KR100682599B1 - 폴리펩티드 - Google Patents

폴리펩티드

Info

Publication number
KR100682599B1
KR100682599B1 KR1020017007774A KR20017007774A KR100682599B1 KR 100682599 B1 KR100682599 B1 KR 100682599B1 KR 1020017007774 A KR1020017007774 A KR 1020017007774A KR 20017007774 A KR20017007774 A KR 20017007774A KR 100682599 B1 KR100682599 B1 KR 100682599B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
polypeptide
activity
gly
ile
leu
Prior art date
Application number
KR1020017007774A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20010099842A (ko
Inventor
다카야마마사노리
우메다가호코
고야마노부토
아사다기요조
가토이쿠노신
Original Assignee
다카라 바이오 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 다카라 바이오 가부시키가이샤 filed Critical 다카라 바이오 가부시키가이샤
Publication of KR20010099842A publication Critical patent/KR20010099842A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100682599B1 publication Critical patent/KR100682599B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01091—Cellulose 1,4-beta-cellobiosidase (3.2.1.91)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 첨가, 삽입 및/또는 치환된 아미노산 서열을 갖고 셀로비오하이드로라아제 활성을 갖는 폴리펩티드.

Description

폴리펩티드{Polypeptides}
본 발명은 폴리펩티드, 더욱 특히, 바이오매스(biomass)의 이로운 사용에 유용한, 셀룰로오스를 분해(degrading)시키는 활성을 갖는 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 유전 공학에 의해 상기 폴리펩티드를 제조하는데 유용한 유전자에 관한 것이다.
셀룰로오스는 (C6H10O5)n으로 표시된다. 주성분으로 셀룰로오스를 함유하는 물질은 소나무(pines), 참죽나무(cedars), 너도밤나무(beeches) 및 포플러(poplars)와 같은 재목; 대마(hemps), 페이퍼 부쉬(paper bushes), 벼의 지푸라기(rice straws), 바가스(bagasse) 및 겨(chaff)와 같은 줄기(staks) 및 인피(basts); 무명(cotton)과 같은 종자의 솜털(seed downs); 신문, 잡지 및 골판지의 폐지와 같은 오랜된 종이들; 그외의 섬유 폐기물; 펄스, 셀룰로오스 분말 등으로 예시화된다. 최근, 사무실로부터 오래된 종이가 증가하고 있다.
셀룰로오스 분자는 D-글루코피라노오스가 β-1,4 결합으로 연결되고 측쇄를 갖지 않는 구조를 갖는다. 따라서, 셀룰로오스는 알콜 발효에서 원료로서 사용될 수 있는 글루코오스로 구성된다. 셀룰로오스가 글루코오스로 분해될 수 있다면, 오 랜된 종이 또는 섬유 폐기물로부터 연료 등으로서 유용한 알콜을 제조하는 것이 가능할 것이다.
산성 방법 또는 효소적 방법에 의해 셀룰로오스를 글루코오스로 가수분해하는 것이 셀룰로오스를 분해(당화(saccharifying)하는 방법으로서 수행되어 왔다. 산성 방법에서, 셀룰로오스를 염산 또는 황산과 접촉시켜 다량의 섬유를 격렬히 분해시킨다. 가수분해 조건을 적절하게 결정하기 어렵기 때문에, 강산의 존재에서 생성된 글루코오스를 추가로 반응시킬 수 있다. 따라서, 산성 방법은 고수율로 글루코오스를 회수하기 어렵다는 문제점 등을 갖고 있다. 그러므로, 산성 방법은 현재 실용되지 않는다. 반대로, 셀룰로오스 가수분해효소를 이용하는 효소적 방법은 높은 반응 특이성을 갖고 환경 보호면에 있어 이롭다. 따라서, 효소적 방법이 가수분해 방법의 주가 되어 왔다. 다양한 방법이 보고되어 왔다[Wood, B.E., et al., Biotechnology Progress, 13:223-237(1997); United States Patent NO. 5,508,183; Zhao Xin, et al., Enzyme Microbial Technology, 15:62-65(1993), etc.].
셀룰로오스 가수분해효소는 엔도글루카나아제(EC 3.2.1.4), β-D-글루코시다아제(EC 3.2.1.21), 엑소-1,4-β-D-글루코시다아제(EC 3.2.1.74) 및 셀로비오하이드로라아제(EC 3.2.1.91)에 의해 예시된다. 엔도글루카나아제의 권장명은 셀룰라아제이고, 합성명은 1,4-(1,3,1,4)-β-D-글루칸 3(4)-글루카노하이드로라아제이다.
엔도글루카나아제, β-D-글루코시다아제, 엑소-1,4-β-D-글루코시다아제, 셀로비오하이드로라아제 등으로 구성된 혼합물이 일반적으로 셀룰로오스의 가수분해 를 위해 사용된다. 그러한 효소는 함께 작용하여 셀룰로오스를 글루코오스로 분해한다. 작용 모드에 대하여 몇몇의 이론이 공지되어 있다. 무라오(Murao) 등은 하기 모델을 제안하였다. 우선, 엔도글루카아나제의 작용에 의해 셀룰로오스의 비결정 부위에 분열을 유도한다. 셀로비오하이드로라아제는 결정을 분해시키면서 갭(gap)에 작용한다. 올리고당은 엔도글루카나아제 및 셀로비오하이드로라아제의 작용에 의해 생성된다. 올리고당이 β-D-글루코시다아제의 작용에 의해 분해되고 글루코오스를 생성한다[Sawao Murao et al. "Cellulase", pp. 102-104, Kodansha(May 10, 1987)].
대부부의 경우, 셀룰로오스는 단일 셀룰로오스 쇄로 존재하지 않는다. 다수의 셀룰로오스 쇄가 수소 결합을 통해 결합된 구조를 형성한다. 이 구조에는, 다수의 셀룰로오스 쇄가 조밀하게 뭉쳐있는 결정 부위 및 셀룰로오스 쇄가 산재하게 위치한 비결정 부위가 존재한다. 효소적 방법에 의한 가수분해 반응에서 속도-측정 단계는 결정 부위에서 다수의 셀룰로오스를 분리하고 분산시키는 단계이다. 따라서, 고온에서 효소적 분해 반응을 수행하는 것은 하기의 장점을 갖는다: (1)셀룰로오스 결정이 용이하게 파괴되기 때문에 반응이 효율적으로 진행된다; (2)각종 박테리아에 의해 오염될 위험성이 거의 없다; 및 (3)가열이 필요한 산업적 공정에서는 효소 반응에 앞서 냉각시킬 필요가 없다.
피로코쿠스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus)로부터의 β-D-글루코시다아제, 써모코쿠스 sp.(Thermococcus sp.)로부터의 β-D-글루코시다아제, 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima)로부터의 엔도글루카나아제 및 β-D-글루코시다아제, 써모 토가 네아폴리타나(Thermotoga neapolitana)로부터의 엔도글루카나아제 및 β-D-글루코시다아제 등이 극도의 고온균으로부터의 셀룰로오스 가수분해효소로서 공지되어 있다[Bauer, et al., Current Opinoin in Biotechnology, 9:141-145(1998)]. 극도의 고온균으로부터의 β-D-글루코시다아제 유전자의 클로닝은 예를 들면, 미국 특허 제 5,744,345 호에 기재되어 있다. 극도의 고온균으로부터의 엔도글루카나아제 유전자의 클로닝은 예를 들면, WO 97/44361에 기재되어 있다.
셀로비오하이드로라아제는 고온성 세균, 써모토가 sp. FjSS-B.1(Thermotoga sp. FjSS-B.1)로부터 분리되어 왔다[Ruttersmith, et al., Biochemical Journal, 277:887-890(1991)]. 셀로비오스에 대한 이 효소의 억제 상수(Ki)(0.2mM)는 낮기 때문에, 상기 효소는 억제시키기 용이한다. 기질로서 4-메틸움벨리페릴-β-D-셀로비오사이드를 사용하는 특이 활성도는 3.6U/mg이다. 또한, 세균은 혐기 조건하에 고온에서 배양되어야 하기 때문에, 산업상 대량으로 효소를 생산하기는 어렵다. 또한, 상기 효소를 코딩하는 유전자가 클로닝되어 있지 않았기 때문에, 유전 공학에 의해 상기 효소를 제조할 수 없다.
발명의 목적
본 발명의 주목적은 셀로비오스에 대한 높은 억제 상수 및 내열성을 갖는 셀로비오하이드로라아제, 및 저렴한 비용으로 상기 셀로비오하이드로라아제를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
발명의 요약
피로코쿠스 호리코시이 OT3(Pyrococcus horikoshii OT3)의 전체 게놈 DNA의 뉴클레오타이드 서열이 확정되었다[Kawarabayasi, et al., DNA Research, 5:55-76(1998); Kawarabayasi, et al., DNA Research, 5:147-155(1998)]. 상기 각 오픈 리딩 프레임으로부터 유래된 유전자 생성물과 아미노산 서열에서 상동성을 갖는 단백질의 목록이 공개되었다{http://www.bio.nite.go.jp/ot3db_index.html). 이 목록에서 공지된 셀룰로오스 가수분해 효소를 코딩하는 핵산과의 상동성 비교에 기초하여, α-아밀라아제, α-만노시다아제, β-D-갈락토시다아제, β-D-글루코시다아제, β-D-만노시다아제 및 엔도글루카나아제와 같은 폴리펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임이 피로코쿠스 호리코시이 OT3에 존재한다고 예측된 바 있다. 그러나, 공지된 셀로비오하이드로라아제를 코딩하는 핵산과 상동성을 갖는 오픈 리딩 프레임이 존재한다고 예측된 적은 없었다.
집중적인 연구 결과, 본 발명자들은 피로코쿠스 호리코시이 OT3 게놈 중 셀로비오하이드로라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 플레임(PH1171)이 존재한다는 것을 발견하였다. 예상외로, 아르카에박테리아 AEPIIa로부터의 엔도글루카나아제를 포함하는 다양한 엔도글루카나아제와 상동성을 가질지라도, 상기 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 셀로비오하이드로라아제 활성을 갖음을 증명한다. 또한, 본 발명자는 유전 공학에 의해 상기 폴리펩티드를 제조하는 방법을 확립하였다. 그러므로, 본 발명은 완성되었다.
본 발명은 하기의 것을 제공한다:
(1)SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열에서 하 나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 추가, 삽입 및/또는 치환된 아미노산 서열을 갖고 셀로비오하이드로라아제 활성을 갖는 폴리펩티드;
(2)상기 (1)에 있어서, 열안정성의 셀로비오하이드로라아제 활성을 갖는 폴리펩티드;
(3)상기 (1) 또는 (2)에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 핵산;
(4)상기 (3)에 있어서, SEQ ID NO:2의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산;
(5)엄격한 조건(stringent conditions)하에서 상기 (3)에 따른 핵산과 혼성화할 수 있는, 셀로비오하이드로라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산;
(6)상기 (5)에 있어서, 열안정성의 셀로비오하이드로라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산;
(7)상기 (3) 내지 (6)중 어느 하나에 따른 핵산을 포함하는 재조합 DNA;
(8)상기 (7)에 따른 재조합 DNA로 형질전환된 형질전환체(transformant);
(9)상기 (8)에 따른 형질전환체를 배양하고 상기 배양액으로부터 셀로비오하이드로라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는, 상기 (1)에 따른 폴리펩티드를 제조하는 방법;
(10)상기 (1)에 따른 폴리펩티드를 β-1,4 결합을 통해 결합된 D-글루코피라노오즈의 폴리머에 작용시켜 셀로비오스를 해리시키는 것을 포함하는, β-1,4 결합을 통해 결합된 D-글루코피라노오즈의 폴리머를 분해하는 방법;
(11)셀로비오하이드로라아제 활성을 갖고 셀로비오스에 대하여 10mM 이상의 억제 상수 Ki를 갖는 폴리펩티드; 및
(12)상기 (11)에 있어서, 95℃에서 5시간의 처리 후, 20% 이상의 셀로비오하이드로라아제 활성을 유지하는 폴리펩티드.
도면의 간단한 설명
도 1은 반응 pH 및 CMC-분해 활성과의 관계를 설명하는 도이다.
도 2는 반응 온도 및 본 발명의 폴리펩티드의 CMC-분해 활성과의 관계를 설명하는 도이다.
도 3은 반응 혼합물중의 NaCl 농도의 본 발명의 폴리펩티드의 CMC-분해 활성에 미치는 영향을 설명하는 도이다.
도 4는 폴리펩티드를 10분동안 95℃에서 가열하였을 때, pH 처리 및 본 발명의 폴리펩티드의 CMC-분해 활성과의 관계를 설명하는 도이다.
도 5는 폴리펩티드를 95℃에서 가열하였을 때, 처리 시간 및 본 발명의 폴리펩티드의 CMC-분해 활성과의 관계를 설명하는 도이다.
도 6은 본 발명의 폴리펩티드 pNPC-분해 활성 및 본 발명의 폴리펩티드의 양과의 관계를 설명한 도이다.
도 7은 다양한 시약의 본 발명의 폴리펩티드의 pNPC-분해 활성에 미치는 효과를 설명한 도이다.
발명의 상세한 설명
1. 본 발명의 폴리펩티드
본 발명의 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 추가, 삽입 및/또는 치환된 아미노산 서열을 갖고 셀로비오하이드로라아제 활성을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 명세서에서 사용되는 바, 셀로비오하이드로라아제 활성은 β-1,4 결합을 통해 결합된 D-글루코오스로 구성된 다당류 또는 올리고당에서 글루코시드 결합을 가수분해하여 셀로비오스, D-글루코오스가 β-1,4 결합을 통해 결합된 이당류를 해리시키지만, 셀로비오스에서 글루코시드 결합을 해리시키지 않는 활성을 의미한다. 셀로비오하이드로라아제 활성을 측정하는 방법은 기질로서 인산-팽윤 셀룰로오스(phosphric acid-swollen celluse)를 사용하여 효소 반응을 수행하고 박층 실리카겔 크로마토그래피에 의해 셀로바이스의 존재 여부를 확인하는 공지된 방법에 의해 구체화된다.
본 발명의 폴리펩티드는 셀로비오하이드로라아제 활성을 갖는다. 상기 폴리펩티드는 엔도글루카나아제 활성 및 β-D-글루코시다아제 활성과 같은 다른 글리코시다아제 활성을 가질 수 있다.
한 예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 열안정성의 셀로비오하이드로라아제 활성을 갖는 것으로 특징화된다.
본 명세서에서 사용되는 바, "내열성"은 바이오매스로부터 알콜을 제조하기 위한 산업 공정에서 셀룰로오스 분해를 위해 필요한 시간동안 고열 조건하에 인큐베이션시킬 때 비가역적으로 변성(불활성)되지 않는 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 바, 비가역적 변성은 효소 활성의 영구적이고 완전한 손실을 의미한다. 이하, 내열성을 갖는 셀로비오하이드로라아제 활성을 열안정성의 셀로비오하이드로라아제 활성으로 언급한다. 본 발명을 제한하는 것은 아니지만, SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 20분동안 75℃, 10분동안 95℃, 또는 95℃에서 5시간의 처리 후, 80% 이상의 셀로비오하이드로라아제 활성을 유지한다. 또한, 상기 폴리펩티드는 90℃ 이상, 또는 100℃ 이상과 같은 고온 조건하에서 셀로비오하이드로라아제 활성을 나타낸다. 열안정성의 셀로비오하이드로라아제 활성을 갖는 본 발명의 폴리펩티드는 5시간동안 95℃에서 처리한 후, 20% 이상, 더욱 바람직하게 40% 이상, 가장 바람직하게 80 % 이상의 셀로비오하이드로라아제 활성을 유지한다.
본 발명의 폴리펩티드의 한 예로서 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 예를 들면, 인산-팽윤 셀룰로오스 또는 셀로올리고당으로부터 셀로비오스를 생성시키는 활성을 갖는다. 상기 폴리펩티드의 열안정성의 셀로비오하이드로라아제 활성에 대한 최적의 pH는 5 내지 6.5이다. 폴리펩티드는 65℃ 내지 113℃에서 열안정성의 셀로비오하이드로라아제 활성을 나타낸다. 최적의 온도는 약 110℃이다. 상기 폴리펩티드는 고온의 내열성을 갖는다. 기질의 존재에 5시간동안 95℃에 pH 6에서 가열 후, 그것은 약 90%의 활성을 유지한다. 추가로 24시간동안 가열한 후 약 80%의 활성이 유지된다. 폴리펩티드를 기질의 부재에서 10분동안 95℃에 pH 5 내지 7에서 가열할 때, 활성은 감소하지 않는다. 정제된 폴리펩티드의 셀로비오하이드로라아제 활성을 기질로서 4-메틸움벨리페릴-β-D-셀로비오사이드를 사용하여 20분동안 pH 6.0에 98℃에서 반응시켜 측정할 때, 특이 활성도는 17.0 U/mg이다,
상기 폴리펩티드는 카복시메틸셀룰로오스(CMC) 또는 셀로올리고당에 작용할 수 있다. CMC 또는 셀로올리고당을 사용하여 생성된 당의 환원 산물의 양을 기질로서 사용하여 상기 폴리펩티드의 셀로비오하이드로라아제 활성을 측정될 수 있다. 상기 폴리펩티드는 또한 p-니트로페닐-β-D-셀로비오시드와 같은 발색 기질(chromophoric substrate) 또는 4-메틸움벨리페릴-β-D-셀로비오시드와 같은 형광 기질에 작용한다. 따라서, 폴리펩티드의 셀로비오하이드로라아제 활성은 반응에 의해 생성된 발색 또는 형광 물질의 양을 측정하여 용이하게 측정될 수 있다.
상기 폴리펩티드는 0.5 내지 1.0M의 NaCl의 존재에서 최대 열안정성의 셀로비오하이드로라아제 활성을 나타낸다. NaCl 부재에서, 폴리펩티드는 0.5M NaCl 존재에서 나타내는 활성의 약 80%를 나타낸다. 2.5M NaCl의 존재에서, 폴리펩티드는 0.5M NaCl 존재에서 나타내는 활성의 약 60%를 나타낸다. 따라서, NaCl 농도의 열안정성의 셀로비오하이드로라아제 활성에 대한 효과는 거의 없다.
한 실시예에서, 본 발명의 폴리펩티드의 셀로비오하이드로라아제 활성은 셀로비오스 또는 글루코오스와 같은 반응 생성물에 의해 거의 억제되지 않는다. 셀로비오스에 대한 폴리펩티드의 억제 상수(Ki)는 바람직하게 10mM 이상, 더욱 바람직하게 30mM 이상, 가장 바람직하게 100mM 이상이다. 예를 들면, SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 폴리펩티드의 셀로비오스에 대한 억제 상수(Ki)는 212mM이다. 셀로비오스에 대한 그러한 높은 억제 상수를 갖는 폴리펩티드는 본 발명에서 앞서 공지된 바 없었다. 글루코오스에 의한 활성의 억제는 거의 관찰되지 않는다. 또한, 하기 시약의 부재에서의 활성과 비교할 때, 활성은 0.5mM의 Fe+3, Cu+2 또는 Zn+2에 의해 약 90%정도까지, 또는 1mM의 Co+2, Ca+2, Mg+2 또는 에틸렌디아민테트라아세트산에 의해 약 50%정도까지 억제된다. 10mM의 디티오트레이톨에 의한 활성의 억제는 거의 관찰되지 않는다.
본 발명의 폴리펩티드는 그것이 셀로비오하이드로라아제 활성을 갖는 한, SEQ ID NO:1의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 추가, 삽입 및/또는 치환된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
아미노산 서열에서 아미노산의 결실, 삽입, 추가 또는 치환과 같은 돌연변이가 자연적으로 발생한 단백질에서 생성될 수 있다. 그러한 돌연변이는 동질 이상(polymorphism) 또는 상기 단백질을 코딩하는 DNA의 돌연변이, 또는 생체내 또는 합성 후 정제하는 동안 단백질의 변형에 의해 생성될 수 있다. 그러나, 그러한 돌연변이가 활성의 유지 또는 단백질의 구조에 중요하지 않은 부위에 위치한다면,그러한 돌연변이화된 단백질은 돌연변이화되지 않은 단백질의 것과 실질적으로는 동일한 생리학적 및 생물학적 활성을 나타낼 수 있다.
그러한 돌연변이가 단백질의 아미노산 서열내로 인공적으로 삽입된 단백질에 적용될 수 있다. 이러한 경우, 더욱 다양한 돌연변이를 생성할 수 있다. 예를 들면, 인간 인터루킨-2(IL-2)의 아미노산 서열에서 시스테인 잔기가 세린으로 치환된 폴리펩티드는 인터루킨-2의 활성을 유지한다고 공지되어 있다(Science, 224:1431(1984)).
또한, 특정 단백질은 그들의 활성에 필수적이지 않은 펩티드 부위를 갖는다 고 공지되어 있다. 그러한 펩티드 부위는 세포외로 분비되는 단백질중 시그날 펩티드 또는 프로테아제의 전구체중에 발견된 프로시퀸스(prosequence)에 의해 예시화된다. 대부분의 그러한 부위는 전사 후 또는 활성 단백질로의 전환시에 제거된다. 그러한 단백질은 제거되는 부위를 갖지 않는 단백질의 것과 상이한 일차 구조를 갖지만, 최종적으로는 동일한 기능을 나타낸다. SEQ ID NO:1의 아미노산 서열은 N-말단에 28개의 아미노산 잔기의 시그날 부위가 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열로부터 제거된 서열이다. SEQ ID NO:6의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산은 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩한다. 이 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 에쉐리히아 콜라이(Escherichia coli)를 배양할 때, 시그날 펩티드 부위는 발현된 폴리펩티드로부터 제거되고, SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 생성된다.
단백질을 유전 공학에 의해 제조할 때, 관심의 대상이 되는 단백질의 활성과는 무관한 펩티드 쇄가 단백질의 아미노 말단 또는 카르복실 말단에 첨가될 수 있다. 예를 들면, 관심의 대상이 되는 단백질의 발현 수준을 증가시키기 위해, 사용되는 숙주에서 높은 수준으로 발현되는 단백질의 아미노산 말단 부위의 일부가 아미노 말단에 첨가된 융합 단백질을 제조할 수 있다. 다르게는, 발현된 단백질의 정제를 촉진시키기 위해, 특정 물질과 결합능을 갖는 펩티드를 관심의 대상인 단백질의 아미노 말단 또는 카르복실 말단에 첨가할 수 있다. 첨가되는 펩티드가 관심의 대상인 단백질의 활성에 해를 끼지지 않는다면, 첨가된 펩티드로 잔존할 수 있다. 필요한 경우, 적절한 처리, 예를 들면 프로테아제로 제한된 분해(digestion)에 의 해 관심의 대상인 단백질로부터 제거될 수 있게 하기 위해 설계될 수 있다.
따라서, 본 명세서에서 공개된 아미노산 서열(SEQ ID NO:1)에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 추가 및/또는 치환된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 셀로비오하이드로라아제 활성을 갖는 한, 본 발명에 포함된다. 바람직하게, 그러한 폴리펩티드는 열안정서의 셀로비오하이드로라아제 활성 및 셀로비오스에 대한 높은 억제 상수를 갖는다.
본 발명의 폴리펩티드는 예를 들면, (1)본 발명의 폴리펩티드를 생성하는 미생물의 배양액으로부터의 정제, 또는 (2)본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 형질전환체의 배양액으로부터의 정제에 의해 제조될 수 있다.
(1)본 발명의 폴리펩티드를 생성하는 미생물의 배양액으로부터의 정제
본 발명의 폴리펩티드를 생성하는 미생물을 리켄(Riken)(Institute of Physical and Chemical Research)사로부터 구입할 수 있는 피로코쿠스 호리코시 OT 3(Pyrococcus horihoshii OT3)(JCM9974)에 의해 예시된다.
미생물을 미생물의 성장에 적절한 조건하에서 배양한다. 바람직하게, 관심의 대상인 폴리펩티드의 발현 수준을 증가시키는 배양 조건을 사용한다. 세포 또는 배양액중에서 생성된 관심의 대상인 폴리펩티드는 통상적인 단백질 정제 방법에 따라 정제될 수 있다.
고온균(hyperthermophile)을 배양하기 위해 통상적으로 사용되는 방법이 상기 언급된 세균 균주의 배양을 위해 사용될 수 있다. 세균 균주에 의해 사용될 수 있는 양분을 배양 배지에 첨가한다. 예를 들면, 전분을 탄소원으로서 사용할 수 있 고, 트립톤, 펩톤 및 효모 추출물을 질소원으로서 사용할 수 있다. 마그네슘염, 나트륨염 또는 철염과 같은 금속염을 미량 원소로서 배양 배지에 첨가할 수 있다. 또한, 예를 들면, 배양 배지의 제조를 위해 인공의 해수를 사용하는 것이 이로울 수 있다. 고체형태의 황을 함유하지 않는 투명한 배양 배지가 바람직하다. 그러한 배양 배지를 사용하여, 세포의 성장을 배지의 혼탁도를 측정하여 용이하게 모니터할 수 있다.
배양액은 스탠딩(standing) 배양액 또는 스피너(spinner) 배양액일 수 있다. 예를 들면, [Applied and Enviromental Microbiology, 55:2086-2088(1992)]에 기재된 바와 같은 다이알리스 배양법이 사용될 수 있다. 일반적으로, 배양 온도는 바람직하게 약 95℃이다. 일반적으로, 약 16 시간동안 배양한 후 상당량의 폴리펩티드가 배양액중에 축적된다. 폴리펩티드의 생산성을 최대가 되도록 하기 위해, 사용되는 세포 또는 배양 배지의 조성물에 따라 배양 조건을 결정하는 것이 바람직하다.
첫째, 폴리펩티드를 수득하기 위해 무세포 추출액을 제조한다. 무세포 추출액은 예를 들면, 배양액으로부터 원심 분리, 여과 등에 세포를 수득하고, 이어서 세포를 분해시켜 제조될 수 있다. 관심의 대상인 효소를 추출하는데 고도로 효과적인 세포 분해(disruption) 방법은 초음파 처리(sonification), 비드(bead)를 사용한 분해, 용균성 효소로의 처리, 계면 활성제로의 처리 등으로부터 선택될 수 있다. 폴리펩티드가 배양액내로 분비되는 경우, 폴리펩티드는 황산 암모늄 염 침전(ammonium sulfate salting out), 한외 여과(ultrafiltration)등에 의해 농축된다. 농축된 폴리펩티드를 무세포 추출액로서 사용한다. 단백질을 정제하기 위해 통상적으로 사용되는 방법을 사용하여 상기와 같이 수득된 무세포 추출액로부터 폴리펩티드를 분리할 수 있다. 예를 들면, 황산 암모늄 염 침전, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 등이 함께 사용될 수 있다.
(2)본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 DNA로 형질전환된 형질전환체의 배양액으로부터의 정제
본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 대표적인 뉴클레오타이드 서열을 SEQ ID NO:2에 나타낸다. SEQ ID NO:2의 뉴클레오타이드 서열로부터 유래된 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 SEQ ID NO:1에 나타낸다. 따라서, 본 발명에 따라 수득된 폴리펩티드의 대표적인 아미노산 서열은 SEQ ID NO:1에 나타낸다.
형질전환된 숙주는 특정의 것으로 제한하지 않고 에쉐리히아 콜라이, 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 효모 및 곰팡이에 의해 예시된다.
예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드는 pECEL211를 포함하는 에쉐리히아 콜라이 BL21(DE3), SEQ ID NO:6의 DNA가 T7 프로모터의 하류에 연결된 플라스미드를 사용하여 수득될 수 있다. SEQ ID NO:6의 뉴클레오타이드 서열로부터 유래된 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열을 SEQ ID NO:5에 나타낸다. pECEL211로 형질 전환된 에쉐리히아 콜라이 JM109가 디자인되고 에쉐리히아 콜라이 JM109/pECEL211로서 표시되고, 1998년 12월 11일 일본, 이바라키켄, 츠쿠바시, 히가시 1-초메, 1-3에 소재하는 내셔날 인스티튜트 오브 바이오사이언스 앤드 휴먼-테크놀러지, 에이젼시 오브 인더스티리얼 사이언스 앤드 테크널러시, 미니스트리 오브 인터내셔날 트래이 드 앤드 인더스트리(National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan)에 수탁번호 FERM P-17075하에 기탁하고, 1999년 11월 15일 부다페트스 조약하에 수탁번호 FERM BP-6939하에 국제 기탁 해당 관청에 송부하였다.
통상의 배양 조건, 예를 들면, 37℃에 100μg/㎖의 앰피실린을 함유하는 LB 배지(10g/ℓ의 트립톤, 5g/ℓ의 효모 추출물, 5g/ℓ의 NacL, pH 7.2)중에서 pECEL211를 포함하는 에쉐리히아 콜라이 BL21(DE3)를 로그 성장 단계(logarithmic growth phase)까지 배양하고, 거기에 최종 농도 0.1mM로 이소프로필-β-D-티오칼로토피라노시드를 가하고 추가로 15℃에서 배양하여 폴리펩티드를 배양된 세포중에서 발현시킬 수 있다.
배양 후 원심분리에 의해 세포를 회수하고, 상기 세포를 초음파 처리에 의해 분해하고 원심분리에 의해 상층액을 회수하여 제조된 상층액을 무세포 추출액로서 사용할 수 있다. 이 무세포 추출액을 효소 반응을 위해 사용할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과, 소수성 크로마토그래피 및 황산염 침전과 같은 공지된 방법을 사용하여 무세포 추출액로부터 정제될 수 있다. 물론, 일부의 정제된 생성물 또한 효소 반응에 사용될 수 있다. pECE211을 포함하는 에쉐리히아 콜라이 BL21(DE3)로부터 발현되는 본 발명의 폴리펩티드는 고도로 열안정성이기 때문에, 정제하기 위해 배양된 세포 및/또는 무세포 추출액을 정제를 예를 들면, 10분동안 95℃에서 가열할 수 있다.
다르게는, 본 발명의 폴리펩티드는 pNCEEL101을 포함하는 바실러스 섭틸러스 DB104, SEQ ID NO:2의 DNA가 섭틸리신(subtilisin) 프로모터의 하류에 연결된 플라스미드를 사용하여 수득할 수 있다. 특히, 본 발명의 폴리펩티드는 pNCEL101을 포함하는 바실러스 섭틸러스 DB104를 통상의 배양 조건, 예를 들면, 밤새도록 37℃에 10μg/㎖의 카나마이신을 함유하는 LB 배지중에서 배양하여 배양액중에 축적될 수 있다. 생성을 위해 숙주를 에쉐리히아 콜라이를 사용하는 상기 기재된 공지된 방법에 따라 배양액중의 본 발명의 폴리펩티드를 정제할 수 있다.
상기 기재된 바, 본 발명의 폴리펩티드가 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 사용하여 보통의 온도(예: 37℃)에서 발현되는 경우, 생성된 발현 생성물은 활성, 내열성 등을 유지한다. 즉, 본 발명의 폴리펩니드는 원 생성 세포(original producer cell)의 성장 온도와 매우 상이한 온도에서 발현될지라도, 그것은 그의 고유의 고차 구조(higher-order structuer)를 유지할 수 있다.
2. 본 발명의 핵산
본 발명의 핵산은 상기 기재된 본 발명의 폴라펩티드를 코딩하는 핵산이다. 특히, 이것은 (1)SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 추가, 삽입 및/또는 치환된 아미노산 서열을 갖고 셀로하이드로라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산; (2)SEQ ID NO:2의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산; 및 (3)엄격한 조건(strigent conditions)에서 상기 (1) 또는 (2)의 핵산과 혼성화할 수 있는, 셀로하이드로라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 의해 예시된다.
본 명세서에서 사용되는 바, 핵산은 싱글 스트랜드 또는 더블 스트랜드 DNA 또는 RNA를 의미한다.
상기 (2)의 핵산이 RNA 인 경우, SEQ ID NO:2의 뉴클레오타이드 서열에서 T는 U에 의해 치환된 뉴클레오타이드 서열에 의해 나타내어진다.
예를 들면, 본 발명의 핵산은 하기와 같이 수득될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 위해 상기 (2)의 SEQ ID NO:2의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산을 상기 기재된 바와 같이 피로코쿠스 호리코시 OT3(JCM9974, Riken)으로부터 분리할 수 있다.
또한, 본 발명에 의해 제공된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 본 발명의 폴리펩티드의 것과 유사한 셀로비오하이드로라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 수득할 수 있다. 혼성화용 프로브 또는 PCR과 같은 유전자 증폭 방법을 위한 프라이머로서 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 또는 일부의 뉴클레오타이드 서열을 사용하여 특히, 셀로비오하이드로라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 스크린할 수 있다. 상기 (1) 및 (3)의 핵산을 그러한 방법에 따라 수득할 수 있다.
관심의 대상인 핵산의 일부만을 포함하는 핵산 단편을 상기 언급한 방법에 따라 수득할 수 있다. 이 경우, 관심의 대상인 전체 핵산을 하기와 같이 수득할 수 있다. 수득된 핵산 단편의 뉴클레오타이드를 측정하여 상기 단편이 관심의 대상인 핵산의 일부임을 확인한다. 프로브로서 핵산 단편 또는 그의 일부를 사용하여 혼성화를 수행한다. 다르게는, 핵산 단편의 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 합성된 프 라이머를 사용하여 PCR을 수행한다.
"엄격한 조건하에서 혼성화"는 것은 예를 들면, 하기 조건하에서 혼성화할 수 있는 것을 언급한다. 12 내지 20시간동안 50℃에 0.5% SDS, 0.1% 소 혈청 알부민(BSA), 0.1% 폴리비닐피롤리돈, 0.1% 피콜 400(Ficoll 400) 및 0.01% 변성된 연어 정자 핵산을 포함하는 6 x SSC(1xSSC: 0.15M NaCl, 0.015M 소듐 시트레이트, pH 7.0)중에서 그 위에 핵산이 고정화된 막을 프로브와 함께 인큐베이션시킨다. 인큐베이션 후, 고정화된 핵산으로부터의 시그날을 바탕과 구별할 수 있을 때까지, SSC의 농도를 0.1x 이상으로 온도를 50℃ 이하까지 변경하면서 막을 37℃에 0.5% SDS를 포함하는 2 x SSC중에서 세척한 후, 프로브를 검출한다. 그렇게 수득한 신규한 핵산에 의해 코딩된 단백질의 활성을 상기 기재된 바와 같이 측정하여, 핵산이 관심의 대상인 핵산 여부를 확인한다.
또한, 핵산을 적절한 발현 벡타 등에 삽입시켜 본 발명의 핵산을 포함하는 재조합 DNA를 작제한다. 이어서, 재조합 DNA를 포함하는 형질전환체를 제조한다. 상기 형질전환체가 산업적으로 폴리펩티드를 제조하기 위해 사용될 수 있다.
상기 기재된 바, 본 명세서 공개된 뉴클레오타이드 서열과 동일하지 않은 뉴클레오타이드 서열이 셀로비오하이드로라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 한, 그것은 본 발명에 포함된다.
유전자중 아미노산을 정의하는 1 내지 6개의 코돈(3개 염기의 조합)이 각 아미노산에 대하여 지정됨이 공지되어 있다. 따라서, 다수의 핵산이 아미노산 서열에 따라 하나의 특정 아미노산 서열을 코딩할 수 있다. 핵산은 본래 불안정하다. 뉴클 레오타이드 서열중 돌연변이의 생성은 보통이다. 핵산중에 생성된 돌연변이가 코딩된 아미노산 서열을 변경시키지 않을 수 있다(침묵돌연변이(silent mutation)으로 불려짐). 이 경우, 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 상이한 핵산이 생성된다고 언급될 수 있다. 따라서, 하나의 특정 아미노산 서열을 코딩하는 분리된 핵산을 포함하는 유기체의 계대(passage) 과정에서 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 다양한 핵산이 생성될 수 있음을 부인할 수 없다. 또한, 유전 공학에 대한 다양한 방법을 사용하여 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 다양한 핵산을 인공적으로 제조하기는 어렵지 않다.
예를 들면, 유전 공학에 의해 단백질을 제조하기 위해 사용되는 숙주에서 관심의 대상인 단백질을 코딩하는 원 핵산에서 사용되는 코돈의 사용이 낮은 경우, 단백질의 발현 수준이 낮을 수 있다. 이 경우, 관심의 단백질의 발현 수준을 향상시킬 목적으로 코딩되는 아미노산을 변경하지 않고 숙주에서 자주 사용되는 것으로 코돈을 인공적으로 전환시킨다(예: JP-B 7-102146). 물론, 상기 기재된 바, 하나의 특정 아미노산 서열을 코딩하는 다양한 핵산을 인공적으로 제조할 수 있다. 그들은 또한 자연적으로 생성될 수 있다.
3. 본 발명의 폴리펩티드를 사용하여 β-1,4 결합을 통해 결합된 D-글루코피라노오스의 폴리머를 분해하는 방법.
β-1,4 결합을 통해 결합된 D-글루코피라노오스의 폴리머로부터 셀로비오스를 해리시키기 위해 본 발명의 폴리펩티드를 사용할 수 있다. 본 발명에서 β-1,4 결합을 통해 결합된 D-글루코피라노오스의 폴리머중 글루코오스의 중합도를 특정하게 제한하는 것은 아니다. 폴리머는 셀로트리오스 및 셀룰로오스를 포함한다. SEQ ID NO:1에 의해 표시되는 본 발명의 폴리펩티드는 고도로 열안정성이다. 부분적으로는 가열에 의한 기질의 구조적 변화와의 상승 효과 때문에, 이것은 더욱 효과적으로 셀룰로오스를 분해할 수 있다.
특히, 예를 들면, 98℃에서 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 50mM MES-NaOH 완충액(pH 6.0)중에서 기질과 반응시켜 셀로비오스를 해리시킬 수 있다. 자연적으로, 기질의 유형(셀룰로오스, 셀로테트라오스 등)에 따라 반응 조건은 달라질 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 유리 형태로 기질 현탁액에 가할 수 있다. 그러나, 폴리펩티드가 적절한 담체상에 고정화된 기질과 반응하면, 반응후 폴리펩티드는 용이하게 회수된다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드와 함께 열안정성의 엔도글루카나아제, 엑소-1,4-β-D-글루코시다아제 및 β-D-글루코시다아제를 사용하여 매우 효과적으로 셀룰로오스를 D-글루코오스로 분해할 수 있다.
하기 실시예는 추가로 본 발명을 상세히 설명하지만 그의 범위를 제한하려는 것은 아니다.
본 명세서에 기재된 방법 중, 플라스미드 DNAs의 제조 및 제한 효소 분해를 포함하는 기본 과정을 [T. Maniatis, et al. (eds.), Molecular Cloning: A laboratory Manual 2nd et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 달리 언급되지 않는 한, 에쉐리히아 콜라이 JM109 또는 HB101를 에쉐리히아 콜라이를 사용하는 플라스미드 작제를 위한 숙주로서 사용하고 100μg/㎖의 앰피실린을 함유하는 LB 배지(1% 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 0.5% NaCl, pH 7.0) 또는 1.5% 농도의 아가를 LB 배지에 가하고 생성된 혼합물을 고형화하여 제조된 LB 플레이트를 사용하여 37℃에서 호기적으로 배양하였다.
실시예 1
피로코쿠스 호리코시 OT3 게놈중 오픈 리딩 프레임 PH1171을 포함하는 재조합 DNA의 작제
(1)오픈 리딩 프레임 PH1171을 포함하는 DNA의 제조
피로코쿠스 호리코시 OT3 게놈의 뉴클레오타이드 서열에 기초하여, SEQ ID NO:3의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 1171FN 및 SEQ ID NO:4의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 1171RA을 합성하여, 주형으로서 피로코쿠스 호리코시 OT3 게놈 DNA를 사용하여 PCR에 의해 오픈 리딩 프레임 PH1171를 포함하는 약 1.6-kb의 증폭된 DNA 단편을 수득하였다.
피로코쿠스 호리코시 OT3 JCM9974(Riken사로부터 구입)을 JCM 카다로그 (Riken)에 기재된 바와 같이 16시간동안 95℃에 배지중에서 배양하였다. 게놈 DNA를 배양된 세포로부터 정제하였다.
프라이머 쌍으로서 올리고뉴클레오타이드 1171FN 및 1171RA를 사용하고 주형으로서 상기 언급된 게놈 DNA를 사용함으로써 PCR을 수행하여 오픈 리딩 프레임 PH1171를 포함하는 DNA를 수득하였다. TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo)에 첨부된 프로토콜에 따라 하기와 같이 PCR을 수행하였다: 0.5분동안 94℃, 2분동안 50℃ 및 1.5 분동안 94℃에서 25회 반복. PCR 생성물을 아가로스 겔 전기 영동 시켰다. 약 1.6kb의 증폭된 DNA 단편을 추출하고 정제하였다. 상기와 같이 수득한 DNA의 핵산 서열 분석으로 DNA가 오픈 리딩 프레임 PH1171를 포함함을 밝혀냈다.
(2)재조합 DNA pECEL101의 작제
상기 (1)에서 수득한 약 1.6kb의 증폭된 DNA 단편을 제한 효소 StuI 및 AvaI(두가지 모두 Takara Shuzo로부터 구입)으로 분해하고, T4 DNA 폴리머라아제 (Takara Shuzo)로 블런트 말단화시키고(blunt-ended) 아가로스 겔 전기 영동 시켰다. 이어서, 약 1.5kb의 DNA 단편을 추출하고 정제하였다. 한편, pET21a(Novagen)을 제한 효소 BamHI(Takara Shuzo)로 분해하고, 알카리성 포스파타아제(Takara Shuzo)로 탈인산화하고 T4 DNA 폴리머라아제로 블런트 말단화시켰다. 두개의 블런트 말단화된 DNA 단편을 DNA 리가아제(Takara Shuzo)를 사용하여 결찰(ligate)시켰다. 결찰 혼합물(ligation mixture)을 사용하여 에쉐리히아 콜라이 JM109를 형질전환시켰다. 일부의 형질전환체를 선별하고, 각 형질전환체에 포함된 플라스미드 DNAs를 정제하였다. 벡타중의 T7 프로모터의 것과 동일한 방향으로 오픈 리딩 프레임 PH1171이 삽입된 플라스미드 DNA를 선별하기 위하여 제한 효소 지도를 DNAs에 대하여 플라스미드 제조하였다. 선별된 플라스미드 DNA를 pECEL101로서 표시하였다.
(3)재조합 DNA pECEL211의 작제
상기 (1)에서 수득된 약 1.6kb의 증폭된 DNA 단편 및 pET21d(Novagen)으로 구성된 재조합 DNA를 하기와 같이 제조하였다.
상기 (1)에서 수득된 약 1.6kb의 증폭된 DNA 단편을 AvaI로 분해하고, T4 DNA 폴리머라아제로 블런트 말단화시키고 제한 효소 NcoI(Takara Shuzo)로 분해하여 PH1171의 첫번째 코돈을 pET21d중의 T7 프로모터로부터 하류에 효과적으로 놓았다. 한편, pET21d을 BamHI으로 분해하고, T4 폴리머라아제로 블런트 말단화시키고, 제한 효소 NcoI(Takara Shuzo)로 분해하고 알칼린성 포스파타아제로 탈인산화하였다.
상기 기재된 바와 같이 처리된 두개의 DNA 단편을 DNA 리가아제를 사용하여 결찰(ligate)시켰다. 결찰 혼합물을 사용하여 에쉐리히아 콜라이 JM109를 형질전환시켰다. 일부의 형질전환체를 선별하고 배양하였다. 각 형질전환체중에 포함된 플라스미드 DNAs를 정제하였다. PH1171이 삽입된 플라스미드 DNA 를 선별하기 위해 플라스미드 DNAs에 대하여 제한 효소 지도를 제작하였다. 선별된 플라스미드 DNA를 pECE211로서 표시하였다. pECE211을 포함하는 에쉐리히아 콜라이 JM109를 에쉐리히아 콜라이 JM109/pECEL211로서 표시하고, 수탁번호 BP-6939하에 내셔날 인스티튜트 오브 바이오사이언스 앤드 휴먼-테크날러지, 에이전시 오브 인더스트리얼 사이언스 앤드 테크날러지(the National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology)에 기탁하였다.
실시예 2
본 발명의 폴리펩티드 제조
(1)폴리펩티드의 발현
실시예 1 (3)에서 제조된 pECEL211 또는 대조군 벡타로서 pET21d를 사용하여 에쉐리히아 콜라이 BL21(DE3)을 형질전환시켰다. 각각의 생성된 형질전환체를 100㎍/㎖의 앰피실린을 함유하는 5㎖ LB 배지에 따로따로 접종하고, 밤새도록 37℃에 호기하에서 배양하였다. 상기 배양액을 5㎖의 1% 농도의 동일한 신선한 배지내로 접종하고, 37℃에 호기상태에서 배양하였다. 혼탁도가 OD600 = 0.4 내지 0.7에 도달했을 때, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG, Takara Shuzo)를 최종 농도 1mM로 가하였다. 추가로 세포를 밤새도록 15℃에서 배양하였다. 배양한 후, 세포를 원심분리에 의해 회수하고, 0.5㎖의 100mM 소듐 시트레이트 완충액(pH 5.0)중에 현탁시키고 초음파처리하여 분해하였다. 원심분리한 후 회수한 상층액을 무세포 추출액로 사용하였다.
엔도글루카나아제 또는 셀로바이소하이드로라아제와 같은 셀룰로오스 하이드로라아제를 사용하여 셀룰로오스를 분해하였을 때, 최종 환원 생성물의 글루코오스 잔기가 신규하게 생성되었다. 이어서, 에쉐리히아 콜라이 추출물중에 최종 환원 생성물의 글루코오스 잔기를 신규하게 생성하는, 셀룰로오스 가수분해 활성을 갖는 폴리펩티드의 존재 여부를 확인하기 위하여,Park 및 Johson 방법에 따라 기질로서 카복시메틸셀룰로오스(CMC)를 사용하여 단위 반응 시간내의 최종 환원 생성물의 증가량을 측정하였다.
CMC(Sigma)를 1% 농도로 100mM 소듐 시트레이트 완충액(pH 5.0)에 용해시켜 CMC 용액을 제조하였다. 50㎕의 CMC 용액 및 100mM 소듐 시트레이트 완충액(pH 5.0)으로 희석된 50㎕의 무세포 추출액을 함께 혼합하고, 상기 혼합물을 광유로 오 버레이(overlay)하였다. 60분동안 98℃에서 인큐베이션한 후, 상기 혼합물을 원심분리하여 수층을 회수하였다. 10㎕의 반응 혼합물, 90㎕의 물, 100㎕의 카보네이트 시아나이드 용액 및 100㎕의 0.05% 포타슘 페리시아나이드 수용액을 함께 혼합하고 비등수(boiling water)에서 15분동안 반응시켰다. 5.3g의 탄산나트륨 및 0.65g의 포타슘 시아나이드를 1ℓ의 물에 용해시켜 카보네이트 시아나이드 용액을 제조하였다. 반응 혼합물을 500㎕의 철 알루미늄 용액과 혼합하였다. 1.5g의 철 알루미늄 및 1g의 소듐 라우릴 설페이트(SDS)를 1ℓ의 0.15N 황산에 용해시켜 철 알루미늄 용액을 제조하였다. 생성된 혼합물을 15분동안 실온에 방치하였다. 이어서, 690nm에서 흡광도를 측정하였다. 공지된 농도의 글루코오스를 사용하여 작성된 검출선(calibration curve)에 기초하여 환원 말단량을 글루코오스 환산량으로 구했다.
CMC-분해 활성 1 단위(U)는 상기 언급된 반응 시스템에서 1분동안에 1μmol의 글루코오스에 상당하는 환원력을 증가시키는 활성량으로 정의한다.
상기 기재된 바와 같이 측정된 각 무세포 추출액의 CMC-분해 활성도를 표 1에 나타낸다. 표 1은 상기 기재된 바와 같이 제조된 무세포 추출액중에서 검출된, 98℃에서의 CMC-분해 활성도를 나타낸 표이다.
표 1.
플라스미드 CMC-분해 활성도(mU/㎖)
pECEL211 64
pET21d 0
표 1에 나타낸 바와 같이, pECEL211로 형질전환된 에쉐리히아 콜라이로부터 의 무세포 추출액중에서 CMC-분해 활성이 확실하게 검출된 반면, pET21d로 형질전환된 에쉐리히아 콜라이로부터의 무세포 추출액중에서는 CMC-분해 활성이 검출되지 않았다. 따라서, 피로코쿠스 호리코시 OT3 게놈중의 오픈 리딩 프레임 PH1171로부터 발현된 폴리펩티드가 최종 환원 생성물의 글루코오스 잔기를 신규하게 생성하는 ,셀룰로오스를 분해하는 활성을 갖는다는 것이 입증되었다.
(2)발현된 폴리펩티드의 셀룰로오스 가수분해 활성의 확인
시험에 앞서, 하기와 같이 발현된 폴리펩티드 용액을 제조하였다.
pECEL211을 포함하는 에쉐리히아 콜라이 BL21(DE3)을 50μg/㎖의 앰피실린을 함유하는 10㎖의 LB 배지에 접종하고 밤새도록 37℃에서 배양하였다. 배양액을 1ℓ의 동일한 배지내로 접종하고 2.5시간동안 37℃에서 배양하였다. 배양 용기를 얼음상에서 냉각시켰다. 최종 농도 0.1mM으로 IPTG를 상기에 가하였다. 상기 세포를 밤새도록 20℃에서 배양하였다. 세포를 원심분리하여 회수하고, 50㎖의 20mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0)중에 현탁시키고 초음파처리하였다. 원심분리에 의해 수득한 상층액을 10분동안 95℃에서 처리한 후 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 이와 같이 수득한, 원심분리된 상층액을 연속된 실험에서 발현된 폴리펩티드 용액으로 사용하였다.
발현된 폴리펩티드의 셀룰로오스 가수 분해 활성을 하기와 같이 확인하였다. 특히, 발현된 폴리펩티드 용액을 다양한 기질에 작용시켰다. 이어서, 생성물을 박층 크로마토그래피상에서 동정하였다.
첫번째로, 인산-팽윤된 셀룰로오스를 기질로서 사용하였다. 인산-팽윤된 셀 룰로오스를 하기와 같이 제조하였다.
2g의 Avicel SF(Asahi Kasei)를 50㎖의 얼음 냉각 85% 인산에 서서히 가하였다. Avicel SF을 용해시키기 위해 가끔씩 초음파처리하면서 혼합물을 얼음상에서 교반하였다. 용액을 1.5ℓ의 빙수에 부었다. 셀룰로오스 겔을 원심분리에 의해 회수하였다. 셀룰로오스 겔을 물중에서 6회 세척하여 인산을 제거하고 40㎖의 0.1M 소듐 시트레이트 완충액(pH 5.0)중에 현탁시키고 연속된 실험에서 인산-팽윤 셀룰로오스로 사용하였다.
75㎕의 발현된 폴리펩티드 용액을 75㎕의 인산-팽윤 셀룰로오스에 가하였다. 혼합물을 8시간동안 98℃에서 반응시켰다. 60㎕의 아세토니트릴을 동일한 양의 혼합물에 가하고 혼합하였다. 원심분리에 의해 수득한 상층액을 감압하에서 증발 건조시켰다. 잔류물을 10㎕의 물에 용해시켰다. 2㎕의 용액을 실리카겔 박층 크로마토그래피시켰다. 전개용 박층 플레이트로서 실리카겔 60F254(Merck)를 사용하고 전개 용매로서 에탄올:부탄올:물=5:5:1을 사용하여 전개를 2회 실시하였다. 전개 후 오르시놀-황산 시약을 박층 플레이트에 분사시키고 스팟을 관찰하기 위해 고온의 플레이트를 사용하여 상기 플레이트를 가열하였다. 400mg의 오르시놀(Sigma)을 22.8㎖의 황산중에 용해시키고 총 부피가 200㎖가 되로록 거기에 물을 가하여 오르시놀-황산 시약을 제조하였다.
결과, 셀로비오스의 생성이 입증되었다.
두번째로, 다양한 올리고당을 기질로서 사용하였다.
셀로비오스(Sigma), 셀로트리오스, 셀로테트라오스 또는 셀로펜타오스(3개의 후자의 것은 Seikagaku Corporation으로부터 구입)를 1%(w/v) 농도로 0.1M MES-NaOH 완충액(pH 6.0)에 용해시켜 올리고당 용액을 제조하였다. 25㎕의 각 올리고당 용액을 MES 완충액을 사용하여 10-, 50- 또는 250배로 희석된 25㎕의 발현된 폴리펩티드 희석액에 가하였다. 상기 혼합물을 20분동안 98℃에서 반응시켰다. 대조군으로서, 희석된 발현된 폴리펩티드 용액 또는 올리고당 용액을 대신하여 MES 완충액이 첨가된 혼합물을 동시에 반응시켰다. 기질로서 인산-팽윤된 셀룰로오스를 사용한 경우, 반응 후 원심분리에 의해 수득된 1㎕의 상층액을 상기 기재된 바와 같이 실리카겔 박층 크로마토그래피시켰다. 기질로서 셀로비오스, 셀로트리오스 또는 셀로테트라오스를 사용한 경우, 전개를 2회 실시하였다. 기질로서 셀로펜타오스를 사용하는 경우, 전개를 3회 실시하였다.
기질로서 셀로비오스, 셀로트리오스, 셀로테트라오스 및 셀로펜타오스에 대한 스팟을 발현된 폴리펩티드 용액을 가하지 않은 반응에 대하여 검출하였다. 기질이 첨가되지 않았을 때 스팟은 검출되지 않았다. 발현된 폴리펩티드 용액 및 기질들 중 하나를 첨가하고 반응을 수행시켰을 때, 셀로비오스를 제외한 각 올리고당으로부터 완전한 기질에 대한 것보다 더욱 큰 Rf 값을 갖는 스팟을 생성하는 물질이 생성되었다. 첨가되는 발현된 폴리펩티드의 양에 따라 물질의 양이 증가되었다.
발현된 폴리펩티드의 희석율이 10이고 반응 시간이 2시간임을 제외하고, 기질로서 올리고당을 사용하여 상기 기재된 바와 같이 반응을 수행하였다. 반응 혼합물을 원심분리하여 수득된 상층액을 상기 기재된 바와 같이 실리카겔 박층 크로마토그래피에 의해 분석하였다.
그 결과, 셀로비오스외의 기질은 거의 완전히 소멸되었다. 셀로트리오스 및 셀로테트라오스는 셀로비오스를 생성하였다. 셀로펜타오스는 셀로트리오스 및 셀로비오스를 생성하였다. 기질로서 각각의 올리고당에 대하여 주 분해 산물은 셀로비오스였다.
이 결과로서 피로코쿠스 호리카시 OT3 게놈중의 오픈 리딩 프레임 PH1171로부터 발현된 폴리펩티드가 셀로비오하이드로라아제 활성을 갖는다는 것을 증명한다.
실시예 3
본 발명의 폴리펩티드의 셀로비오하이드로라아제 활성의 물리 및 화학적 특성
실시예 2-(2)에서 제조된 본 발명의 폴리펩티드 용액을 이 실시예에서 사용하였다. 셀로비오하이드로라아제 활성을 하기 활성들로서 측정하였다: 1)Park 및 Johnson 방법에 따라, 기질로서 CMC를 사용하여 생성된 셀로비오스의 양을 환원당의 양으로 하여 측정된 CMC-분해 활성; 2)기질로서 pNPC를 사용하여 생성된 셀로비오스의 양을 p-니트로페놀의 양으로 하여 측정된 p-니트로페닐-β-D-셀로비오시드 (pNPC)-분해 활성; 3)기질로서 4-MUC를 사용하여 생성된 셀로비오스의 양을 4-메틸움베릴페론(4-MU)의 양으로 하여 측정한 4-메틸움벨리페릴-β-D-셀로비오사이드(pN PC)-분해 활성.
(1)반응 pH와의 의존 관계
하기 완충액들을 제조하였다. pH 2.8, 3.8, 4.9 또는 6.0의 0.2M의 소듐 시 트레이트 완충액, pH 4.6, 5.5 또는 6.5의 MES-NaOH 완충액, 5.6, 6.6 또는 7.7의 0.2M의 트리스-NaOH 완충액 및 pH 7.7, 8.7 또는 9.8의 0.2M의 글리신-NaOH 완충액. pH를 80℃에서 측정하였다.
본 발명의 폴리펩티드 용액을 물로 50배 희석시킨 50㎕의 희석액, 25㎕의 2% CMC 수용액 및 25㎕의 상기 언급된 완충액 중 하나를 함께 혼합하였다. 혼합물을 20분동안 98℃에서 반응시켰다. 반응 혼합물을 원심분리하여 수득한 상층액중에 포함된 환원당의 양을 Park 및 Johnson 방법에 따라 측정하고, CMC-분해 활성도를 계산하였다.
결과를 도 1에 나타낸다. 도 1은 반응 pH 및 CMC-분해 활성과의 관계를 설명한다. 가로축은 pH 및 세로축은 CMC-분해 활성도(상대값 %)를 나타낸다. 흰 동그라미 표시(○), 검은 동그라미 표시(●), 흰 네모 표지(□) 및 검은 네모 표시(■)는 각각, 소듐 시트레이트 완충액, MES-NaOH 완충액, 트리스-HCl 완충액 및 글리신-NaOH 완충액을 나타낸다.
본 발명의 폴리펩티드는 pH 4.9 내지 6.5에서 최고 활성도를 나타내었다.
(2)반응 온도와의 의존 관계
0.1M MES-NaOH 완충액(pH 6.0)중의 50㎕의 1% CMC 용액을 0.1M MES-NaOH 완충액(pH 6.0)으로 희석된 50㎕의 본 발명의 폴리펩티드 용액의 희석액에 가하였다. 혼합물을 20분동안 37, 65, 98, 108 또는 113℃에서 반응시켰다. Park 및 Johnson 방법에 따라 생성된 환원당의 양을 측정하고 CMC-분해 활성도를 측정하였다.
결과를 도 2에 나타낸다. 도 2는 반응 온도 및 본 발명의 폴리펩티드의 CMC- 분해 활성과의 관계를 설명한다.가로축은 온도(℃)를, 세로축은 CMC-분해 활성도(상대적인 값, %)를 나타낸다.
본 발명의 폴리펩티드는 108℃에서 최대 CMC-분해 활성도를 보였고, 90℃에서는 최대 CMC-분해 활성도의 약 80% 및 80℃에서는 최대 CMC-분해 활성도의 약 60%를 보였다.
(3)염농도의 효과
본 발명의 폴리펩티드 용액을 물 또는 1, 2, 3, 4 또는 5M NaCl을 사용하여 50배로 희석시켰다. 0.1M MES-NaOH 완충액(pH 6.0)중의 50㎕의 1% CMC 용액을 본 발명의 폴리펩티드 용액의 50㎕의 희석액 중 어느 하나에 가하였다. 혼합물을 20분동안 98℃에서 반응시켰다. 생성된 환원당의 양을 Park 및 Johnson 방법에 따라 측정하고 CMC-분해 활성도를 측정하였다.
결과를 도 3에 나타낸다. 도 3은 NaCl 농도 및 본 발명의 폴리펩티드의 CMC-분해 활성과의 관계를 설명한다.가로축은 NaCl 농도(M)를, 세로축은 CMC-분해 활성도(상대적인 값, %)을 나타낸다.
본 발명의 폴리펩티드는 0.5 내지 0.6M NaCl의 존재에서 최대 CMC-분해 활성을 보였다.
(4)pH 안정성
25㎕의 본 발명의 폴리펩티드 용액 및 실시예 3-(1)에서 제조된 25㎕의 완충액 중 하나를 함께 혼합하였다. 혼합물을 10분동안 95℃에서 가열하였다. 0.1M의 MES-NaOH 완충액(pH 6.0)중의 50㎕의 1% CMC용액을, 물을 사용하여 50배로 희석된 50㎕의 가열된 혼합물의 희석액에 가하였다. 혼합물을 20분동안 98℃에서 반응시켰다. 반응 혼합물을 원심분리하여 수득한 상층액중에 포함된 환원당의 양을 Park 및 Johnson 방법에 따라 측정하고, CMC-분해 활성도를 계산하였다.
결과를 도 4에 나타낸다. 도 4는, 폴리펩티드를 10분동안 95℃에서 가열하였을 때, pH 및 유지되는 CMC-분해 활성과의 관계를 설명한다.가로축은 가열시 pH를, 세로축은 유지되는 CMC-분해 활성도(U/㎖)를 나타낸다. 흰 동그라미 표시(○), 검은 동그라미 표시(●), 흰 네모 표지(□) 및 검은 네모 표시(■)는 각각, 소듐 시트레이트 완충액, MES-NaOH 완충액, 트리스-HCl 완충액 및 글리신-NaOH 완충액을 나타낸다.
본 발명의 폴리펩티드의 CMC-분해 활성은 pH 5 내지 7에서 최대 안정성을 보였다.
(5)열 안정성
CMC를 0.1M MES-NaOH 완충액(pH 6.0)중에 용해시켜 1% CMC 용액(pH 6.0)을 제조하였다. 50㎕의 MES 완충액을 50㎕의 본 발명의 폴리펩티드 용액에 가하였다. 혼합물을 0, 1, 5 또는 24시간동안 95℃에서 가열시켰다. 가열된 혼합물을 원심분리하여 수득한 상층액을 MES 완충액으로 50-, 200- 또는 500배 희석시킨 50㎕의 희석액에 50㎕의 1% CMC 용액을 가하였다. 혼합물을 20분동안 98℃에서 반응시켰다. 반응 혼합물중에 포함된 생성된 환원당의 양을 Park 및 Johnson 방법에 따라 측정하고 CMC-분해 활성도를 측정하였다.
결과를 도 5에 나타낸다. 도 5는 열처리 시간 및 가열후의 유지되는 활성과 의 관계를 설명한다.가로축은 열처리 시간(시간)을, 세로축은 가열후의 유지되는 활성도(%)을 나타낸다.
본 발명의 폴리펩티드은 24시간동안 95℃에서 가열한 후, 약 90%의 CMC-분해 활성을 유지하였다.
(6)합성 기질에 대한 분해 활성
0.1M MES-NaOH 완충액(pH 6.0)중의 50㎕의 10mM pNPC 용액을 50㎕의 본 발명의 폴리펩티드 용액 또는 0.1M의 MES-NaOH 완충액(pH 6.0)을 사용하여 2-, 5-, 10- 또는 20배로 희석된 그의 희석액에 가하였다. 혼합물을 20분동안 98℃에서 가열시켰다. 405nm에서 원심분리에 의해 수득한 상층액의 흡광도를 측정하고 해리된 p-니트로페놀(pNP)의 양에 기초하여 pNPC-분해 활성도를 측정하였다.
결과를 도 6에 나타낸다. 도 6은 본 발명의 폴리펩티드 용액의 희석율 및 각 희석액의 pNPC-분해 활성을 설명한다.가로축은 희석율의 역수를, 세로축은 pNPC-분해 활성도(mU/㎖)를 나타낸다.
pNPC-분해 활성은 본 발명의 폴리펩티드 용액의 농도에 따라 증가하였다.
(7)글루코오스 및 셀로비오스에 의한 억제
0,10, 20, 50, 100 또는 200mM의 글루코오스 또는 0, 5, 10, 25 또는 50mM의 셀로비오스, 0.4, 0.8, 1.2 또는 1.6mM pNPC 및 본 발명의 폴리펩티드 용액을 포함하는 50mM MES-NaOH 완충액(pH 6.0)을 20분동안 98℃에서 가열하고 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 405nm에서의 흡광도의 역수(가로축)를 글루코오스 또는 셀로비오스의 농도(세로축)에 대하여 플라팅(plot)하였다. 각 pNPC 농도에 대한 점을 연결 하여 얻는 라인의 교차점을 정하였다. 억제 상수 Ki은 가로축상의 교점 값의 플러스 또는 마이너스 사인을 반대로 하여 측정하였다.
글루코오스에 의한 본 발명의 폴리펩티드의 pNPC-분해 활성 억제는 거의 없었기 때문에, Ki를 계산하는 것은 불가능하였다. 한편, 셀로비오스에 대한 Ki는 212mM이었다.
(8)다양한 시약의 효과
0, 0.5, 1, 2 또는 10mM의 CoCl2, CuCl2, CaCl2, FeCl3, ZnCl 2, MgCl2, 디티오트레이톨(DTT) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 5mM p-니트로페닐-β-D-셀로비오시드(pNPC, sigma) 및 본 발명의 폴리펩티드 용액을 포함하는 50mM의 MES-NaOH 완충액(pH 6.0)을 20분동안 98℃에서 반응시키고 405nm에서 흡광도를 측정하였다. p-니크로페놀(pNP) 농도 및 405nm에서의 흡광도와의 관계를 나타내는 검출선을 사용하여 pNPC-분해 활성도를 계산하였다. 본 발명의 폴리펩티드의 pNPC-분해 활성의 1단위(U)를 1분동안 상기 언급된 반응 혼합물중에 1μmol의 pNP를 해리시키는 양으로 정의한다.
결과를 도 7에 나타낸다. 도 7은 다양한 시약 및 pNPC-분해 활성과의 관계를 설명한다.가로축은 시약의 농도(mM) 및 세로축은 pNPC-분해 활성도(상대적인 값, %)를 나타낸다. 흰 동그라미 표시(○), 검은 동그라미 표시(●), 흰 네모 표지(□), 검은 네모 표시(■), 흰 세포(△), 검은 세모(▲), 흰 다이아몬드(◇) 및 검은 다이아몬드(◆)는 각각, CoCl2, CuCl2, CaCl2, FeCl3, ZnCl2, MgCl2, DTT 및 EDTA에 대한 결과를 나타낸다.
본 발명의 폴리펩티드의 pNPC-분해 활성은 DTT에 의해서는 억제되지 않았다. 활성의 약 90%는 0.5mM의 Cu+2, Fe+3 또는 Zn+2에 의해 억제되었다. 활성의 약 50%는 1mM의 Co+2, Ca+2, Mg+2 또는 EDTA에 의해 억제되었다
(9)본 발명의 폴리펩티드의 정제
20분동안 75℃에서 열처리한 것을 제외하고 실시예 2-(2)에 기재된 바와 같이, 발현된 폴리펩티드 용액을 제조하였다.
가열된 상층액을 원심분리하여 수득한 상층액을 HiTrap Q 칼럼(Pharmacia)을 사용하여 음이온 교환 크로마토그래피시켰다. 상기 샘플을 일렬로 연결된 2개의 5㎖의 HiTrap Q 칼럼에 사용하였다. 50mM MES-NaOH 완충액(pH 6.0) 내지 200mM NaCl을 함유하는 동일한 완충액에서 2㎖/분의 유속으로 20분동안 직선구배를 사용하여 용리시켰다. 100mM의 MES-NaOH 완충액(pH 6.0)중의 50㎕의 6mM 4-MUC 용액을 각 분획의 50㎕의 일련의 희석액중 하나에 가하였다. 혼합물을 20분동안 98℃에서 반응시켰다. 355nm의 여기 파장 및 460nm의 방출 파장에서 형광도 값을 측정하였다. 해리된 4-MU의 양에 기초하여, 4-MU-분해 활성도를 계산하였다.
음이온 교환 칼럼 크로마토그래피로부터의 활성 분획을 하이트랩 페닐 세파로스 6 패스트 플로우(HiTrap Phenyl Sepharose 6 Fast Flow)(로우 섭(low sub))(Pharmacia)을 사용하여 소수성 칼럼 크로마토그래피하였다. 포화된 황산암모늄을 20% 포화시까지 음이온 교환 칼럼 크로마토그래피로부터의 활성 분획에 가하 였다. 혼합물을 20% 포화 황산암모늄으로 평형화된 소수성 칼럼(부피 1㎖)에 이용하였다. 20% 포화된 황산암모늄을 포함하는 MES 완충액 내지 황산암모늄을 포함하지 않는 MES 완충액에서 1㎖/분의 유속으로 15분동안 직선구배를 사용하여 용리시켰다. 4-MUC-분해 활성을 약 0% 포화된 황산암모늄을 사용하여 용리된 분획중에서 검출하였다.
(10)특이 활성 측정
소수성 칼럼 크로마토그래피로부터의 2㎖의 활성 분획을 한외여과에 의해 염을 제거하고, 동결건조한 후, 3시간동안 135℃에서 기체상 HCl의 존재에서 가수분해하였다. 가수분해산물을 100㎕의 물에 용해시켰다. 아미노산 분석기(L-8500, Hitachi)를 사용하여 50㎕의 용액을 분석함으로써 분석된 샘플이 3.61μg의 단백질을 포함함을 밝혀냈다. 60mU의 4-MUC-분해 활성에 상응하는 폴리펩티드를 아미노산 분석하였다. 따라서, 특이 활성은 17.0 U/mg로 측정되었다. 상기와 같이 수득한 정제된 폴리펩티드는 실시예 3에서 측정된 것과 유사한 물리적 및 화학적 특성을 나타내었다.
(11)N-말단 아미노산 서열 분석
실시예 3-(9)에서 제조된 정제된 폴리펩티드를 통상의 방법에 따라 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동시켰다. 전기영동 후, 겔을 10mM DTT를 포함하는 100mM 숙신산 완충액(pH 5.8)중에서 세척한 후 1시간동안 60℃에서 1mM 4-MUC를 포함하는 100mM 숙신산 완충액(pH 5.8)중에서 반응시켰다. 겔에 340nm에서 자외선을 조사하였을 때, 형광 밴드를 관찰하였다.
반건조 블랏팅 방법(semidry blotting method)에 따라 겔에 포함된 단백질을 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 막에 이전시켰다. 막을 쿠사시에 브릴란트 블루(Coomasse Brilliant Blue(CBB))로 염색하였다. PVDF 막의 일부를 절단하였다. 상기 부분은 4-MUC-분해 활성을 나타내고 CBB로 염색된 밴드와 일치하였다. 펩티드 서열기를 사용하여 N-말단 아미노산 서열을 분석하였다.
N-말단에 6개의 아미노산 잔기의 서열은 Glu-Asn-Thr-Thr-Tyr-Gln이었다. 따라서, N-말단의 28개의 아미노산 잔기가 에쉐리히아 콜라이에서 발현된 본 발명의 폴리펩티드로부터 제거되었음이 증명되었다.
실시예 4
바실러스 섭틸러스를 사용한 본 발명의 폴리펩티드의 제조
(1)바실러스 섭틸러스에 대한 발현 벡타의 작제
WO 97/21823에 기재된 바와 같이 플라스미드 pNAPS1을 작제하고, HindIII(Takara Shuzo)로 분해하고, 아가로스 겔 전기영동시켰다. 바실러스 섭틸러스에 대한 복제 기점(replicaiton origin), 섭틸리신 유전자에 대한 프로모터 및 섭틸리신에 대한 분비 시그날을 코딩하는 서열을 포함하는 약 4.5kb의 DNA 단편을 통상의 방법으로 아가로스 겔로부터 추출하고 정제하였다. pUC119(Takara Shuzo)를 HindIII로 분해하고 알칼린성 포스포타아제로 탈인산화하였다. 이들 DNA 단편들을 DNA 리가아제로 결찰시켰다. 에쉐리히아 콜라이의 형질전환, 형질전환체의 배양 및 플라스미드의 추출 및 정제를 통상의 방법으로 수행하였다. pUC119중 lac 프로모터 및 섭틸러신 유전자에 대한 프로모터가 반대 방향으로 위치한 4.5kb의 DNA 단편이 삽입된 플라스미드를 상기와 같이 수득한 플라스미드로부터 선별하고 pUC119-BV로 표시하였다.
실시예 1에서 작제된 pECEL101을 BamHI로 분해시키고 아가로스 겔 전기영동시켰다. 오픈 리딩 프레임 PH1171중 19번 위치의 류신 잔기 내지 말단 코돈을 코딩하는 약 1.5kb의 DNA 단편을 통상의 방법으로 아가로스 겔로부터 추출하고 정제하였다. 상기 기재된 바와 같이 수득한 pUC119-BV를 BamHI로 분해하고 아가로스 겔 전기영동시켰다. 바실러스 섭틸러스 에 대한 복제 기점 등을 포함하는 약 4.5kb의 DNA 단편을 통상의 방법으로 아가로스 겔로부터 추출하고 정제하였다. 이들 DNA 단편들을 DNA 리가아제를 사용하여 결찰시켰다. 바실러스 섭틸러스 DB104의 형질전환, 형질전환체의 배양 및 플라스미드의 추출 및 정제를 통상의 방법으로 수행하였다.
오픈 리딩 프레임 PH1171이 벡타중 섭틸리신 유전자에 대한 프로모터의 것과 동일한 방향으로 삽입된 플라스미드를 상기와 같이 수득된 플라스미드로부터 선별하고 pNCEL101로 표시하였다. 플라스미드 pNECL101은 바실러스 섭틸러스에서 구성상 작동하는 섭틸러신에 대한 프로모터로부터 하류에 융합 폴리펩티드를 코딩한다. 융합 단백질에서, N-말단에 29개의 아미노산 잔기로 구성된 섭틸리신에 대한 분비 시그날 잔기를 포함하는 벡터로부터 유래된 31개의 아미노산 잔기의 리더 서열을 위치 19번에 류신 잔기로부터 출발하는 PH1171과 연결시킨다. 상기 플라스미드를 선별하는 동안, 벡타에서 섭틸러스 유전자에 대한 프로모터와 반대 방향으로 오픈 리딩 프레임 PH1171이 삽입된 플라스미드 및 벡타의 자가-결찰로부터 생성된 플라 스미드를 수득하고, 각각 pNCEL001 및 pNBV로 표시하였다. 이들 플라스미드를 발현 시험을 위한 대조군 벡타로 사용하였다.
(2)본 발명의 폴리펩티드의 발현
상기 기재된 바와 같이 수득한 pNCEL101, pNCEL001 또는 pNBV으로 형질전환된 바실러스 섭틸러스 DB104를 10μg/㎖의 카나마이신을 포함하는 LB 배지에 접종시키고 밤새도록 37℃에서 호기하에서 배양하였다. 배양액중의 CMC-분해 활성을 무세포 추출액 대신 생성된 배양액을 사용하여 실시예 2-(1)에 기재된 바와 같이 측정하였다.
특히, 50㎕의 바실러스 섭틸러스 형질전환체의 배양액중 하나 및 100mM의 소듐 시트레이트 완충액(pH 5.0)중의 50㎕의 1% CMC 용액을 함께 혼합하고, 혼합물을 광유로 오버레이하였다. 60분동안 98℃에서 인큐베이션한 후, 상층액을 회수하기 위해 혼합물을 원심분리하였다. 실시예 2-(1)에 기재된 바와 같이 Park 및 Johnson 방법에 따라 반응 혼합물의 환원력을 측정하였다. pNCEL101으로 형질전환된 바실러스 섭틸러스 DB104의 배양액이 사용된 반응 혼합물이 자가-결찰된(self-ligated) 벡타로부터 생성된 플라스미드 pNBV로 형질전환된 DB104의 배양액이 사용된 반응 혼합물(대조군)의 것보다 분명히 더욱 높은 환원력을 보였다. 대조군에 대한 값을 감하고 상응하는 글루코오스의 양으로 전환시킨 환원력에 기초하여 계산한 CMC-분해 활성도는 0.63mU/㎖ 배양액이었다. PH1171이 반대 방향으로 삽입된 플라스미드 pNCEL001에 대하여, pNBV에 대한 것과 유일하게 일치하는 환원력이 관찰되었다.
실시예 5
본 발명의 폴리펩티드를 사용하는 종이의 분해
25mg의 Kimwipe(Crecia)를 약 1mm의 사각형 모양의 조각으로 절단하였다. 480㎕의 50mM MES-NaOH(pH 6.0) 및 20㎕의 동일한 완충액 또는 실시예 2-(1)에서 제조된 pECEL211로 형질전환된 에쉐리히아 콜라이로부터의 무세포 추출액을 그에 가하였다. 혼합물을 66시간동안 95℃에서 반응시켰다. 100㎕의 아세토니트릴을 원심분리에 의해 수득한 50㎕의 상층액에 가하였다. 상층액을 감압하에 증발시켜 건조시켰다. 잔류물을 10㎕의 50% 아세토니트릴 수용액중에 재용해시켰다. 1㎕의 용액을 실시예 2-(2)에 기재된 바와 같이 실리카겔 박층 크로마토그래피시켰다.
결과, 셀로비오스에 대한 것과 동일한 Rf 값을 갖는 스팟은 pECEL211로 형질전환된 에스케리아 콜라이로부터의 무세포 추출액이 첨가된 샘플에 대해서만 관찰되었다.
산업상 이용가능성
본 발명은 셀로비오하이드로라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 폴리펩티드는 높은 내열성을 갖고 효과적으로 셀룰로오스를 분해할 수 있다. 극도의 고온균으로부터 유래된 엔도글루코오스, 엑소-1,4-β-D-글루코시다아제 및 β-D-글루코시다아제와 함께 본 발명의 폴리펩티드를 사용하여 셀룰로오스로부터 글루코오스를 효과적으로 제조할 수 있기 때문에, 셀룰로오스형 바이오매스의 이용을 촉진시킨다.
서열 목록 프리 텍스트
SEQ ID NO:3: 오픈 리딩 프레임 PH1171을 포함하는 1.6kb DNA 단편을 증폭시키기 위해 작제된, 명칭 1171FN의 올리고뉴클레오타이드 프라이머
SEQ ID NO:4: 오픈 리딩 프레임 PH1171을 포함하는 1.6kb DNA 단편을 증폭시키기 위해 작제된, 명칭 1171RA의 올리고뉴클레오타이드 프라이머
<110> Takara Shuzo Co., Ltd. <120> Polypeptide <130> 661630 <150> JP 10-366237 <151> 1998-12-24 <160> 6 <210> 1 <211> 430 <212> PRT <213> Pyrococcus horikoshii OT3 <400> 1 Glu Asn Thr Thr Tyr Gln Thr Pro Thr Gly Ile Tyr Tyr Glu Val 1 5 10 15 Arg Gly Asp Thr Ile Tyr Met Ile Asn Val Thr Ser Gly Glu Glu 20 25 30 Thr Pro Ile His Leu Phe Gly Val Asn Trp Phe Gly Phe Glu Thr 35 40 45 Pro Asn His Val Val His Gly Leu Trp Lys Arg Asn Trp Glu Asp 50 55 60 Met Leu Leu Gln Ile Lys Ser Leu Gly Phe Asn Ala Ile Arg Leu 65 70 75 Pro Phe Cys Thr Glu Ser Val Lys Pro Gly Thr Gln Pro Ile Gly 80 85 90 Ile Asp Tyr Ser Lys Asn Pro Asp Leu Arg Gly Leu Asp Ser Leu 95 100 105 Gln Ile Met Glu Lys Ile Ile Lys Lys Ala Gly Asp Leu Gly Ile 110 115 120 Phe Val Leu Leu Asp Tyr His Arg Ile Gly Cys Thr His Ile Glu 125 130 135 Pro Leu Trp Tyr Thr Glu Asp Phe Ser Glu Glu Asp Phe Ile Asn 140 145 150 Thr Trp Ile Glu Val Ala Lys Arg Phe Gly Lys Tyr Trp Asn Val 155 160 165 Ile Gly Ala Asp Leu Lys Asn Glu Pro His Ser Val Thr Ser Pro 170 175 180 Pro Ala Ala Tyr Thr Asp Gly Thr Gly Ala Thr Trp Gly Met Gly 185 190 195 Asn Pro Ala Thr Asp Trp Asn Leu Ala Ala Glu Arg Ile Gly Lys 200 205 210 Ala Ile Leu Lys Val Ala Pro His Trp Leu Ile Phe Val Glu Gly 215 220 225 Thr Gln Phe Thr Asn Pro Lys Thr Asp Ser Ser Tyr Lys Trp Gly 230 235 240 Tyr Asn Ala Trp Trp Gly Gly Asn Leu Met Ala Val Lys Asp Tyr 245 250 255 Pro Val Asn Leu Pro Arg Asn Lys Leu Val Tyr Ser Pro His Val 260 265 270 Tyr Gly Pro Asp Val Tyr Asn Gln Pro Tyr Phe Gly Pro Ala Lys 275 280 285 Gly Phe Pro Asp Asn Leu Pro Asp Ile Trp Tyr His His Phe Gly 290 295 300 Tyr Val Lys Leu Glu Leu Gly Tyr Ser Val Val Ile Gly Glu Phe 305 310 315 Gly Gly Lys Tyr Gly His Gly Gly Asp Pro Arg Asp Val Ile Trp 320 325 330 Gln Asn Lys Leu Val Asp Trp Met Ile Glu Asn Lys Phe Cys Asp 335 340 345 Phe Phe Tyr Trp Ser Trp Asn Pro Asp Ser Gly Asp Thr Gly Gly 350 355 360 Ile Leu Gln Asp Asp Trp Thr Thr Ile Trp Glu Asp Lys Tyr Asn 365 370 375 Asn Leu Lys Arg Leu Met Asp Ser Cys Ser Lys Ser Ser Ser Ser 380 385 390 Thr Gln Ser Val Ile Arg Ser Thr Thr Pro Thr Lys Ser Asn Thr 395 400 405 Ser Lys Lys Ile Cys Gly Pro Ala Ile Leu Ile Ile Leu Ala Val 410 415 420 Phe Ser Leu Leu Leu Arg Arg Ala Pro Arg 425 430 <210> 2 <211> 1293 <212> DNA <213> Pyrococcus horikoshii OT3 <400> 2 GAAAATACAA CATATCAAAC ACCGACTGGA ATTTACTACG AGTGAGAGG AGATACGATA 60 TACATGATTA ATGTCACCAG TGGAGAGGAA ACTCCCATTC ATCTCTTTGG TGTAAACTGG 120 TTTGGCTTTG AAACACCTAA TCATGTAGTG CACGGACTTT GGAAGAGAAA CTGGGAAGAC 180 ATGCTTCTTC AGATCAAAAG CTTAGGCTTC AATGCAATAA GACTTCCTTT CTGTACTGAG 240 TCTGTAAAAC CAGGAACACA ACCAATTGGA ATAGATTACA GTAAAAATCC AGATCTTCGT 300 GGACTAGATA GCCTACAGAT TATGGAAAAG ATCATAAAGA AGGCCGGAGA TCTTGGTATC 360 TTTGTCTTAC TCGACTATCA TAGGATAGGA TGCACTCACA TAGAACCCCT CTGGTACACG 420 GAAGACTTCT CAGAGGAAGA CTTTATTAAC ACATGGATAG AGGTTGCCAA AAGGTTCGGT 480 AAGTACTGGA ACGTAATAGG GGCTGATCTA AAGAATGAGC CTCATAGTGT TACCTCACCC 540 CCAGCTGCTT ATACAGATGG TACCGGGGCT ACATGGGGTA TGGGAAACCC TGCAACCGAT 600 TGGAACTTGG CGGCTGAGAG GATAGGAAAA GCGATTCTGA AGGTTGCCCC TCATTGGTTG 660 ATATTCGTGG AGGGGACACA ATTTACTAAT CCGAAGACTG ACAGTAGTTA CAAATGGGGC 720 TACAACGCTT GGTGGGGAGG AAATCTAATG GCCGTAAAGG ATTATCCAGT TAACTTACCT 780 AGGAATAAGC TAGTATACAG CCCTCACGTA TATGGGCCAG ATGTCTATAA TCAACCGTAC 840 TTTGGTCCCG CTAAGGGTTT TCCGGATAAT CTTCCAGATA TCTGGTATCA CCACTTTGGA 900 TACGTAAAAT TAGAACTAGG ATATTCAGTT GTAATAGGAG AGTTTGGAGG AAAATATGGG 960 CATGGAGGCG ATCCAAGGGA TGTTATATGG CAAAATAAGC TAGTTGATTG GATGATAGAG 1020 AATAAATTTT GTGATTTCTT TTACTGGAGC TGGAATCCAG ATAGTGGAGA TACCGGAGGG 1080 ATTCTACAGG ATGATTGGAC AACAATATGG GAAGATAAGT ATAATAACCT GAAGAGATTG 1140 ATGGATAGTT GTTCCAAAAG TTCTTCAAGT ACTCAATCCG TTATTCGGAG TACCACCCCT 1200 ACAAAGTCAA ATACAAGTAA GAAGATTTGT GGACCAGCAA TTCTTATCAT CCTAGCAGTA 1260 TTCTCTCTTC TCTTAAGAAG GGCTCCCAGG TAG 1293 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as 1171FN to amplify a 1.6- kb DNA fragment containing the open reading frame PH1171. <400> 3 CGGCCATGGA GGGGAATACT ATTCT 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed oligonucleotide primer designated as 1171RA to amplify a 1.6- kb DNA fragment containing the open reading frame PH1171. <400> 4 AGAAATTTTC CATAAAAGGG GTCGC 25 <210> 5 <211> 458 <212> PRT <213> Pyrococcus horikoshii OT3 <400> 5 Met Glu Gly Asn Thr Ile Leu Lys Ile Val Leu Ile Cys Thr Ile 1 5 10 15 Leu Ala Gly Leu Phe Gly Gln Val Val Pro Val Tyr Ala Glu Asn 20 25 30 Thr Thr Tyr Gln Thr Pro Thr Gly Ile Tyr Tyr Glu Val Arg Gly 35 40 45 Asp Thr Ile Tyr Met Ile Asn Val Thr Ser Gly Glu Glu Thr Pro 50 55 60 Ile His Leu Phe Gly Val Asn Trp Phe Gly Phe Glu Thr Pro Asn 65 70 75 His Val Val His Gly Leu Trp Lys Arg Asn Trp Glu Asp Met Leu 80 85 90 Leu Gln Ile Lys Ser Leu Gly Phe Asn Ala Ile Arg Leu Pro Phe 95 100 105 Cys Thr Glu Ser Val Lys Pro Gly Thr Gln Pro Ile Gly Ile Asp 110 115 120 Tyr Ser Lys Asn Pro Asp Leu Arg Gly Leu Asp Ser Leu Gln Ile 125 130 135 Met Glu Lys Ile Ile Lys Lys Ala Gly Asp Leu Gly Ile Phe Val 140 145 150 Leu Leu Asp Tyr His Arg Ile Gly Cys Thr His Ile Glu Pro Leu 155 160 165 Trp Tyr Thr Glu Asp Phe Ser Glu Glu Asp Phe Ile Asn Thr Trp 170 175 180 Ile Glu Val Ala Lys Arg Phe Gly Lys Tyr Trp Asn Val Ile Gly 185 190 195 Ala Asp Leu Lys Asn Glu Pro His Ser Val Thr Ser Pro Pro Ala 200 205 210 Ala Tyr Thr Asp Gly Thr Gly Ala Thr Trp Gly Met Gly Asn Pro 215 220 225 Ala Thr Asp Trp Asn Leu Ala Ala Glu Arg Ile Gly Lys Ala Ile 230 235 240 Leu Lys Val Ala Pro His Trp Leu Ile Phe Val Glu Gly Thr Gln 245 250 255 Phe Thr Asn Pro Lys Thr Asp Ser Ser Tyr Lys Trp Gly Tyr Asn 260 265 270 Ala Trp Trp Gly Gly Asn Leu Met Ala Val Lys Asp Tyr Pro Val 275 280 285 Asn Leu Pro Arg Asn Lys Leu Val Tyr Ser Pro His Val Tyr Gly 290 295 300 Pro Asp Val Tyr Asn Gln Pro Tyr Phe Gly Pro Ala Lys Gly Phe 305 310 315 Pro Asp Asn Leu Pro Asp Ile Trp Tyr His His Phe Gly Tyr Val 320 325 330 Lys Leu Glu Leu Gly Tyr Ser Val Val Ile Gly Glu Phe Gly Gly 335 340 345 Lys Tyr Gly His Gly Gly Asp Pro Arg Asp Val Ile Trp Gln Asn 350 355 360 Lys Leu Val Asp Trp Met Ile Glu Asn Lys Phe Cys Asp Phe Phe 365 370 375 Tyr Trp Ser Trp Asn Pro Asp Ser Gly Asp Thr Gly Gly Ile Leu 380 385 390 Gln Asp Asp Trp Thr Thr Ile Trp Glu Asp Lys Tyr Asn Asn Leu 395 400 405 Lys Arg Leu Met Asp Ser Cys Ser Lys Ser Ser Ser Ser Thr Gln 410 415 420 Ser Val Ile Arg Ser Thr Thr Pro Thr Lys Ser Asn Thr Ser Lys 425 430 435 Lys Ile Cys Gly Pro Ala Ile Leu Ile Ile Leu Ala Val Phe Ser 440 445 450 Leu Leu Leu Arg Arg Ala Pro Arg 455 <210> 6 <211> 1377 <212> DNA <213> Pyrococcus horikoshii OT3 <400> 6 ATGGAGGGGA ATACTATTCT TAAAATCGTA CTAATTTGCA CTATTTTAGC AGGCCTATTC 60 GGGCAAGTCG TGCCAGTATA TGCAGAAAAT ACAACATATC AAACACCGAC TGGAATTTAC 120 TACGAAGTGA GAGGAGATAC GATATACATG ATTAATGTCA CCAGTGGAGA GGAAACTCCC 180 ATTCATCTCT TTGGTGTAAA CTGGTTTGGC TTTGAAACAC CTAATCATGT AGTGCACGGA 240 CTTTGGAAGA GAAACTGGGA AGACATGCTT CTTCAGATCA AAAGCTTAGG CTTCAATGCA 300 ATAAGACTTC CTTTCTGTAC TGAGTCTGTA AAACCAGGAA CACAACCAAT TGGAATAGAT 360 TACAGTAAAA ATCCAGATCT TCGTGGACTA GATAGCCTAC AGATTATGGA AAAGATCATA 420 AAGAAGGCCG GAGATCTTGG TATCTTTGTC TTACTCGACT ATCATAGGAT AGGATGCACT 480 CACATAGAAC CCCTCTGGTA CACGGAAGAC TTCTCAGAGG AAGACTTTAT TAACACATGG 540 ATAGAGGTTG CCAAAAGGTT CGGTAAGTAC TGGAACGTAA TAGGGGCTGA TCTAAAGAAT 600 GAGCCTCATA GTGTTACCTC ACCCCCAGCT GCTTATACAG ATGGTACCGG GGCTACATGG 660 GGTATGGGAA ACCCTGCAAC CGATTGGAAC TTGGCGGCTG AGAGGATAGG AAAAGCGATT 720 CTGAAGGTTG CCCCTCATTG GTTGATATTC GTGGAGGGGA CACAATTTAC TAATCCGAAG 780 ACTGACAGTA GTTACAAATG GGGCTACAAC GCTTGGTGGG GAGGAAATCT AATGGCCGTA 840 AAGGATTATC CAGTTAACTT ACCTAGGAAT AAGCTAGTAT ACAGCCCTCA CGTATATGGG 900 CCAGATGTCT ATAATCAACC GTACTTTGGT CCCGCTAAGG GTTTTCCGGA TAATCTTCCA 960 GATATCTGGT ATCACCACTT TGGATACGTA AAATTAGAAC TAGGATATTC AGTTGTAATA 1020GGAGAGTTTG GAGGAAAATA TGGGCATGGA GGCGATCCAA GGGATGTTAT ATGGCAAAAT 1080 AAGCTAGTTG ATTGGATGAT AGAGAATAAA TTTTGTGATT TCTTTTACTG GAGCTGGAAT 1140 CCAGATAGTG GAGATACCGG AGGGATTCTA CAGGATGATT GGACAACAAT ATGGGAAGAT 1200 AAGTATAATA ACCTGAAGAG ATTGATGGAT AGTTGTTCCA AAAGTTCTTC AAGTACTCAA 1260 TCCGTTATTC GGAGTACCAC CCCTACAAAG TCAAATACAA GTAAGAAGAT TTGTGGACCA 1320 GCAATTCTTA TCATCCTAGC AGTATTCTCT CTTCTCTTAA GAAGGGCTCC CAGGTAG 1377 4/8

Claims (13)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 β-1,4 결합을 통해 결합된 D-글루코피라노오스의 폴리머에 작용시켜 셀로비오스를 해리시키는 것을 포함하는, β-1,4 결합을 통해 결합된 D-글루코피라노오스의 폴리머로부터 셀로비오스를 생성하는 방법.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 활성 성분으로 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하는, β-1,4 결합을 통해 결합된 D-글루코피라노오스의 폴리머로부터 셀로비오스를 생성하기 위한 폴리펩티드 용액.
KR1020017007774A 1998-12-24 1999-12-14 폴리펩티드 KR100682599B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP366237/1998 1998-12-24
JP36623798 1998-12-24

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20010099842A KR20010099842A (ko) 2001-11-09
KR100682599B1 true KR100682599B1 (ko) 2007-02-15

Family

ID=18486274

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020017007774A KR100682599B1 (ko) 1998-12-24 1999-12-14 폴리펩티드

Country Status (7)

Country Link
US (1) US6566113B1 (ko)
EP (1) EP1142992A4 (ko)
JP (1) JP4199422B2 (ko)
KR (1) KR100682599B1 (ko)
CN (1) CN1203174C (ko)
AU (1) AU1685600A (ko)
WO (1) WO2000039288A1 (ko)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003210182A (ja) * 2001-11-14 2003-07-29 Rakuto Kasei Industrial Co Ltd 好熱性エンドグルカナーゼ
EP2305801B1 (en) * 2002-08-16 2017-07-05 Danisco US Inc. Novel variant hyprocrea jecorina CBH1 cellulases
CA2771875A1 (en) 2003-04-01 2005-01-06 Danisco Us Inc. Variant hypocrea jecorina cbh1
EP2404929B1 (en) 2003-07-02 2014-06-18 BP Corporation North America Inc. Glucanases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
ATE492633T1 (de) * 2005-01-06 2011-01-15 Novozymes Inc Polypeptide mit cellobiohydrolaseaktivität und dafür kodierende polynukleotide
EP2949756A3 (en) * 2005-03-15 2016-02-24 BP Corporation North America Inc. Cellulases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
FI120045B (fi) * 2005-12-22 2009-06-15 Roal Oy Selluloosamateriaalin käsittely ja siinä käyttökelpoiset entsyymit
US8101393B2 (en) 2006-02-10 2012-01-24 Bp Corporation North America Inc. Cellulolytic enzymes, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
BRPI0714876B1 (pt) * 2006-08-04 2022-04-19 Verenium Corporation Ácido nucleico isolado, sintético ou recombinante, cassete de expressão, vetor ou veículo de clonagem, célula bacteriana, fúngica ou de levedura transformada, polipeptídeo isolado, sintético ou recombinante, composição, bem como métodos de produção e de usos dos mesmos
CN104212822A (zh) 2007-01-30 2014-12-17 Bp法人北美有限公司 用于处理木质纤维素的酶、编码它们的核酸及其制备和应用方法
JP2009077703A (ja) * 2007-09-04 2009-04-16 Kazusa Dna Kenkyusho 形質転換植物
JP2009273379A (ja) * 2008-05-13 2009-11-26 National Institute Of Advanced Industrial & Technology セルロースの糖化方法
WO2010077806A1 (en) 2008-12-15 2010-07-08 Greenlight Biosciences, Inc. Methods for control of flux in metabolic pathways
CN101619309B (zh) * 2009-06-24 2011-10-05 郑荣 一种高效分解纤维素的酶组合物
US9624482B2 (en) 2009-09-28 2017-04-18 Sandia Corporation Thermophilic cellobiohydrolase
KR20130071433A (ko) * 2010-05-07 2013-06-28 그린라이트 바이오사이언시스, 아이엔씨. 효소의 재배치를 통한 대사 경로에서의 흐름의 제어 방법
JP6280367B2 (ja) 2010-08-31 2018-02-14 グリーンライト バイオサイエンシーズ インコーポレーテッドＧｒｅｅｎｌｉｇｈｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ． プロテアーゼ操作を介した代謝経路におけるフラックスの制御のための方法
US9096871B2 (en) * 2010-10-06 2015-08-04 Bp Corporation North America Inc. Variant CBH I polypeptides with reduced product inhibition
JP2016504034A (ja) 2012-12-21 2016-02-12 グリーンライト バイオサイエンシーズ インコーポレーテッドＧｒｅｅｎｌｉｇｈｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ． メタンを燃料、ピルビン酸またはイソブタノールに変換する無細胞システム
US8778641B1 (en) * 2013-02-12 2014-07-15 Novozymes Inc. Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
US8771994B1 (en) * 2013-02-12 2014-07-08 Novozymes Inc. Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
US8778640B1 (en) * 2013-02-12 2014-07-15 Novozymes Inc. Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
US8993275B2 (en) * 2013-02-12 2015-03-31 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
BR112016002494A2 (pt) 2013-08-05 2017-09-05 Greenlight Biosciences Inc Proteí-nas construídas com um sítio de clivagem de protease, ácido nucléico, vetor, célula e processo de engenharia de uma proteína recombinante e de um grande número de variantes de ácidos nucleicos que codificam proteínas recombinantes
CN104561071A (zh) * 2013-10-29 2015-04-29 天津强微特生物科技有限公司 一种表达内切葡聚糖酶的重组大肠杆菌的构建方法
JP6340647B2 (ja) * 2014-03-13 2018-06-13 本田技研工業株式会社 超耐熱性セロビオハイドロラーゼ
JP6429377B2 (ja) * 2014-12-12 2018-11-28 本田技研工業株式会社 耐熱性セロビオハイドロラーゼ
JP6531974B2 (ja) 2015-03-11 2019-06-19 本田技研工業株式会社 耐熱性セロビオハイドロラーゼ
MX2017012665A (es) 2015-03-30 2018-04-24 Greenlight Biosciences Inc Produccion de acido ribonucleico libre de celulas.
CN105176949B (zh) * 2015-10-21 2018-07-13 青岛蔚蓝生物集团有限公司 一种纤维二糖水解酶突变体
EP4293104A3 (en) 2016-04-06 2024-04-24 Greenlight Biosciences, Inc. Cell-free production of ribonucleic acid
KR20230130144A (ko) 2017-10-11 2023-09-11 그린라이트 바이오사이언시스, 아이엔씨. 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 리보핵산 생산을 위한 방법 및 조성물

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07508890A (ja) * 1993-05-10 1995-10-05 ギスト　ブロカデス　ナムローゼ　フェンノートシャップ エンドグルカナーゼとセロビオヒドロラーゼの共同作用
US5789228A (en) 1996-05-22 1998-08-04 Diversa Corporation Endoglucanases
ATE462784T1 (de) * 1997-01-31 2010-04-15 Novozymes As Thermostabile endo-beta-1,4-glucanase

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
1020017007774 - 698807
NCBI Accession No. AP000005 "PH 1171" (1998.06.26) *

Also Published As

Publication number Publication date
JP4199422B2 (ja) 2008-12-17
CN1334868A (zh) 2002-02-06
US6566113B1 (en) 2003-05-20
WO2000039288A1 (fr) 2000-07-06
CN1203174C (zh) 2005-05-25
EP1142992A1 (en) 2001-10-10
AU1685600A (en) 2000-07-31
KR20010099842A (ko) 2001-11-09
EP1142992A4 (en) 2003-05-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100682599B1 (ko) 폴리펩티드
Hakamada et al. Enzymatic properties, crystallization, and deduced amino acid sequence of an alkaline endoglucanase from Bacillus circulans
US7449320B2 (en) Truncated forms of pullulanase
US7510857B2 (en) Thermostable cellulase and methods of use
WO2000070031A1 (en) E1 endoglucanase variants y245g, y82r and w42r
JPH06217770A (ja) プルラナーゼ、それを生産する微生物、そのプルラナーゼの調製方法及び使用
KR100601333B1 (ko) 아가레이즈 및 그의 유전자
JP3212798B2 (ja) 超耐熱性β−ガラクトシダーゼ遺伝子
Kotchoni et al. Purification and biochemical characterization of carboxymethyl cellulase (CMCase) from a catabolite repression insensitive mutant of Bacillus pumilus
Kruus et al. Product inhibition of the recombinant CelS, an exoglucanase component of the Clostridium thermocellum cellulosome
JP3086115B2 (ja) 超耐熱性β−ガラクトシダーゼ遺伝子
US7037696B1 (en) Truncated form of fibrobacter succinogenes 1,3-1, 4-β-d-glucanase with improved enzymatic activity and thermo-tolerance
JP4228073B2 (ja) 高活性融合酵素
US11371032B2 (en) Beta glucosidase with high glucose tolerance, high thermal stability and broad PH activity spectrum
Li et al. Cloning and expression of β-glucosidase from Flavobacterium meningosepticum: A new member of family B β-glucosidase
JP4340382B2 (ja) アルカリセルラーゼ遺伝子
KR100674133B1 (ko) 폴리펩티드
CN113430217B (zh) 一种持续性内切纤维素酶及其编码基因与应用
JP4358984B2 (ja) アルカリセルラーゼ遺伝子
JP5062730B2 (ja) 改良耐熱性セルラーゼ
KR101834493B1 (ko) 신규 베타-만노시다제 및 이의 생산방법
JP2001258577A (ja) ポリガラクツロナーゼ
Oh et al. Mutational Analysis of Thermus caldophilus GK24 ${\beta} $-Glycosidase: Role of His119 in Substrate Binding and Enzyme Activity
JP2014171474A (ja) セルロース系バイオマスの分解における全細胞生体触媒
RU2523581C2 (ru) ПРИМЕНЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОЙ БЕТА-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ AsBgl 1390 ИЗ АРХЕИ SACCHAROVORANS В КАЧЕСТВЕ БЕТА-ГЛЮКОЗИДАЗЫ, БЕТА-КСИЛОЗИДАЗЫ И БЕТА-МАННОЗИДАЗЫ

Legal Events

Date Code Title Description
N231 Notification of change of applicant
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
LAPS Lapse due to unpaid annual fee