HUT70470A - Combined action of endoglucanases and cellobiohydrolases - Google Patents
Combined action of endoglucanases and cellobiohydrolases Download PDFInfo
- Publication number
- HUT70470A HUT70470A HU9500044A HU9500044A HUT70470A HU T70470 A HUT70470 A HU T70470A HU 9500044 A HU9500044 A HU 9500044A HU 9500044 A HU9500044 A HU 9500044A HU T70470 A HUT70470 A HU T70470A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- endoglucanases
- cellulose
- endoiv
- cbh
- mixture
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01091—Cellulose 1,4-beta-cellobiosidase (3.2.1.91)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K10/00—Animal feeding-stuffs
- A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
- A23K10/14—Pretreatment of feeding-stuffs with enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L2/00—Non-alcoholic beverages; Dry compositions or concentrates therefor; Their preparation
- A23L2/70—Clarifying or fining of non-alcoholic beverages; Removing unwanted matter
- A23L2/84—Clarifying or fining of non-alcoholic beverages; Removing unwanted matter using microorganisms or biological material, e.g. enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L5/00—Preparation or treatment of foods or foodstuffs, in general; Food or foodstuffs obtained thereby; Materials therefor
- A23L5/20—Removal of unwanted matter, e.g. deodorisation or detoxification
- A23L5/25—Removal of unwanted matter, e.g. deodorisation or detoxification using enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
- C08B37/0057—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid beta-D-Xylans, i.e. xylosaccharide, e.g. arabinoxylan, arabinofuronan, pentosans; (beta-1,3)(beta-1,4)-D-Xylans, e.g. rhodymenans; Hemicellulose; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
-
- D—TEXTILES; PAPER
- D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- D06M—TREATMENT, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE IN CLASS D06, OF FIBRES, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR FIBROUS GOODS MADE FROM SUCH MATERIALS
- D06M16/00—Biochemical treatment of fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, e.g. enzymatic
- D06M16/003—Biochemical treatment of fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, e.g. enzymatic with enzymes or microorganisms
-
- D—TEXTILES; PAPER
- D21—PAPER-MAKING; PRODUCTION OF CELLULOSE
- D21C—PRODUCTION OF CELLULOSE BY REMOVING NON-CELLULOSE SUBSTANCES FROM CELLULOSE-CONTAINING MATERIALS; REGENERATION OF PULPING LIQUORS; APPARATUS THEREFOR
- D21C5/00—Other processes for obtaining cellulose, e.g. cooking cotton linters ; Processes characterised by the choice of cellulose-containing starting materials
- D21C5/005—Treatment of cellulose-containing material with microorganisms or enzymes
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Textile Engineering (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Physiology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Chemical Or Physical Treatment Of Fibers (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
A találmány tárgya a sejtfal lebontásával kapcsolatos. A találmány enzim kombinációknak a növényi sejtfalak lebontásában való felhasználását közli. Közli a xiloglükanáz aktivitás felhasználásának előnyét. A sejtfalat lebontó enzimek jellemző legkedvezőbb értékre beállított arányait is közli. Kifejezetten az endoglükanázok és cellobiohidrolázok kombinált hatását közli egy xiloglükán/cellulóz komplex lebontásában.The present invention relates to the destruction of the cell wall. The invention discloses the use of enzyme combinations in the degradation of plant cell walls. It discloses the advantage of using xyloglucanase activity. It also provides the most favorable ratios of enzymes that break down the cell wall. Specifically, it reports the combined effect of endoglucanases and cellobiohydrolases on the degradation of a xyloglucan / cellulose complex.
Továbbá bemutatja, hogy ezek az enzimek szinergikus hatásúak .It further demonstrates that these enzymes are synergistic.
A növényi sejtfal enzimes lebontásának tanulmányozása során eddig a növényi sejtfal két szerkezeti alkotórészét vizsgálták széles körben, ezek a cellulóz és a pektin.To date, two structural components of the plant cell wall, cellulose and pectin, have been extensively studied in the study of enzymatic degradation of the plant cell wall.
A cellulóz és pektin anyagoktól eltekintve egy harmadik sejtfal szerkezeti elemet is meg kell említeni: a xiloglükánokat [Hayashi et al.; Plánt Physiol., 75, 605-610 (1984); Hayashi T.; Ann. Rév. Plánt Physiol. Plánt Mól. Bioi., 4 0, 139-168 (1989)] . A xiloglükánok egy olyan cellulóz gerincet tartalmaznak, amelyben a glükóz csoportok körülbelül 70%-a oldalláncokkal szubsztituált. Ezek az oldalláncok elsődlegesen xilózt, galaktózt és fukózt tartalmaznak. Továbbá a cellulózhoz hidrogénkötéssel erősen kötődnek [Hayashi et al.; Plánt Physiol. 83, 384-389; Talbott L.D. és P.M.Ray; Plánt Physiol., 98, 357-368 (1992)] és más sejtfal alkotórészekhez is kötődnek [ Fry S.C. és J.G.Miller; (1989). A növekvő növényi sejtfal működő modelljéhez: fenolos keresztkötési reakciók a kétszikűek elsődleges sejtfalában. Lewis N.G.; Paice M.G.; Eds. The biosynthesis and biodegradation of plánt cell wall polymers, ÁCS, Washington, DC, 33-36.Apart from cellulose and pectin materials, a third cell wall structural element should be mentioned: the xyloglucans [Hayashi et al .; Plant Physiol. 75: 605-610 (1984); Hayashi T .; Ann. Port. Plant Physiol. Plant Mole. Bioi., 1989, 40, 139-168. Xyloglucans contain a cellulose backbone in which about 70% of the glucose groups are substituted by side chains. These side chains contain primarily xylose, galactose and fucose. Further, they are strongly bound to cellulose by hydrogen bonding [Hayashi et al .; Plant Physiol. 83, 384-389; Talbott L.D. and P.M.Ray; Plant Physiol., 98, 357-368 (1992)] and other cell wall components [Fry, S.C. and J.G. Miller; (1989). For a working model of a growing plant cell wall: phenolic cross-linking reactions in the primary cell wall of dicotyledons. Lewis N.G.; Paice M.G.; Eds. The Biosynthesis and Biodegradation of Plant Cell Wall Polymers, ÁCS, Washington, DC, 33-36.
oldalon és Talbott L.D. és P.M.Ray; (1992) fent idézett dolgozatában] .page and Talbott L.D. and P.M.Ray; (1992), supra.
Bár a xiloglükánok viszonylag nagy mennyiségben vannak jelen [ a kétszikűekben T. Hayashi (1989, fent idézett munkája) szerint körülbelül 20%-ban], a növényi anyag enzimes elfolyósítási folyamata tekintetében nem fordítottak figyelmet a xiloglükánokra [ Voragen et al.; Fiüss. Obst., 5 9, 404-410 (1992)] . A glükanázok tisztítása alatt kiszűrt aktivitások a (gyakran Cxként vagy endoglükanázként azonosított) (karboxi-metil)-celluláz (CMCase), a (gyakran C^-ként, cellobiohidrolázként vagy exoglükanázként azonosított) aviceláz és néha cellobiáz vagy β-glükozidáz. Xiloglükanáz (XGase) aktivitás általában nincs. Ez azt jelenti, hogy a mai napig a sejtfal lebontásban nincs rendszeres használatban a xiloglükanáz aktivitás.Although xyloglucans are present in relatively large amounts (about 20% in dicotyledons according to T. Hayashi (1989, cited above)), no attention has been paid to xyloglucans in the enzymatic liquefaction process of plant material [Voragen et al .; Fiüss. Obst., 5, 9, 404-410 (1992)]. The activities screened during the purification of glucanases are (carboxymethyl) cellulase (often identified as C x or endoglucanase) (CMCase), avicellase (often identified as C 4, cellobiol hydrolase or exoglucanase) and sometimes cellobiase or β-glucosidase. Xyloglucanase (XGase) activity is generally absent. This means that xyloglucanase activity is not regularly used in cell wall degradation.
Viszonylag keveset tudunk a xiloglükánok szerepéről a gyümölcslégyártás folyamatában. A xiloglükánok a pektinhez hasonlóan közismerten jó gélképzőszerek [ M. Glicksman; a Glicksman M. által szerkesztett Food Hydrocolloids 3, CRC Press Boca Raton, Florida (1986) 191-202.oldalain] , és mint ilyenek használatosak Japánban. Az almaszövetek elfolyósífásához az elsődleges sejtfal nagytömegű alkotórészének, a cellulóznak hatékony lebontása lényeges. A sejtfalba beágyazott cellulóz megközelíthetőségét csökkentik a jelenlevő egyéb sejtfal alkotórészek, például a pektin és xiloglükán.Relatively little is known about the role of xyloglucans in fruit production. Xyloglucans, like pectin, are known to be good gel-forming agents [M. Glicksman; edited by Glicksman M., Food Hydrocolloids 3, CRC Press Boca Raton, Florida (1986) 191-202] and used as such in Japan. Effective decomposition of the bulky component of the primary cell wall, cellulose, is essential for the flow of apple tissues. The accessibility of cellulose embedded in the cell wall is reduced by the presence of other cell wall components such as pectin and xyloglucan.
Kimutatták, hogy a pektin eltávolítása elősegíti a cellulóz lebomlását. A xiloglükánoknak viszont csekély figyelmet szenteltek.Removal of pectin has been shown to promote cellulose degradation. However, little attention was paid to xyloglucans.
A találmány közli a xiloglükanáz aktivitás cellulóz sejtfal lebontásában való felhasználásának előnyeit.The present invention discloses the advantages of using xyloglucanase activity in cellulosic cell wall degradation.
A találmány tárgyát képezik xiloglükanáz aktivitással rendelkező endoglükanázok és cellobiohidrolázok keverékei, amelyeket alkalmassá teszünk optimális cellulóz lebontásra. Egy jellemző keverék három enzimet tartalmaz; endoglükanáz I-et, endoglükanáz IV-et és cellobiohidrolázt, egy másik jellemző keverék két enzimet tartalmaz; endoglükanáz V-öt és cellobiohidrolázt.The present invention relates to mixtures of endoglucanases with xyloglucanase activity and cellobiohydrolases which are adapted for optimal cellulose degradation. A typical mixture contains three enzymes; endoglucanase I, endoglucanase IV and cellobiohydrolase, another typical mixture containing two enzymes; endoglucanase V and cellobiohydrolase.
Az endoglükanázok és cellobiohidrolázok keverékében a xiloglükanáz és aviceláz aktivitás arányt úgy választjuk meg, hogy optimális cellulóz hidrolízist biztosítson.In the mixture of endoglucanases and cellobiohydrolases, the ratio of xyloglucanase to avicellase activity is chosen to provide optimum cellulose hydrolysis.
A találmány egy másik megvalósításában a jellemző EndoI/Endo-IV/CBH keverék enzimek tömegarányait úgy választjuk meg, hogy állandó, 0,5-20 (g/g) közötti (Endol + EndoIV)/CBH tömegarányt és 0,1-3 közötti optimális EndoI/EndoIV mólarányt használunk.In another embodiment of the invention, the weight ratios of typical EndoI / Endo-IV / CBH blend enzymes are chosen such that a constant weight ratio of (Endol + EndoIV) / CBH of 0.5-20 (g / g) and 0.1-3 an optimal EndoI / EndoIV molar ratio is used.
Előnyösen az endoglükanáz/cellobiohidroláz tömegarány 0,96 és az EndoI/EndoIV mólarány 0,33.Preferably, the weight ratio of endoglucanase / cellobiohydrolase is 0.96 and the molar ratio EndoI to EndoIV is 0.33.
Ezenkívül leírjuk az igényelt keverékek előállítási eljárásait is .In addition, processes for preparing the claimed mixtures are described.
A találmány további tárgya egy eljárás sejtfalba ágyazott xiloglükán/cellulóz komplex endoglükanázok (Endo), cellobiohidrolázok (CBH) és xiloglükanáz aktivitás kombinált hatása által történő lebontására. Jellemzően alma sejtfalcellulózt bontunk le.It is a further object of the present invention to provide a process for the degradation of xyloglucan / cellulose complex endoglucanases (Endo), cellobiohydrolases (CBH) and xyloglucanase activity embedded in a cell wall. Typically, apple cell wall cellulose is degraded.
Az eljárás endoglükanázok és cellobiohidrolázok egy kombinációját hasznosítja. Az endoglükanázt előnyösen a xiloglüka5 náz aktivitás alapján választjuk ki. Enzimforrásként elvben bármilyen, a közölt aktivitásokkal rendelkező enzimeket termelő törzset használhatunk. Az enzimeket előnyösen Trichodermá-ból, Aspergillus-ból vagy Disporotrichum-ból nyerhetjük.The process utilizes a combination of endoglucanases and cellobiohydrolases. The endoglucanase is preferably selected on the basis of xyloglucose activity. In principle, any strain producing enzymes having the indicated activities can be used as an enzyme source. The enzymes are preferably obtained from Trichoderma, Aspergillus or Disporotrichum.
A találmány közli a xiloglükanáz aktivitások használatát a sejtfalanyagok lebontásában. Jellemzően egy xiloglükán/cellulóz komplex lebontásában.The invention discloses the use of xyloglucanase activities in the degradation of cell wall materials. Typically in the degradation of a xyloglucan / cellulose complex.
A találmány további tárgyát képezik xiloglükán/cellulóz komplexet tartalmazó növényi anyag xiloglükanázt tartalmazó cellulózbontó enzimkeverékekkel való kezelése után kapott termékek. A termék jellemzően almából származik. Még jellemzőbban a termék almaié.The present invention further provides products obtained by treating plant material containing xyloglucan / cellulose complex with xyloglucanase-containing cellulosic enzyme mixtures. The product is typically derived from apples. Even more typically, the product belongs to apples.
Az ábrák rövid ismertetéseBrief Description of the Drawings
1. ábra. A jellemző kromatogramok alma vízzel nem extrahálható anyagának (WUS), glükanázokkal (azok kombinációjával) oldhatóvá tett lebontási termékeinek Aminex HPX 22H oszlopon végzett analízisét mutatják: A görbe CHB; B görbe Endol + CBH; C görbe Endo-IV+CBH. Egy maltodextrin szirup elúciós profilját nyilakkal, a megfelelő polimerizációfokkal jelöljük. EndoIV jellemző lebomlási termékeit a bevonalkázott csúcsokkal jelöljük. Ezeknek a területeknek összegét használjuk a xiloglükán oligoszacharidok mennyiségi meghatározására.Figure 1. The analysis of the characteristic chromatograms of the degradation products of apple water-non-extractable water (WUS) solubilized with glucanases (combinations thereof) on an Aminex HPX 22H column shows: The curve is CHB; Curve B Endol + CBH; Curve C Endo-IV + CBH. The elution profile of a maltodextrin syrup is indicated by arrows, corresponding to the degree of polymerization. Representative degradation products of EndoIV are indicated by the coated peaks. The sum of these areas is used to quantify xyloglucan oligosaccharides.
2. ábra. Az endoglükanáz/cellobiohidroláz arány hatása az alma-WUS-ból származó cellobióz és oligomer xiloglükán fragmentumok felszabadulására; □ cellobióz felszabadítás EndoI+CBH-val; o cellobióz felszabadítás EndoIV+CBH-val; · xiloglükán frgamentumok felszabadítása EndoIV +CBH-val; FXG=fukozilált xiloglükán.Figure 2. Effect of endoglucanase / cellobiohydrolase ratio on release of cellobiose and oligomeric xyloglucan fragments from apple-WUS; □ release of cellobiose by EndoI + CBH; o release of cellobiose with EndoIV + CBH; · Release of xyloglucan fragments with EndoIV + CBH; FXG = fucosylated xyloglucan.
3. ábra. Cellobióz (Δ) és xiloglükán oligoszacharidok (í) felszabadulása egy három enzimes rendszerben, 0,96 pg/g rögzített (En-doI+EndoIV)/CBH tömegaránnyal és változó Endol és EndoIV meny-nyiségekkel.Figure 3. Release of cellobiose (Δ) and xyloglucan oligosaccharides (1) in a three enzyme system, with a fixed weight ratio (EndoI + EndoIV) / CBH of 0.96 pg / g and varying amounts of Endol and EndoIV.
4. ábra. Nyers alma gyümölcsszövet elfolyósítása pektin liázzal (PL) és (lásd a 3.példát, javított) kereskedelmi enzimkészítményekkel. Nyers alma gyümölcsszövetet inkubálunk 200 mM 4,0 pH értékű szukcinát pufferben 16 órán át, 40°C-on és 150 fordulat/percnél. 1, enzim hozzáadása nélkül; 2, Maxazyme (10 mU aktivitás Avicellel szemben, 200 mU XGase); 3, 50 mU PL; 4, 2 és 3 kombinációja; 5, Xyl 5000 (10 mU aktivitás Avicellel szem-ben, 100 mU XGase-zal szemben); 6, 3 és 5 kombinációja; 7, mint 6 plusz 100 mU EndoV.Figure 4. Liquidation of crude apple fruit tissue with pectin lyase (PL) and (see Example 3, improved) commercial enzyme preparations. Raw apple fruit tissue was incubated in 200 mM succinate pH 4.0 for 16 hours at 40 ° C and 150 rpm. 1, without addition of enzyme; 2, Maxazyme (10 mU activity against Avicel, 200 mU XGase); 3.50 mU PL; A combination of 4, 2 and 3; 5, Xyl 5000 (10 mU activity against Avicel, 100 mU against XGase); A combination of 6, 3 and 5; 7 than 6 plus 100 mU EndoV.
5. ábra. Cellobióz felszabadítása alma gyümölcsszövetből tisztított glükanázok keverékével. Előfőzött alma gyümölcsszövetet inkubáltunk (200 mM 4,0 pH értékű szukcinát pufferben, 16 órán át, 40°C-on, 150 fordulat/percnél) azonos Avicelt lebontó potenciállal (0,26 mU) , de eltérő XGase aktivitással (5-40mU) rendelkező különböző glükanáz keverékekkel kombinált PL-zal. A cellobióz mennyiségi meghatározását HPAEC-vel (high performance affinity elution chromatography) végeztük.Figure 5. Release of cellobiose by a mixture of glucanases purified from apple fruit tissue. Pre-cooked apple fruit tissue (200 mM succinate pH 4.0 in buffer for 16 hours at 40 ° C, 150 rpm) was incubated with the same Avicel degradation potential (0.26 mU) but with different XGase activity (5-40mU). PL with different glucanase mixtures. Quantification of cellobiose was performed by high performance affinity elution chromatography (HPAEC).
A találmány részletes leírásaDetailed Description of the Invention
A találmány tárgya xiloglükanáz aktivitással rendelkező enzimek használata xiloglükánokat tartalmazó biológiai anyagok lebontásában .The present invention relates to the use of enzymes having xyloglucanase activity in the degradation of biological materials containing xyloglucans.
Azon megállapítás alapján, hogy a glükanázok CMCase és Aviceláz aktivitásra való szűrése nem megfelelő mérce a xiloglüká nokra irányuló aktivitással rendelkező enzimek megtalálására, a glükanázokat xiloglükánokkal szemben mutatott aktivitásra szűrtük. Megállapítottuk, hogy a különböző endoglükanázok aktivitása között eltérés van.Based on the finding that glucanase screening for CMCase and Avicellase activity is not a suitable measure for finding enzymes with xyloglucan activity, glucanases were screened for xyloglucan activity. We found that there is a difference in the activity of different endoglucanases.
A találmány továbbá közli endoglükanázok, cellobiohidrolázok és xiloglükanáz aktivitásait tartalmazó cellulózt lebontó enzimkeverékek használatának előnyeit. A keveréket előnyösen Trichoderma-ból, Aspergillus-ból vagy Disporotrichum-ból nyerjük. A keverékeket, további tisztítás nélkül, ezeknek a mikroorganizmusoknak szaporító táptalajából izoláljuk. Meg kell jegyeznünk, hogy a keverékben a különböző enzimek aktivitása és aránya függ a szubsztráttól, a szaporítási körülményektől és a fermentálásnál használt törzsektől.The invention further provides the advantages of using cellulose-degrading enzyme mixtures containing endoglucanases, cellobiohydrolases and xyloglucanase activities. Preferably the mixture is obtained from Trichoderma, Aspergillus or Disporotrichum. The mixtures are isolated without further purification from the growth medium of these microorganisms. It should be noted that the activity and ratio of different enzymes in the mixture will depend on the substrate, the growth conditions and the strains used in the fermentation.
Ha az ilymódon izolált keverék a kívánt arányú enzimaktivitást tartalmazza, magát a keveréket használjuk. A kívánt arány a lebontandó szubsztráttól függ, és előnyösen meghatározzuk minden szubsztrátra.If the mixture so isolated contains the desired ratio of enzyme activity, the mixture itself is used. The desired ratio depends on the substrate to be degraded and is preferably determined for each substrate.
Ha az izolált keverék további kezelés nélkül nem tartalmazza a kívánt arányú enzimaktivitásokat, különböző tenyészetekből származó keverékeket használunk az arány javítására. Az is lehetséges, hogy a különböző törzsek vagy fajták szaporításából származó tenyésztő folyadékokat keverjük. Más módon a kívánt enzimaktivitás arány elérése céljából az enzimeket tisztítjuk. A tisztítást bármilyen, a szakember által ismert eljárással elvégezhetjük. Az enzimeket előnyösen 70%-os tisztasági szintre tisztítjuk. Még előnyösebb, ha a tisztasági szint 90%, különösen előnyös, ha meghaladja a 95%-ot. A Beldman et al . [ Eur. J.If the isolated mixture does not contain the desired ratio of enzyme activities without further treatment, mixtures from different cultures are used to improve the ratio. It is also possible to mix the culture fluids from the propagation of different strains or varieties. Alternatively, the enzymes are purified to obtain the desired enzyme activity ratio. Purification can be carried out by any method known to those skilled in the art. Preferably, the enzymes are purified to a purity level of 70%. More preferably, the purity level is 90%, more preferably greater than 95%. Beldman et al. [Eur. J.
Biochem., 146, 301-308 (1985)] szerinti tisztítás hat endoglükanázt (EndoI-VI) és két cellobiohidrolázt (CBH) eredményez. A találmányi leírásban használt enzim nomenklatúra a Beldman et al. publikációnak [ Biotech. Bioeng., 31, 160-167 (1988)] , felel meg, és ennélfogva eltér a többi publikációtól. A találmány leírásában közölteken kívül más eljárásokat és forrásokat is használhatunk az ismertetett enzimek nyerésére. Egy alternatív megközelítés lehet a klónozás és a kívánt enzim(ek)et kódoló gén(ek) termelése olyan heterológ mikroorganizmusokban, amelyek nem fertőződhetnek más enzimekkel. Azonban homológ mikroorganizmust is használhatunk klónozásra és a kívánt gén(ek) feleslegben való termelésére. Ebben az esetben a különböző enzimek arányát külső enzimadagolás nélkül befolyásolhatjuk. A keverékhez tartozó jellemző enzimek inaktiválása is lehetséges. Differenciált inaktiválást például melegítéssel, a pH megváltoztatásával vagy specifikus inhibitorok adagolásával érhetünk el.Biochem., 146, 301-308 (1985)] yields six endoglucanases (EndoI-VI) and two cellobiohydrolases (CBH). The enzyme nomenclature used in the present invention is described in Beldman et al. Biotech. Bioeng., 31, 160-167 (1988)] and is therefore different from other publications. In addition to those described herein, methods and sources for obtaining the disclosed enzymes may be used. An alternative approach may be cloning and production of the gene (s) encoding the desired enzyme (s) in heterologous microorganisms that cannot be infected with other enzymes. However, a homologous microorganism may also be used for cloning and production of the desired gene (s) in excess. In this case, the ratio of different enzymes can be influenced without external enzyme addition. It is also possible to inactivate typical enzymes of the mixture. Differential inactivation can be achieved, for example, by heating, changing the pH, or by adding specific inhibitors.
Endoglükanázok, cellobiohidrolázok és xiloglükanáz aktivitásait tartalmazó, cellulózt lebontó előnyös enzimkeverékeket a tisztított enzimek előre meghatározott mennyiségeinek keverésével vagy a kívánt végső enzimaktivitás arányokat adó, előre meghatározott aktivitású keverékek kombinálásával kapunk.Preferred cellulose-degrading enzyme mixtures containing the activities of endoglucanases, cellobiohydrolases and xyloglucanase are obtained by mixing predetermined amounts of purified enzymes or by combining predefined activity mixtures to obtain desired final enzyme activity ratios.
A találmány közli, hogy a sejtfalanyag lebontásában használva a különböző enzimek szinergikus hatásúak. Ez a hatás különösen világos, ha a keveréket specifikus arányokban xiloglükanáz aktivitást tartalmazó endoglükanázokból és cellobiohidrolázokból készítjük. Az enzimek előnyös tömegarányai a használt szubsztráttól függnek.The invention discloses that when used to degrade cell wall material, various enzymes have a synergistic effect. This effect is particularly clear when the mixture is prepared from endoglucanases and cellobiohydrolases having specific proportions of xyloglucanase activity. Preferred weight ratios of enzymes depend on the substrate used.
A (jelenleg Trichoderma reesei-ként ismert) Trichoderma viride celluláz komplexéről kimutatták, hogy hat megkülönböztetett endoglükanázt tartalmaz [ Beldman et al; Eur. J. Biochem., 146, 301-308 (1985)] , amelyeket xilánokat lebontó képességük alapján két osztályba sorolhatunk: egy specifikus (Endo I, II és III) és egy nem specifikus (Endo IV, V és VI) osztályba. Az 1. példában bemutatjuk, hogy xiloglükánt lebontó képességük alapján az endoglükanázokat három enzimcsoportba oszthatjuk: egy csoport aktív cellulózra (Avicel), például az Endol, egy csoport aktív xi-loglükánokra, például EndoIV, és egy csoport aktív mindkét szubsztrátra, például EndoV (lásd a 3. táblázatban).The Trichoderma viride cellulase complex (currently known as Trichoderma reesei) has been shown to contain six distinct endoglucanases [Beldman et al; Eur. J. Biochem., 146, 301-308 (1985)], which can be divided into two classes based on their ability to degrade xylans: one specific (Endo I, II and III) and one non-specific (Endo IV, V and VI). Example 1 illustrates that, by virtue of their ability to degrade xyloglucan, endoglucanases can be divided into three groups of enzymes: one group for active cellulose (Avicel), e.g. Endol, one group for active xyloglucans, such as EndoIV, and in Table 3).
A találmány közli a xiloglükanáz aktivitást tartalmazó endoglükanáz IV, V és Vl-nak az endoglükanáz I, II és III-hoz képest előnyös használatát (3.táblázat).The invention discloses the advantageous use of endoglucanase IV, V and V1 containing xyloglucanase activity over endoglucanase I, II and III (Table 3).
A találmány közli, hogy a sejtfalba ágyazott cellulóz lebontásában előnyös a xiloglükánra specifikus EndoIV és a cellulóz lebontásra specifikus Endol + CBH kombinált hatása és előnyös a mind xiloglükánra mind cellulózra specifikus EndoV és CBH kombinált hatása. Továbbá felismertük, hogy az EndoI-EndoIV kombináció mindkét jellemzője megvan EndoV-ben.The invention discloses that the combined action of xyloglucan-specific EndoIV and cellulose-specific endol + CBH is beneficial in the degradation of cellulose embedded in the cell wall, and the combined effect of both xyloglucan and cellulose-specific EndoV and CBH is preferred. Further, it has been recognized that both characteristics of the EndoI-EndoIV combination are present in EndoV.
Továbbá bemutatjuk ezeknek az enzimeknek használatát kombinációkban. Általában egy xiloglükanáz aktivitást tartalmazó enzimet, például az Endo IV-VI csoporthoz tartozó enzimet választunk xiloglükánnak a xiloglükán/cellulóz komplex felületéről való kioldására, amely után (egy) celluláz aktivitást tartalmazó enzim(ek), például az Endo I-III csoporthoz tartozó enzim CBH-val együtt meg tudja támadni a cellulózt. Felismertük, hogy a szubsztráttól függ az endoglükanázok, cellobiohidrolázok és a xiloglükanáz aktivitások relatív mennyisége. A cellulóz lebontási eljárás méretnövelése, például ipari méretre, szintén befolyásolhatja ezeknek az enzimeknek relatív mennyiségét. A találmányt bemutatjuk úgynevezett vízzel nem extrahálható szilárdanyagok (WUS) használatával és almaszövet használatával.Further, the use of these enzymes in combinations is shown. Generally, an enzyme containing xyloglucanase activity, such as the Endo Group IV-VI enzyme, is chosen to liberate xyloglucan from the surface of the xyloglucan / cellulose complex, followed by (one) cellulase activity enzyme (s), e.g. can attack cellulose with. It has been recognized that the relative amount of endoglucanases, cellobiohydrolases and xyloglucanase activities depends on the substrate. Increasing the size of the cellulose degradation process, for example to industrial size, can also affect the relative amount of these enzymes. The invention is illustrated by the use of so-called water-non-extractable solids (WUS) and apple tissue.
A 2. példában bemutatjuk, hogy a sejtfal cellulóz hatékony lebontásához három aktivitás fontos: (Avicellel szemben aktivitással rendelkező) endoglükanáz, cellobiohidroláz és xiloglükanáz. Optimális cellulózlebontást érünk el, ha a cellobióz kioldás optimális. A cellobióz kioldás megvalósítása akkor optimális, ha a xiloglükán kioldás maximális. Megfigyeléseink szerint az alma WUS lebontásánál az optimális Endo/CBH mólarány 1,1 — EndoI/CBH esetében — és 14,9 között — EndoIV/CBH esetében — változik. Azonban az optimális EndoI/CBH arányokhoz képest az optimális EndoIV/CBH arányokkal kétszer annyi cellobiózt oldunk ki. A cellulózzal szemben mutatott kis abszorbanciája miatt EndoIV-ből viszonylag nagy mennyiségek szükségesek. A három enzimrendszer használatával hasonló cellulóz lebontásokat kaphatunk, azonban sokkal kisebb fehérjemennyiségekkel.Example 2 demonstrates that three activities are important for the efficient degradation of cell wall cellulose: endoglucanase (having activity against Avicel), cellobiohydrolase, and xyloglucanase. Optimal cellulose degradation is achieved if cellobiose lysis is optimal. The implementation of cellobiose lysis is optimal when xyloglucan lysis is maximal. According to our observations, the optimal molar ratio of Endo / CBH for apple WUS degradation varies from 1.1 for EndoI / CBH to 14.9 for EndoIV / CBH. However, twice the amount of cellobiose is dissolved with optimal EndoIV / CBH ratios compared to optimal EndoI / CBH ratios. Due to its low absorbance against cellulose, relatively large amounts of EndoIV are required. Using the three enzyme systems, similar cellulose degradations can be obtained, but with much smaller amounts of protein.
Továbbá a 2.példa bemutatja, hogy az optimális endoglükanáz/cellobiohidroláz arány 0,5-20 (g/g) közötti érték. Állandó — 0,96 — (EndoI+EndoIV/CBH) tömegarány használatával bemutatjuk, hogy az optimális EndoI/EndoIV arány 0,1-3 közötti érték. Előnyösen az arány 0,20-0,60 közötti érték, még előnyösebben az arány 0,33.Further, Example 2 demonstrates that the optimal endoglucanase / cellobiohydrolase ratio is between 0.5 and 20 (g / g). Using a constant weight ratio of 0.96 to (EndoI + EndoIV / CBH), we show that the optimal EndoI / EndoIV ratio is between 0.1 and 3. Preferably the ratio is between 0.20 and 0.60, more preferably the ratio is 0.33.
Az endoglükanázok jellemzően Endol és EndoIV, és a keverékre jellemző, hogy 0,96 (g/g) állandó (EndoI+EndoIV)-/CBH tömegarány mellett a keverék 0,33 EndoI/EndoIV mólarányt tartalmaz.Endoglucanases are typically Endol and EndoIV, and the mixture is characterized by a 0.96 (g / g) constant weight ratio (EndoI + EndoIV) to CBH of 0.33 EndoI / EndoIV.
A 3.példában a xiloglükanáz aktivitásnak az almaszövet lebontásában és elfolyósitásában játszott fontos szerepét mutatjuk be. Kis xiloglükanáz aktivitású celluláz készítményt xiloglükanáz hozzáadásával, előnyösen EndoIV-EndoVI csoportból kiválasztott endoglükanáz hozzáadásával, még előnyösebben EndoV hozzáadásával javítunk.Example 3 illustrates the important role of xyloglucanase activity in apple tissue degradation and fluidity. The cellulase composition with low xyloglucanase activity is improved by the addition of xyloglucanase, preferably by the addition of endoglucanase selected from the group EndoIV-EndoVI, more preferably by addition of EndoV.
A 4.példában bemutatjuk, hogy a tisztított enzimek keverékei hasonló hatásokat eredményeznek. A keverékek Avicelt lebontó potenciálját állandó értéken tartva a xiloglükanáz aktivitás mennyiségének megnövelésével megnő a cellobióz kioldása az almaszövetből. EndoV alakjában 25 mU minimális mennyiségű xiloglükanáz aktivitás szükséges 0,26mU Avicelt lebontó aktivitáshoz .Example 4 shows that mixtures of purified enzymes produce similar effects. Keeping the Avicelt degradation potential of the mixtures constant at increasing the amount of xyloglucanase activity increases the cellobiose leaching from apple tissue. In the form of EndoV, a minimum amount of 25mU xyloglucanase activity is required for 0.26mU Avicel degradation activity.
A találmány szerint definiált keverékeket előnyösen használhatjuk xiloglükánokat alkotórészként tartalmazó szubsztrátokra. Ilyen szubsztrátok az élelmiszerekben, takarmányokban, papírban, papírpépben és textil alapanyagokban fordulnak elő. A lebontási folyamatokban ennélfogva a keverékeket előnyösen használhatjuk élelmiszer, takarmány, papír, papírpép és textil kezelésénél .Mixtures as defined in the present invention may advantageously be used on substrates containing xyloglucans as constituents. Such substrates are found in food, feed, paper, pulp and textile raw materials. Therefore, in the degradation processes, the mixtures can be advantageously used in the treatment of food, feed, paper, pulp and textiles.
A keverékek gyümölcslevek előállításánál különösen hasznosak. Jellemzően az almaié előállításában hasznosak.Mixtures are particularly useful in the preparation of fruit juices. Typically useful in the production of apple juice.
A találmányban hat gombából származó endoglükanáznak négy különböző glükánnal szemben mutatott specifikusságát mutatjuk be (1. példa). Továbbá almából származó sejtfalmintát (2.példa) vagy teljes almaszövetet (3, 4.példa) használva szubsztrátként bemutatjuk a glükán komplex lebontását endoglükanázok és cellobiohidrolázok kombinált hatásával.The present invention demonstrates the specificity of six fungal endoglucanases against four different glucans (Example 1). Furthermore, the degradation of the glucan complex by the combined action of endoglucanases and cellobiohydrolases is demonstrated using apple cell wall sample (Example 2) or whole apple tissue (Example 3, 4).
Jellemző enzimkombinációk használatának szinergikus hatását is bemutatjuk.The synergistic effect of using typical enzyme combinations is also shown.
Kísérleti részExperimental part
AnyagokMaterials
Az almát (Malus malus L., Rosaceae, var. Golden Delicious) 1989. október közepén takarítottuk be, és négy hónapig ellenőrzött atmoszférában (2°C, 2% O2 és 5% CO2) tároltuk.Apples (Malus malus L., Rosaceae, var. Golden Delicious) were harvested in mid-October 1989 and stored for four months in a controlled atmosphere (2 ° C, 2% O2 and 5% CO2).
Kereskedelmi Trichoderma viride (Maxazyme Cl, Grist-Brocades, Delft, The Netherlands) készítményből hat endoglükanázt (EndoI-EndoVI) [ E.C.3.2.1.4] és két cellobiohidrolázt (CBH) [E.C.3.2.1.91] tisztítottunk Beldman et al. által [Eur.J.Biochem., 146, 301-308 (1985)] közöltek szerint.Six endoglucanases (EndoI-EndoVI) [E.C.3.2.1.4] and two cellobiohydrolases (CBH) [E.C.3.2.1.91] were purified from a commercial preparation of Trichoderma viride (Maxazyme Cl, Grist-Brocades, Delft, The Netherlands) according to Beldman et al. Eur. J. Biochem. 146: 301-308 (1985).
Az Avicel kristályos cellulózt a Serva-tól (Heidelberg, Germany) kaptuk, a CMC-t (Akucell Af 0305 típus) az Akzo-tól (Arnhen, The Netherlands) és a tamarindusz-mag xiloglükánt a Dainippon Pharmaceutical-tól (Osaka, Japan).Avicel crystalline cellulose was obtained from Serva (Heidelberg, Germany), CMC (type Akucell Af 0305) from Akzo (Arnhen, The Netherlands) and tamarind core xyloglucan from Dainippon Pharmaceutical (Osaka, Japan). ).
Vízzel nem extrahálható szilárdanyagok (WUS)Non-Water Extractable Solids (WUS)
Az endogén enzimek (poligalakturonázok és pektin észterázok) inaktiválására az almát (5 kg) — a magház eltávolítása után — egy kilogrammos adagokban mikrohullámmal (Philips AKB 276/PH, 4kW, Switzerland) kezeltük. A kapott anyagot hámoztuk, őröltük és meleg desztillált vízzel (50°C) alaposan addig extraháltuk, míg a mosóvíz csak csekély mennyiségű cukrot tartalmazott. A • · · szilárd anyagot centrifugálással gyűjtöttük össze (20 perc, 50000g). A maradék anyagot fagyasztva szárítottuk és egy Fritsch pulverisette-en megőröltük (1,0 mm-es szita, Germany) és WUSként jelöltük.To inactivate endogenous enzymes (polygalacturonases and pectin esterases), apples (5 kg) were treated with microwave (Philips AKB 276 / PH, 4kW, Switzerland) in kilograms after removal of the nucleus. The resulting material was peeled, ground and thoroughly extracted with warm distilled water (50 ° C) until the washing water contained only a small amount of sugar. The solid was collected by centrifugation (20 min, 50000g). The residue was freeze-dried and ground on a Fritsch pulverisette (1.0 mm sieve, Germany) and labeled as WUS.
Xiloglükánok előállításaPreparation of Xyloglucans
WUS extrahálása. 2 g WUS-t 5mM 1,2-ciklohexilén-dinitrilo-tetraecetsavat (CDTA) tartalmazó 200 ml 0, 05M nátrium-hidroxid-oldattal, folyamatos keveréssel 16 órán át, 4°C-on extraháljuk. A maradékot centrifugálás után (20 perc, 50000g) újraszuszpendáljuk 1 tömeg% nátrium-[ tetrahidrido-borát] (1—)-ot tartalmazó 320 ml 1M kálium-hidroxid-oldatban , 16 órán át 20°C-on extraháljuk és centrifugáljuk (20 perc, 50000g). Az utóbbi eljárást ennek a maradéknak felhasználásával megismételjük 1 tömeg% nátrium-[ tetrahidrido-borát] (1—)-ot tartalmazó 4M kálium-hidroxid-oldattal. Az egymás után következő extrahálások között a maradékot desztillált vízzel kétszer mossuk. A végső maradékot sósavoldattal 5 pH-ra savanyítjuk és fagyasztva szárítjuk. A megfelelő felülúszókat összegyűjtjük, sósavoldattal 5 pH-ra savanyítjuk és desztillált vízzel szemben alaposan dializáljuk.Extraction of WUS. 2 g of WUS was extracted with 200 ml of 0.05 M sodium hydroxide solution containing 5 mM 1,2-cyclohexylene dinitrilotetraacetic acid (CDTA) with stirring for 16 hours at 4 ° C. After centrifugation (20 min, 50,000 g), the residue was resuspended in 320 ml of 1M potassium hydroxide solution containing 1% by weight sodium [tetrahydroborate] (1), and extracted for 16 hours at 20 [deg.] C. min, 50000g). The latter procedure was repeated using this residue with 4M potassium hydroxide solution containing 1% by weight sodium [tetrahydroborate] (1). Between successive extractions, the residue was washed twice with distilled water. The final residue is acidified to pH 5 with hydrochloric acid and freeze-dried. The appropriate supernatants were collected, acidified to pH 5 with hydrochloric acid and thoroughly dialyzed against distilled water.
A 4M kálium-hidroxidos extraktum tisztítása. A 4M kálium-hidroxidos extraktumot 50mM nátrium-acetát pufferral (pH5,0) egyensúlyozott DEAE Sepharose CL-6B oszlopon (40x440mm, Pharmacia, Uppsala, Sweden) pektinmentesítjük. A 200 ml minta felvitele után az oszlopot 400 ml pufferrel mossuk. Az oszlopon viszszatartott frakciót 500 ml 1M nátrium-acetát pufferrel (pH5,0) végzett elúcióval oldjuk ki. A frakciókat (16,5 ml) mind uronsavakra, mind semleges cukrokra vizsgáljuk, egyesítjük, diali·» ·*·<♦ záljuk és fagyasztva szárítjuk. A semleges frakció xiloglükánból áll (APFXG).Purification of the 4M potassium hydroxide extract. The 4M potassium hydroxide extract was pectinated on a DEAE Sepharose CL-6B column (40x440mm, Pharmacia, Uppsala, Sweden) equilibrated with 50mM sodium acetate buffer (pH5.0). After applying 200 ml of sample, the column is washed with 400 ml of buffer. The fraction retained on the column was dissolved by elution with 500 mL of 1M sodium acetate buffer (pH 5.0). The fractions (16.5 ml) were assayed for both uronic acids and neutral sugars, pooled, dialyzed and freeze-dried. The neutral fraction consists of xyloglucan (APFXG).
APFXG enyhe savas hidrolízise. 40 mg tisztított alma xiloglükánt 25mM trifluor-ecetsavval (TFA) (5mg/ml) kezeljük 60°C-on 100 órán át. Dialízis után a fukózmentesített XG-t (APXG) fagyasztva szárítjuk.Slight acid hydrolysis of APFXG. 40 mg of purified apple xyloglucan was treated with 25 mM trifluoroacetic acid (TFA) (5 mg / ml) at 60 ° C for 100 hours. After dialysis, the deprotected XG (APXG) is freeze-dried.
Az enzimaktivitások meghatározása.Determination of enzyme activities.
Az endoglukanázok és cellobiohidrolázok aktivitásait CMC-n (CMCase), Avicel-en (aviceláz) és tamarindusz-mag xiloglükánon (xiloglükanáz), a redukáló végcsoportok számának növekedését Somogyi szerint [J. Bioi. Chem., 195, 19-23] mérve határozzuk meg. Az inkubálásokat (40°C, O,1M szukcinát puffer, pH 4,0) nem szubsztrát korlátos körülmények között végezzük. Az enzim egy milliegysége (mU) az egy perc alatt képződött nanomólban kifejezett redukáló végcsoport mennyiségnek felel meg.The activities of endoglucanases and cellobiohydrolases on CMC (CMCase), Avicel (avicellase) and tamarind core xyloglucanase (xyloglucanase), increased the number of reducing end groups according to Somogyi [J. Biol. Chem., 195, 19-23]. Incubations (40 ° C, 0.1M succinate buffer, pH 4.0) were performed under non-substrate limited conditions. One unit of enzyme (mU) corresponds to the amount of reducing end group expressed in nanomoles per minute.
Analitikai eljárások üronsav tartalom. Az uronsavakat (AUA) 0,0125M dinátrium-[ heptaoxo-tetraborát] -ot tartalmazó tömény kénsavat felhasználó automatizált m-hidroxi-difenil vizsgálattal [ Thibault JF; Lebensm.Wiss.Technoi., 12, 247-251 (1979)] kolorimetriásan határozzuk meg. A vízben oldhatatlan anyagot 72 tömeg%-os kénsavval (1 órán át 30°C-on) előkezeljük, és vízzel való hígítás után, az analízist megelőzően 1M kénsavval (3 órán át 100°C-on).Analytical procedures for uric acid content. An automated m-hydroxydiphenyl assay using concentrated sulfuric acid containing 0.0125M disodium [heptaoxotetetraborate] uronic acid (AUA) [Thibault JF; Lebensm.Wiss.Technol., 12, 247-251 (1979)] is determined colorimetrically. The water-insoluble material is pre-treated with 72% sulfuric acid (1 hour at 30 ° C) and after dilution with water, 1M sulfuric acid (3 hours at 100 ° C) prior to analysis.
Összes semleges cukortartalom. Az összes semleges cukortartalmat kolorimetriásan egy 'automatizált orcinol/kénsavas vizsgálattal [ Tollier MT, Robin JP; Ann. Technoi. Agric. , 28, 115 (1979)] határozzuk meg.Total neutral sugar content. All neutral sugars were colorimetrically determined by an automated orcinol / sulfuric acid test [Tollier MT, Robin JP; Ann. Technol. Agric. , 28, 115 (1979)].
··♦♦ ··
Semleges cukorkompozíció. A vízben oldhatatlan anyagot egy 72 tömeg%-os kénsavas előhidrolízisnek vetjük alá (1 óra 30°Con) , amelyet vízzel való hígítás után egy 1M kénsavval végzett hidrolízis követ (3 óra 100°C-on). A vízben oldható anyagokat 2M TFA-val hidrolizáljuk (1 óra 121°C-on). A következő lépésben a kioldott semleges cukrokat konvertáljuk alditol-acetátjaikká [ Englyst HN, Cummings JH; Analyst, 109, 937-942 (1984)] és elválasztjuk egy (3% OV275-tel bevont Chrom WAW 80-100mesh töltettel megtöltött, Chrompack, Middelburg, Hollandia) 3mx2mm belső átmérőjű üvegoszlopon egy 200°C-on működő és 270°C-ra beállított lángionizációs (F.I.D.) detektorral ellátott Carlo Erba Fractovap 2300 gázkromatográfon (GC) (Milánó, Olaszország). Belső standard-ként inozitot használunk.Neutral sugar composition. The water-insoluble material was subjected to a 72 wt% pre-hydrolysis of sulfuric acid (1 hour at 30 ° C) followed by dilution with water followed by hydrolysis with 1M sulfuric acid (3 hours at 100 ° C). The water-soluble materials were hydrolyzed with 2M TFA (1 h at 121 ° C). In the next step, the dissolved neutral sugars are converted to their alditol acetates [Englyst HN, Cummings JH; Analyst, 109, 937-942 (1984)] and separated on a (3% OV275 coated Chrom WAW 80-100mesh filling, Chrompack, Middelburg, The Netherlands) 3m x 2mm internal glass column operating at 200 ° C and 270 ° C. on a Carlo Erba Fractovap 2300 gas chromatograph (GC) equipped with a flame ionization (FID) detector (Milan, Italy). Inositol is used as the internal standard.
Glikozilkötés kompozíció. A tisztított xiloglükánt a módosított Hakomori eljárás szerint [ Sandfort PA, Conrad HE; Biochemistry, 5, 1508-1517 (1966)] metilezzük, és ezt követően vízzel szemben dializáljuk és párologtatással szárítjuk (levegőáram, szobahőmérséklet). Ezt az eljárást egyszer megismételjük. A következő lépésben a metilezett xiloglükánt hidrolizáljuk 2M trifluor-ecetsav (TFA) használatával (1 óra 121°C-on), amelyet párologtatással eltávolítunk (levegőáram, szobahőmérséklet) . A cukrokat 0,2 ml frissen készített, 75 mg nátrium-[ tetradeutérium-borát] (l-)/ml-t tartalmazó 1,5M ammónia oldat hozzáadásával redukáljuk, és konvertáljuk alditol-acetátokká [ Englyst et al.; Analyst, 10 9, 937-942 (1984)]’ . A részlegesen metilezett alditol-acetátokat (Ιμΐ) oszlopra injektálásokkal egy szilikagél kapilláris oszlopon (30mx0,32mm belső átmérő; DB 1701 falbevo nattal; 0,25pm filmvastagsággal; J & W Scientific, Folsom, Kalifornia, USA) analizáljuk egy 280°C-ra beállított lángionizációs detektorral (FID) felszerelt Carlo-Erba Fractovap 4160 gázkromatográfon. A hőmérsékletprogram 80->180°C 20°C/perccel, 180—»230°C 2°C/perccel, 230°C 3 percig. A vegyületek azonosítását egy CP Sil 19 CB kapilláris oszlopot (26mx0,22mm belső átmérő, Ο,ΐδμιη filmvastagság; Chrompack Nederland B.V., Middelburg, Hollandia) egy Hewlett-Packard 5970-B tömegszelektív detektorhoz kapcsolt HP 5890 gázkromatográfban (GC) felhasználó és egy PAW-HP 300 Chem Station-t (Hewlett-Packard) felhasználó gázkromatográfiás tömegspektrometriával megerősítjük. A hőmérsékletprogram 160—»185 °C 0,5°C/perccel, 185—>230°C 10°C/perccel, 230°C 5,5 percig. A származékok mennyiségi meghatározását effektív szénreakciójuk szerint [ Sweet DP, Shapiro RH, Albersheim P; Carbohydr. Rés., 40, 217-225 (1975)] végezzük.Glycosyl bond composition. Purified xyloglucan according to the modified Hakomori procedure [Sandfort PA, Conrad HE; Biochemistry, 5, 1508-1517 (1966)], followed by dialysis against water and drying by evaporation (air flow, room temperature). This procedure is repeated once. In the next step, the methylated xyloglucan is hydrolyzed using 2M trifluoroacetic acid (TFA) (1 hour at 121 ° C) which is removed by evaporation (air flow, room temperature). The sugars were reduced by addition of 0.2 ml of freshly prepared 1.5M ammonia solution containing 75 mg of sodium [tetradeuterium borate] (1) / ml and converted to alditol acetate [Englyst et al .; Analyst, 10 9, 937-942 (1984)]. Partially methylated alditol acetates (Ιμΐ) were analyzed by column injection on a silica gel capillary column (30mx0.32mm internal diameter; DB 1701 wall plated; 0.25pm film thickness; J & W Scientific, Folsom, California, USA) at 280 ° C. on a Carlo-Erba Fractovap 4160 gas chromatograph equipped with an adjusted flame ionization detector (FID). The temperature program is 80 to 180 ° C at 20 ° C / min, 180 to 230 ° C at 2 ° C / min, 230 ° C for 3 minutes. Identification of compounds using a CP Sil 19 CB capillary column (26mx0.22mm internal diameter, Ο, ΐδμιη film thickness; Chrompack Nederland BV, Middelburg, The Netherlands) in an HP 5890 gas chromatograph (GC) coupled to a Hewlett-Packard 5970-B mass-selective detector Confirmed by gas chromatography mass spectrometry using -HP 300 Chem Station (Hewlett-Packard). The temperature program is 160 to 185 ° C at 0.5 ° C / min, 185 to 230 ° C at 10 ° C / min, 230 ° C for 5.5 minutes. Quantification of derivatives according to their effective carbon reaction [Sweet DP, Shapiro RH, Albersheim P; Carbohydr. Sl., 40, 217-225 (1975)].
Fehérjetartalom. Az enzimkészítmények fehérjetartalmát Sedmak J.J. és Grossberg S.E. [ Anal .Biochem. 7 9, 544-552 (1977)] szerint határozzuk meg.Protein content. The protein content of the enzyme preparations was determined by Sedmak J.J. and Grossberg, S.E. [Anal. Biochem. 7, 9, 544-552 (1977).
A xiloglükán és cellulóz lebomlási termékek analízise. Egy Shodex SE-61 refraktométerrel (Showa Denko K.K., Tokyo, Japán) és egy AG 50W X4 védőoszloppal (7,8x50mm, Bio-Rad Labs) kombinált Aminex HPX-22H oszloppal (7,8x300mm; Bio-Rad Labs, Richmond, CA, U.S.A.) felszerelt SP 8800 HPLC szivattyúrendszerrel (Spectra Physics, San Jósé, CA U.S.A.) 85°C-on kivitelezett nagy teljesítményű folyadék kromatográfiával analizálunk. Az oldószer 0,2ml/perc áramlási sebességgel szivattyúzott 0,005M kénsav. Az injektált térfogat 20μ1. Kalibrálásra maltodextrineket használunk. Az almaszövet lebontása után a cellobióz mennyiségi analízisét egy Diomex CarboPack PA100 oszloppal (250x4mm, 20°C, Diomex, Sunnyvale, CA) felszerelt Diomex Bio-LC GPM-II kvaterner gradiens modul felhasználásával nagy teljesítményű anioncserés kromatográfiával (HPAEC) végezzük. A mintákat (20 μΐ) egy 7010 Rheodyne injectorszelepben levő Tefzel rotortömítéssel felszerelt SP8780 automatikus mintavevővel (Spectra Physics, San Jósé, CA) injektáljuk be. Az oldószereket gáztalanítjuk, és egy Dionex EDM modul használatával héliumgáz alatt tároljuk. Az eluátumot (1 ml/perc) egy, a pulzáló-amperometrikus detektálási (PAD) módban működő Dionex PED detektor használatával ellenőrizzük. Ezüst/ezüst-klorid referencia elektródot használunk egy, a következő pulzálási potenciálokkal és időtartamokkal működő aranyelektróddal: E]_ O,1V és o,5s, E2 0, 6V és 0,ls, E3 0,6V és 0,ls. Az inkubációs keverékekben a cellobiózt mennyiségileg a következő gradiens alkalmazásával határozzuk meg: 0—>12 percig, 25—>85 mM nátrium-hidroxidos lineáris gradiens, 12—>25 percig, 85 mM nátrium-hidroxid-oldatban levő 0—>100 mM nátrium-acetátos lineáris gradiens. Az oszlopot minden egyes analízis után 100 mM nátrium-hidroxid-oldatban levő 1 mólos nátrium-acetáttal 5 percig átöblítjük, és 25 mM nátrium-hidroxid-oldattal 15 percig kiegyensúlyozzuk.Analysis of xyloglucan and cellulose degradation products. Combined with an Aminex HPX-22H column (7.8x300mm) combined with a Shodex SE-61 refractometer (Showa Denko KK, Tokyo, Japan) and an AG 50W X4 protective column (7.8x50mm, Bio-Rad Labs), Bio-Rad Labs, Richmond, CA , USA) was analyzed by high performance liquid chromatography at 85 ° C using an SP 8800 HPLC pump system (Spectra Physics, San Jose, CA USA). The solvent was 0.005M sulfuric acid pumped at a flow rate of 0.2ml / min. The injected volume is 20μ1. Maltodextrins are used for calibration. After degradation of apple tissue, quantitative analysis of cellobiose was performed on a Diomex Bio-LC GPM-II Quaternary Gradient Module (HPAEC) equipped with a Diomex CarboPack PA100 column (250x4mm, 20 ° C, Diomex, Sunnyvale, CA). Samples (20 μΐ) were injected with a SP8780 automatic sampler (Spectra Physics, San Jósé, CA) equipped with a Tefzel rotor seal in a 7010 Rheodyne injector valve. The solvents were degassed and stored under helium gas using a Dionex EDM module. The eluate (1 ml / min) was monitored using a Dionex PED detector in pulsed amperometric detection (PAD) mode. Silver / silver chloride reference electrode was used as an active in the following pulse potentials and durations aranyelektróddal E] _ O, 1V, and o, 5s, E 2 0, 6 V and 0, ls, E3 0,6V and 0, ls. The cellobiose in the incubation mixtures is quantitated using a gradient of 0 to 12 minutes, a linear gradient of 25 to 85 mM sodium hydroxide, 0 to 100 mM sodium in 85 mM sodium hydroxide, 12 to 25 minutes. -acetate linear gradient. After each analysis, the column was rinsed with 1 M sodium acetate in 100 mM sodium hydroxide solution for 5 minutes and equilibrated with 25 mM sodium hydroxide solution for 15 minutes.
1. példa;Example 1;
A Trichoderma viride-ből származó hat endoglükanáz szubsztrát specifikussága.Specificity of the six endoglucanase substrates from Trichoderma viride.
A xiloglükánok zömét 4M kálium-hidroxid-oldattal extraháljuk ki (1.táblázat). Ez az extraktum tartalmaz valamennyi pektinanyagot is, amelyet anioncserés kromatográfiával hatékonyan el tudunk távolítani. Ennek a tisztított xiloglükánnak jellemzésére metilezési analízist végzünk. A 2.táblázat és a szakirodalom [ York WS, van Halbeek H, Darvill AG, Albersheim P; Carbohydr. Rés. 200, 9-310 (1990)] alapján ez a poliszaccharid (1—>4)-β-glükóz egységekből áll, amelyeknek körülbelül 42%-a (6—>1) —CC—Most of the xyloglucans were extracted with 4M potassium hydroxide solution (Table 1). This extract also contains all pectic substances which can be effectively removed by anion exchange chromatography. Methylation analysis was performed to characterize this purified xyloglucan. Table 2 and literature [York WS, van Halbeek H, Darvill AG, Albersheim P; Carbohydr. Gap. 200: 9-310 (1990)], this polysaccharide is composed of (1-4) -β-glucose units, of which about 42% (6-> 1) -CC-
-xilóz végcsoportot tartalmaz, körülbelül 10%-a (6—>1)-a-Xil-(2—>contains about 10% (6-> 1) -a-Xyl- (2->) of the end group xylose
1)-β-Gal-szakasszal helyettesített és körülbelül 13%-a egy (6—>1) -β-Gal substituted and about 13% is one (6->
1)-d-Xil-(2—>1)-β-Gal-(2—>1)-α-Fuc oldallánccal rendelkezik. Néhány arabinóz végcsoportot is találtunk, amelyek a legvalószínűbben xilóz csoportokhoz kapcsolódnak. A tisztított alma xiloglükán cukorösszetétele megegyezik más szakemberek [ Renard C.M.G.C. et al. ; Carbohydr.Polymers, 15, 387-403 (1991) és1) It has a side chain -d-Xyl- (2-> 1) -β-Gal- (2-> 1) -α-Fuc. We also found some arabinose end groups most likely to be linked to xylose groups. The sugar composition of purified apple xyloglucan is the same as described by other experts [Renard C.M.G.C. et al. ; Carbohydr. Polymers, 15, 387-403 (1991) and
Ruperez P. et al. Carbohydr.Rés., 142, 107-113 (1985)] megállapításaival. Alulmetilezés, különösen a hexóz csoportoké, csak korlátozott mértékben fordul elő (körülbelül 5%) . Meg kell jegyeznünk, hogy a tisztított xiloglükán egy csekély szenynyeződést még tartalmaz (körülbelül 5%) , a legvalószínűbben egy galakto-(glüko)-mannánt, amelyben minden kilencedik mannózcsoporthoz egy galaktóz csatlakozik.Ruperez P. et al. 142: 107-113 (1985)]. Undermethylation, especially of hexose groups, occurs only to a limited extent (about 5%). It should be noted that the purified xyloglucan still contains a small amount of contamination (about 5%), most likely a galacto (gluco) mannan, with one galactose attached to every ninth mannose group.
250pg tisztított xiloglükánt oldunk 100μ1 pufferben, és 1 vagy 20 órán át inkubáljuk EndoIV-gyel, EndoV-tel és EndoVI-tal (30ng), illetve Endol-gyel, EndoII-vel és EndoIII-mal (400ng). Az enzimadag olyan, hogy nem jön létre szubsztrát korlátozás. A mintákat azután kétszer hígítjuk, és a redukáló cukrok mennyiségének növekedését, kalibrálásra glükózt használva, Somogyi (1952) szerint határozzuk meg. Hasonló kísérleteket végzünk fukózmentesített alma xiloglükán és CMC szubsztrát használatával.250µg of purified xyloglucan was dissolved in 100µl buffer and incubated for 1 or 20 hours with EndoIV, EndoV and EndoVI (30ng) and Endol, EndoII and EndoIII (400ng). The enzyme core is such that no substrate restriction occurs. The samples are then diluted twice and the increase in reducing sugars is determined using glucose for calibration according to Somogyi (1952). Similar experiments were performed using de-fucose apple xyloglucan and CMC substrate.
Az endoglükanázok specifikusságának meghatározására a tisztított alma xiloglükánt (APFXG), egy fukózmentesített ekvivalenst (APXG) és burgonya arabino-xiloglükánt (PoAXG) használunk. A 3.táblázat foglalja össze a különböző endoglükanázoknak a különböző glükánokra vonatkozó ciklusszámait. CMC-vel szemben mutatott aktivitásuk — az EndoII-mal szemben mutatott aktivitást kivéve — azonos nagyságrendű. A xiloglükánokra vonatkozó aktivitás mérések az endoglükanázokat világosan két osztályba osztják. Endol, V és Vl-hoz képest Endol, II és III viszonylag kis aktivitást mutat XG-nal szemben. A fukózcsoport eltávolítása általában kissé megnöveli a xiloglükán xiloglükanázokkal való lebontását. Azonban például Endol aktivitásának megnövekedése nem olyan drámai, hogy Endol és egy fukozidáz kombinációja a találmány alkalmazásaiban alternatív megoldásnak bizonyuljon EndoIVhez képest.Purified apple xyloglucan (APFXG), a fucose-free equivalent (APXG) and potato arabinoxyloglucan (PoAXG) were used to determine the specificity of endoglucanases. Table 3 summarizes the cycle numbers of the different endoglucanases for the different glucans. Their activity against CMC, except for EndoII, is of the same order of magnitude. The activity measurements for xyloglucans clearly divide endoglucanases into two classes. Endol, II and III exhibit relatively low activity against XG compared to Endol, V and V1. Removal of the fucose group generally slightly increases the degradation of xyloglucan by xyloglucanases. However, for example, the increase in Endol activity is not so dramatic that the combination of Endol and a fucosidase would prove to be an alternative solution to EndoIV in the applications of the invention.
Ebben a példában azt mutatjuk be, hogy az endoglükanázok jellemzése nem alapulhat pusztán a CMCase és Aviceláz aktivitásokon, mert egy készítmény XGase potenciálját könnyen túlbecsülhetjük.In this example, it is shown that the characterization of endoglucanases cannot be based solely on CMCase and Avicellase activities, since the XGase potential of a formulation can easily be overestimated.
1.táblázatTable 1
WUS összetétele és szakaszos extrahálásokkal kapott frakciói (mól%) .WUS composition and fractions obtained by batch extraction (mole%).
2.táblázat.Table 2.
A tisztított alma xiloglükán (APFXG) és burgonya xiloglükán (PoAXG) glikozilkötés összetétele.The glycosyl bond composition of purified apple xyloglucan (APFXG) and potato xyloglucan (PoAXG).
a)the)
Egy inozitoltól való rossz elválasztás következtében a nem metilezett glükóz mennyiségét nem határoztuk meg.Due to poor separation from an inositol, the amount of non-methylated glucose was not determined.
3.táblázatTable 3
CMC, APFXG, APXG, POXG és Avicel hat endoglükanázra és Trichoderma viride-ből származó CHB-re meghatározott ciklusszámaiCycle counts for CMC, APFXG, APXG, POXG, and Avicel for six endoglucanases and CHB from Trichoderma viride
a) Értékek Beldman et al.; Eur.J.Biochem., 146, 301-308 (1985) szerint,a) Values Beldman et al .; Eur. J. Biochem., 146, 301-308 (1985),
b) Értékek Beldman et al . ; Biotech.Bioeng. , 30, 251-257 szerint.b) Values Beldman et al. ; Biotech.Bioeng. , 30, 251-257.
c) nd= nem határoztuk meg.c) nd = not determined.
2.példa;Example 2;
Alma gyümölcs sejtfalmodell lebontása endoglükanázok és cellobiohidrolázok kombinált hatásávalDegradation of apple fruit cell wall model by combined action of endoglucanases and cellobiohydrolases
Az alma-WUS cukor kompozíciójából (1.táblázat) a poliszacharid komponensekre vonatkozóan az alábbi következtetéseket vonhatjuk le. Feltételezve, hogy a xiloglükánban az összes olyan xilóz jelen van, amelyben a Glc/Xyl/Gal/Fuc alapegységek aránya 7:4:2:1 (a metilezési analízis alapján) [ Aspinall és Famous; Carbohydr. Rés. 4, 193-214 (1984)], a xiloglükán frakció körül belül 25 tömeg% összes cukormaradékot tartalmaz, amely általában a kétszikű növényeknél talált érték [ Hayashi T; Ann.Rév.Plánt Physiol.Plánt.Mól.Bioi., 40, 139-168 (1989)] . A glükóz többi részéről (32 tömeg%) feltételezzük, hogy cellulózként van jelen. Ez kihangsúlyozza az alma sejtfalmátrixnak körülbelül 57%-át kitevő cellulóz-xiloglükán komplex fontosságát.The following conclusions can be drawn for the polysaccharide components of the apple-WUS sugar composition (Table 1). Assuming all xylose is present in xyloglucan in which the ratio of Glc / Xyl / Gal / Fuc base units is 7: 4: 2: 1 (based on methylation analysis) [Aspinall and Famous; Carbohydr. Gap. 4, 193-214 (1984)], containing about 25% by weight of total sugar residues around the xyloglucan fraction, which is generally found in dicotyledonous plants [Hayashi T; Ann.Rev.Plants Physiol.Plants.Mol.Bioi., 40, 139-168 (1989)]. The rest of the glucose (32% by weight) is presumed to be present as cellulose. This underlines the importance of the cellulose xyloglucan complex, which represents about 57% of the apple cell wall matrix.
Az időtartam tanulmányokhoz 20 mg WUS-t 6,4gg CBH-t és lgg Endol-et vagy EndoIV-et (Endo/CBH arány 0,16pg/pg) tartalmazó 1,5 ml össztérfogatú pufferben szuszpendálunk, és 24 óráig terjedő meghatározott időtartamokkal inkubáljuk. A második sorozat a fentitől az inkubálási időben (3 óra) és a (0,02pg/pg-30pg/^g tartományban levő Endo/CBH arányokkal) változó endoglükanáz (I vagy IV) mennyiségekkel különbözik. Az utolsó sorozatban az EndoI+EndoIV (6,lpg) és CBH (6,4pg) mennyiségeket változó Endol-/EndoIV arányokkal állandó értéken tartjuk és szintén 3 órán át inkubáljuk. A cellulózlebontás linearitását 5pg/pg Endo/CBH aránynál ellenőrizzük. Miután az inkubációs keverékeket 10 perc-ig 100°C-on melegítjük és centrifugáljuk (2 perc, 20000g), a lebomlási termékeket HPLC-vel analizáljuk. Az Endo-k és a CBH közötti szinergetikus tevékenységet általában az Avicel lebomlásánál a redukáló végcsoportok mennyiségi növekedésének meghatározásával tesszük érzékelhetővé. Azonban ez nem megfelelő megközelítés egy olyan komplex mátrixban, mint a WUS, mivel mind a cellobióz, mind az oligomer xiloglükán törmelékek hozzájárulnak a redukáló végcsoportok mennyiségéhez. Ennélfogva mind a cellobióz (a cellulóz hidrolízis mértékeként való) , mind az összes xiloglükán oligoszaccharid mennyiségi meghatározására egy HPLC-s eljárást használunk. Az izolált sejtfalanyagot Endol-gyel, Endo-IV-gyel, CBH-val és ezek különböző kombinációival inkubáljuk. Az 1A. ábrában bemutatjuk, hogy a CBH által képzett egyetlen termék a cellobióz, mig egyik endoglükanáz sem old ki a WUS-ból semennyi cellobiózt (adatokat nem mutatunk be). Az IC. ábrában a cellobióz és az egyéb komponensek (bevonalkázott terület az IC ábrában) elválasztását mutatjuk be. Az utóbbiakat BioGel P2-n és félpreparativ CarboPac PAl-en való frakcionálás után xiloglükán oligoszacharidokként jellemezzük (adatokat nem mutatunk be).For duration studies, 20 mg of WUS was suspended in 1.5 ml total buffer containing 6.4 µg of CBH and 1 µg of Endol or EndoIV (Endo / CBH ratio 0.16 µg / µg) and incubated for 24 hours at specified time intervals. . The second series differs from the above by varying amounts of endoglucanase (I or IV) during the incubation time (3 hours) and (with Endo / CBH ratios in the range of 0.02 µg / pg to 30 µg / µg). In the final series, the amounts of EndoI + EndoIV (6, 1pg) and CBH (6.4pg) were kept constant with variable Endol / EndoIV ratios and also incubated for 3 hours. The linearity of the cellulose degradation is checked at a 5µg / pg Endo / CBH ratio. After incubation mixtures are heated at 100 ° C for 10 min and centrifuged (2 min, 20000 g), the degradation products are analyzed by HPLC. The synergistic activity between the Endo's and the CBH is usually detected by quantifying the increase in reducing end groups upon Avicel degradation. However, this is not an appropriate approach in a complex matrix such as WUS, since both cellobiose and oligomeric xyloglucan fragments contribute to the amount of reducing end groups. Therefore, an HPLC method is used to quantify both cellobiose (as a measure of cellulose hydrolysis) and total xyloglucan oligosaccharides. The isolated cell wall material was incubated with Endol, Endo-IV, CBH and various combinations thereof. 1A. Figure 1B shows that no product produced by CBH is cellobiose, whereas no endoglucanase loses any cellobiose from WUS (data not shown). IC. Figure 1B shows the separation of cellobiose and other components (coated area in Figure IC). The latter were characterized as xyloglucan oligosaccharides after fractionation on BioGel P2 and semi-preparative CarboPac PA1 (data not shown).
A cellulóz lebontása az endoglükanáz és cellobiohidroláz összehangolt tevékenységével megy végbe azáltal, hogy az előbbi új láncvégeket képez az utóbbi számára, hogy az működhessen. Kis Endo/CBH arányoknál az endoglükanáz mennyisége korlátozó tényező, míg nagy arányoknál az Endo verseng a cellulóz kötési helyekért CBH-val. Ez magában foglalja azt, hogy létezik egy optimális arány, — amelyet a 2. ábrában látunk — mind EndoI+CBH-ra (1,lmól/mól), mind EndoIV+CBH-ra (14,9mól/mól). A cellulóz hidrolízis szempontjából az optimális mólarányok közötti különbséget részben a két endoglükanáz eltérő adszorpciós magatartása magyarázza (3.táblázat). A cellulózon való kis adszorbeálódás esetén az optimum eléréséhez nagyobb mennyiségű enzim szükséges.The breakdown of cellulose occurs by the concerted action of endoglucanase and cellobiohydrolase, the former forming new ends for the latter to function. At low Endo / CBH ratios, the amount of endoglucanase is limiting, while at high ratios Endo competes for cellulose binding sites with CBH. This implies that there is an optimum ratio, as shown in Figure 2, to both EndoI + CBH (1.1 mol / mol) and EndoIV + CBH (14.9 mol / mol). The difference in optimal molar ratios for cellulose hydrolysis is partly explained by the different adsorption behavior of the two endoglucanases (Table 3). In the case of low adsorption on cellulose, a greater amount of enzyme is required to reach the optimum.
Eltekintve az eltérő optimális Endo/CBH arányoktól, a kioldott összes cellobióz mennyiség különösen figyelemre méltó. EndoIV olyan mértékben stimulálja CBH-t, hogy 3 órás reakcióidő után a WUS-ból kioldott cellobióz mennyiség az EndoI+CBH-val végzett inkubálásokhoz képest kétszeres. A cellulózlebontás láthatóan a xiloglükán oldhatóvá tételétől függ (2.ábra), az előbbiApart from the different optimal Endo / CBH ratios, the total amount of cellobiose dissolved is particularly noteworthy. EndoIV stimulates CBH to such an extent that after 3 hours of reaction, the amount of cellobiose lysed from WUS is twice that of incubation with EndoI + CBH. The cellulose degradation apparently depends on the solubilization of xyloglucan (Figure 2).
akkor optimális, ha optimális EndoI/CBH xiloglükán ciklust, helyzet.optimal if optimal EndoI / CBH xyloglucan cycle, position.
Ezek az adatok az utóbbi maximális.These data are maximum for the latter.
aránynál a cellulózcellulose
Optimális EndoIV/CBH azt mutatják, hogyOptimal EndoIV / CBH show that
Kiszámíthatjuk, hogy ciklus meghaladja a arányra fordított a kis mennyiségű viszonylagWe can calculate that cycles exceed the ratio of inverse to small amounts of relatively
Endol-gyel optimális szinergizmust kapunk CBH-val, bár a cellulóz hidrolízis kevésbé kedvezően megy, mint EndoIV+CBH-val. Az endoglükanázok láthatóan eltérő módon hatnak a sejtfalanyagra. Ennélfogva egy állandó CBH mennyiséghez különböző EndoI/EndoIV mólarányokkal, és az optimális EndoI/CBH aránnyal azonos, 0,96 pg^g állandó Endo/CBH tömegaránnyal Endol-et és EndoIV-et adunk hozzá (mint a 2.ábrában látható).Endol provides optimum synergism with CBH, although cellulose hydrolysis is less favorable than EndoIV + CBH. Endoglucanases appear to act in a different way on cell wall material. Therefore, Endol and EndoIV (as shown in Figure 2) were added to a constant amount of CBH with different molar ratios of EndoI / EndoIV and with a constant weight ratio of EndoI / CBH of 0.96 pg / g constant EndoI / CBH.
Az összes, két különböző Endo-t CBH-val kombináltan hasz náló vizsgált kombináció növeli a cellulóz hidrolízis mértékét (3.ábra). A cellulóz lebontásra az optimális EndoI/EndoIV arányAll of the tested combinations using two different Endo's in combination with CBH increase the degree of cellulose hydrolysis (Figure 3). The optimum EndoI / EndoIV ratio for cellulose degradation
0,33, és a hidrolízisfok 2, illetve 1,25 szorzótényezővel nő, ha a csak EndoI+CBH-val, illetve EndoIV+CBH-val végzett lebontással hasonlítjuk össze. Ennél a pontnál a cellobióz képződés azonos az optimális EndoIV/CBH aránynál elért mennyiséggel (2.ábra), azonban ebben az esetben 7-8-szor kisebb endoglükanáz adag szükséges. Továbbá, meg kell említenünk, hogy az optimum meglehetősen széles, ami azt jelzi, hogy bármelyik endoglükanázból egy, csak 20 mól%-os adag maximális hatást nyújt. A cellobióz képződésben 80 mól%-nál tapasztalható nagy esés a xiloglükán hidrolízis erős csökkenésével társul.0.33, and the degree of hydrolysis increases by a factor of 2 and 1.25, respectively, when compared to degradation with EndoI + CBH and EndoIV + CBH only. At this point, cellobiose formation is equivalent to that achieved with the optimal EndoIV / CBH ratio (Figure 2), but in this case a 7-8 fold lower dose of endoglucanase is required. Furthermore, it should be noted that the optimum is quite wide, indicating that a single dose of only 20 mole% of any endoglucanase produces maximum effect. The large drop in cellobiose formation at 80 mol% is associated with a strong reduction in xyloglucan hydrolysis.
Az eredmények azt jelzik, hogy a sejtfalba ágyazott cellulóz hatékony hidrolíziséhez alapvető a xiloglükán bevonat eltá26 volítása. Az EndoI+CBH cellulózt lebontó potenciálját nem használjuk ki teljesen, mert az enzimkomplex kötődésére alkalmas bevonat nélküli cellulóz felszíni terület korlátoz. A xiloglükánnak Endol-gyel végbemenő kis ciklus száma (3.táblázat) következtében ebben a helyzetben nem várható gyors javulás. Endol-nek EndoIV-hez viszonyított, cellulózzal szemben nutatott (Avicel, 3.táblázat) nagyobb aktivitása ellenére, a cellulóz hidrolízis lemarad. Egy EndoIV+CBH kombinációra a xiloglükán ciklus meghaladja a cellulóz ciklust, és a „csupasz cellulóz mikrorostok gyorsan lebomlanak. A teljes cellulózt lebontó potenciált kihasználjuk, bár a cellulózzal szemben mutatott kis adszorpciója miatt viszonylag nagy EndoIV mennyiségek szükségesek (3.táblázat) . A három enzimes rendszer egyesíti az előző kettő pozitív vonatkozásait. A xiloglükán bevonat eltávolításával EndoIV pedig javítja a cellulóz hozzáférhetőségét Endol és CBH számára, amelyek nagyobb aktivitást mutatnak ezzel a szubsztráttal szemben, mint EndoIV. Ebben az esetben a cellulóz ciklus csaknem egyenlő a xiloglükán ciklussal. Ennek a három enzimes rendszernek egyik előnye, hogy sokkal kisebb (moláris alapon legalább ötször kisebb) enzim mennyiségek szükségesek az EndoIV+CBH-val elérthez hasonló cellobióz kioldáshoz.The results indicate that removal of the xyloglucan coating is essential for efficient hydrolysis of cellulose embedded in the cell wall. The cellulose-degrading potential of EndoI + CBH is not fully exploited because it is limited by the uncoated cellulosic surface area capable of binding the enzyme complex. Due to the small number of cycles of xyloglucan with Endol (Table 3), no rapid improvement is expected in this situation. Despite the higher activity of Endol compared to EndoIV against cellulose (Avicel, Table 3), cellulose hydrolysis is lagging behind. For an EndoIV + CBH combination, the xyloglucan cycle exceeds the cellulose cycle and the "bare cellulose microfibers are rapidly degraded. The total cellulose-degrading potential is exploited, although relatively high amounts of EndoIV are required due to its low adsorption to cellulose (Table 3). The three enzymatic systems combine the positive aspects of the previous two. By removing the xyloglucan coating, EndoIV improves the availability of cellulose to Endol and CBH, which show greater activity against this substrate than EndoIV. In this case, the cellulose cycle is almost equal to the xyloglucan cycle. One advantage of these three enzyme systems is that much smaller amounts of enzyme (at least five times lower on a molar basis) are required for cellobiose lysis similar to EndoIV + CBH.
Ebben a példában világosan bemutatjuk, hogy a sejtfalmodell lebontásában fontos legalább két eltérő endoglükanáz aktivitás jelenléte: egy közvetlenül a cellulózra irányuló, és a másik a xiloglükánokra irányuló.In this example, it is clearly demonstrated that at least two different endoglucanase activities are important in the degradation of the cell wall model, one targeting cellulose directly and the other targeting xyloglucans.
3. példa;Example 3;
Almaszövet lebontása (xiloglükanázzal javított) kereskedelmi celluláz készítményekkelDegradation of apple tissue with commercial cellulase preparations (improved by xyloglucanase)
Két gramm nyers alma gyümölcsszövetet 40°C-on, 16 órán át, folyamatos rázással (150 fordulat/perc) inkubálunk 0,1% aszkorbinsavat tartalmazó, 3 ml 4,0 pH-jú 200 mM-os szukcinát pufferben. A puffér a Gist-Brocades-től beszerezhető két kereskedelmi enzimkészítményből — Maxazyme CL (Trichoderma viride) és Xyl 5000 (Disporotrichum) — származó enzimek megfelelő mennyiségeit tartalmazza. Az Avicelt lebontó potenciál 10 mU, és a velejáró X-Gase aktivitások 200 és 300 mU Maxazyme-ra, illetve Xyl 5000re. A pektinanyag lebontására és a cellulóz-xiloglükán háló hozzáférhetőségének növelésére a megfelelő inkubálásokhoz pektin liázt (PL) (50 mU) [ lásd a PL tisztításnál: van Houdenhoven; Studies on pectin lyase, Ph. D. thesis, Agricultural University Wageningen, Hollandia (1975)] adunk hozzá. Kezelés és vizuális értékelés után az inkubációs keverékből 1 ml-t kiveszünk, az enzimek inaktiválására 10 percig 100°C-on melegítjük, centrifugáljuk (2 perc, 20000g), és a felülúszóban levő lebontási termékeket HPAEC-vel analizáljuk.Two grams of crude apple fruit tissue was incubated at 40 ° C for 16 hours with continuous shaking (150 rpm) in 3 ml of 200 mM succinate pH 4.0 with 0.1% ascorbic acid. The buffer contains appropriate amounts of enzymes from two commercial enzyme preparations available from Gist-Brocades, Maxazyme CL (Trichoderma viride) and Xyl 5000 (Disporotrichum). Avicelt has a degradation potential of 10 mU and the accompanying X-Gase activities of 200 and 300 mU for Maxazyme and Xyl 5000 respectively. For appropriate incubation, pectin lyase (PL) (50 mU) is used to degrade the pectin material and increase the accessibility of the cellulose xyloglucan mesh [see PL Purification: van Houdenhoven; Studies on pectin lyase, Ph. D. thesis, Agricultural University Wageningen, The Netherlands (1975)]. After treatment and visual evaluation, 1 ml of the incubation mixture is withdrawn, heated to 100 ° C for 10 minutes to inactivate the enzymes, centrifuged (2 min, 20000g) and the supernatant degradation products analyzed by HPAEC.
A Maxazyme önmagában 16 órán belül nem képes a nyers alma gyümölcsszövet nagy mértékű lebontására (4.ábra) . 50 mU minimális mennyiségű pektin liáz (PL) szükséges ahhoz, hogy ugyanezen körülmények között a Maxazyme képes legyen az anyag teljes elfolyósitására. A cellulóz-XG hálónak a glükonázok számára való hozzáférhetőségének biztosítására ennélfogva az összes inkubáláshoz ilyen koncentrációjú PL-t adunk hozzá. PL és Xyl 5000 kombinációjával nem tudunk teljes elfolyósítást elérni, bár aMaxazyme alone is not capable of major degradation of raw apple fruit tissue within 16 hours (Figure 4). A minimum amount of 50 pU of pectin lyase (PL) is required to allow Maxazyme to fully fluidize under the same conditions. Therefore, PL at this concentration is added to all incubations to ensure accessibility of the cellulose XG network to the gluconases. A combination of PL and Xyl 5000 does not provide complete liquefaction, though
cellulózt lebontó potenciál hasonló a PL plusz Maxazyme kombináció potenciáljához. Az XGase aktivitás azonban egy 2 szorzótényezővel kisebb, és ez azt jelezheti, hogy az XGase aktivitás az elfolyósitásnál fontos. Ennélfogva a Xyl 5000 XGase aktivitását a Maxazyme szintjére növeljük megfelelő mennyiségű EndoV hozzáadásával. A 4.ábrában látható, hogy a lebontás mértéke hasonló, mint a PL plusz Maxazyme kombinációval kapott lebontás. EndoV hozzáadásával a cellobióz kioldás 1,6-szorosra nő, azonban még megközelítőleg ötször kisebb, mint egy PL plusz Maxazyme-mal végzett inkubációnál. Hasonló mennyiségű Endol fehérje hozzáadása nem befolyásolja a cellobióz kioldást (adatokat nem közlünk). Meg kell jegyeznünk, hogy a különböző almatételek a fent vázolt enzim kombinációkra hasonló cellobióz kioldást adnak. Azonban az elfolyósitás vizuálisan meghatározott mértéke nagyon eltér, bár a 4.ábrabelihez hasonló diagramot kapunk. A kereskedelmi készítmények endoglükanázt (CMCase aktivitás) és CBH-t (cellobióz kioldása a szövetből) is tartalmaznak. A Maxazyme és Xyl 5000 teljesítménye nagyon eltérő, bár a két készítmény cellulózt lebontó potenciálja hasonló (10 mU) (4.ábra). Ezekben a készítményekben a CMCase aktivitás azonos nagyságrendű, azonban a Maxazyme Avicellel szemben mutatott aktivitása tízszer nagyobb. Ez azt jelzi, hogy Maxazyme sokkal több CBH-t tartalmaz, mint Xyl 5000, és az utóbbi Avicellel szemben mutatott aktivitásának viszonylag nagy részéért az endoglükanázok felelősek. Ebben a példában továbbá látható a megfelelő endoglükanáz CBH arány fontossága, amelyet már korábban bemutattunk. Erre az arányra való tekintettel furcsának tűnhet Endol vagy EndoV hozzáadása Xyl 5000-hez,the cellulose-degrading potential is similar to that of the PL plus Maxazyme combination. However, XGase activity is reduced by a factor of 2, which may indicate that XGase activity is important for fluidity. Therefore, the activity of Xyl 5000 XGase is increased to the level of Maxazyme by addition of sufficient amount of EndoV. Figure 4 shows that the degree of degradation is similar to that obtained with PL plus Maxazyme. Addition of EndoV increases the cellobiotic lysis to 1.6-fold, but is still approximately 5-fold lower than a PL plus incubation with Maxazyme. Addition of a similar amount of Endol protein does not affect cellobiose lysis (data not shown). It should be noted that the various apple batches give a similar cellobiotic lysis to the enzyme combinations outlined above. However, the visually determined degree of fluidity is very different, although a diagram similar to Figure 4 is obtained. Commercial formulations also contain endoglucanase (CMCase activity) and CBH (tissue lysis of cellobiose). The performance of Maxazyme and Xyl 5000 is very different, although the cellulose-degrading potential of the two formulations is similar (10 mU) (Figure 4). In these formulations, CMCase activity is of the same order of magnitude, but with an activity of up to ten times that of Maxazyme Avicel. This indicates that Maxazyme contains much more CBH than Xyl 5000 and that the latter is responsible for a relatively large part of its activity against Avicel. This example further illustrates the importance of the appropriate endoglucanase CBH ratio, which has been described previously. Given this ratio, it might seem strange to add Endol or EndoV to Xyl 5000,
azonban itt a fő feladat a xiloglükán bevonat eltávolítása a sejtfalba ágyazott cellulózról.however, the main task here is to remove the xyloglucan coating from cellulose embedded in the cell wall.
Ez a példa bemutatja, hogy az XGase aktivitás fontos az alma elfolyósításában.This example demonstrates the importance of XGase activity in apple liquefaction.
4.példa;Example 4;
Almaszövet lebontása tisztított enzimek keverékeinek használatávalDegradation of apple tissue using mixtures of purified enzymes
Endol és CBH körülbelül 3,5 tömegaránnyal való keverésével egy „kis XGase aktivitású keveréket kapunk. „Nagy XGase aktivitású keveréket Endol helyett EndoV-öt használva kapunk. Ennek a két keveréknek megfelelő módon való keverésével öt további közbülső XGase aktivitású keveréket készítünk. A tisztított enzimek hét keverékében az Aviceláz aktivitást az Endol plusz EndoV plusz CBH és a megfelelő CBH nélküli keverék Avicellel szemben mutatott aktivitása közötti eltérésként definiáljuk. Az alma anyagot a fent leírt hét keverék egyikével olymódon bontjuk le, hogy minden inkubálás azonos mennyiségű Aviceláz aktivitást (0,26 mU) és eltérő XGase aktivitást (4-40 mU) tartalmazzon.By mixing Endol and CBH at a ratio of about 3.5% by weight, a mixture of "low XGase activity" is obtained. “A mixture of high XGase activity is obtained using EndoV instead of Endol. By mixing the two mixtures appropriately, five additional mixtures of intermediate XGase activity are prepared. Avicellase activity in seven mixtures of purified enzymes is defined as the difference between the activity of Endol plus EndoV plus CBH and the corresponding CBH-free mixture against Avicel. The apple material was digested with one of the seven mixtures described above such that each incubation contained the same amount of Avicellase activity (0.26 mU) and different XGase activity (4-40 mU).
Beldman és munkatársai (1987) kimutatták, hogy az Avicel kristályos cellulóznak Trichoderma viride különböző endoglükanázaival való lebontása eltérő (arányú) termékeket ad (glükóz, cellobióz, cellotrióz) . Azonban alma WUS-t Endol vagy EndoIV plusz CBH-val inkubálva az egyetlen kioldott termék a cellobióz. Ez az ellentmondás feltételezhetően áll az almaszövetre is, mert az Endol-et tartalmazó inkubációs keverékek egyikében sem található cellotrióz. A glükózt nem tudjuk analizálni, mert az al ··· mában nagy mennyiségű glükóz fordul elő természetesen. A tisztított glükanázok keverékeinek Aviceláz aktivitását ennélfogva az endoglükanáz plusz CBH (endoglükanáz/CBH-tömegarány körülbelül 3,5) és endoglükanáz aktivitásai közötti eltérésként definiáljuk. Ezzel feltételezzük, hogy mindkét enzim (Endol és EndoV) hasonló módon viselkedik Avicellel és alma cellulózzal szemben.Beldman et al. (1987) showed that the degradation of Avicel crystalline cellulose with different endoglucanases of Trichoderma viride gives different (proportional) products (glucose, cellobiose, cellotriose). However, after incubating apple WUS with Endol or EndoIV plus CBH, the only dissolved product is cellobiose. This contradiction is presumably also true for apple tissue, since none of the incubation mixtures containing Endol contain cellotriose. Glucose cannot be analyzed because naturally high levels of glucose are present in al ··· today. Avicellase activity of mixtures of purified glucanases is therefore defined as the difference between endoglucanase plus CBH (endoglucanase / CBH weight ratio of about 3.5) and endoglucanase activity. This assumes that both enzymes (Endol and EndoV) behave similarly to Avicel and apple cellulose.
Az 5.ábrában látható, hogy növekvő XGase aktivitásnál több cellobióz oldódik ki a blansírozott almaszövetből. A cellulóz lebontásban a „csupasz felszíni terület korlátozó tényező, amíg az XGase aktivitás el nem éri a körülbelül 25 mU szintet. Ezen pont után a cellobióz kioldást valószínűleg CBH mennyisége korlátozza. A glükanáz keverékek teljesítményét is vizuálisan értékeljük. Az elfolyósítás mértéke a 4.ábrabeli „3 mintáéhoz hasonló (adatokat nem közlünk), azt jelezve, hogy a cellobióz kioldást a szövetlebontás kezdeti szakasza határozza meg. Ezeket a kísérleteket megismételjük dupla adag glükanázokkal és megnövelt inkubációs időkkel is (40 óra) . A kis XGase aktivitásos inkubációknál még látható néhány szövetdarab, míg a nagy XGase aktivitással végzett inkubálásoknál az alma anyag teljesen elfolyósodott (adatokat nem közlünk).Figure 5 shows that with increasing XGase activity, more cellobiose is leached from blanched apple tissue. In cellulose degradation, “bare surface area is a limiting factor until XGase activity reaches about 25 mU. After this point, cellobiose lysis is likely to be limited by the amount of CBH. The performance of glucanase mixtures is also visually evaluated. The degree of liquefaction is similar to that of Example 3 in Figure 4 (data not shown), indicating that cellobiose lysis is determined by the initial stage of tissue degradation. These experiments were repeated with double-dose glucanases and increased incubation times (40 hours). At low XGase activity incubations, a few pieces of tissue are still visible, while at high XGase activity incubations the apple material is completely liquefied (data not shown).
Tisztított enzimekkel is be tudjuk mutatni az XGase aktivitás fontosságát az almaszövet lebontásában. Továbbá az alma WUSsal kapcsolatos eredményeket vonatkoztathatjuk a teljes almaszövetre is .Purified enzymes can also demonstrate the importance of XGase activity in the degradation of apple tissue. In addition, results for apple WUS can be applied to whole apple tissue.
Claims (14)
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP93201312 | 1993-05-10 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HU9500044D0 HU9500044D0 (en) | 1995-03-28 |
HUT70470A true HUT70470A (en) | 1995-10-30 |
Family
ID=8213817
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU9500044A HUT70470A (en) | 1993-05-10 | 1994-05-10 | Combined action of endoglucanases and cellobiohydrolases |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0656057A1 (en) |
JP (1) | JPH07508890A (en) |
AU (1) | AU668651B2 (en) |
BR (1) | BR9405351A (en) |
CA (1) | CA2139001A1 (en) |
FI (1) | FI950051A (en) |
HU (1) | HUT70470A (en) |
NZ (1) | NZ266461A (en) |
WO (1) | WO1994026880A1 (en) |
ZA (1) | ZA943258B (en) |
Families Citing this family (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7005128B1 (en) * | 1993-12-17 | 2006-02-28 | Genencor International, Inc. | Enzyme feed additive and animal feed including it |
NZ303162A (en) | 1995-03-17 | 2000-01-28 | Novo Nordisk As | Enzyme preparations comprising an enzyme exhibiting endoglucanase activity appropriate for laundry compositions for textiles |
FI952165A0 (en) * | 1995-05-05 | 1995-05-05 | Primalco Oy | Cellulaskomposition Foer behandling av cellulosainnehaollande materialer |
US5981835A (en) * | 1996-10-17 | 1999-11-09 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Transgenic plants as an alternative source of lignocellulosic-degrading enzymes |
US6818803B1 (en) | 1997-06-26 | 2004-11-16 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Transgenic plants as an alternative source of lignocellulosic-degrading enzymes |
US6489279B2 (en) | 1998-05-05 | 2002-12-03 | The Procter & Gamble Company | Laundry and cleaning compositions containing xyloglucanase enzymes |
JP4199422B2 (en) * | 1998-12-24 | 2008-12-17 | タカラバイオ株式会社 | Polypeptide |
WO2018099762A1 (en) | 2016-12-01 | 2018-06-07 | Basf Se | Stabilization of enzymes in compositions |
US11732250B2 (en) | 2018-04-26 | 2023-08-22 | Basf Se | Lipase enzymes |
WO2021105330A1 (en) | 2019-11-29 | 2021-06-03 | Basf Se | Compositions and polymers useful for such compositions |
MX2023003275A (en) | 2020-09-22 | 2023-04-12 | Basf Se | Improved combination of protease and protease inhibitor with secondary enzyme. |
WO2023117977A1 (en) | 2021-12-21 | 2023-06-29 | Basf Se | Chemical product passport |
WO2024033136A1 (en) | 2022-08-11 | 2024-02-15 | Basf Se | Amylase variants |
WO2024033135A2 (en) | 2022-08-11 | 2024-02-15 | Basf Se | Amylase variants |
WO2024094733A1 (en) | 2022-11-04 | 2024-05-10 | Basf Se | Polypeptides having protease activity for use in detergent compositions |
WO2024094732A1 (en) | 2022-11-04 | 2024-05-10 | Basf Se | Polypeptides having protease activity for use in detergent compositions |
WO2024094735A1 (en) | 2022-11-04 | 2024-05-10 | Basf Se | Polypeptides having protease activity for use in detergent compositions |
EP4389864A1 (en) | 2022-12-20 | 2024-06-26 | Basf Se | Cutinases |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SU983141A1 (en) * | 1981-06-29 | 1982-12-23 | Всесоюзный Научно-Исследовательский Биотехнический Институт | Method of producing cellulolytic enzyme complex |
CA1338400C (en) * | 1983-08-31 | 1996-06-18 | David H. Gelfand | Recombinant fungal cellulases |
US5110735A (en) * | 1989-09-26 | 1992-05-05 | Midwest Research Institute | Thermostable purified endoglucanase from thermophilic bacterium acidothermus cellulolyticus |
WO1992006183A1 (en) * | 1990-10-05 | 1992-04-16 | Genencor International, Inc. | Methods for treating cotton-containing fabrics with cellulase |
DK73891D0 (en) * | 1991-04-22 | 1991-04-22 | Novo Nordisk As | ENZYME TREATMENT |
WO1993022428A1 (en) * | 1992-05-01 | 1993-11-11 | Genencor International, Inc. | Methods for treating cotton-containing fabrics with cbh i enriched cellulase |
-
1994
- 1994-05-10 CA CA002139001A patent/CA2139001A1/en not_active Abandoned
- 1994-05-10 NZ NZ266461A patent/NZ266461A/en unknown
- 1994-05-10 EP EP94916229A patent/EP0656057A1/en not_active Withdrawn
- 1994-05-10 HU HU9500044A patent/HUT70470A/en unknown
- 1994-05-10 AU AU67971/94A patent/AU668651B2/en not_active Ceased
- 1994-05-10 JP JP6524968A patent/JPH07508890A/en active Pending
- 1994-05-10 WO PCT/EP1994/001531 patent/WO1994026880A1/en not_active Application Discontinuation
- 1994-05-10 BR BR9405351-0A patent/BR9405351A/en not_active Application Discontinuation
- 1994-05-11 ZA ZA943258A patent/ZA943258B/en unknown
-
1995
- 1995-01-04 FI FI950051A patent/FI950051A/en unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO1994026880A1 (en) | 1994-11-24 |
AU668651B2 (en) | 1996-05-09 |
HU9500044D0 (en) | 1995-03-28 |
CA2139001A1 (en) | 1994-11-24 |
BR9405351A (en) | 1999-09-28 |
JPH07508890A (en) | 1995-10-05 |
ZA943258B (en) | 1995-01-11 |
EP0656057A1 (en) | 1995-06-07 |
FI950051A (en) | 1995-03-03 |
AU6797194A (en) | 1994-12-12 |
FI950051A0 (en) | 1995-01-04 |
NZ266461A (en) | 1997-01-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
HUT70470A (en) | Combined action of endoglucanases and cellobiohydrolases | |
de Souza et al. | Cellulases, hemicellulases, and pectinases: Applications in the food and beverage industry | |
Talbott et al. | Molecular size and separability features of pea cell wall polysaccharides: implications for models of primary wall structure | |
Williams et al. | Polysaccharide-degrading enzymes formed by three species of anaerobic rumen fungi grown on a range of carbohydrate substrates | |
Prasanna et al. | Fruit ripening phenomena–an overview | |
Hatfield et al. | Characterization of the hydrolytic activity of avocado cellulase | |
Prabasari et al. | Pectic polysaccharides from mature orange (Citrus sinensis) fruit albedo cell walls: Sequential extraction and chemical characterization | |
Grishutin et al. | Specific xyloglucanases as a new class of polysaccharide-degrading enzymes | |
Vincken et al. | The effect of xyloglucans on the degradation of cell-wall-embedded cellulose by the combined action of cellobiohydrolase and endoglucanases from Trichoderma viride | |
Mutter et al. | Rhamnogalacturonan [alpha]-L-rhamnopyranohydrolase (a novel enzyme specific for the terminal nonreducing rhamnosyl unit in rhamnogalacturonan regions of pectin) | |
Mikkelson et al. | Hydrolysis of konjac glucomannan by Trichoderma reesei mannanase and endoglucanases Cel7B and Cel5A for the production of glucomannooligosaccharides | |
Ishikawa et al. | Characterization of pectin methyltransferase from soybean hypocotyls | |
Doong et al. | Solubilization and characterization of a galacturonosyltransferase that synthesizes the pectic polysaccharide homogalacturonan | |
Ray et al. | Novel and diverse fine structures in LiCl–DMSO extracted apple hemicelluloses | |
Noguchi et al. | Determination of chemical structure of pea pectin by using pectinolytic enzymes | |
Irwin et al. | Cloning, expression and characterization of a family‐74 xyloglucanase from Thermobifida fusca | |
Lemaire et al. | Three novel rhamnogalacturonan I-pectins degrading enzymes from Aspergillus aculeatinus: Biochemical characterization and application potential | |
Shiga et al. | Two banana cultivars differ in composition of potentially immunomodulatory mannan and arabinogalactan | |
Steck et al. | Structural profiling of xyloglucans from food plants by high-performance anion-exchange chromatography with parallel pulsed amperometric and mass spectrometric detection | |
Vincken et al. | Potato xyloglucan is built from XXGG-type subunits | |
Bouranis et al. | Cell wall metabolism in growing and ripening stone fruits | |
Kato et al. | Enzymic dissociation of Zea shoot cell wall polysaccharides: II. Dissociation of (1→ 3),(1→ 4)-β-D-glucan by purified (1→ 3),(1→ 4)-β-D-glucan 4-glucanohydrolase from Bacillus subtilis | |
Renard et al. | Studies on apple protopectin. II: Apple cell wall degradation by pure polysaccharidases and their combinations | |
Chen et al. | Biorefinery of apple pomace: New insights into xyloglucan building blocks | |
Eda et al. | Enzymatic activity and substrate specificity of the recombinant tomato β-galactosidase 1 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
DGB9 | Succession in title of applicant |
Owner name: DSM N.V.,, NL |
|
DFA9 | Temporary prot. cancelled due to abandonment |