CN116554238A - 一种高纯度β-烟酰胺单核苷酸的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种高纯度β‑烟酰胺单核苷酸的制备方法，使用3‑吡啶甲酸乙酯和四乙酰核糖作为原料，通过缩合反应、加入醇的有机金属盐、磷酸化、再进行过柱洗脱纯化，制得一种高纯度的β‑烟酰胺单核苷酸。本发明的制备方法中控制缩合反应中原料的特定添加量、反应温度，控制特定的醇的有机金属盐的使用量与反应温度，以及磷酸化反应中使用特定的POCl3/PO(OCH3)3溶液，制得的β‑烟酰胺单核苷酸纯度高，具有高产率高纯度的特点，可广泛适用于化妆品产品中；且反应条件温和、易于操作，具有极大的市场应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及化妆品原料技术领域，具体涉及一种高纯度β-烟酰胺单核苷酸的制备方法及其应用。
背景技术
烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN)属于维生素B族衍生物，是一种天然存在的生物活性核苷酸，参与了许多重要的生化代谢过程，如能量产生、细胞凋亡等。烟酰胺单核苷酸有α和β两种异构体，其中β-烟酰胺单核苷酸为烟酰胺单核苷酸的活性形式。
NMN的生产工艺主要包括生物合成法和化学合成方法。由于生物合成法酶法对生产的条件要求比较高，技术投资大，因此化学合成方法仍是NMN的合成研究中的一个重点方向。
专利CN112225770A公开了一种烟酰胺单核苷酸(NMN)的化学合成方法，使用β-烟酰胺核糖和四氢呋喃为原料，通过磷酸化、萃取、树脂脱盐后得到β-烟酰胺单核苷酸。其反应步骤简单，但是其合成的β-烟酰胺单核苷酸的纯度却有待提高。
β-烟酰胺单核苷酸的制备中，由于手性异构体的存在，常会导致制备的β-烟酰胺单核苷纯度不高。当下，研发出一种反应条件温和、易于操作、高产率且高纯度的β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，具有极大的市场价值。
发明内容
针对上述问题，本发明一方面提供一种高纯度β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，其具体步骤如下：
步骤S1：将3-吡啶甲酸乙酯和四乙酰核糖溶于溶剂A中，加入含有至少一个氟的甲磺酸，在40-60℃条件下反应2-4h，除去溶剂后得到反应物A；
步骤S2：将反应物A溶于溶剂B中，在-20℃～-1℃条件下加入醇的有机金属盐，反应2-4h，加酸溶液调节pH为5-6，在-5～5℃条件下加入甲基叔丁基醚得反应物B；
步骤S3：将反应物B溶于溶剂C中，加入POCl3/PO(OCH3)3溶液在-5-0℃条件下反应1-2h，加入冰水淬灭反应，加入有机溶剂萃取即得β-烟酰胺单核苷酸溶液；
步骤S4：将β-烟酰胺单核苷酸溶液使用色谱柱进行洗脱分离，收集洗脱液，干燥冻干即得所述高纯度的β-烟酰胺单核苷酸。
优选的，所述步骤S1中的溶剂A为二氯甲烷、四氢呋喃、N,N二甲基甲酰胺、三氯甲烷、二甲基亚砜、丙酮中的至少一种。本发明中，所述溶剂A优选为三氯甲烷。
优选的，所述步骤S1中3-吡啶甲酸乙酯和四乙酰核糖的质量比为0.8-1：1。例如可列举的有0.8：1、0.9：1、1：1等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
优选的，所述步骤S1中的含有至少一个氟的甲磺酸为三氟甲磺酸、三甲基硅三氟甲磺酸酯中的一种。本发明中，所述含有至少一个氟的甲磺酸优选的为三甲基硅三氟甲磺酸酯。
在步骤S1的缩合反应中，反应原料3-吡啶甲酸乙酯、四乙酰核糖和含有至少一个氟的甲磺酸的使用量，直接影响到缩合反应的进行。本发明中通过控制3-吡啶甲酸乙酯和四乙酰核糖的质量比为0.8-1：1、四乙酰核糖与含有至少一个氟的甲磺酸的质量比为1：(0.3-0.6)，使反应能够稳定进行，并且减低杂质特别是手性异构体的生成。
优选的，步骤S1中的所述四乙酰核糖与含有至少一个氟的甲磺酸的质量比为1：(0.3-0.6)。例如可列举的有1：0.3、1：0，4、1：0，5、1：0.6等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
优选的，步骤S1中所述四乙酰核糖与溶剂A的质量体积比为1：3-5g/ml。
优选的，步骤S1中所述反应2-4h后，再加入乙醇溶液，所述乙醇与四乙酰核糖的质量比为1：(6-8)。本发明中对乙醇溶液的浓度不做具体限定。
优选的，步骤S2中所述溶剂B为乙醇、甲醇、异丙醇中的至少一种。本发明中优选的为乙醇。
优选的，步骤S2中所述醇的有机金属盐为甲醇钠、乙醇钠、异丙醇钠、叔丁醇钾中的一种。更优选的，本发明中所述醇的有机金属盐为异丙醇钠。
优选的，所述醇的有机金属盐与反应物A的质量比为1：(4-6)。例如可列举的有1：4、1：5、1：6等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。本发明中通过添加醇的有机金属盐将反应物A进行处理，得到核苷盐。控制醇的有机金属盐与反应物A的质量比为1：(4-6)，且在加入醇的有机金属盐时需控制加入速率，控制反应体系的温度不超过-5℃。醇的有机金属盐的作用主要为对反应物A碱解去除乙酰基，若添加量过多不易于后续处理且处理成本较高，若添加量过少无法有效去除乙酰基。
优选的，步骤S2中所述酸溶液为醋酸溶液或盐酸溶液。本发明中对酸溶液的浓度不做具体限定，调节pH为5-6即可。
优选的，步骤S3中所述溶剂C为四氢呋喃、乙腈、三甲基磷酸酯中的一种。更优选的，所述溶剂为乙腈。
优选的，步骤S3中所述反应物B与溶剂C的质量体积比为1：4-6g/ml。例如可列举的有1：4g/ml、1：5g/ml、1：6g/ml等，但并不仅限于所列举的数值，该数值范围内其他未列举的数值同样适用。
优选的，步骤S3中所述反应物B与POCl3/PO(OCH3)3溶液的质量体积比为1：1-2g/ml。本发明中，控制反应物B与磷酸化溶液的用量，并且使用的POCl3/PO(OCH3)3溶液中POCl3与PO(OCH3)3的质量体积比为1：1-2g/ml，对反应物B进行磷酸化处理，去除羟基得到β-烟酰胺单核苷酸。POCl3/PO(OCH3)3溶液的用量过低或过高都会影响磷酸基对羟基的磷酸化反应。
优选的，步骤S3中所述POCl3/PO(OCH3)3溶液中POCl3与PO(OCH3)3的质量体积比为1：1-4g/ml。更优选的，POCl3与PO(OCH3)3的质量体积比为1：3-4g/ml。
优选的，所述有机溶剂为乙酸乙酯、正庚烷、二氯甲烷中的一种。更优选的，所述有机溶剂为乙酸乙酯。
优选的，步骤S4中所述β-烟酰胺单核苷酸溶液先进行过滤，所述过滤膜为孔径为0.01-1μm的中空纤维膜。
优选的，步骤S4中所述色谱柱的固定相为分析纯硅胶。
优选的，步骤S4中所述洗脱液为80％乙醇溶液，洗脱液用量为1-1.2倍柱体积，所述洗脱次数为1-4次。
本发明另一方面提供一种高纯度β-烟酰胺单核苷酸在化妆品中的应用。
有益效果：
本发明使用3-吡啶甲酸乙酯和四乙酰核糖作为原料，通过缩合反应、加入醇的有机金属盐、磷酸化、再进行过柱洗脱纯化，制得一种高纯度的β-烟酰胺单核苷酸。本发明的制备方法控制缩合反应中原料的特定添加量、反应温度，控制特定的醇的有机金属盐的使用量与反应温度，以及磷酸化反应中使用特定的POCl3/PO(OCH3)3溶液，制得的β-烟酰胺单核苷酸纯度高，具有高产率高纯度的特点，可广泛适用于化妆品产品中；且反应条件温和、易于操作，具有极大的市场应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1制得的β-烟酰胺单核苷酸的样品袋装图；
图2为本发明实施例1制得的β-烟酰胺单核苷酸的样品瓶装图。
具体实施方式
为更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，下面对本发明进一步详细说明。但下述的实施例仅仅是本发明的举例，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明保护范围以权利要求书为准。
实施例
实施例1
本实施例提供一种高纯度β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，具体步骤如下：
步骤S1：将90g的3-吡啶甲酸乙酯和100g的四乙酰核糖溶于400ml的三氯甲烷中，滴加50g的三甲基硅三氟甲磺酸酯，滴加时间为60min，在50℃条件下反应3h后，降至室温，加入15g乙醇淬灭反应，减压除去溶剂后得到反应物A；
步骤S2：将反应物A溶于800ml乙醇中，在-5℃条件下滴加加入35g异丙醇钠，反应3h，加稀盐酸调节pH为5-6，在0℃条件下加入甲基叔丁基醚，析出固体即得反应物B；
步骤S3：将反应物B溶于600ml乙腈中，加入200ml的POCl3/PO(OCH3)3溶液在-5-0℃条件下反应2h，加入冰水淬灭反应，加入乙酸乙酯萃取即得β-烟酰胺单核苷酸溶液；
POCl3/PO(OCH3)3溶液中POCl3与PO(OCH3)3的质量体积比为1：3g/ml。
步骤S4：将β-烟酰胺单核苷酸溶液使用色谱柱(固定相为分析纯硅胶)进行洗脱分离，洗脱液为80％乙醇溶液，洗脱液用量为1倍柱体积，所述洗脱次数为3次，收集洗脱液，干燥冻干即得所述高纯度的β-烟酰胺单核苷酸，收率为71％。
3-吡啶甲酸乙酯购于重庆睿雅生物科技有限公司；四乙酰核糖购于湖北帝柏化工有限公司；三甲基硅三氟甲磺酸酯(CAS号为27607-77-8)购于江西国化实业有限公司；三氯甲烷、异丙醇钠购于阿拉丁；甲基叔丁基醚购于山东千祥化工有限公司；乙腈购于山东创赢化工有限公司；POCl3、PO(OCH3)3购于麦卡希试剂。
实施例2
本实施例提供一种高纯度β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，具体步骤如下：
步骤S1：将80g的3-吡啶甲酸乙酯和100g的四乙酰核糖溶于400ml的三氯甲烷中，滴加40g的三甲基硅三氟甲磺酸酯，滴加时间为60min，在50℃条件下反应3h后，降至室温，加入15g乙醇淬灭反应，减压除去溶剂后得到反应物A；
步骤S2：将反应物A溶于800ml乙醇中，在-5℃条件下滴加加入33g异丙醇钠，反应3h，加稀盐酸调节pH为5-6，在0℃条件下加入甲基叔丁基醚，析出固体即得反应物B；
步骤S3：将反应物B溶于600ml乙腈中，加入180ml的POCl3/PO(OCH3)3溶液在-5-0℃条件下反应2h，加入冰水淬灭反应，加入乙酸乙酯萃取即得β-烟酰胺单核苷酸溶液；
POCl3/PO(OCH3)3溶液中POCl3与PO(OCH3)3的质量体积比为1：3g/ml。
步骤S4：将β-烟酰胺单核苷酸溶液使用色谱柱(固定相为分析纯硅胶)进行洗脱分离，洗脱液为80％乙醇溶液，洗脱液用量为1倍柱体积，所述洗脱次数为3次，收集洗脱液，干燥冻干即得所述高纯度的β-烟酰胺单核苷酸，收率为67％。
对比例1
本实施例提供一种高纯度β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，具体实施方式同实施例1，与实施例1的区别在于步骤S1的具体步骤为：
将60g的3-吡啶甲酸乙酯和100g的四乙酰核糖溶于400ml的三氯甲烷中，滴加30g的三甲基硅三氟甲磺酸酯，滴加时间为60min，在50℃条件下反应3h后，降至室温，加入15g乙醇淬灭反应，减压除去溶剂后得到反应物A；β-烟酰胺单核苷酸的收率为61％。
对比例2
本实施例提供一种高纯度β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，具体实施方式同实施例1，与实施例1的区别在于步骤S2的具体步骤为：
将反应物A溶于800ml乙醇中，在-5℃条件下滴加加入50g异丙醇钠，反应3h，加稀盐酸调节pH为5-6，在0℃条件下加入甲基叔丁基醚，析出固体即得反应物B；β-烟酰胺单核苷酸的收率为69％。。
对比例3
本实施例提供一种高纯度β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，具体实施方式同实施例1，与实施例1的区别在于步骤S3的具体步骤为：
将反应物B溶于600ml乙腈中，加入100ml的POCl3/PO(OCH3)3溶液在-5-0℃条件下反应2h，加入冰水淬灭反应，加入乙酸乙酯萃取即得β-烟酰胺单核苷酸溶液；POCl3/PO(OCH3)3溶液中POCl3与PO(OCH3)3的质量体积比为1：1g/ml；β-烟酰胺单核苷酸的收率为58％。
β-烟酰胺单核苷酸的纯度测试：
高效液相色谱检测方法为：将β-烟酰胺单核苷酸配置为10g/L的溶液，进行连续上样，上样流速：0.2BV/min，上样10BV(2L)。
色谱柱：岛津INERTSIL ODS-SP 5μm 4.6*150mm；流动相：A：pH＝6.6磷酸三乙胺水溶液；B：甲醇；A/B＝97/3v/v；检测波长：UV@256nm；柱温：40℃；流速：0.6mL/min；进样量：20μL。
将实施例1-2、对比例1-3得到的β-烟酰胺单核苷酸使用HPLC进行β-烟酰胺单核苷酸的含量测试，测得其纯度见表1。
表1
| 实施例 | 实施例1 | 实施例2 | 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 |
| 纯度(％) | 98.7 | 98.4 | 95.1 | 96.3 | 92.2 |
Claims (10)
1.一种高纯度β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，其特征在于，所述制备方法的具体步骤如下：
步骤S1：将3-吡啶甲酸乙酯和四乙酰核糖溶于溶剂A中，加入含有至少一个氟的甲磺酸，在40-60℃条件下反应2-4h，除去溶剂后得到反应物A；
步骤S2：将反应物A溶于溶剂B中，在-20℃～-1℃条件下加入醇的有机金属盐，反应2-4h，加酸溶液调节pH为5-6，在-5～5℃条件下加入甲基叔丁基醚得反应物B；
步骤S3：将反应物B溶于溶剂C中，加入POCl3/PO(OCH3)3溶液在-5-0℃条件下反应1-2h，加入冰水淬灭反应，加入有机溶剂萃取即得β-烟酰胺单核苷酸溶液；
步骤S4：将β-烟酰胺单核苷酸溶液使用色谱柱进行洗脱分离，收集洗脱液，干燥冻干即得所述高纯度的β-烟酰胺单核苷酸。
2.根据权利要求1所述的一种高纯度β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中的溶剂A为二氯甲烷、四氢呋喃、N,N二甲基甲酰胺、三氯甲烷、二甲基亚砜、丙酮中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的一种高纯度β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中3-吡啶甲酸乙酯和四乙酰核糖的质量比为0.8-1：1。
4.根据权利要求1所述的一种高纯度β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中的含有至少一个氟的甲磺酸为三氟甲磺酸、三甲基硅三氟甲磺酸酯中的一种。
5.根据权利要求1所述的一种高纯度β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中的四乙酰核糖与含有至少一个氟的甲磺酸的质量比为1：
(0.3-0.6)。
6.根据权利要求1所述的一种高纯度β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中醇的有机金属盐为甲醇钠、乙醇钠、异丙醇钠、叔丁醇钾中的一种。
7.根据权利要求6所述的一种高纯度β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，其特征在于，所述醇的有机金属盐与反应物A的质量比为1：(4-6)。
8.根据权利要求1所述的一种高纯度β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中反应物B与溶剂C的质量体积比为1：4-6g/ml。
9.根据权利要求1所述的一种高纯度β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中反应物B与POCl3/PO(OCH3)3溶液的质量体积比为1：1-2g/ml。
10.根据权利要求1-9任一项所述的一种高纯度β-烟酰胺单核苷酸的制备方法制备的高纯度β-烟酰胺单核苷酸在化妆品中的应用。
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