够顺利地与苄基环相互作用。
[129](7)增加任何表面活性剂/热敏感配体的电负性，可以增加在表面活性剂或热应激下的稳定性。例如，使用苯丙氨酸或酪氨酸置换，可以通过增加对溶剂的屏蔽而增加D(天冬氨酸)残基的电负性，从而增加稳定性。
c抗-CBH抗体
[130]本发明进一步提供抗CBH抗体。该抗体可以是单克隆、多克隆、人源化、双特异性或异源缀合(heteroconjugate)抗体。
[131]制备多克隆抗体的方法是熟练技术人员已知的。免疫试剂可以是CBH多肽或其融合蛋白。将抗原与在待免疫动物体内已知具有免疫原性的蛋白质连接，是有用的。本领域技术人员可以在标准程序或常规实验法的基础上确定免疫程序。
[132]作为选择，抗CBH抗体可以为单克隆抗体。单克隆抗体可以由动物体内被免疫的细胞或者使用重组DNA方法产生。(见，例如Kohler等，Nature，vol.256，pp.495-499，August 7，1975；美国专利号4,816,567)。
[133]本发明的抗CBH抗体可以进一步包括人源化或者人类抗体。术语“人源化抗体”指非人类(例如鼠)抗体的人源化形式，是嵌合抗体，免疫球蛋白链或其片段(例如抗体的Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其他抗原结合部分序列)，含有源于非人类抗体的某些部分。非人类抗体的人源化方法广为本领域所知，如进一步在下述文献中所详述：Jones等，Nature，321：522-525，1986；Riechmann等，Nature，vol.332，pp.323-327，1988；及Verhoeyen等，Science，vol.239，pp.1534-1536，1988。产生人类抗体的方法也为本领域所知。见，例如，Jakobovits.A等，Annals New York Academy of Sciences，764：525-535，1995及Jakobovits.A，Curr Opin Biotechnol 6(5)：561-6，1995。
VI  重组CBH1变体的表达
[134]本发明依赖于使用细胞表达变体CBH I，CBH I的表达不要求特殊方法。
[135]本发明提供使用表达载体转导、转化或转染的宿主细胞，该表达载体包括编码变体CBH的核酸序列。培养条件(例如温度、pH等)是在转导、转化或转染之前应用于母本细胞、并且对于本领域技术人员显而易见的那些条件。
[136]在一种方法中，使用表达载体转染丝状真菌细胞或酵母细胞，该表达载体具有启动子或有生物学活性的启动子片段，或者一个或多个(例如一系列)增强子，这些在宿主细胞系中有功能的元件有效连接于编码CBH的DNA片段，从而使CBH在细胞系中得到表达。
A核酸构建体/表达载体
[137]天然或合成的编码CBH I的多核苷酸片段(“CBH I编码核酸序列”)可以整合到异源核酸构建体或载体当中，该异源核酸构建体或载体能够引入丝状真菌或酵母细胞、并在其内复制。此处公布的载体和方法适合在用于CBH I表达的细胞中使用。可以使用任何载体，只要该载体在其转导的细胞中能够复制并存活。大量合适的载体和启动子已为本领域技术人员所知，并且有商业供应。克隆和表达载体已在Sambrook等，1989；Ausubel FM等，1989；以及Strathern等，The Molecular Biologyof the Yeast Saccharomyces，1981中加以说明，每一个都在此明确引用作为参考。对真菌适宜的表达载体在van den Hondel，C.A.M.J.J.等(1991)In：Bennett，J.W.和Lasure，L.L.(eds.)More GeneManipulations in Fungi.Academic Press，pp.396-428中得到说明。适当的DNA序列可以通过许多程序插入到质粒或载体(此处全部称为“载体”)中。通常，使用标准程序将DNA序列插入到适宜的限制内切酶位点。这类程序以及有关的亚克隆程序被认为在本领域技术人员的知识范围之内。
[138]可以通过将包括变体CBH I编码序列的异源核酸构建体引入到所选的丝状真菌菌株而产生包括变体CBH I编码序列的重组丝状真菌。
[139]一旦获得所需的变体cbh核酸序列形式，可以通过多种方法对其进行修饰。在包括非编码侧翼区的序列处，侧翼区可以发生切除、诱变等。因此，可以在自然发生序列上进行转位(transition)、易位、缺失和插入。
[140]所选的变体cbh编码序列可以根据广为人知的重组技术插入到合适的载体中，并用于转化能够表达CBH I的丝状真菌。由于遗传密码子的内在简并性，可以使用其他编码基本相同或功能相当氨基酸序列的核酸序列，以克隆和表达变体CBH I。因此，将编码区的这些置换理解为属于本发明所涵盖的序列变体之内。任何以及所有这些序列可以按照与此处所述之用于母本CBH I编码核酸序列的相同方法使用。
[141]本发明还包括含有一个或多个如上所述之编码变体CBH I核酸序列的重组核酸构建体。该构建体包括正向或反向插入本发明序列的载体，例如质粒或病毒载体。
[142]异源核酸构建体可以包括下述形式的变体cbh编码序列：(i)分离形式；(ii)与其它编码序列组合，例如融合蛋白或信号肽编码序列，其中cbh编码序列为主要的编码序列；(iii)与例如内含子或控制元件的非编码序列组合，例如对于编码基因在合适宿主中的表达有效的启动子和终止元件，或5′和/或3′非翻译区；和/或(iv)在cbh编码序列为异源基因的载体或宿主环境中。
[143]在本发明的一个方面，使用异源核酸构建体将变体CBH I编码核酸序列体外转运到细胞中，优选确定的丝状真菌和酵母细胞系。对于长远生产变体CBH I来说，稳定表达是优选的。由此得出，任何有效产生稳定转化子的方法都可以用于实践本发明。
[144]合适的载体一般整合了选择标志编码核酸序列、插入位点和适宜的控制元件，例如启动子和终止序列。载体可以包含对编码序列在适宜的宿主内(和/或在经过修饰的可溶性蛋白质抗原编码序列通常不被表达的载体或宿主细胞中)表达有效的调控序列，例如，包括有效连接于编码序列的非编码序列(例如内含子和控制元件，即启动子和终止元件，或5′和/或3′非翻译区)。大量适宜的载体和启动子广为本领域技术人员所知，其中，许多有商品提供，和/或由Sambrook等描述(见上文)。
[145]示范启动子包括组成性启动子和可诱导启动子，其例子包括CMV启动子、SV40早期启动子、RSV启动子、EF-1α启动子、含有所述(ClonTech and BASF)tet-on或tet-off系统中tet反应元件(TRE)的启动子、β肌动蛋白启动子、以及可以通过增加某些金属盐而上调的金属硫蛋白启动子。启动子序列是为了表达目的由特定丝状真菌识别的DNA序列。它有效连接于编码变体CBH I多肽的DNA序列。这些连接包括，在公布的表达载体中，启动子相对于编码变体CBH I多肽的DNA序列起始密码子进行定位。启动子序列含有转录和翻译控制序列，介导变体CBH I多肽的表达。实例包括来自黑曲霉、泡盛曲霉或米曲霉葡糖淀粉酶、α-淀粉酶或α-葡糖苷酶编码基因；构巢曲霉gpdA或trpC基因；粗糙脉孢菌cbh1或trp1基因；黑曲霉或Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶编码基因；红褐肉座菌(瑞氏木霉)cbh1、cbh2、egl1、egl2或其他纤维素酶编码基因的启动子。
[146]选择适宜的选择标志依赖于宿主细胞，适合于不同宿主的标志广为本领域所知。通常的选择标志基因包括来自构巢曲霉或瑞氏木霉的argB、来自构巢曲霉的amdS、来自粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)或瑞氏木霉的pyr4、以及来自黑曲霉或构巢曲霉的pyrG。附加的示范选择标志包括但是不限于trpc、trp1、oliC31、niaD或leu2，他们包括在用于转化诸如trp-，pyr-，leu-等突变株的异源核酸构建体中。
[147]这些选择标志赋予转化子利用通常不被丝状真菌所代谢的代谢物的能力。例如，来自红褐肉座菌、编码乙酰胺酶的amdS基因，允许转化子细胞以乙酰胺为氮源并在其上生长。选择标志可以恢复营养缺陷型突变株在选择性基本培养基上生长的能力，或者该选择标志可以赋予转化子在抑制性药物或抗生素上生长的能力。
[148]使用本领域通常使用的方法将选择标志编码序列克隆到任何适宜的质粒中。示范质粒包括pUC18、pBR322、pRAX和pUC100。pRAX质粒含有来自构巢曲霉的AMA1序列，使其能够在黑曲霉中复制。
[149]除非另外说明，本发明的实施将使用在本领域技术范围内的传统的分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学技术。这些技术在文献中得到充分解释。例如，见Sambrook等，1989；Freshney，Animal CellCulture，1987；Ausubel等，1993；以及Coligan等，Current Protocolsin Immunology，1991。
B CBH1生产的宿主细胞和培养条件
(i)丝状真菌
[150]本发明提供丝状真菌，相对于相应的非转化母本真菌而言，该丝状真菌经过修饰、选择并以有效方式培养以导致变体CBH I的生产或表达。
[151]可以为变体CBH I表达而处理和/或修饰的母本丝状真菌种类的例子包括但是不限于木霉属，例如瑞氏木霉、长枝木霉、绿色木霉、康宁木霉；青霉属、腐质霉属，包括Humicola insolens；曲霉属、金孢子菌属、镰刀霉属、肉座菌属和裸孢壳霉属。
[152]在通常用来培养母本真菌系的条件下培养CBH I表达细胞。一般而言，细胞在含有生理盐分和营养素的标准培养基(例如在Pourquie，J.等，Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation，eds.，Aubert，J.P.等，Academic Press，pp.71-86，1988和IImen，M.等，Appl.Environ.Microbiol.63：1298-1306，1997中所描述)中培养。培养条件也是标准的，例如，培养物在振荡培养器或发酵罐中，于28℃培养直至达到所需的CBH I表达水平。
[153]给定丝状真菌的优选培养条件可以在科学文献和/或从真菌来源(例如American Type Culture Collection，(ATCC；http://www.a tcc.Org))中寻找到。真菌生长建立之后，细胞暴露于有效引起或允许变体CBH I表达的条件中。
[154]在CBH I编码序列处于可诱导启动子控制的情况下，将诱导试剂(例如糖、金属盐或抗生素)以诱导CBH I表达的有效浓度添加到培养基中。
[155]在一个实施方案中，菌株包括对于获得过表达蛋白质有用的黑曲霉。例如，已知黑曲霉泡盛变种(A.niger var.awamori)dgr246分泌提高量的分泌性纤维素酶(Goedegebuur等，Curr.Genet(2002)41：89-98)。黑曲霉泡盛变种的其他菌株(例如GCDAP3、GCDAP4和GAP3-4)也是已知的。Ward等(Ward，M，Wilson，L.J.和Kodama，K.H.，1993，Appl.Microbiol.Biotechnol.39：738-743)。
[156]在其他实施方案中，菌株包括对于获得过表达蛋白质有用的瑞氏木霉。例如，由Sheir-Neiss等在Appl.Microbiol.Biotechnol.20：46-53(1984)中描述的RL-P37，已知分泌提高量的纤维素酶。RL-P37的功能等价物包括瑞氏木霉菌株RUT-C30(ATCC No.56765)和菌株QM9414(ATCC No.26921)。可以预期，这些菌株也将在过表达变体CBH1中有用。
[157]当需要在没有潜在危害的天然纤维素水解活性存在下获得变体CBH I时，获得木霉菌宿主细胞系是有用的，其中在引入含有编码变体CBH I的DNA片段的DNA构建体或质粒之前，该细胞系的一个或多个纤维素酶基因被缺失。这些菌株可以通过在美国专利号5,246,853和WO92/06209中说明的方法制备，在此引用该专利的公开内容作为参考。在缺少一个或多个纤维素酶基因的微生物中表达变体CBH I纤维素酶，简化了鉴定及后续的纯化程序。可以缺失任何来自木霉的克隆基因，例如，cbh1、cbh2、egl1和egl2基因，以及那些编码EGIII和/或EGV蛋白质的基因(分别见，例如美国专利号5,475,101和WO 94/28117)。
[158]可以使用本领域已知的方法，通过把将被缺失或断裂的所需基因的一种形式插入到质粒中，从而实现基因缺失。缺失质粒于是在适宜的限制酶切位点被切割，该限制酶切位点在所需基因编码区内部，该基因编码序列或其部分由选择标志替代。来自将被缺失或断裂的基因所在座位的侧翼序列，优选在约0.5至2.0kb之间，保持在选择标志基因的两侧。适宜的缺失质粒通常具有独特的限制性酶位点，能够使含有缺失基因的片段(包括侧翼DNA序列)和选择标志基因以单个线性片段被除去。
[159]必须对选择标志进行选择，从而可以检测转化微生物。在所选微生物中表达的任何选择标志基因将是合适的。例如，对于曲霉属物种，对选择标志进行选择，以使选择标志在转化子中的存在不显著影响其性质。这样的选择标志可以是编码可检测产物的基因。例如，可以使用这样的曲霉基因的功能拷贝，如果在宿主菌株中缺乏该拷贝会导致宿主菌株表现营养缺陷表型。类似的，存在用于木霉的选择标志。
[160]在一个实施方案中，使用功能性pyrG基因转化曲霉属的pyrG-衍生菌株，该基因从而为转化提供选择标志。通过选择具有氟乳清酸(FOA)抗性的曲霉属菌株获得pyrG-衍生菌株。pyrG基因编码乳清苷-5′-单磷酸脱羧酶，该酶是尿苷合成所需的。含有完整pyrG基因的菌株在缺乏尿苷的培养基上生长，但是对氟乳清酸敏感。通过选择FOA抗性而选择pyrG-衍生菌株是可能的，该pyrG-衍生菌株缺乏功能性乳清苷单磷酸脱羧酶，生长需要尿苷。使用FOA选择技术，也可能获得缺乏功能性乳清酸焦磷酸核糖转移酶、需要尿苷的菌株。使用编码该酶基因的功能性拷贝转化这些细胞是可能的(Berges和Barreau，Curr.Genet.19：359-365(1991)，以及van Hartingsveldte等，(1986)Development ofa homologous transformation system for Aspergillus niger based onthe pyrG gene.Mol.Gen.Genet.206：71-75)。使用上文中提及的FOA抗性技术，容易执行衍生菌株的选择，因此，优选使用pyrG基因作为选择标志。
[161]在另一个实施方案中，使用功能性pyr4基因转化肉座菌(肉座菌物种(木霉属))的pyr4-衍生株，该基因由此为转化提供了选择标志。pyr4-生株可以通过选择具有氟乳清酸(FOA)抗性的肉座菌(木霉属)菌株而获得。pyr4基因编码乳清苷-5′-单磷酸脱羧酶，该酶是尿苷的生物合成所需要的。具有完整pyr4基因的菌株在缺乏尿苷的培养基上生长，但是对氟乳清酸敏感。可以通过选择FOA抗性而选择缺乏功能性乳清苷单磷酸脱羧酶、生长需要尿苷的pyr4-衍生菌株。使用FOA选择技术，也可以获得缺乏功能性乳清酸焦磷酸核糖转移酶、需要尿苷的菌株。使用编码该酶的基因的功能性拷贝转化这些细胞也是可能的(Berges及Barreau，Curr.Genet.19：359-365(1991))。衍生菌株的选择很容易使用上文涉及的FOA抗性技术而进行，因此，作为选择标志使用的基因优选为pyr4基因。
[162]为了转化pyrG-曲霉或pyr4-肉座菌(木霉)以缺失表达一种或多种纤维素酶基因的能力，包含断裂或缺失的纤维素酶基因的单DNA片段于是从缺失质粒中分离，并用于转化适宜的pyr-曲霉或pyr-木霉宿主。基于转化子分别表达pyG或pyr4基因产物，从而弥补宿主菌株营养缺陷型的能力将其鉴定并选择。在产生的转化子上进行蛋白质杂交分析，以识别并确认双交换整合事件，该双交换整合事件用适宜的pyr选择标志替代了待缺失的基因的基因组拷贝编码区的部分或全部。
[163]尽管上文描述的特定质粒载体涉及pyr-转化子的制备，本发明不限于这些载体。使用上述技术，可以在曲霉或肉座菌(木霉)菌株中缺失和取代多种基因。另外，可以使用前文所讨论的任何可利用的选择标志。实际上，任何被克隆并确定的宿主(例如曲霉或肉座菌)基因，可以使用前述策略从基因组中缺失。
[164]如前文所声明，使用的宿主菌株可以从肉座菌(木霉)衍生，该宿主菌株缺乏或具有与选择标志相应的非功能基因。例如，如果为曲霉选择pyrG为选择标志，则使用特定的pyrG-衍生株作为转化程序中的受体。同样，例如，如果为肉座菌选择pyr4为选择标志，则使用特定的py4-衍生株作为转化程序中的受体。类似的，可以使用含有与构巢曲霉amdS、argB、trpC、niaD基因相当的肉座菌(木霉)基因的选择标志。相应的受体株因此必须分别为诸如argB-、trpC-、niaD-之类衍生株系。
[165]制备编码CBH I变体的DNA，用于插入到合适的微生物中。根据本发明，编码CBH I变体的DNA包括对于编码具有功能性纤维素水解活性的蛋白质所必需的DNA。编码CBH I变体的DNA片段可以功能地附着于真菌启动子序列，例如，曲霉glaA基因或木霉cbh1或egl1基因的启动子。
[166]可以预见，不止一种编码CBH I变体的DNA拷贝可以重组入菌株中帮助过表达。可以使用携带编码变体的DNA的表达载体构建体制备编码CBH I变体的DNA。携带插入的CBH I变体编码DNA片段的表达载体可以是能够在给定宿主微生物中自主复制、或者是可以整合到宿主DNA中的任何载体，一般为质粒。在优选的实施方案中考虑两类表达载体来实现基因表达。第一类含有的DNA序列中启动子、基因编码区以及终止序列均源于将要表达的基因。如果需要，可以缺失不需要的DNA序列(例如编码不必要结构域的)使基因截短，从而使待表达的结构域处于它自身的转录和翻译调控序列控制下。载体上也可以含有选择标志，从而允许对多拷贝新基因序列整合进入宿主的事件进行选择。
[167]第二类表达载体经过预装配，并含有高水平转录所需的序列和选择标志序列。预计基因或其部分的编码区可以插入到此用于通用目的的表达载体中，所以处于表达盒启动子和终止序列的控制下。
[168]例如，在曲霉中，pRAX就是这样的通用目的表达载体。基因或其部分可以插入到强glaA启动子的下游。
[169]例如，在肉座菌中，pTEX就是这样的通用目的表达载体。基因或其部分可以插入到强cbh 1启动子的下游。
[170]在此载体中，本发明的编码CBH I变体的DNA序列应该与转录和翻译序列(即按阅读框与结构基因连接的合适的启动子序列和信号序列)有效连接。启动子可以是在宿主细胞中表现出转录活性的任何DNA序列，可以得自编码与宿主细胞同源或异源蛋白质的基因。可选的信号肽为CBH I变体的细胞外生产作准备。信号序列的编码DNA优选与将表达的基因具有天然关联，然而，本发明中考虑使用来自任何合适来源的信号序列，例如，来自木霉的外切纤维二糖水解酶或内切葡聚糖酶。
[171]用于将本发明的变体CBH I DNA编码序列连接到启动子、并且插入到合适载体的程序，广为本领域所知。
[172]可以根据已知技术(例如转化、转染、微注射、微穿孔、生物弹轰击等)，将前文描述的DNA载体或构建体导入宿主细胞。
[173]在优选的转化技术中，必须考虑到肉座菌(木霉)细胞壁对DNA的通透性非常低。因此，所需DNA序列、基因或基因片段的摄取充其量也是最小限度的。许多方法在转化步骤之前在衍生菌株(即缺乏与所用的选择标志相应的功能性基因)中增加肉座菌(木霉)细胞壁的通透性。
[174]本发明中制备用于转化的曲霉或肉座菌(木霉)的优选方法包括从真菌菌丝体制备原生质体。见Campbell等，Improvedtransformation efficiency of A.niger using homologous niaD genefor nitrate reductase.Curr.Genet.16：53-56；1989。菌丝体可以从萌发的、具有生长力的孢子获得。使用消化细胞壁而产生原生质体的酶处理菌丝体。原生质体由于悬浮介质中存在渗透稳定剂而得到保护。这些稳定剂包括山梨醇、甘露醇、氯化钠、硫酸镁等。通常这些稳定剂的浓度在0.8M至1.2M之间变化。在悬浮介质中优选使用约1.2M山梨醇溶液。
[175]宿主菌株(曲霉或肉座菌(木霉))对DNA的摄取，依赖于钙离子浓度。在摄取溶液中通常使用约10mM CaCl2至50mM CaCl2。在摄取溶液中除了钙离子之外，其他通常包括的是缓冲系统，例如TE缓冲液(10MmTris，pH 7.4；1mM EDTA)，或10mM吗啉代丙烷磺酸(MOPS)的pH 6.0缓冲液以及聚乙二醇(PEG)。确信聚乙二醇使细胞膜融合，从而允许介质中的成分运送入宿主细胞(例如曲霉或肉座菌菌株)的细胞质中，质粒DNA被转运到核。该融合常常使多拷贝质粒DNA温和整合到宿主染色体中。
[176]在转化中，通常使用含有密度为105至106/mL、优选2×105/mL曲霉原生质体或经过通透性处理的细胞悬浮液。类似地，在转化中，通常使用含有密度为108至109/mL、优选2×108/mL肉座菌(木霉)原生质体或经过通透性处理的细胞悬浮液。将这种原生质体或细胞的合适溶液(例如1.2M山梨醇；50mM CaCl2)100μl体积，与所需DNA混合。通常将高浓度PEG添加到摄取溶液中。可以向原生质体悬浮液中添加0.1至1体积的25％PEG 4000。然而，优选向原生质体悬浮液中添加0.25体积。也可以向摄取溶液中添加二甲亚砜、肝素、亚精胺、氯化钾等添加剂以帮助转化。
[177]通常，混合物在约0℃孵育10至30分钟时间。然后向混合物中添加PEG进一步加强所需基因或DNA序列的摄取。通常以转化混合物体积的5至15倍加入25％PEG 4000；然而，更多或更少的体积也可以是合适的。25％PEG 4000优选为转化混合物体积的10倍。添加PEG后，在添加山梨醇和CaCl2溶液之前，将转化混合物在室温或于冰上孵育。于是进一步将原生质体悬浮液添加到熔化的分装生长培养基中。该生长培养基只允许转化子生长。在本发明中可以使用适合生长所需转化子的任何生长培养基。然而，如果Pyr+转化子得到选择，优选使用不含尿苷的生长培养基。接着菌落被转移到去除尿苷的生长培养基，并在其上纯化。
[178]在此阶段，稳定转化子可以通过其较快的生长速率、及其在缺乏尿苷的固体培养基上形成轮廓光滑而非粗糙的圆形菌落而与不稳定转化子区分。另外，在有些情况下，在固体非选择性培养基(即含有尿苷)上培养转化子，从该培养基上收获孢子，测定这些将随后在缺乏尿苷的选择性培养基上出芽并生长的孢子的百分率，从而实现进一步的稳定性检验。
[179]在上述方法的一个特定的实施方案中，在液体培养基中生长之后，作为CBH I变体合适的翻译后修饰的结果，CBH I变体以活性形式从宿主细胞中重新获得。
(ii)酵母
[180]本发明也考虑使用酵母作为生产CBH I的宿主细胞。其他几个编码水解酶的基因已在多个酿酒酵母菌株中表达。这些基因包括编码两种内切葡聚糖酶(Penttila等，Yeast vol.3，pp 175-185，1987)、两种纤维二糖水解酶(Penttila等，Gene，63：103-112，1988)和一种瑞氏木霉β-葡糖苷酶(Cummings及Fowler，Curr.Genet.29：227-233，1996)、出芽短柄霉(Aureobasidlium pullulans)木聚糖酶(Li及Ljungdahl，Appl.Environ.Microbiol.62，no.1，pp.209-213，1996)、小麦α-淀粉酶(Rothstein等，Gene 55：353-356，1987)等的基因。另外，编码溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)β-1，4-内切葡聚糖酶(END1)、白色腐坏真菌(Phanerochaetechrysosporium)纤维二糖水解酶(CBH1)、瘤胃纤维分解菌(Ruminococcus flavefaciens)纤维糊精酶(cellodextrinase)(CEL1)以及Endomyces fibrilizer纤维二糖酶(Bgll)的纤维素酶基因盒在一个酿酒酵母实验室菌株中成功地得到表达(Van Rensburg等，Yeast，vol.14，pp.67-76，1998)。
C将CBH I编码核酸序列引入宿主细胞
[181]本发明进一步提供经过遗传修饰而包括由外源提供的变体CBHI编码核酸序列的细胞或细胞组合物。母细胞或细胞系可以使用克隆载体或表达载体进行遗传修饰(即转导、转化或转染的)。如前文进一步的描述，载体可以是例如质粒、病毒颗粒、噬菌体等形式。
[182]本发明的转化方法可以导致转化载体向丝状真菌基因组全部或部分的稳定整合。然而，也考虑导致保持自我复制的染色体外转化载体的转化。
[183]许多标准转染方法可以用于产生表达大量异源蛋白质的瑞氏木霉细胞系。一些已发表的将DNA构建体引入产生纤维素酶的木霉菌株的方法，包括Lorito，Hayes，DiPietro及Harman，1993，Curr.Genet.24：349-356；Goldman，VanMontagu及Herrera-Estrella，1990，Curr.Genet.17：169-174；Penttila，Nevalainen，Ratto，Salminen及Knowles，1987，Gene 6：155-164，对于曲霉参见Yelton，Hamer及Timberlake，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：1470-1474，对于镰刀霉参见Bajar，Podila及Kolattukudy，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8202-8212，对于链霉参见Hopwood等，1985，The JohnInnes Foundation，Norwich，UK及对于芽孢杆菌参见Brigidi，DeRossi，Bertarini，Riccardi及Matteuzzi，1990，FEMS Microbiol.Lett.55：135-138。
[184]其他用于将异源核酸构建体(表达载体)引入丝状真菌(例如红褐肉座菌)的方法包括但是不限于使用粒子或基因枪、在转化程序前的丝状真菌细胞壁通透(例如，通过使用高浓度碱，譬如0.05M至0.4M CaCl2或醋酸锂)、原生质体融合或农杆菌介导的转化。通过使用聚乙二醇和CaCl2处理原生质体或原生质球来转化丝状真菌的示范方法，在Campbell，E.I.等，Curr.Genet.16：53-56，1989和Penttila，M.等，Gene，63：11-22，1988中已有说明。
[185]可以使用任何熟知的引导外源基因进入宿主细胞的程序。这些程序包括使用磷酸钙转染、1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物、原生质体融合、电穿孔、生物弹击、脂质体、微注射、等离子载体(plasma vectors)、病毒载体以及任何其他的广为人知的用于引导克隆的基因组DNA、cDNA、合成DNA或其他外源遗传物质进入宿主细胞的方法(见，例如Sambrook等，如上文)。在美国专利号No.6,255,115中说明的农杆菌介导的转染也是有用的。唯一必要的是，使用的特定基因工程程序能够成功引导至少一个基因进入可表达异源基因的宿主细胞。
[186]另外，含有变体CBH I编码核酸序列的异源核酸构建体可以在体外转录，通过广为人知的方法(例如注射)引导产生的RNA进入宿主细胞。
[187]本发明进一步包括新的有用的丝状真菌转化子，例如用于产生真菌纤维素酶组合物的红褐肉座菌和黑曲霉。本发明包括丝状真菌转化子，尤其是包括变体CBH I编码序列或缺失内源cbh编码序列的真菌。
[188]在含有变体cbh 1编码序列的异源核酸构建体的引入之后，经过遗传修饰的细胞可以在经改良适于激活启动子、选择转化子或增强变体CBH I编码核酸序列表达的传统营养培养基上培养。培养条件(例如温度、pH等)是先前使用的用于所选细胞表达的条件，这对本领域技术人员而言是显而易见的。
[189]通常认为，此类异源核酸序列构建体所引导进入的细胞的后裔，包含发现于外源核酸构建体中的变体CBH I编码核酸序列。
[190]本发明进一步包括新的有用的丝状真菌转化子，例如用于产生真菌纤维素酶组合物的红褐肉座菌。本发明包括丝状真菌转化子，尤其是包括变体cbh 1编码序列或缺失内源cbh编码序列的真菌。
[191]稳定转化子通常可以通过其较快的生长速率、及其在固体培养基上形成轮廓光滑而非粗糙的圆形菌落而与不稳定转化子区分。另外，在有些情况下，在固体非选择性培养基上培养转化子，从该培养基上收获孢子，测定这些将随后在选择培养基上出芽并生长的孢子的百分率，从而进行进一步的稳定性检验。
VII CBH1核酸编码序列和/或蛋白质表达分析
[192]为了评价变体CBH I由使用编码变体CBH I核酸构建体转化的细胞系的表达，可以在蛋白质水平、RNA水平、或使用特异于纤维二糖水解酶活性和/或生产的功能性生物测定法进行试验。
[193]此处所述之变体cbh 1核酸和蛋白质序列的示范性申请中，设计经过遗传修饰的丝状真菌菌株(例如瑞氏木霉)产生增加产量的CBH I。这类经过遗传修饰的丝状真菌对于产生具有纤维素水解能力大大增加的纤维素酶产物是有用的。在一个方法中，这是通过将cbh1编码序列引入适宜的宿主(例如，黑曲霉这类丝状真菌)中而实现。
[194]因此，本发明包括通过将含有变体CBH I编码DNA序列的表达载体引入丝状真菌或其它合适的宿主细胞、从而在丝状真菌或其他合适的宿主中表达变体CBH I的方法。
[195]在另一个方面，本发明包括改良CBH I在丝状真菌或其他合适的宿主中表达的方法。这类改良包括内源性CBH表达的降低或消除。
[196]一般而言，分析变体CBH I表达所使用的检测法包括Northern印迹杂交、斑点杂交(DNA或RNA分析)、RT-PCR(逆转录酶聚合酶链反应)，或使用适当标记探针的(以核酸编码序列为基础)原位杂交和传统Southern印迹和放射自显影。
[197]另外，变体CBH I的表达和/或生产可以通过例如检测纤维二糖水解酶活性、表达和/或生产而在样品中直接得到测定。这类检测法在例如Becker等，Biochem J.(2001)356：19-30和Mitsuishi等，FEBS(1990)275：135-138得到说明，每个都在此明确引用作为参考。CBH I水解可溶性或不溶性底物的能力可以使用在Srisodsuk等，J.Biotech.(1997)57：49-57及Nidetzky和Claeyssens Biotech.Bioeng.(1994)44：961-966中说明的方法测定。对测定纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶或β-葡糖苷酶活性有用的底物包括晶体纤维素、滤纸、磷酸溶胀纤维素、纤维寡糖、甲基繖形基(umbelliferyl)乳糖苷、甲基繖形基纤维二糖苷、正硝基苯基乳糖苷、对硝基苯基乳糖苷、正硝基苯基纤维二糖苷、对硝基苯基纤维二糖苷。
[198]另外，蛋白质表达可以通过免疫学方法(例如细胞、组织切片的免疫组织化学染色，或免疫检测组织培养基，如通过Western印迹或ELISA)评价。这类免疫测定可以用于CBH I变体表达的定性和定量评价。这类方法的细节是本领域技术人员所知的，许多实行这类方法的试剂有商品供应。
[199]纯化形式的变体CBH I可以用于产生所表达蛋白质的单克隆或多克隆抗体，以用于多种免疫测定。(见，例如Hu等，Mol Cell Biol.vol.11，no.11，pp.5792-5799，1991)。示范性检测法包括ELISA、竞争性免疫测定、放射性免疫测定、蛋白质印迹、间接免疫荧光测定等。通常，商品提供的抗体和/或试剂盒可以用于纤维二糖水解酶蛋白质表达水平的定量免疫测定。
VIII重组CBH I蛋白质的分离和纯化。
[200]通常，细胞培养中产生的变体CBH I蛋白质被分泌入培养基，并可得到纯化和分离，例如，通过去除来自细胞培养基的不想要的成分。然而，在有些情况下，变体CBH I蛋白质可以在促使从细胞裂解液重新获得的细胞形式中产生。在这类情况下，本领域技术人员使用常规使用的技术将变体CBH I蛋白质从其产生的细胞中纯化。实例包括但是不限于亲合层析(Tilbeurgh等，FEBS Lett.16：215，1984)、离子交换层析(Goyal等，Bioresource Technol.36：37-50，1991；Fliess等，Eur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.17：314-318，1983；Bhikhabhai等，J.Appl.Biochem.6：336-345，1984；Ellouz等，J.Chromatography396：307-317，1987)，包括使用高分辨能力物质的离子交换(Medve等，J.Chromatography A 808：153-165，1998)，疏水相互作用层析(Tomaz和Queiroz，J.Chromatography A 865：123-128，1999)，以及两相分配法(Brumbauer等，Bioseparation 7：287-295，1999)。
[201]变体CBH I蛋白质一般通过分级来分离具有所选择的特性(例如，对抗体或受体等特定结合试剂的结合亲和力)、或具有所选择的分子量范围或等电点范围的蛋白质。
[202]一旦实现给定的变体CBH I蛋白质的表达，由此产生的CBH I蛋白质从细胞或细胞培养物中纯化。适于这类纯化的示范程序包括如下：抗体亲合柱层析、离子交换层析、乙醇沉淀；反相HPLC；硅石或诸如DEAE的阳离子交换树脂层析；层析聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；以及使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤。可以使用多种蛋白质纯化方法，这些方法是本领域已知的，并在例如Deutscher，Methods in Enzymology，vol.182，no.57，pp.779，1990；Scopes，Methods Enzymol.90：479-91，1982中说明。所选的纯化步骤依赖于，例如，所使用的生产过程及所产生的特定蛋白质的特性。
IX  cbh 1和CBH1的应用
[203]可以理解，变体cbh核酸序列、变体CBH I蛋白质和包括变体CBH I蛋白质活性的组合物发现在多种广泛应用中具有效用，其中一些说明如下。
[204]在表现出清洁能力增强的去垢剂组合物中，用于将木质纸浆降解为糖的组合物(例如用于生物乙醇生产)、和/或在饲料组合物中，新的改进的包括不同含量BG型、EG型和变体CBH型纤维素酶的纤维素酶组合物发现具有效用，其中，在去垢剂组合物中，起到软化剂和/或改进棉纤维触感(例如“石洗”或“生物磨光”)的功能。各型纤维素酶的分离和表征提供了控制这类组合物这些方面的能力。
[205]具有增强的热稳定性的变体(或突变体)CBH因其在升高温度保持活性的能力，所以在任何上述领域具有作用。
[206]具有降低的热稳定性的变体(或突变体)CBH在例如需要酶活性在较低温度压制以使其他可能存在的酶不受影响的领域中发现用途。另外，该酶发现在纤维制品的有限转化中有效，例如，在控制结晶程度或纤维素链长度中。达到需要的转化程度后，糖化温度可以升高至高于去稳定的CBH I的存活温度。由于CBH I活性对于水解晶体纤维素而言是必需的，所以晶体纤维素的转化将在升高的温度终止。
[207]具有增加的可逆性的变体(或突变体)CBH(即，再折叠或活性保持的增强)，也发现在类似领域具有效用。依赖于热失活条件，可逆的变性能够与不可逆过程竞争，或者比不可逆过程占优势。具有增加的可逆性的变体将在这些条件下显示出对热失活抗性的增加。在任何失活事件继之以在非失活条件下的处理的过程中，增加的可逆性也将具有潜在的益处。例如，在用于生物物质转化为乙醇的交错水解和发酵(HybridHydrolysis and Fermentation，HHF)过程中，生物物质首先在升高的温度由纤维素酶不完全糖化(即50℃或更高)，然后温度将下降(例如降至30℃)，以允许引入发酵微生物将糖转化为乙醇。随着处理温度的降低，如果热失活的纤维素酶可逆性折叠并重获活性，则在低温发酵过程中，糖化可以持续到更高的转化水平。
[208]在一个方法中，在去垢剂组合物中、或在改进纤维触感和外观的织物处理中，本发明的纤维素酶发现具有效用。
[209]由于纤维制品的水解速度可以通过使用转化子而增加，因此含有纤维素或杂多糖的产物可以以更快的速度降解至更高的程度，其中所述的转化子具有至少一个额外的插入到基因组中的cbh基因拷贝。由纤维素制造的产物(例如纸、棉、含纤维尿布等)，可以在垃圾中得到更有效的降解。因此，能够从转化子获得的发酵产物或转化子本身，可以用于帮助降解的组合物中，通过将多种添加到拥塞垃圾中的纤维素产物液化而帮助降解。
[210]分开的糖化和发酵过程为，将存在于生物物质(如玉米秸秆)中的纤维素转化为葡萄糖，继而由酵母菌株将葡萄糖转化为乙醇。同步糖化和发酵的过程为，将存在于生物物质(如玉米秸秆)中的纤维素转化为葡萄糖，同时，在同一个反应器中，由酵母菌株将葡萄糖转化为乙醇。因此，在另一个方法中，本发明的变体CBH型纤维素酶在将生物物质降解为乙醇中发现具有效用。来自来源容易获得的纤维素的乙醇产物提供了稳定并可再生的燃料来源。
[211]以纤维素为基础的原料(feedstock)包括农业垃圾、草、木以及城市垃圾(例如再生纸、园林修葺物等)之类的其他低价生物物质。任何这些纤维原料的发酵可以产生乙醇。然而，纤维素在被转化为乙醇之前，必须首先转化为糖。
[212]许多原料可以通过本发明的变体CBH而得到使用，选作使用的原料依赖于进行转化的地区。例如，在美国中西部，较多的是例如小麦秆、玉米秸秆和甘蔗渣之类的农业垃圾；而在加利福尼亚较多的是稻秆。然而，应当理解，任何可获得的纤维素生物物质可以在任何地区使用。
[213]纤维二糖水解酶含量增加的纤维素酶组合物在乙醇生产中发现具有效用。来自此途径的乙醇可以进一步用作辛烷增强物或直接作为替代汽油的燃料，这种燃料是有益的，因为乙醇是一种比石油来源产物更加环保的燃料来源。已知使用乙醇将改善空气质量并可能降低局部臭氧水平和烟雾。此外，使用乙醇替代汽油，在缓冲不可再生能源和石油化工的意外变化的冲击中，具有战略重要性。
[214]乙醇可以经糖化和发酵从纤维素生物物质(例如树木、草本植物、城市固体垃圾和农林业残渣)中产生。然而，在由细菌产生的天然存在的纤维素酶混合物中，个体纤维素酶的比例对于生物物质中纤维素向糖的快速转化可能不是最有效率的。已知内切葡聚糖酶的作用是产生新的纤维素链末端，这些末端本身是纤维二糖水解酶作用的底物，从而改进整个纤维素酶系统的水解效率。因此，使用增加或优化的纤维二糖水解酶活性，可以大大增加乙醇的产生。
[215]这样，该发明的纤维二糖水解酶在将纤维素水解为糖分中发现具有效用。在一个实施方案中，在加入发酵微生物之前，将变体纤维二糖水解酶添加到生物物质中。在第二个实施方案中，在加入发酵微生物的同时，将变体纤维二糖水解酶添加到生物物质中。可选地，在任一实施方案中可以存在其他纤维素酶成分。
[216]在另一个实施方案中，纤维素原料可以进行预处理。预处理可以通过升高的温度、以及稀释酸或浓缩酸或稀释碱溶液的加入而进行。加入预处理溶液至足够至少部分水解半纤维素成分的时间，然后将其中和。
[217]CBH I作用于纤维素的主要产物是可以通过BG活性(例如真菌纤维素酶产物中)转化为葡萄糖的纤维二糖。无论通过预处理还是通过酶作用于生物物质，除了葡萄糖和纤维二糖之外，可以从生物物质制备可以利用的其它糖。生物物质中的半纤维素成分可以转化为(由半纤维素酶)诸如木糖、半乳糖、甘露糖和阿拉伯糖等糖。因此，在生物物质转化过程中，酶促糖化作用能够产生糖，这些糖可以用于生物或化学转化为中间或终产物。因此，从生物物质产生的糖在除产生乙醇之外的许多过程中发现具有效用。这些转化的实例为葡萄糖发酵为乙醇(如M.E.Himmel等，在“Fuels and Chemicals from Biomass”，pp2-45，ACSSymposium Series 666，ed B.C.Saha及J.Woodward，1997中所综述)以及其他葡萄糖向2，5-二酮-D-葡萄糖酸(美国专利号6,599,722)、乳酸(R.Datta和S-P.Tsai pp 224-236，如上)、琥珀酸(R.R.Gokarn，M.A.Eiteman和J.Sridhar，pp237-263，同上)、1，3-丙二醇(A-P.Zheng，H.Biebl和W-D.Deckwer，pp264-279，同上)、2，3-丁二醇(C.S.Gong，N.Cao和G.T.Tsao，pp280-293，同上)的生物转化，以及木糖向木糖醇的化学和生物转化(B.C.Saha和R.J.Bothast，pp307-319，同上)。也见例如WO 98/21339。
[218]除了纤维素酶组合物(不考虑纤维二糖水解酶含量，即无纤维二糖水解酶、基本无纤维二糖水解酶或增强的纤维二糖水解酶)，本发明的去垢剂组合物还可以使用表面活性剂(包括阴离子、非离子和两性表面活性剂)、水解酶、助洗剂、漂白剂、上蓝剂和荧光染料、结块抑制剂、增溶剂、阳离子表面活性剂等。所有这些成分为清洁剂领域所知。上文描述的纤维素酶混合物可以以液体稀释液、颗粒、乳液、凝胶、糊等形式添加到去垢剂组合物中。这些形式为技术人员所熟知。当使用固体去垢剂组合物时，纤维素酶组合物优选设计为颗粒。颗粒优选配制为含有纤维素酶保护试剂。更完全的讨论见美国专利号6,162,782，题目为“含有缺乏CBHI型成份的纤维素酶组合物的去垢剂组合物”，此处引用作为参考。
[219]使用的纤维素酶组合物优选占总去垢剂组合物质量百分比的约0.00005至约5。使用的纤维素酶组合物更优选占总去垢剂组合物质量百分比的约0.0002至约2。
[220]另外，变体cbh I核酸序列在相关核酸序列的鉴定和表征中发现具有效用。许多技术对于测定(预测或证实)相关基因或基因产物的功能是有用的，包括但是不限于(A)DNA/RNA分析，例如(1)过表达、异常表达、以及在其他物种表达；(2)基因敲除(反向遗传学、靶向敲除、病毒介导的基因沉默(VIGS，见Baulcombe，100 Years of Virology，Calisher和Horzinek eds.，Springer-Verlag，New York，NY 15：189-201，1999)；(3)基因甲基化状态分析，尤其是侧翼调节区；和(4)原位杂交；(B)基因产物分析，例如(1)重组蛋白质表达；(2)抗血清生产；(3)免疫定位；(4)催化或其他活性的生物化学检测；(5)磷酸化状态；和(6)通过酵母双杂交分析与其他蛋白质的相互作用；(C)通路分析，例如在特定生物化学或信号通路中安插一个基因或基因产物，基于其过表达表型或与相关基因的序列同源性；和(D)其它也可以得到执行以测定或确认在特定代谢或信号通路中分离的基因及其产物的参与，并帮助测定基因功能。
[221]此处提及的所有专利、专利申请、论文和出版物，在此明确引用作为参考。
                        实施例
[222]本发明在下面的实施例中得到进一步详细说明，该实施例无意以任何方式限制本发明的权利要求范围。附图意在被考虑为本发明详述和说明的完整部分。所有引证的参考文献在此明确引用其所有公开内容作为参考。
                         实施例1
                已知的Cel7A纤维素酶比对
[223]通过使用结构信息和建模程序，首先将红褐肉座菌Cel7A与其41个家族成员进行比对，从而确定几种突变体的选择。所有42个家族成员的一级氨基酸序列比对显示于图8中。
[224]先前已对该成员中的四个(即20MW.1，1A 39，6CEL和1EG1.1)测定了晶体结构。4个已公布结构的蛋白质的比对，锁定了所有骨架原子在特定RMS偏差内(RMS小于或等于2.0A)的氨基酸的比对。使用由Chemical Computing Group，Montreal Canada提供的MOE version2001.01执行这四个序列的三级结构比对。重叠的结构元件用来冻结这四个序列的一级结构。其余38个序列的一级结构使用MOE与冻结的四个进行比对，MOE的二级结构预测开放，其余参数设置为默认值。
[225]在比对的基础上，通过定点诱变在蛋白质中造成多种单氨基酸或多氨基酸突变。
[226]单氨基酸突变以下面的原理为基础(也见表1)：检查同源体间氨基酸保守性后，在红褐肉座菌序列中选取位点，在其他41个序列中，可从统计学上看到该位点偏爱另一个氨基酸(例如，在77位的Ala，仅仅出现在红褐肉座菌和其他3个同源物中，而在其他22个当中变为Asp)。
表1：Cel7A变体及改变原理
  Cel 7A变体和变化理论   Tm   ΔTm
  野生型红褐肉座菌   62.5
  (4)A77D(22)Q7和I80有3个可能的氢键   62.2   -0.3
  (7)S113D(18)主链有许多新的氢键以稳定转角   62.8   0.3
  (8)L225F(13)更好的内部包装   61.6   -0.9
  (5)L288F(17)更好的内部包装   62.4   -0.1
  (1)A299E(24)晶体结构中观察到与钴原子额外配合   61.2   -1.3
  (4)N301K(11)E295和E325具有盐桥   63.5   1.0
  (5)T356L(20)更好的内部包装   62.6   0.1
  (2)G430F(17)更好的表面包装   61.7   -0.8
[227]多氨基酸突变建立在要求影响酶稳定性、加工能力和产物抑制的基础上。在红褐肉座菌序列中构建下述多位点改变：
1)Thr 246 Cys+Tyr 371 Cys
2)Thr 246 Ala+Arg 251 Ala+Tyr 252 Ala
3)Thr 380 Gly+Tyr 381 Asp+Arg 394 Ala+缺失残基382 to393，
4)Thr 380 Gly+Tyr 381 Asp+Arg 394 Ala
5)Tyr 252 Gln+Asp 259 Trp+Ser 342 Tyr
[228]预测T246A/R251A/Y252A以及另一个三位点突变+缺失突变体都降低该酶的产物抑制。预测Thr246Cys+Tyr371Cys增加酶稳定性并增加其加工能力。预测D259W/Y252Q/S342Y变体影响该酶的产物抑制。
[229]使用本领域熟知的方法(参考文献见上)构建其他单突变和多突变体，并呈现于表2中。
表2：红褐肉座菌CBH I变体
  突变体
  S8P
  N49S
  A68T
  A77D
  N89D
  S92T
  S113N
  S113D
  L225F
  P227A
  P227L
  D249K
  T255P
  D257E
  S279N
  L288F
  E295K
  S297T
  A299E
  N301K
  T332K
  T332Y
  T332H
  T356L
  F338Y
  V393G
  G430F
  T41I(加缺失Thr445)
  V403D/T462I
  S196T/S411F
  E295K/S398T
  A112E/T226A
  T246C/Y371C
  G22D/S278P/T296P
  S8P/N103I/S113N
  S113T/T255P/K286M
  P227L/E325K/Q487L
  P227T/T484S/F352L
  T246A/R251A/Y252A
  突变体
  T380G/Y381D/R394A
  Y252Q/D259W/S342Y
  A68T/G440R/P491L
  Q17L/E193V/M213I/F352L
  S8P/N49S/A68T/S113N
  A112E/P227L/S278P/T296P
  S8P/N49S/A68T/N103I/S113N
  S8P/N49S/A68T/S278P/T296P
  G22D/N49S/A68T/S278P/T296P
  G22D/N103I/S113N/S278P/T296P
  S8P/N49S/A68T/S113N/P227L
  S8P/N49S/A68T/A112E/T226A
  S8P/N49S/A68T/A112E/P227L
  T41I/A112E/P227L/S278P/T296P
  S8P/T41I/N49S/A68T/S113N/P227L
  S8P/T41I/N49S/A68T/A112E/P227L
  G22D/N49S/A68T/P227L/S278P/T296P
  G22D/N49S/A68T/N103I/S113N/S278P/T296P
  G22D/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/S278P/T296P
  G22D/N49S/A68T/N103I/A112E/P227L/S278P/T296P
  G22D/N49S/N64D/A68T/N103I/S113N/S278P/T296P
  S8P/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/S411F
  S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/S278P/T296P
  S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/S278P/T296P
  S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S113N/P227L/D249K/S278P/N301R
  S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/S411F
  S8P/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/V403D/T462I
  S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N 103I/S113N/P227L/D249K/S278P/T296P
  S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/S278P/T296P/N301R
  S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S113N/P227L/D249K/S278P/T296P/N301R
  S8P/T41I/N49S/S57N/A68T/S113N/P227L/D249K/S278P/T296P/N301R
  S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/V403D/T462I
  S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/D249K/S278P/T296P/N301R
  S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/S196T/P227L/D249K/T255P/S278P/T296P/N301R/E325K/S411F
  S8P/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/S196T/P227L/D249K/T255P/S278P/T296P/N301R/E325K/V403D/S411F/T462I
  S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/S196T/P227L/D249K/T255P/S278P/T296P/N301R/E325K/V403D/S411F/T462I
实施例2
CBH I变体在红褐肉座菌中的克隆及表达
A红褐肉座菌通用目的(general-purpose)表达质粒-PTEX的构建
[230]质粒pTEX按照前文Sambrook等(1989)的方法构建，并在图7中加以阐明。设计该质粒用于丝状真菌长枝木霉中的多目的表达载体。表达盒具有一些对该功能有用的独特特征。使用长枝木霉强CBH I基因启动子和终止子序列调节转录。在CBH I启动子和终止子之间是独特的PmeI和SstI限制性位点，该位点用于插入将要表达的基因。长枝木霉pyr4选择标志基因插入CBH I终止子内；利用独特的Notl限制性位点或独特的Notl和Nhel限制性位点，可以切割整个表达盒(CBH I启动子-插入位点-CBH I终止子-pyr4基因-CBH I终止子)。
[231]本载体以细菌载体pSL1180(Pharmacia Inc.，Piscataway，N.J.)为基础，该载体为具有延长的多克隆位点的PUC型载体。本领域技术人员能够根据图7中说明的流程图构建此载体。
[232]载体pTrex2L从pTrex2(pTEX的衍生物)构建。pTrex2序列在图6中给出。
[233]只要变体蛋白质以有用的水平表达，使用的质粒并不是那么重要。然而，通过在cbh 1位点强迫整合而将表达水平最大化，是有益的。
B克隆
[234]技术人员可以使用本领域已知方法将所需的CBH I变体克隆到合适的载体中。如前所述，只要变体蛋白质以有用的水平表达，使用的质粒并不是那么重要。下面关于一种本发明的变体CBH I酶的制备的说明，可以用于制备任何在此说明的本发明的变体。
[235]变体cBH 1基因被克隆到pTrex2L载体中。
[236]质粒pTrex2L的构建如下：使用合成的、含有BstE II和BamHI位点的连接子替换pTrex2中独特的Sac II和Asc I位点之间的6个核苷酸，从而产生质粒Trex2L。合成的互补连接子
21聚体合成寡核苷酸CBHlink1+：GGTTTGGATCCGGTCACCAGG
以及
27聚体合成寡核苷酸CBHlink-：CGCGCCTGGTGACCGGATCCAAACCGC被退火。
[237]使用Sac II和Asc I消化pTrex2。退火的连接子于是连接入pTrex2中产生pTrex2L。然后使用适当的限制性酶消化该质粒，将野生型CBH I基因连接入该质粒中。
[238]使用引物将所需突变引入野生型基因。应当理解，可以使用任何导致将所需改变或突变引入基因的方法。使用合成的DNA引物作为突变体构建的PCR模板。在将被引入的所需突变基础上设计引物，完全在熟练技术人员的知识范围内。
[239]使用合成的DNA寡核苷酸通过PCR将诱变模板进行延伸并形成双链。经过25个PCR循环后，终产物主要是含有所需突变的58bp双链产物。随后使用标准技术将诱变的片段附着于野生型CBH I片段并连接到质粒中。
c转化和表达
[240]把为所需变体制备的载体转化双重或四重缺失的木霉菌株的尿苷营养缺陷型中(见表3；也见美国专利号5,861,271和5,650,322)，鉴别稳定转化子。
表3：转化/表达株
 CBH I变体   表达株系
  A77D   四重缺失株(1A52)
  S113D   双重缺失株
  L225F   双重缺失株
  L288F   双重缺失株
  A299E   四重缺失株(1A52)
  N301K   四重缺失株(1A52)
  T356L   双重缺失株
  G430F   四重缺失株(1A52)
  T246C/Y371C   四重缺失株(1A52)
  T246A/R251A/Y252A   四重缺失株(1A52)
  Y252Q/D259W/S342Y   四重缺失株(1A52)
  T380G/Y381D/R394A   四重缺失株(1A52)
  T380G/Y381D/R394A加缺失382-393   四重缺失株(1A52)
“双重缺失”(ΔCBH I及ΔCBH II)以及“四重缺失”(ΔCBHI及A CBHII，ΔEGI及ΔEG II)瑞氏木霉宿主菌株
[241]为了选择表达变体CBH I的转化子，在Vogels+1％葡萄糖上生长后，从菌株分离DNA，使用分离的仅含有变体CBH I的DNA片段进行Southern印迹实验。分离变体CBH I表达盒的拷贝整合入宿主细胞基因组的的转化子。在Vogels+1％乳糖上生长一天之后从菌株分离总mRNA。使用变体CBH I编码区作为探针将mRNA进行Northern分析。鉴别表达变体CBH I的转化子。
[242]使用上述方法可以获得其他新的变体CBH I纤维素酶或其衍生物。
                    实施例3
            CBH1变体在黑曲霉中的表达
[243]使用下面的引物及程序获得PCR片段。
[244]构建下列DNA引物，用于扩增多种微生物基因组DNA的同源CBH1基因。此处所有用于蛋白质和DNA序列的符号与IUPAC IUBBiochemical Nomenclature Commission编码相符合。
[245]在瑞氏木霉CBH1序列的基础上发展同源5′(FRG192)和3′(FRG193)引物。两个引物都在引物5′端含有Invitrogen
Figure G03823928020070530D000581
的Gateway克隆序列。引物FRG192含有attB1序列，引物FRG193含有attB2序列。
不含attB1的FRG192序列：
ATGTATCGGAAGTTGGCCG(CBH1红褐肉座菌信号序列)(SEQ ID NO：3)
不含attB2的FRG193序列：
TTACAGGCACTGAGAGTAG(CBH1红褐肉座菌纤维素结合模块)(SEQ IDNO：4)
[246]红褐肉座菌CBH I cDNA克隆作为模板。
[247]PCR条件如下：10μL 10X反应缓冲液(10X反应缓冲液包括100mM Tris HCl，pH 8-8.5；250mM KCl；50mM(NH4)2SO4；20mM MgSO4)；dATP、dTTP、dGTP、dCTP各0.2mM(终浓度)，1μL 100ng/μL基因组DNA，0.5uL PWO聚合酶(Boehringer Mannheim，Cat#1644-947)(1unit/μL)，引物FRG192和FRG193各0.2uM，(终浓度)，4μL DMSO，加水至100μL。
[248]红褐肉座菌CBH1中的多个位点可能与变体的热稳定性有关，因此将红褐肉座菌CBH1基因进行诱变。
[249]使用Qiagen Gel extraction KIT从琼脂凝胶中纯化编码变体的片段。使用Invitrogen
Figure G03823928020070530D000591
的GatewayTMTechnology操作手册(versionC)，将纯化的片段与Invitrogen
Figure G03823928020070530D000592
pDONRTM201载体进行克隆酶反应，此处引用该手册作为参考。然后基因从这个ENTRY载体转入目标载体(pRAXdes2)，从而获得表达载体pRAXCBH1。
[250]使用含有变体CBH I纤维素酶编码核酸的表达载体转化细胞。根据Cao等说明的方法(Cao Q-N，Stubbs M，Ngo KQP，Ward M，CunninghamA，Pai EF，Tu G-C和Hofmann T(2000)Penicillopepsin-JT2 arecombinant enzyme from Penicillium janthinellum and contributionof a hydrogen bond in subsite S3 to kcat Protein Science 9：991-1001)，将构建体转化到黑曲霉泡盛变种中。
[251]将转化子在基本培养基平板上划线(Ballance DJ，Buxton FP及Turner G(1983)Transformation of Aspergillus nidulans by theorotidine-5′-phosphate decarboxylase gene of Neurospora crassaBiochem Biophys Res Commun 112：284-289)并于30℃生长4天。使用本领域熟知的方法收集孢子(见http://www.fgsc.net/fgn48/Kaminskyj.Htm)。将构巢曲霉分生孢子收获于水中(使用消毒弯玻棒摩擦分生培养物表面以去除孢子)，可以在4℃保存数星期至数月而没有严重的活力损失。然而，新鲜收获的孢子出芽繁殖能力更强。为了长期保存，孢子可以于-20℃保存在50％甘油中，或者于-80℃保存在15-20％甘油中。甘油在80％的水溶液中更易于吸量。800μL孢子水悬液(如同用于4℃保藏)加至200μL 80％甘油中，用于-80℃库存；400μL悬液加至600μL 80％甘油中，用于-20℃库存。冰冻前涡流振荡。对于突变体收集，可以切下小块孢子培养物，置于20％甘油中，涡流振荡，冰冻于-80℃作为库存。在我们的案例中，将其在-80℃保存与50％甘油中。
[252]在缺乏尿苷的基本培养基上培养黑曲霉泡盛变种(Ballance等，1983)。按照Cao等(2000)说明，将1cm2分生生长的琼脂盘的孢子悬液接种到100ml摇瓶中，于37℃生长3天，从而筛选纤维素酶活性。
[253]CBHI活性检验建立在非荧光4-甲基繖形基-β-乳糖苷水解的基础上，水解产物为乳糖和7-羟基-4-甲基香豆素，后者是造成荧光信号的原因。吸量170μL 50mM NaAc溶液pH 4.5到适于荧光的96孔微量板(MTP)(Greiner，Fluotrac 200，art.nr.655076)。添加10μL上清液，随后添加10μL MUL(1mM 4-甲基繖形基-β-乳糖苷(MUL)于milliQ水)，将MTP置于Fluostar Galaxy(BMG Labtechnologies；D-77656Offenburg)中。在50℃，于λ320nm(激发)和λ460nm(发射)测量动力学16分钟(8个循环，每个循环120秒)。具有CBH活性的上清液进行疏水相互作用层析。
                     实施例4
                CBH 1变体的稳定性
[254]按照上文克隆和表达CBH I纤维素酶变体(见实施例2和3)。使用柱层析将Cel7A野生型和变体从这些培养物的无细胞悬液中纯化。使用疏水相互作用层析(HIC)纯化蛋白质。使用Poros
Figure G03823928020070530D000611
20HP2树脂的柱子在BioCADR Sprint Perfusion Chromatography System下运行，二者都由Applied Biosystems制造。
[255]HIC柱子使用5倍柱体积的0.020M磷酸钠、0.5M硫酸铵(pH6.8)平衡。硫酸铵以终浓度约0.5M加入上清液中，pH调节至6.8。过滤后，将上清加于柱上。上样后，使用10倍柱体积平衡缓冲液清洗柱，然后使用10倍柱体积溶于0.02M磷酸钠、pH6.8的硫酸铵梯度洗脱，梯度从0.5M硫酸铵到0M硫酸铵。Cel7A约在中间梯度洗脱。收集级分，并以还原SDS-PAGE凝胶分析为基础混和这些级分。
[256]根据Luo等，Biochemistry 34：10669和Gloss等，Biochemistry36：5612的方法测定熔点。也见Sandgren等(2003)Protein Science12(4)pp848。
[257]在Aviv 215圆二色性分光光度计上收集数据。变体在210-260nm的自然光谱出现在25℃。缓冲条件为pH5.5的50mM Bis TrisPropane/50mM醋酸铵/冰乙酸。蛋白质浓度保持在0.25至0.5mgs/mL。确定监测去折叠的最佳波长后，在相同的缓冲条件下，将温度从25℃升至75℃，使样品热变性。每2度收集数据5秒钟。在0.1厘米路径长度小室中，于230nm检测部分可逆去折叠。在75℃，如上所述收集去折叠光谱。然后将样品冷却到25℃收集再折叠光谱。使用三个光谱在230nm的区别来评价变体可逆性。
[258]野生型CBH I和多种变体CBH I的热变性特征显示于图9A和9B中。也见表4。
表4：变体CBH I纤维素酶的热稳定性
  红褐肉座菌CBHI残基置换   Tm   delta Tm   ％rev230nm
  野生型   62.5   23
  S8P   63.1   0.6
  N49S   63.7   1.2
  A68T   63.7   1.2   32
  A77D   62.2   -0.3
  N89D   63.6   1.1   50
  S92T   64.4   1.9   25
  S113D   62.8   0.3
  S113N   64.0   1.5
  L225F   61.6   -0.9
  P227A   64.8   2.3   49
  P227L   65.2   2.7   45
  D249K   64.0   1.5   39
  T255P   64.4   1.9   35
  S279N   62.4   -0.1   ～95
  E295K   64.0   1.5   ～95
  T332K   63.3   0.8   37
  T332Y   63.3   0.8   37
  T332H   62.7   0.2   64
  F338Y   60.8   -1.7   ～95
  G430F   61.7   -0.8
  L288F   62.4   -o.1
  A299E   61.2   -1.3
  N301K   63.5   1.0
  T356L   62.6   0.1
  D257E   61.8   -o.7   45
  V393G   61.7   -0.8   43
  S297T   63.3   0.8   31
  T41I加缺失T445   64.2   1.7
  T246C/Y371C   65.0   2.5
  S196T/S411F   65.3   2.8   27
  E295K/S398T   63.9   1.4   36
  V403D/T462I   64.5   2   53
  A112E/T226A   63.5   1.0
  A68T/G440R/P491L   63.1   0.6   32
  G22D/S278P/T296P   63.6   1.1
  T246A/R251A/Y252A   63.5   1.0
  T380G/Y381D/R394A   58.1   -4.4
  Y252Q/D259W/S342Y   59.9   -2.6   50
  S113T/T255P/K286M   63.8   1.3   16
  红褐肉座菌CBHI残基置换   Tm   delta Tm   ％rev230nm
  P227L/E325K/Q487L   64.5   2.0   22
  P227T/T484S/F352L   64.2   1.7   45
  Q17L/E193V/M213I/F352L   64.0   1.5   34
  S8P/N49S/A68T/S113N   64.5   2.0   90
  S8P/N49S/A68T/S113N/P227L   66.0   3.5   86
  T41I/A112E/P227L/S278P/T296P   66.1   3.6   48
  S8P/N49S/A68T/A112E/T226A   64.6   2.1   46
  S8P/N49S/A68T/A112E/P227L   65.2   2.7   32
  S8P/T41I/N49S/A68T/A112E/P227L   67.6   5.1   40
  G22D/N49S/A68T/P227L/S278P/T296P   65.9   3.4   26
  G22D/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/S278P/T296P   65.3   2.8   72
  G22D/N49S/A68T/N103I/A112E/P227L/S278P/T296P   65.1   2.6   20
  G22D/N49S/N64D/A68T/N103I/S113N/S278P/T296P   61.4   -1.1   75
  S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/S278P/T296P   68.8   6.3   56
  S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/D249K/S278P/T296P   69.0   6.5   71
  S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/S278P/T296P/N301R   68.7   6.2   70
  S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/D249K/S278P/T296P/N301R   68.8   6.3   74
  S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S113N/P227L/D249K/S278P/T296P/N301R   69.9   7.4   88
  S8P/T41I/N49S/S57N/A68T/S113N/P227L/D249K/S278P/T296P/N301R   68.9   6.4   ～100
  S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S113N/P227L/D249K/S278P/N301R   68.7   6.2   92
  S8P/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/V403D/T462I   68.8   6.3   ～100
  S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/V403D/T462I   68.5   6.0   ～100
  S8P/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/S411F   68.6   6.1   ～100
  S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/S411F   69.5   7.0   ～100
  S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/S196T/P227L/D249K/T255P/S278P/T296P/N301R/E325K/S411F   70.7   8.2   ～100
  S8P/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/S196T/P227L/D249K/T255P/S278P/T296P/N301R/E325K/V403D/S411F/T462I   71.0   8.5   ～100
  S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/S196T/P227L/D249K/T255P/S278P/T296P/N301R/E325K/V403D/S411F/T462I   70.9   8.4   ～100
不离开本发明的范围和精神，所描述的本发明方法和体系的多种修改和变化对本领域技术人员而言将是显而易见的。尽管结合特定的优选实施方案对本发明进行说明，仍然应当理解，本发明不应当被不适当地限制于这类特定的实施方案。事实上，所述的实施本发明的方法可以进行多种修改，这些修改对于分子生物学或相关领域技术人员而言是显而易见的，并且落在权利要求范围内。

Claims (13)

1.变体CBH I纤维素酶，其中所述变体由红褐肉座菌CBH I(SEQID NO：2)组成，其前提是替换P227L存在于SEQ ID NO：2中。
2.根据权利要求1的变体CBH I纤维素酶，其中所述变体包含在某位点的置换，该置换对应于红褐肉座菌CBH I(SEQ ID NO：2)的下列一个或多个残基：S8P、N49S、A68T、N89D、S92T、S113N、S113D、P227L、D249K、T255P、E295K、S297T、N301K、T332K、T332Y、T332H和/或T356L。
3.变体CBH I纤维素酶，其中所述变体CBH I由选自红褐肉座菌CBH I(SEQ ID NO：2)的下列突变组成：
li.P227L/E325K/Q487L；
lv.S8P/N49S/A68T/S113N/P227L；
lvi.T41I/A112E/P227L/S278P/T296P；
lviii.S8P/N49S/A68T/A112E/P227L；
lix.S8P/T41I/N49S/A68T/A112E/P227L；
lx.G22D/N49S/A68T/P227L/S278P/T296P；
lxi.S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/S278P/T296P；
lxii.G22D/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/S278P/T296P；
lxiii.G22D/N49S/A68T/N 103I/A112E/P227L/S278P/T296P；
lxiv.S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/D249K/S278P/T296P；
lxv.S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/S278P/T296P/N301R；
lxvi.S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/N103I/S113N/P227L/D249K/S278P/
T296P/N301R；
lxvii.S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S113N/P227L/D249K/S278P/T296P/
N301R；
lxviii.S8P/T41I/N49S/S57N/A68T/S113N/P227L/D249K/S278P/T296P/
N301R；
lxix.S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S 113N/P227L/D249K/S278P/N301R；
lxx.S8P/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/V403D/T462I；
lxxi.S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/V403D/T462I；
lxxii.S8P/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/S411F；
lxxiii.S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/P227L/D249K/S411F；
lxxiv.S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/S196T/P227L/D249K/
T255P/S278P/T296P/N301R/E325K/S411F；
lxxv.S8P/T41I/N49S/A68T/S92T/S 113N/S 196T/P227L/D249K/T255P
/S278P/T296P/N301R/E325K/V403D/S411F/T462I；
lxxvi.S8P/G22D/T41I/N49S/A68T/S92T/S113N/S196T/P227L/D249K/
T255P/S278P/T296P/N301R/E325K/V403D/S411F/T462I，
其中所述的变体CBH I纤维素酶具有升高的热稳定性。
4.编码根据权利要求1-3任一项的CBH I变体的核酸。
5.包含根据权利要求4的编码CBH I变体的核酸的载体。
6.用权利要求5的载体转化的宿主细胞。
7.生产CBH I变体的方法，该方法包括步骤：
(a)在适合生产CBH I变体的条件下，在合适的培养基中培养根据权利要求6的宿主细胞；
(b)获得由此产生的CBH I变体。
8.包含表面活性剂和CBH I变体的去垢剂组合物，其中所述CBH I变体包括根据权利要求1的CBH I变体。
9.根据权利要求8的去垢剂，其中所述去垢剂为洗衣用去垢剂。
10.根据权利要求9的去垢剂，其中所述去垢剂为餐具去垢剂。
11.包含根据权利要求1的CBH I变体的饲料添加剂。
12.处理木质纸浆的方法，该方法包括将所述木质纸浆与根据权利要求1的CBH I变体接触。
13.将生物物质转化为糖的方法，该方法包括将所述生物物质与根据权利要求1的CBH I变体接触。
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