JPH07508890A - エンドグルカナーゼとセロビオヒドロラーゼの共同作用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 エンドグルカナーゼとセロビオヒドロラーゼの共同作用技術分野 本発明は、細胞壁分解の分野に関する。本発明は、植物細胞壁の分解における酵 素の組合わせの使用を開示するものである。キシログルカナーゼ活性の使用の利 点が開示される。細胞壁分解酵素の特定の最適比も開示される。詳細には、キシ ログルカン／セルロース複合体の分解におけるエンドグルカナーゼとセロビオヒ ドロラーゼの共同作用か開示される。更に、これらの酵素が相乗作用を有するこ とも証明される。

発明の「景 植物細胞壁酵素分解の研究においては、植物細胞壁の２構造酸分が広く研究され ており、これらはセルロースとペクチンである。

セルロースとペクチン質の他に、細胞壁の第３構造要素：キシログルカン（Ｈａ ｙａｓｈｉら、（＋９８４）　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　７５：６０５− ６１０．　Ｈａｙａｓｈｉ　Ｔ、（１９８９）　Ａｎ氏A　Ｒｅｖ。

Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｐｌａｎｔ　Ｍａｔ、　Ｂｉｏｌ、　４０：１ ３９−１６８）が言及されなければならない。

キシログルカンはセルロース骨格からなり、この骨格の約７０％のグルコース残 基か側鎖で置換されている。これらの側鎖は、主としてキシロース、ガラクトー ス及びフコースを含む。更に、キシログルカンはセルロースにしっかりと水素結 合しくＨａｙａｓｈｉら、　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　８３：３８４−３ ８９．　Ｔａ１ｂｏｔｔ　Ｌ、Ｄ、、　Ｐ、Ｍ、Ｒａｙ　（P９９２） Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　９８：３５７−３６８）、池の細胞壁成分にも 結合されている（Ｆｒｙ　Ｓ、Ｃ，。

Ｊ、Ｇ、　Ｍｉｌｌｅｒ　（＋９８９）、成長植物細胞壁の使用モデルについて ：双子葉植物の一次細胞壁のフェノール架橋反応、　Ｌｅｗｉｓ　Ｎ、Ｇ、、　 Ｐａ１ｃｅ　Ｍ、Ｇ、　Ｅｄｓ、植物細胞壁ポリマーの生合成と生物分解、　Ａ Ｃ３，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　ＤＣ，ｐｐ　３３−４６及び上記で引用したＴａ ｂｏｔｊ　Ｌ、Ｄ、、　Ｐ、Ｍ、Ｒａｙ　（＋９９２））。

キシログルカンは比較的多量に存在するか（上記て引用したＴ、　Ｈａｙａｓｈ ｉ　（１９８９）により双子葉植物巾約２０％）、植物材料の酵素液化法に関し てキシログルカン。

には注意か払われていなかった（Ｖｏｒａｇｅｎら（＋９９２）　Ｆｌｕｅｓｓ 、　０ｂｓｔ、　５９４０４−４１０）。

グルカナーゼの精製中にスクリーンされた活性はＣＭＣａｓｅ（ＬばしばＣ１又 はエンドグルカナーゼと呼ばれる）、アビセラーゼ（しばしばＣ，、セロビオヒ ドロラーゼ又はエキソグルカナーゼと呼ばれる）及び時にはセロビアーゼ又はβ −グルコシダーゼである。キシログルカナーゼ（ＸＧａｓｅ）活性は通常台まれ ない。これは、今日まで細胞壁分解においてキシログルカナーゼ活性が系統的に 利用されていなかったことを意味する。

フルーツジュースの調製方法におけるキシログルカンについてはほとんど知られ ていない。キシログルカンは、ペクチンのように良好なゲル化剤であることが既 知であり（Ｍ、　Ｇｌｉｃｋｓｍａｎ、　（１９８６）　Ｇｌｉｃｋｓｍａｎ　 Ｍ、　ｅｄ、　Ｆｏｏｄ　Ｈｙｄｒｏｃｏｌｌｏｉｄｓ　R゜ ＣＲＣＰｒｅｓｓ、　Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ、　Ｆｌｏｒｉｄａ、　ｐｐ、　＋ ９ｌ−２０２）、日本でもそれだけで用いられている。リンゴ’Ｍ織の液化の場 合、−次細胞壁の多量成分、セルロースの効率のよい分解か不可欠である。細胞 壁包埋セルロースの接触性はペクチン及びキシログルカンのような他の細胞壁成 分の存在によって減少する。

ペクチンを除去するとセルロース分解か促進されることが証明されている。とこ ろか、キシログルカンはほとんど注意されていない。

本発明は、細胞壁セルロースの分解におけるキシログルカナーゼ活性の使用の利 点を開示するものである。

発明の要約 本発明は、最適なセルロース分解に適応されるキシログルカナーゼ活性を含むエ ンドグルカナーゼとセロビオヒドロラーゼの混合物を開示するものである。ある 特定の混合物は３酵素；エンドグルカナーゼＩ、エンドグルカナーゼＩＶ及びセ ロビオヒドロラーゼを含み、別の特定の混合物は２酵素；エンドグルカナーゼＶ 及びセロビオヒドロラーゼを含んでいる。

エンドグルカナーゼとセロビオヒドロラーゼの混合物におけるキシログルカナー ゼのアビセラーゼに対する比率は最適なセルロース加水分解を生しるように選ば れる。

本発明のもう１つの実施態様においては、特定のＥｎｄｏ　Ｉ／Ｅｎｄｏ　ＩＶ ／ＣＢＨ混合物の酵素の質量比は一定の（Ｅｎｄｏ　■＋Ｅｎｄｏ　ＩＶ）／Ｃ ＢＨ質量比０．５−２０　（ｇ／ｇ）において最適モル比Ｅｎｄｏ　ｒ／Ｅｎｄ ｏ　ＩＶＯ，Ｉ　−３を用いるように選ばれる。

エンドグルカナーゼ／セロビオヒドロラーゼの質量比は０．９６であり、Ｅｎｄ ｏｆ／ＥｎｄｏｌＶモル比が０．３３であることが好ましい。

更に、所望の混合物の調製方法が記載される。

本発明は、更にエンドグルカナーゼ（Ｅｎｄｏ）、セロビオヒドロラーゼ（Ｃｏ ＢＨ）及びキシログルカナーゼ活性の共同作用によって細胞壁包埋キシログルカ ン／セルロース複合体を分解する方法を開示するものである。詳細には、リンゴ 細胞壁セルロースが分解される。

本方法は、エンドグルカナーゼとセロビオヒドロラーゼの組合わせを利用するも のである。エンドグルカナーゼは、キシログルカナーゼ活性に基づいて選ばれる ことが好ましい。記載された活性を有する酵素を生産する種は、原則として酵素 源として用いることができる。酵素は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ）　、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）又はジスボロトリクム（Ｄｉ ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）から入手することが好ましい。

本発明は、細胞壁材料の分解において、詳細にはキシログルカン／セルロース複 合体の分解においてキシログルカナーゼ活性の使用を記載するものである。

本発明は、更にキシログルカン／セルロース複合体を含有する植物材料をキシロ グルカナーゼを含むセルロース分解酵素混合物で処理した後得られた産物を開示 するものである。詳細には、産物はリンゴに由来する。更に詳細には、産物はＩ Ｎ＋　グルカナーゼ（の混合物）によって可溶化されたリンゴ−ＷＵＳの分解産 物を示す典型的クロマトグラムは、Ａｍ１ｎｅｘ　ＨＰＸ　２２ＨカラムでＡ、 ＣＢＨ。

ＢＳＥｎｄｏ　＋＋ＣＢＨ：Ｃ，Ｅｎｄｏ　ＩＶ＋ＣＢＨを分析した。マルトデ キストリンソロツブの溶離プロファイルは、対応する重合度によって矢印で示さ れている。ＥｎｄｏＴＶの典型的な分解産物は、斜線でがげをつけたピークで示 されている。これらの面積の合計をキシログルカンオリゴ糖の定量化に用いた。

図２．　リンゴ−ＷＵＳのセロビオースとキシログルカンオリゴマーフラグメン トの放出に関するエンドグルカナーゼ／セロビオヒドロラーゼ比率の影響１口Ｅ ｎｄｏｌ＋ＣＢＨによるセロビオース放出；ＯＥｎｄｏｌＶ＋ＣＢＨによるセロ ビオース放出：・　Ｅｎｄｏ　ＩＶ＋ＣＢＨによるキシログルカンフラグメント の放出；ＦＸＧ＝フコシル化キシワキシログルカン、　所定の（Ｅｎｄｏ　＋＋ Ｅｎｄｏ　ＩＶ）／ＣＢＨ質量比０．９６　μｇ／μｇの３酵素系及びＥｎｄｏ ｌとＥｎｄｏｌＶの種々の量におけるセロビオース（△）及びキシログルカンオ リゴ糖の放出（ム）。

図４．　ＰＬ及び（改良品、実施例３参照）市販の酵素標品による皮をむいたリ ンゴ果実組織の液ｆ−皮をむいたリンゴ果実組織を２００繭コハク酸塩バツフア ーｐＨ４，０中４０℃及び＋５Ｏｒｐｍで１６時間インキュベートした。１１添 加酵素なし、２、Ｍａｘａｘｙｍｅ　（Ａｖｉｃｅｌに対してＩ　ＯｍＵ１２０ ０ｍＵＸＧａ　ｓ　ｅ）　：　３．５０ｍＵＰＬ　；　４．２と３の組合わせ： ５、Ｘｙｌ　５０００　（Ａｖｉｃｅｌに対して１０ｍＵ。

＋　００ｍＵＸＧａ　ｓ　ｅ）　；　６．３と５の組合わせニア、６と１００ｍ ＵＥｎｄｏＶとして。

図５．　精製グルカナーゼの混合物によるリンゴ果実組織からセロビオースの放 出。残りのリンゴ果実組織を、Ａｖｉｃｅ１分解ポテンシャル（０，２６ｍＵ） が等しいがＸＧａ５ｅ活性が異なる（５〜４０ｍＵ）種々のグルカナーゼ混合物 と組合わせたＰＬとインキュベートした（２００ｄコハク酸塩バッファーｐＨ４ ，０，１６時間、４０°Ｃ１１５Ｏｒｐｍ）。セロビオースをＨＰＡＥＣで定量 した。

発明の詳細な説明 本発明は、キシログルカンを含有する生物材料の分解においてキシログルカナー ゼ活性を有する酵素の使用を開示するものである。

ＣＭＣａｓｅとアビセラーゼ活性についてグルカナーゼをスクリーンすることは キシログルカナーゼ活性を有する酵素を発見する適切な尺度ではないという知見 に基づいて、キシログルカンの活性についてグルカナーゼをスクリーンする。

異種のエンドグルカナーゼの活性の間に違いのあることが判明した。

本発明は、更にエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ及びキシログルカナ ーゼ活性を含むセルロース分解酵素の混合物を使用する利点を記載するものであ る。混合物は、トリコデルマ、アスペルギルス又はジスボロトリクムから入手す ることか好ましい。混合物はこれらの微生物の増殖培地から精製せずに単離され る。混合物中異種酵素の活性及び比率は発酵に用いられる基質、増殖条件及び゛ 　菌株に左右される。

そのようにして単離された混合物が所望の比率の酵素活性を含む場合には、混合 物はそれだけで用いられる。所望の比率は、分解されなければならない基質に左 右され、すべての基質についてめることが好ましい。

処理せずに単離される混合物が所望の比率の酵素活性を含まない場合には、別の 培養液からの混合物を用いて比率を改良する。異種菌株又は種の増殖からの培養 液を混合することも可能である。また、所望の比率の酵素活性を得るために、酵 素を精製する。精製は、当業者に既知の方法を用いて行うことができる。酵素は 純度レベル７０％まで精製することが好ましい。純度レベルが９０％であること か更に好ましく、９５％を超えることが特に好ましい。Ｂｅｌｄｍａｎらによる 精製（Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　（＋９８５）　１４６：３０１−３ ０８）により、６種類のエンドグルカナーゼ（ＥｎｄｏＴ〜ＶＴ）と２ｆｌ類の セロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）が得られた。

本明細書で用いられる酵素の命名は、Ｂｅｌｄｍａｎら（Ｂｉｏｔｅｃｈ、　Ｂ ｉｏｅｎｇ、（１９８８）　３１１６０−１６７）によるものであるので他の発 表とは異なる。本明細書で記載される以外の方法及び原料も該酵素を得るために 用いることができる。他の１方法は異種微生物中所望の酵素をコードする遺伝子 のクローニング及び発現であり、他の酵素による混入が回避される。しかしなが ら、所望遺伝子のクローニング及び過剰発現のために同種微生物を使用すること も可能である。その場合、酵素を外部から加えることなく種々の酵素の比率か影 響される。混合物に属する特定の酵素の不活化も可能である。示差不活化は、例 えば加熱、ｐＨ変化又は特定インヒビターの添加によって得られる。

エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ及びキシログルカナーゼ活性を含む セルロース分解酵素の混合物は、精製酵素を所定量で混合するか又は所定の活性 を有する混合物を混合することにより得られ、所望の最終酵素活性比を得る。

本発明は、異種酵素を細胞壁材料の分解に用いると相乗作用を有することを開示 するものである。この作用は、混合物がキシログルカナーゼ活性を含むエンドグ ルカナーゼ及びセロビオヒドロラーゼから特定の比率で製造されると特に明らか である。酵素の好ましい質量比は使用される基質に左右される。

トリコデルマビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｖｉｒｉｄｅ）　（現在はトリ コデルマリーセインドグルカナーゼを含むことが証明されており（Ｂｅｌｄｍａ ｎら（１９８５）　Ｂｕｒ、　Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　＋４６：３０１−３０８）　、これらはキシランの分解能に 基づいて特異的（Ｅｎｄｏｌ、＋＋及び１］１）及び非特異的（Ｅｎｄｏ　ＩＶ 、Ｖ及びＶｌ）クラスの２種類に更に分類される。実施例１においては、エンド グルカナーゼはキシログルカンの分解能に基づいて３つの酵素グループ：セルロ ース（Ａｖｉｃｅｌ）に活性なグループ、例えばＥｎｄｏｌ、キシログルカンに 活性なグループ、例えばＥｎｄｏｌＶ、及び両基質に活性なグループ、例えばＥ ｎｄｏＶに分けられることが示されている（表ＩＩＩ参照）。

本発明は、キシログルカナーゼ活性を含むエンドグルカナーゼＩＶＳＶ及びＶｌ の使用がエンドグルカナーゼＩ、　［１及びＩＩ＋より宥和であることを開示す るものである（表ＩＩＩ）。

本発明は、細胞壁包埋セルロースの分解において、キシログルカンに特異的なＥ ｎｄｏＴＶとセルロース分解に特異的なＥｎｄｏｌ＋ＣＢＨの共同作用の利点及 びキシログルカンとセルロースの双方に特異的なＥｎｄｏＶとＣＢＨの共同作用 の利点を開示するものである。Ｅｎｄｏ　Ｉ−Ｅｎｄｏ　ＩＶ組合わせの両態様 がＥｎｄｏＶに示されることも確認される。

更に、これらの酵素の組合わせの使用が証明される。一般に、キシログルカナー ゼ活性、例えばＥｎｄｏ　ＩＶ−ＥｎｄｏＶＩに属する酵素を含む酵素がキシロ グルカン／セルロース複合体の表面からキシログルカンを放出させるように選ば れ、その後セルラーゼ活性を含む酵素、例えばＥｎｄｏ　Ｉ−Ｅｎｄｏｌｌ［グ ループの酵素がＣＢＨと共にセルロースを攻撃する。エンドグルカナーゼ、セロ ビオヒドロラーゼ及びキシログルカナーゼ活性の相対量が基質に左右されること が確認される。セルロース分解の方法を例えば工業的規模まで拡張すると、これ らの酵素の相対量にも影響する。本発明は、いわゆる水に抽出できない固形分（ ＷＵＳ）の使用及びリンゴ組織の使用により証明される。

実施例２は、細胞壁セルロースの効率のよい分解の場合３活性：エンドグルカナ ーゼ（Ａｖｉｃｅｌに対して活性を有する）、セロビオヒドロラーゼ及びキシロ グルカナーゼが重要であることを証明する。最適なセルロース分解はセロビオー ス放出が最適である場合に達成される。キシログルカンオリゴマーの放出が最大 である場合今度はセロビオース放出が最適である。リンゴＷＵＳの分解の場合、 最適なＥｎｄｏ／ＣＢＨモル比はＥｎｄｏｌ／ＣＢＨの場合の１．１からＥｎｄ ｏｌＶ／ＣＢＨの場合の１４．９まで異なることが認められた。しがしながら、 Ｅｎｄ。

ｒ／ＣＢＨ最適比に比べると最適Ｅｎｄｏ　ＴＶ／ＣＢＨを用いてちょうど２倍 のセロビオースが放出される。セルロースに対する吸着性が低いために相対的に 多量のＥｎｄｏ　ＩＶが必要である。しかしながら、３酵素系を用いると、がな り少量の汐ンバク質を用いて匹敵しつるセルロース分解が得られる。

実施例２は、更にエンドグルカナーゼ／セロビオヒドロラーゼ質量比が０．５〜 ２０　（ｇ／ｇ）で最適であることを示すものである。一定の質量比０．９６（ Ｅｎｄ。

１＋Ｅｎｄｏ　ＴＶ／ＣＢＨ）を用いて、Ｅｎ　ｄ　ｏ　Ｉ／Ｅｎ　ｄ　ｏ　Ｉ Ｖの最適比がＯｌ〜３であることか証明される。比率は０．２０−０．６０が好 ましく、０．３３が更に好ましい。

詳細には、エンドグルカナーゼはＥｎｄｏｌとＥｎｄｏｌＶであり、この混合物 は一定の（Ｅｎｄｏ　Ｉ＋Ｅｎｄｏ　ＩＶ）／ＣＢＨ質量比ｐ、　９６　（ｇ／ ｇ）においてＥｎ　ｄ　ｏ　Ｉ／Ｅｎ　ｄ　ｏ　ＩＶモル比０．３３を含むこと を特徴とする。

実施例３においては、リンゴ組織の分解及び液化の場合キシログルカナーゼ活性 か重要であることが証明される。キシログルカナーゼ活性の低いセルラーゼ標品 は、キシログルカナーゼの添加、好ましくはＥｎｄｏ　ＩＶ−ＥｎｄｏＶＩのグ ループから選ばれたエンドグルカナーゼの添加、更に好ましくはＥｎｄｏＶの添 加により改良される。

実施例４は、精製酵素の混合物が同様の効果を生じることを証明するものである 。キシログルカナーゼ活性の量を増加するとリンゴ組織からセロビオース放出の 増加が認められ、混合物のＡｖｉｃｅ１分解ポテンシャルか一定に保たれる。最 少量の２５ｍＵのキシログルカナーゼ活性がＥｎｄｏＶとして、０．２６ｍＵの Ａｖｉｃｅ１分解活性に対して必要である。

本発明で定義される混合物は、成分としてキシログルカンを存する基質に用いる ことか有利である。このような基質は、食品、飼料、紙、バルブ及び織物原料に 存在する。従って、混合物を食品、飼料、紙、バルブ及び織物処理における分解 過程で用いることが有利である。

混合物は、フルーツジュースの調製、特にリンゴジュースの調製に特に育用であ る。

本発明は、４種類のグルカンに対して６種類の真菌エンドグルカナーゼの特異性 を記載するものである（実施例１）。更に、エンドグルカナーゼとセロビオヒド ロラーゼの共同作用によるグルカン複合体の分解が、基質としてリンゴのモデル 細胞壁（実施例２）又はリンゴの全組織（実施例３．４）を用いて開示される。

酵素の特定の組合わせを使用する相乗作用が開示される。

実験 材料 リンゴ（マルスマルス（Ｍａｌｕｓ　ｍａｌｕｓ）　Ｌ、、イバラ科、ゴールデ ンデリシャス変種）を１９８９年１０月の中頃に収穫し、制御された雰囲気下（ ２°Ｃ，２％０．及び５％Ｃｏ、）で４力月間貯蔵した。

６種類のエンドグルカナーゼ（Ｅｎｄｏ　１−Ｖｌ）［Ｅ、Ｃ，３，２，１，４ ］及び２種類のセロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）［Ｅ、Ｃ，３，２，１，９１］ をＢｅｌｄｍａｎら（＋９８５）　Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１４６：３ ０１−３０８に記載されているようにトリコデルマビリデ（Ｍａｘａｚｙｍｅ　 Ｃ１゜Ｇ１５ｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ、　Ｄｅｌｆｔ、　Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌ ａｎｄｓ）の市販標品から精製した。

Ａｖｉｃｅｌ結晶性セルロース（ＳＦ型）をＳｅｒｖａ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｕ ｇ、　Ｇｅｒｍａｎｙ）から、ＣＭＣ（Ａｋｕｃｅｌｌ　ＡＦ　壓０３０５）を Ａｋｚｏ（Ａｒｎｈｅｍ、　Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から、タマリン ドの種子キシログルカンを大日本製薬（大阪、日本）から入手した。

水に抽出できない固形分（ＷＵＳ）の単離内在性酵素（ポリガラクッロナーゼ及 びペクチン−エステラーゼ）を不活化するために、芯を取り除いた後リンゴ（５ ｋｇ）を１ｋｇずつマイクロ波にかけた（Ｐｈｉｌｉｐｓ　ＡＫＢ　２７６／Ｐ Ｈ，４ｋＷ、　５ｗ１ｔｚｅｒｌａｎｄ）。得られた材料の皮をむき、すりつぶ し、加温蒸留水（５０°Ｃ）で洗浄水か少量の糖を含有するまで大量に抽出した 。

遠心分離（２０分、５０．ＯＯＯｇ）で固形分を集めた。残りの材料を凍結乾燥 し、フリッソユブルベリセット（ふるい１．Ｏｍｍ、ドイツ）ですりつぶし、Ｗ ＵＳと称した。

キシログルカンの調製 ＷＵＳの抽出　５ｍＭ１．２−シクロヘキシレンージニトリロ四酢酸（ＣＤＴＡ ）を含有する０、　０５Ｎ　ＮａＯＨ（２００ｍ１）を用いて４°Ｃで１６時間 連続的に攪拌しながらＷＵＳ（２ｇ）を抽出した。遠心分離（２０分、５０．Ｏ ＯＯｇ）後、残留物を１％（Ｗ／Ｗ）　Ｎ　ａ　Ｂ　Ｈａを含有するＩＮ　ＫＯ Ｈ（３２０ｍ１）に再懸濁し、２０°Ｃて１６時間抽出し、遠心分離（２０分、 ５０．ＯＯＯｇ）した。この残留物を用いて、１％（ｗ／ｗ）　Ｎ　ａ　Ｂ　Ｈ ４を含有する４８　ＫＯＨで後者の手順を繰り返した。連続抽出工程の間で、残 留物を蒸留水で２回洗浄した。最後の残留物をＭＣＩでｐＨ５まで酸性にし、凍 結乾燥した。対応する上溝を集め、ＨＣＩでｐＨ５まで酸性にし、蒸留水で大量 に透析した。

４ＮＫＯＨ抽出物の精製　５０而（酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５，０）で 平衡化したＤεＡＥセファ０−スＣＬ−６Ｂカラム（４０Ｘ　４４０ｎｎ、　Ｐ ｈａｒｍａｃｉａ、　Ｕｐｐｓａｌａ。

Ｓｗｅｄｅｎ）て４Ｎ　ＫＯＨ抽出物を脱ペクチン化した。試料（２００ｍｌ） を加えた後、カラムを４００ｍ１のバッファーで洗浄した。カラムに保持された 両分を５００ｍｌの１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５，０）で溶離するこ とにより放出させた。

画分（１６，５ｍ１）をウロン酸と中性糖の双方について分析し、プールし、透 析し、凍結乾燥した。中性画分はキシログルカン（ＡＰＦＸＧ）であった。

ＡＰＦＸＧの弱酸加水分解　精製リンゴキシログルカン（４０ｍｇ）を２５−Ｔ ＦＡ　（５ｍｇ／ｍｌ）で６０°Ｃにおいて１００時間処理した。透析後、脱フ コシル化ＸＧ　（ＡＰＸＧ）を凍結乾燥した。

酵素活性の定量 ＣＭＣ（ＣＭＣａ　ｓ　ｅ）　、Ａｖｉｃｅｌ　（アビセラーゼ）及びタマリン ド種子のキシログルカン（キシログルカナーゼ）のエンドグルカナーゼとセロビ オヒドロラーゼの活性をＳｏｍｏｇｙｉ（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　＋ ９５：１９−２３）によって還元末端基の増加を測定することによりめた。イン キュベーション（４０°Ｃ１０，１Ｍコハク酸塩バッフｙ　ｐＨ４，ｏ）は非基 質限定条件下に生じた。１ミリ単位（ｍｕ）の酵素は、１分間に生成されたナノ モルの還元末端基量に対応する。

分析法 一ヒドロキシジフェニル試験（Ｔｈｉｂａｕｌｔ　ＪＦ　（＋９７９）　Ｌｅｂ ｅｎｓｍ、Ｗｉｓｓ、Ｔｅｃｈｎｏｌ、　＋２：２４７−２５１）でウロン酸（ ＡＵＡ）を比色分析で定量した。分析の前に、水不溶性材料を７２％（ｗ／ｗ） 　Ｈｘ　ＳＯ４（３０°Ｃて１時間）及び水で希釈した後２８　Ｈ２ＳＯ，（１ ００℃で３時間）で前処理した。

全中性糖含量　自動オルシノール／硫酸分析（Ｔｏｌｌｉｅｒ　ＭＴ、　Ｒｏｂ ｉｎ　ＪＰ　（１９７９）Ａｎｎ、　Ｔｅｃｈｎｏｌ、　Ａｇｒｉｃ、　２８： ｌ−１５）で全中性糖含量を比色分析でめた。

中性糖組成　水不溶性材料を７２％（ｗ／ｗ）　Ｈ，Ｓ○４予備加水分解（３０ ″Ｃで１時間）に供し、次いで水で希釈した後、２Ｎ　Ｈａ　ＳＯ４加水分解（ １００”Ｃで３時間）に供した。水可溶分を２Ｎ　ＴＦＡ　（１２１″Ｃで１時 間）で加水分解した。

次に、遊離した中性糖を酢酸アルジトール（Ｅｎｇｌｙｓｔ　ＨＮ、　Ｃｕｎｗ ｎｉｎｇｓ　ＪＨ（１９８４）Ａｎａｌｙｓｔ　１０９：１３７−９４２）に変 換し、２００℃で操作され２７０℃に設定されたＦ、ｌ。

Ｄ、検出器を備えたＣａｒｌｏ　Ｅｒｂａ　Ｆｒａｃｔｏｖａｐ　２３００　Ｇ Ｃ（Ｍｉｌａｎ、　Ｉｔａｌｙ）の３ｍＸ２ｎ＋ｍｉ、ｄ、ガラスカラム（Ｃｈ ｒｏｍ　ＷＡＷ　８０−１００メツシユを充填、３％０Ｖ２７５を被覆、Ｃｈｒ ｏｍｐａｃｋ、　Ｍｉｄｄｅｌｂｕｒｇ、　Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ） で分離した。内部標準としてイノシトールを用いた。

グリコジル結合組成　精製キシログルカンを箱守法（Ｓａｎｄｆｏｒｄ　ＰＡ、 　Ｃｏｎｒａｄ　）ＩＥ（１９６６）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　５：ｌ５０ ８−１５１７）の変法によってメチル化し、引き続き水で透析し、蒸発（空気流 、室温）で乾燥した。この手順を１回繰り返した。次に、蒸発（空気流、室温） で除去される２Ｎ（１２１″Ｃで１時間）ＴＦＡを用いてメチル化キシログルカ ンを加水分解した。糖を７５ｍｇのＮ　ａ　Ｂ　ｐ　４／ｍｌを含有する０、２ ｍｌの新たに調製された１、５Ｎアンモニア溶液を加えることにより還元し、酢 酸アルジトール（Ｅｎｇｌｙｓｔら（１９８４）　Ａｎａｌｙｓｔ　＋０９：９ ３７−９４２）に変換した。２８０″Ｃに設定された炎イオン化検出器（ＦＩＤ ）を備えたＣａｒｌｏ−Ｅｒｂａ　Ｆｒａｃｔｖａｐ　４１６０ガスク０マトグ ラフイ一ノ溶融シリカ毛管カラム（３０ｍｍｘ０．３２％ｗｎ　ｉ、、ｄ、　； 　ＤＢ　＋７０１を被覆した壁：膜厚０．２５１ｔｍ：　Ｊ　＆　Ｗ　５ｃｉｅ ｎｔ山ｃ、　Ｆｏｌｓｏｍ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ、　ＵＳＡ）にオンカラム 注入することにより、部分的にメチル化された酢酸アル）トール（１１８０−２ ３０°Ｃ１２３０°Ｃで３分間とした。化合物の同定は、ヒユーエツト−パラカ ート質量選択検出器５９７０．７Ｂ　ニつなげたＨＰ　５８９０　ＧＣのＣＰ　 Ｓｉｔ　１９　ＣＢ毛管カラム（２６ｎｎ＋Ｘ０．２２＋ｍ＋　ｉ、ｄ、、ｏ、 　１８　μｍ膜厚：　Ｃｈｒｏｍｐａｃｋ　Ｎｅｄｅｒｌａｎｄ　Ｂ、　Ｖ、。

Ｍｉｄｄｅｌｂｕｒｇ、　Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いかッＰＡＷ −１（Ｐ　３００　ＣｈｅＩＸｌステーション（ヒューエソトーパッカード）を 用いてガスクロマトグラフィー−質量分析（ＱＣ−ＭＳ）で確認した。温度プロ グラムは０．５°Ｃ／分で１６０−１８５°Ｃ，１０″Ｃ／分で１８５→２３０ ℃、２３０℃で５．５分間とした。誘導体を有効炭素応答（ＳｗｅｅｔＤＰ、　 ５ｈａｐｉｒｏ　Ｒ）１．　Ａｌｂｅｒｓｈｅｉｍ　Ｐ　（１９７５）　Ｃａｒ ｂｏｈｙｄｒ　Ｒｅｓ　４０：２１７−２２５）に謔■■■ 量した。

タンパク質含量　酵素標品のタンパク質含量をＳｅｄｍａｋ　Ｊ、　Ｊ、及びＧ ｒｏｓｓｂｅｒｇ　Ｓ。

Ｅ、　（１９７７）（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　７９：５４４−５５２） に従ってめた。

キシログルカン及びセルロース分解産物の分析　５ｈｏｄｅｘ　５Ｅ−６１屈折 計（昭和電工に、　Ｋ、　、東京１日本）及びＡＧ　５０Ｗ　Ｘ４ガードカラム （７，８Ｘ　５０ｎｗｎ、　Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｓ）を組合わせたＡｍ１ｎｅ ｘ　）ＩＰＸ−２２Ｈカラム（７，８Ｘ　３００ｗｅ、　Ｂｔｏ−Ｒａｄ　Ｌａ ｂｓ。

Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）を備えたＳＰ　８８００　ＨＰＬ Ｃポンプ系（Ｓｐｅｃｔｒａ　Ｐｈｙｓｉｃｓ、　５ａｎＪｏｓｅ、　ＣＡ　Ｕ 、Ｓ、Ａ）を用いて８５°Ｃで高性能液体クロマトグラフィーを行った。溶媒は 、流速０．２ｍｌ／分でポンプで送られるＯ、ＱＩＮ硫酸とした。注入量は２０ μｍであった。目盛定めにはマルトデキストリンを用いた。リンゴ組織を分解し た後、Ｄｉｏｎｅｘ　ＣａｒｂｏＰａｃ　ＰＡ１００カラム（２５０ｘ４ｍｍ、 ２０℃、　Ｄｉｏｎｅｘ。

５ｕｎｎｙｖａｌｅ、　ＣＡ）を備えたＤｉｏｎｅｘ　Ｂｉｏ−ＬＣＧＰＭ−Ｉ Ｉ四次グラジェントモジュールを用いる高性能アニオン交換クロマトグラフィー （ＨＰＡＥＣ）でセロビオースの定量分析を行った。７０１０　Ｒｈｅｏｄｙｎ ｅインジェクターバルブ内にＴｅｆｚｅｌローターシールを備えた５Ｐ８７８０ オートサンプラー（Ｓｐｅｃｔｒａ　Ｐｈｙｓｉｃｓ、　Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ、　 ＣＡ）を用いて試料（２０μｌ）を注入した。溶媒を脱ガスし、ヘリウム下Ｄｉ ｏｎｅｘ　ＥＤＩＪモジュールを用いて貯蔵した。パルス電流測定検出（ＰＡＤ ）方式のＤｉｏｎｅｘ　ＥＤＭ検出器を用いて溶出液（１ｍｌ／分）をモニター した。Ａｇ／ＡｇＣ１参照電極を次のパルス電位と持続を存する全使用電極と共 に用いた：Ｅ＋０．ＩＶと０．５ｓ、Ｅｔｏ、６ＶとＯ，Ｉ　ｓＳＥ！　０．６ Ｖと０．１ｓａインキユベ一シヨン混合物中のセロビオースを次の勾配：０→Ｉ ２分、線状勾配２５→８５嘘ＮａＯＨ，１２→２５分、線状勾配８５ｍＭＮａＯ Ｈ中０−１００ｎ＃Ｎａ０Ａｃを適用することにより定量した。各分析後、カラ ムを＋００ｒｒＭＮａＯＨ中ＩＭＮａＯＡｃで５分間すすぎ、２５ｍ１ＪＮａＯ Ｈで１５分間平衡化した。

実施例１ トリコデルマビリデの６種類のエンドグルカナーゼの基質特異性キシログルカン の大部分を４Ｎ　ＫＯＨで抽出された（表１）。この抽出物は、アニオン交換ク ロマトグラフィーでほとんど除去することができるペクチン質も含有した。この 精製キシログルカンを確認するためにメチル化分析を行った。表ＩＩ及び文献（ Ｙｏｒｋ　ＷＳ、　ｖａｎ　Ｈａｌｂｅｅｋ　Ｈ，Ｄａｒｖｉｌｌ　ＡＧ、　Ａ ｌｂｅｒｓｈｅｉｍ　Ｐ　（１９９０）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、　Ｒｅｓ、　２０ ０：９−３１０）に基づくと、この多糖は（１−４）−β−グルコース骨格から なり、その約４２％は（６→ｌ）−α−キシロース末端を含有し、約１０％は（ ６−”Ｉ）−ａ−ＸｙＩ−（２−１）−β−Ｇａｌで置換され、約１３％は（６ −−１）　−ａ−Ｘｙ　Ｉ　−（２→Ｉ）−β−Ｇａ　１−　（２−＋１）　− ａ−ＦｕＣ側鎖を有する。また、キシロース残基におそらく結合される末端アラ ビノースが見られる。精製リンゴキシログルカンの糖組成は、他の研究結果と一 致している（Ｒｅｎａｒｄ　Ｃ，Ｍ、　Ｇ、　Ｃ，ら（１９９１）　Ｃａｒｂｏ ｈｙｄｒ、　Ｐｏｌｙｍｅｒｓ　１５：３８７−４０３及びＲｕｐｅ窒■噤@Ｐ 。

ら（＋９８５）　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、　Ｒｅｓ、　１４２：１０７−１１３） 。特にヘキソース残基の低メチル化が少し生じた（約５％）。精製キシログルカ ンがなおわずかな混入（約５％）、おそらくマンノース残基の９個毎に結合した ガラクトースを有するガラクト−（グルコ）−マンナンを含有することは留意さ れなければならない。

精製キシログルカン（２５０℃ｇ）を１００μｌバツフアーに溶解し、Ｅｎｄｏ ＩＶ、ＥｎｄｏＶ及びＥｎｄｏＶＩ　（３０ｎｇ）又はＥｎｄｏｒ、Ｅｎｄａｌ ｌ及びＥｎ　ｄ　ｏｌｌｌ（４００ｎｇ）と各々ｌ又は２０時間インキュベート した。酵素用量は基質限定が生じないようにした。次いで試料を２倍に希釈し、 還元糖の増加をＳｏｍｏｇｙｉ　（１９５２）によって目盛定めにグルコースを 用いてめた。基質として脱フコシル化リンゴキシログルカン及びＣＭＣを用いて 同様の実験を行った。

精製リンゴキシログルカン（ＡＰＦＸＧ）、脱フコシル化等価物（ＡＰＸＧ）及 びジャガイモアラビノキシログルカン（ＰｏＡＸＧ）を用いてエンドグルカナー ゼの特異性をめた。表ＩＩＩは、種々のグルカンの種々のエンドグルカナーゼの 代謝回転数を纏めたものである。ＣＭＣに対する活性は、Ｅｎｄｏ［ＩＩ以外同 じ桁数である。キシログルカンについての活性測定によりエンドグルカナーゼが 更に２ｆＩ類に分けられることが明らかである。Ｅｎｄｏｒ、１！及びＩＩＩは 、ＥｎｄｏｒＶ、Ｖ及びＶｌに比べてＸＧに対して相対的に活性が低い。一般に 、フコース残基を除去すると、エンドグルカナーゼによるキシログルカンの分解 がわずかに高められた。しかしながら、例えばＥｎｄｏｌの活性増大はＥｎｄｏ ｒとフコシダーゼの組合わせが適用においてＥｎｄｏ　ＩＶの代替物となるほど 劇的ではない。

本実施例は、標品のＸＧａ５ｅポテンシヤルが容易に過大評価されるので、エン ドグルカナーゼの確認が単にＣＭＣａｓ６及びアビセラーゼ活性に基づいてはな らないことを示すものである。

Ｒｈａ　Ｆｕｃ　Ａｒａ　Ｘｙｌ　Ｍａｎ　Ｇａｌ　Ｇｌｃ　Ｇａ１ＡＷＬＩＳ 　Ｉ　１１３１０　２　９４２　２２０．０５ＮＮａ０１（６０４７４１１８１ ２３ＩＮＫＯＨ１３１５２１４１３３１１２４ＮＫＯＨｌ　５　５２９　３　１ ２４０　５残り　Ｉ　Ｉ　１３　８　３　８　６０　６表１１ｍ製リンゴキシロ グルカン（ＡＰＦＸＧ）及びジャガイモキシログルカン（ＰＯＡＸＧ）グリコジ ル　メチル化　推定される　ＡＰＦＸＧ　ＰＯＡＸＧ残基　位置　結合　（モル 比） Ｍａｎ　２，３．６　４−Ｍａｎ　４．８　５．３Ｍａｎ　２．３　４．６−Ｍ ａｎ　Ｏ，５１，７Ｍａｎ　非メチル化　未同定　０．７　１．０Ａｒａ　２． ３．５　Ｔ−ａｒａ　１．３　７．９Ｆｕｃ　２．３．４　Ｔ−ＦｕＣ６，３ｘ ｙ＋　２．３．４　’ｒ−ｘｙ＋　１７．７　９．１Ｘｙｌ　３．４　２−Ｘｙ ｌ　９．８　１０．５ｘｙ＋　２．３　４−Ｘｙｌ　１．０　１．６ｘｙｔ　非 メチル化　未同定　０．６　０．６Ｇａｌ　２，３．４．６　Ｔ−Ｇａｌ　４． ８　８．１Ｇａｌ　３．４．６　２−Ｇａ１　８．２Ｇａｌ　非メチル化　未同 定 Ｇｌｃ　２．３．４　６−Ｇｌｃ　Ｏ，５０，４Ｇｌｃ　２．３．６　４−Ｇｌ ｃ　１５．２　３４．０Ｇｌｃ　２，３　４．６−Ｇｌｃ　２ｇ、６　１９．８ Ｇｌｃ　非メチル化　未同定　ａ　ａ ａ）非メチル化グルコース量はイノシトールからの分離か悪いために定量されな かった。

表Ｉｌｌ　）リコデルマビリデの６種類のエンドグルカナーゼとＣＢＨのＣＭＣ ，ＡＰ酵素　ＣＭＣＡＰＦＸＧ　ＡＰＸＧ　ＰＯＡＸＧ　Ａｖｉｃｅｌ’　Ｐａ ｄｓゝ（ｍｉｎ−’）　（ｍｉｎ−’）　（ｍｉｎ−’）　（ｍｉｎ−’）　（ ｍｉｎ−’）　（ｍｇ／ｍｇ）Ｅｎｄｏｌ　１５１８　９　３２　３６　０．６ ５　０．１２６Ｅｎｄｏｌｌ　１３６３　４　１７　２２　０．３１　０．０９ ０Ｅｎｄｏｌｌｌ　２１２　４　８　１５　０．９１　０．０２６ＥｎｄｏｌＶ 　１１３９　２０１７　２２３７　２３９０　０．０６　０．００３ＥｎｄｏＶ 　１０４９　６００　７８１　１＋４９　０．４２　０．＋０５ＥｎｄｏＶＩ　 ９７４　８０７　１１５０　１１８３　０．２３　０．００４ＣＢＨｎｄ’　ｎ ｄｃｎｄ’　０．４８　０．０６３ａ）　３ｅｌｄｍａｎらＥｕｒ、　Ｊ、　ｂ ｉｏｃｈｅｍ、　（１９８５）　１４６：３０１−３０８による数値。

ｂ）　ＢｅｌｄｍａｎらＢｉｏｔｅｃｈ、　Ｂｉｏｅｎｇ、　３０：２５１−２ ５７による数値。

ｃ）ｎｄ＝測定せず 実施例２ エンドグルカナーゼとセロビオヒドロラーゼの共同作用によるリンゴ果実のモデ ル細胞壁の分解 リンゴＷＵＳの糖組成（表■）から成分多糖についての情報を次のように推論す ることができる。Ｇｌｃ／Ｘｙｌ／Ｇａｌ／Ｆｕｃ比約７：４：２：１　（メチ ル化分析による）を存するキシログルカンに全キシロースが存在することを前提 とすると（Ａｓｐｉｎａｌｌｍ、　Ｆａｍｏｕｓ　（１９８４）　Ｃａｒｂｏｈ ｙｄｒ、　Ｒｅｓ、　４：１９３−２１４）、キシログルカン画分は全糖残基量 的２５％（Ｗ／Ｗ）　、ジコチレドンに通常見られる数値（Ｈａｙａｓｈｉ　Ｔ 、　（１９８９）　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｐｌ ａｎｔ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　４O：１３９−１６８） を含んでいる。残りのグルコース部分（３２％Ｗ／Ｗ）はセルロースとして存在 すると考えられる。これにより、リンゴ細胞壁マトリックス約５７％とみなして いるセルロース−キシログルカン複合体の重要性が強調される。

時間経過実験の場合、６．４ｇｇのＣＢＨ及びｌμｇのＥｎｄｏｌ又はＥｎｄ。

ＩＶを含有する１、５ｍｌのバッファー（Ｅｎｄｏ／ＣＢＨ比０．１６　ｔｔｇ ／Ｊｉｇ＞の全量に２０ｍｇのＷＵＳを懸濁し、特定の間隔で２４時間までイン キュベートした。第２組は、インキュベーション時間（３時間）及び種々のエン ドグルカナーゼ（Ｉ又はＩＶ）量（Ｅｎｄｏ／ＣＢＨ比０．０２〜３０　ｔｔｇ ｈＬｇ）で上記のものと異なった。最後の組においては、Ｅｎｄｏ　Ｉ＋Ｅｎｄ ｏ　ＩＶ　（６，１ｇｇ）及びＣＢＨ（６，４μｇ　）の量を種々のＥｎｄｏ　 Ｉ／Ｅｎｄｏ　ＩＶ比で一定に保ち、３時間インキュベートした。セルロース分 解過程の線形性をＥｎｄｏ／ＣＢＨ比５μｇ／μｇで調べた。インキュベーショ ン混合物を１００°Ｃで１０分間加熱し遠心分離（２分、２０．０００ｇ）した 後、分解産物をＨＰＬＣで分析した。一般に、ＥｎｄＯとＣＢＨとの間の相乗作 用はＡｖｉｃｅｌの分解で還元末端基の増加をめることにより表される。しかし ながら、ＷＵＳのような複合体マトリックスにおいては、これはセロビオースと オリゴマーキシログルカンフラグメントの双方が還元末端基量にあずかるので適 切な方法ではない。従って、ＨＰＬＣ法（Ａｎｉｍｅｘカラム）を用いてセロビ オース（セルロース加水分解の尺度として）と全キシログルカンオリゴ糖の双方 を定量した。単離細胞壁材料をＥｎｄｏ　Ｉ、Ｅｎｄｏ　ＩＶ、ＣＢＨ及びその 種々の組合わせとインキュベートした。図ＩＡは、セロビオースがＣＢＨによっ て形成された唯一の産物であるが両エンドグルカナーゼはセロビオースをＷＵＳ から放出しなかった（データは図示されていない）ことを示すものである。図１ Ｃは、セロビオースと他の化合物の分離を示すものである（図ＩＣの斜線でかげ をつけた面積）。後者はＢｉｏＧｅｌ　Ｐ２及び半分成用ＣａｒｂｏＰａｃ　Ｐ ＡＩによる分画後キシログルカンオリゴ糖として確認した（データは図示されて いない）。

セルロース分解はエンドグルカナーゼとセロビオヒドロラーゼの協調作用を含み 、そのことにより前者は後者が働きかける新しい鎖末端を生成する。低Ｅｎｄｏ ／ＣＢＨ比のエンドグルカナーゼ量は限界があるが、高比率においてはＥｎｄＯ はセルロースに対する結合部位のＣＢＨと相対して開始する。これは、Ｅｎｄｏ 　Ｉ＋ＣＢＨ（１，１モル１モル）及びＥｎｄｏ　ＩＶ＋ＣＢＨ（１４，９モル １モル）双方の場合図２に見られる最適比率があることを示すものである。セル ロース加水分解について最適モル比の違いは両エンドグルカナーゼの種々の吸着 挙動によって部分的に説明することができる（表ＩＩ＋）。低セルロース吸着に は、最適性に達するために多量の酵素が必要である。

種々の最適Ｅｎｄｏ／ＣＢＨ比の他に、可溶化されたセロビオースの全量は特に 注目すべきことであった。Ｅｎｄｏ　ＩＶは、３時間の反応時間後ＷＵＳから放 出されたセロビオース量がＥｎｄｏ　Ｉ＋ＣＢＨとのインキュベーションに比べ て２倍高い程度までＣＢＨの促進能を有する。セルロース分解はキシログルカン の可溶化に関連があるようであり（図２）、前者は後者が最大である場合に最適 である。最適Ｅｎｄｏｌ／ＣＢＨにおいて、セルロース代謝回転はキシログルカ ン代謝回転を超えることが計算される。最適Ｅｎｄｏ　ＩＶ／ＣＢＨの場合には 逆である。

これらのデータは、ＣＢＨとの最適相乗作用か比較的少量のＥｎｄｏｌで得られ るが、セルロース加水分解はＥｎｄｏ　ＩＶ＋ＣＢＨより好ましく進行しないこ とを示した。エンドグルカナーゼは細胞壁材料に様々に作用するようであった。

従って、Ｅｎｄｏｌ及びＥｎｄｏｌＶを種々のＥｎｄｏ　Ｉ／Ｅｎｄｏ　ＩＶ％ ル比であるが、最適Ｅｎｄｏ　Ｉ／ＣＢＨ比と同じ０．９６　ｔ１ｇ／ｌ１ｇの 一定のＥｎｄｏ／ＣＢＨ質量比で所定量のＣＢＨに加えた（図２に示されている ）。

２ｆ１１類のＥｎｄｏ及びＣＢＨを用いて試験した組合わせずへてかセルロース 加水分解反を高めた（図３）。セルロース分解の最適Ｅｎｄｏ　Ｉ／Ｅｎｄｏ　 ＩＶＶＯ２３３＋、：おいて、加水分解反はＥｎｄｏＩ＋ＣＢＨ及びＥｎｄｏＩ Ｖ＋ＣＢＨのみの消化に比へて各々２及び１．２５倍増大した。この点のセロビ オース形成は最適ＥｎｄｏｌＶ／ＣＢＨ比で到達した量に等しいく図２）が、こ の場合にはＩ／７〜ｌ／８のエンドグルカナーゼ量を必要とした。更に、わずか ２０モル％ずつの両エンドグルカナーゼかたいてい最大効果を生じる最適性がか なり広く示していることは言及されなければならない。８０モル％Ｅｎｄｏｌの セロビオース形成の鋭い降下は、キシログルカン画分解の強い減少を伴う。

結果は、キシログルカンコーティングの除去が細胞壁包埋セルロースの効率のよ い加水分解に不可欠であることを示すものである。酵素複合体が結合する被覆さ れないセルロースの表面積に限界かあるので、セルロースを分解するＥｎｄ。

１＋ＣＢＨのポテンシャルは完全に用いられない。Ｅｎｄｏｌによるキシログル カンの代謝回転が低いために（表ＩＩ＋）　、この状態の速い改良は予想されな い。

セルロースに対するＥｎｄｏｌの活性がＥｎｄｏｌＶに比べて高いにもかかわら ず（Ａｖｉｃｅｌ、表ｌ１１）　、セルロース加水分解は低い。Ｅｎｄｏ　ＩＶ ＋ＣＢＨの組合わせの場合、キシログルカンの代謝回転はセルロースの代謝回転 を超え、　°はだかの′セルロースミクロフィブリルは容易に分解される。十分 なセルロース分解ポテンシャルが用いられるが、セルロースへの吸着が低いため に比較的多量のＥｎｄｏ　ＩＶを必要とする（表ｌ１１）。３酵素系は、前の２ 酵素系の正の態様をいっしょにするものである。キシログルカンコーティングを 除去することにより、ＥｎｄｏｌＶはＥｎｄｏｌＶより基質に対して活性の大き いＥｎｄｏｌ＋ＣＢＨのセルロースの接触性を高める。この場合、セルロース代 謝回転は、キシログルカン代謝回転にほとんど等しい。この３酵素系の利点は、 Ｅｎｄｏ　ＩＶ＋ＣＢＨと同様のセロビオース放出に達するためにごく少量の酵 素（１モルに対して少なくとも５倍）を必要とすることである。

本実施例が、モデル細胞壁の分解において一方がセルロースに向けられもう一方 がキシログルカンに向けられる少なくとも２種類のエンドグルカナーゼ活性の重 要性を示すことは明らかである。

２ｇの皮をむいたリンゴ果実組織を０．１％アスコルビン酸を含有する３ｍｌの ２００ｍ１Ｊ：Ｉハク酸塩バッフｙ−ｐＨ４，０に４０°Ｃで１６時間連続振盪 （１５０ｒｐｍ）　Ｌながらインキュベートした。バッファーは、２種類のＧ１ ５ｔ−ｂｒｏｃａｄｅｓ製酵素標品：　Ｍａｘａｘｙ呪ＣＬ（トリコデルマビリ デ）及びＸＹＩ　５０００（ジスポロトリク幻の酵素の適量を含有した。Ａｖｉ ｃｅ１分解ポテンシャルは１０ｍＵであり、付随するＸＧａ５ｅ活性はＭａｘａ ｚｙｍｅ及びｘｙ＋　５０００に対して各々２００及び１００ｍＵであった。ペ クチンリアーゼ（ＰＬＸ５０ｍＵ）（ＰＬ精製についてｖａｎ　Ｈｏｕｄｅｎｈ ｏｖｅｎ（Ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｐｅｃｔｉｎ　１ｙａｓｅ、　Ｐｈ、Ｄ、　 ｔｈｅｓｉｓ　（１９７５）、　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉ魔■窒唐奄 狽■ Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ、　Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ参照）を適切なイン キュベーションに加えてペクチン質をを分解しかつセルロース−キシログルカン 網目構造の接触性を高めた。

処理及び肉視評価後、インキュベーション混合液から１ｍｌを取り出し、１００ °Ｃで１０分間加熱して酵素を不活化し、遠心分離（２分、２０．ＯＯＯｇ）ｔ 、、上清の分解産物をＨＰＡＥＣで分析した。

Ｍａｘａｚｙｍｅ単独は１６時間以内に皮をむいたリンゴ果実組織を大部分分解 することは不可能である（図４）。同じ状況でＩＪａｘａｚｙｍｅが材料を完全 に液化させるには５０ｍ１ペクチンリアーゼ（ＰＬ）の最少量を必要とした。従 って、ＰＬをセルロース−ＸＧ網目構造がグルカナーゼに接触できる濃度で全イ ンキュベーションに加えた。ＰＬ及びｘｙｔ　５０００の組合わせでは液化を完 全に得ることができなかったが、セルロース分解ポテンシャルはＰＬとＭａｘａ ｚｙｍｅの組合わせと同じであった。しかしながら、ＸＧａ５ｅ活性は１／２で あり、これはＸＣ；ａｓｅ活性が液化に重要であることを示すものである。従っ て、ｘｙｔ　５ｏｏｏのｘｃａｓｅ活性は適量のＥｎｄｏＶを加えることにより ！Ｊａｘａｚｙｍｅのレベルまで高めた。図４は、分解の程度がＰＬとＩＪａｘ ａｚｙｍｅの組合わせで得られたものに匹敵することを示すものである。Ｅｎｄ ｏＶの添加でセロビオース放出は１．６倍増加するが、ＰＬとＭａｘａｚｙｍｅ とのインキュベーションに比べるとまだ約１１５である。同量のＥｎｄｏｌタン パク質を加えると、セロビオース放出に影響しなかった（データは示されていな い）。別のリンゴバッチが上記酵素組合わせについて同様のセロビオース放出を 得たことは留意しなければならない。しかしながら、定量された液化の程度はか なり違って見えたが、図４と同様のパターンが得られた。市販の標品はエンドグ ルカナーゼ（ＣＭＣａｓｅ活性）とＣＢＨ（組織からセロビオース放出）の双方 を含有する。ＭａｘａｚｙｍｅとＸｙｌ　５０００のセルロース分解ポテンシャ ルは同じ（１０ｍＵ）であるが、両標品の性能はかなり違っていた（図４）。こ れらの標品におけるＣＭＣａｓｅ活性は同じ桁数であるが、Ｍａｘａｚｙｍｅの Ａｖｉｃｅｌに対する活性は１０倍である。これは、Ｍａｘａｚｙｍｅがｘｙｔ 　５０００よりかなり多く含有しかつエンドグルカナーゼが後者のＡｖｉｃｅｌ に対する活性に比較的大部分関与することを示すものである。本実施例は、更に 前に示したＣＢＨに対するエンドグルカナーゼの適切な比率の重要性を示すもの である。この比率について、Ｅｎｄｏｌ又はＥｎｄｏＶのＸｙｌ　５０００への 添加は不思議なよってあるが、ここでの主な目的は細胞壁包埋セルロースからキ シログルカンコーティングを除去することであった。

本実施例は、ＸＧａ５ｅ活性がリンゴの液化に重要であることを示すものである 。

実施例４ 精製酵素の混合物を用いるリンゴ組織の分解ＥｎｄｏｌとＣＢＨを約３．５の質 量比で組合わせることにより“低ＸＧａ５ｅ”混合物を得た。Ｅｎｄｏｌの代わ りにＥｎｄｏＶを用いて“高ＸＧａ５ｅ”混合物を作成した。適切な方法でこれ らの２種類の混合物を組合わせることにより、中間ＸＧａ５ｅ活性を有する５種 類の混合液を作成した。精製酵素の７種類の混合物のアビセラーゼ活性をＥｎｄ ｏｒとＥｎｄｏＶとＣＢＨ及びＣＢＨなしの対応する混合物のＡｖｉｃｅｌに対 する活性の違いとして定義した。すべてのインキュベージコンが等量のアビセラ ーゼ活性（０，２６ｍＵ）を含むが種々の量のＸＧａ５ｅ活性（４〜４０ｍＵ） を含むような方法で上記７種類の混合物の１つでリンゴ材料を分解した。

Ｂｅｌｄｍａｎら（１９８７）は、Ａｖｉｃｅｌ結晶性セルロースをトリコデル マビリデの種々のエンドグルカナーゼで分解すると種々の（比率の）産物（グル コース、セロビオース、セロトリオース）を生じることを示した。しかしながら 、リンゴＷＵＳをＥｎｄｏ　Ｉ又はＥｎｄｏｌＶとＣＢＨとインキュベートする と、セロビオースが放出された唯一の産物であった。この違いは、おそらくセロ ビオースがＥｎｄｏＩを含有するインキュベーション混合液に見られないことか らリンゴ組織の分解にもあてはまる。グルコースは、当然リンゴに多量に存在す るので分析することかできなかった。従って、精製グルカナーゼの混合物のアビ セラーゼ活性を、エンドグルカナーゼとＣＢＨ（エンドグルカナーゼ／ＣＢＨ質 量比は約３．５である）及びエンドグルカナーゼの活性の違いとして定義した。

このことにより両酵素（Ｅｎｄｏｌ及びＥｎｄｏＶ）かＡｖｉｃｅｌ及びリンゴ セルロースに対して同様に挙動すると考えられる。

図５は、ＸＧａ５ｅ活性が増大すると残りのリンゴ組織からセロビオースが放出 されることを示すものである。　゛はだかの゛表面積はＸＧａ５ｅ活性が約２５ ｍｕのレベルに達するまでセルロース分解の限定因子である。この点の後、セロ ビオース放出はおそら＜ＣＢＨ量によって限定される。グルカナーゼ混合物の性 能も肉視評価される。液化の程度は図４の試料“３′に匹敵しくデータは示され ていない）、セロビオース放出を組織分解の初期段階でめたことが示される。こ れらの実験を２倍のグルカナーゼ量及びインキュベーション時間の延長（４０時 間）で繰り返した。低ＸＧａ５ｅ活性によるインキュベーションはなお数組縁片 を示したが、高ＸＧａ５ｅ活性によるインキュベーションのリンゴ材料は完全に 液化された（データは示されていない）。

精製酵素でもリンゴ組織の分解にＸＧａ５ｅ活性が重要であることを示すことか できた。更に、リンゴＷＵＳについての結果を全組織に置き換えることかできる 。

ＦＩＧＬＩＲＥ　１ ○　２０　乙０　６０　８０　１００ ＦＩＧＵＲＥ４ ・つ　９　ｉ８　２／　３６　乙５ キンロクルカナーゼ　（ｍｕ） ＦＩＧＬＩＲＥ　５ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　ｃｉ、　６　識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｒ１：８８５ ） （７２）発明者　ヴオラーヘン　アルフオンス　へラルトヨセフ オランダ国　エフエル−６フ０５ベーベー　ワーゲニンへン　スパーレンポス　 ３７ Ｉ

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ及びキシログルカナーゼ活性を 含むセルロース分解酵素の単離混合物。
2. ２．酵素を所定量で混合することにより得られたエンドグルカナーゼ、セロビオ ヒドロラーゼ及びキシログルカナーゼ活性を含むセルロース分解酵素の混合物。
3. ３．キシログルカナーゼ活性がエンドグルカナーゼにあることを特徴とする請求 項１又は２記載の混合物。
4. ４．キシログルカナーゼ活性がトリコデルマリーセイエンドグルカナーゼＥｎｄ ｏＩＶ〜ＥｎｄｏＶＩからなる群より選ばれたエンドグルカナーゼにあることを 特徴とする請求項３記載の混合物。
5. ５．添加酵素の少なくとも１種が精製状態にある請求項２〜４のいずれか１項に 記載の混合物。
6. ６．混合物が最適なセルロース分解を生じるのに十分な量のキシログルカナーゼ 活性を含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の混合物。
7. ７．酵素がトリコデルマ、アスルギルス又はジスポロトリクムから入手できるこ とを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の混合物。
8. ８．エンドグルカナーゼがトリコデルマリーセイ由来のＥｎｄｏＩ及びＥｎｄｏ ＩＶであり、一定の（ＥｎｄｏＩ＋ＥｎｄｏＩＶ）／ＣＢＨ質量比０．５−２０ （ｇ／ｇ）においてＥｎｄｏＩ／ＥｎｄｏＩＶモル比０．１−３を含むことを特 徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の混合物。
9. ９．エンドグルカナーゼがトリコデルマリーセイ由来のＥｎｄｏＩ及びＥｎｄｏ ＩＶであり、一定の（ＥｎｄｏＩ＋ＥｎｄｏＩＶ）／ＣＢＨ質量比０．９６（ｇ ／ｇ）においてＥｎｄｏＩ／ＥｎｄｏＩＶモル比０．３３を含むことを特徴とす る請求項８記載の混合物。
10. １０．エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ及びキシログルカナーゼを含 むセルロース分解酵素の混合物の調製方法であって、該酵素を所定量で混合する ことを特徴とする方法。
11. １１．エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ及びキシログルカナーゼ活性 の共同作用を含むキシログルカン／セルロース複合体を含有する材料の分解方法 。
12. １２．トリコデルマ、アスルギルス又はジスポロトリクムから入手できるエンド グルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ及びキシログルカナーゼ活性の組合わせの 使用を特徴とする請求項１１記載の方法。
13. １３．請求項１〜９のいずれか１項に記載の混合物の使用を特徴とする請求項１ １記載の方法。
14. １４．ペクチンリアーゼの作用が含まれることを特徴とする請求項１１記載の方 法。
15. １５．材料が食品、飼料、紙、パルプ及び織物原料を含む群より選ばれる請求項 １１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
16. １６．キシログルカン／セルロース複合体を請求項１〜９のいずれか１項に記載 の酵素混合物で処理した後得られた産物。
17. １７．該産物がリンゴ由来であることを特徴とする請求項１６記載の産物。