CN110483601A - 制备β-烟酸胺单核苷酸的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于化学合成领域，具体涉及一种制备β‑烟酰胺单核苷酸的方法及其应用。该制备方法包括：S1、缩合反应：将烟酸乙酯、四乙酰核糖和催化剂在第一溶剂中进行缩合反应得到含有烟酸乙酯三乙酰核苷的溶液；S2、氨解反应：将含有烟酸乙酯三乙酰核苷的溶液经氨气溶液进行氨解反应，得到烟酰胺核苷盐酸盐；S3、磷酸化反应：将烟酰胺核苷盐酸盐与三氯氧磷在第二溶剂中进行反应，得到β‑烟酸胺单核苷酸。该制备方法相比于常规方法，具有操作简单、易放大、易纯化以及收率高等优点。
Description
技术领域
本发明属于化学合成领域，具体涉及一种制备β-烟酰胺单核苷酸的方法及其应用。
背景技术
辅酶NAD+、NADH和NADP+、NADPH的细胞氧化还原反应是众所周知的，已知NAD+在凋亡、钙动员、老化、基因表达、免疫系统调节、能量代谢和代谢调节中发挥重要作用；NAD+可以酶促合成和化学合成，自维生素B3(烟酸(NA)、烟酰胺(Nam)、烟酰胺核苷(NR)、烟酰胺单核苷酸(NMN))的各种前体和色氨酸。NAD+利用反应释放烟酰胺，循环利用烟酰胺，以使用烟酰胺磷酸核糖转移酶由烟酰胺和5-磷酸核糖焦磷酸形成NMN。合成的NMN与ATP反应，并通过烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶(NMNAT)转化为NAD+。对于可以施用以增加生理NAD+的前体的兴趣日益增加，这推动了对前体NMN有效、实用的合成的开发。
β-烟酰胺单核苷酸(NMN)是辅酶NAD+的合成前体，同时NMN也被用于抗衰老研究。日本庆应义塾大学和美国华盛顿大学合作，正在对β-NMN的抗衰老效果和安全性进行人体临床试验。研究表明，β-烟酰胺单核苷酸(NMN)具有以下作用：1.延缓衰老：恢复衰老细胞的功能，让虚弱的人体器官恢复活力，从而达到延缓衰老的目的；2.提高心血管健康：提高心肌细胞和血管细胞的功能，还能降低心血管系统中血脂水平，所以，能提高心血管功能；3.提高大脑健康：提高脑细胞和其他神经细胞的活力，提高整个神经系统的功能，因此，能提高大脑健康，对老年痴呆症有较好的效果，轻度认知功能障碍和阿尔茨海默症患者的脑线粒体会发生特征性改变，线粒体能量输出也会随着疾病的发展而减少；4.提高脂肪代谢：减少人体对食物中脂类物质的吸收，提高脂肪细胞内脂肪的消耗，达到减肥的目的：5.提高人体对癌细胞的抵抗力：提高人体内各种免疫细胞的功能，增强对癌细胞的抵抗力，对癌症有辅助治疗的作用：6.戒毒作用：大剂量的服用，能解除毒瘾，有较好的戒毒作用；7.美容作用：提高表皮细胞功能，以及人体内其他细胞的功能，能让皮肤保持青春光彩。
目前文献报道的这两种化合物的合成方法主要有两种，其中β-烟酰胺核糖是作为β-烟酰胺单核苷酸(NMN)合成的中间体的方式来进行的。第一种方法：以烟酰胺为起始物：
(参见Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 2002,12,1135–1137)；
第二种方法：以烟酸乙酯为起始物：
(参见Journal of Medicinal Chemistry,2007,50,6458–6461；AngewandteChemie-International Edition,2004,43,4637–4640)；
这两条路线都存在收率低(低于28％)、反应纯化难、中间体稳定性差、放大难(都需要通过活性炭色谱分离)等问题。因此找到一种收率高、适用于工业化批量生产的制备方法显得尤为重要。
发明内容
为了克服现有的制备β-烟酰胺单核苷酸方法的缺陷，本发明提供了一种操作简便、产品纯度高、收率高、能够进行吨位级工业化生产的制备β-烟酰胺单核苷酸的新方法。
本发明所要解决的第一个方面是提供一种制备稳定状态的β-烟酰胺核糖盐酸盐的新方法。
具体方案如下：
一种制备β-烟酸胺单核苷酸的方法，包括以下步骤：
S1、缩合反应：将烟酸乙酯、四乙酰核糖和催化剂在第一溶剂中进行缩合反应得到含有烟酸乙酯三乙酰核苷的溶液；
S2、氨解反应：将含有烟酸乙酯三乙酰核苷的溶液经氨气溶液进行氨解反应，得到烟酰胺核苷盐酸盐；
S3、磷酸化反应：将烟酰胺核苷盐酸盐与三氯氧磷在第二溶剂中进行反应，得到β-烟酸胺单核苷酸。
应该理解，本发明不限于上述步骤，还可以包含其他的步骤，例如在步骤S1之前、步骤S1和S2之间、步骤S2和S3之间、步骤S3之后，还包含其他额外的步骤，而不超出本发明的保护范围。
优选的，所述S1至少满足以下任意一项：
(1)所述催化剂为三氟甲磺酸三甲基硅脂或三甲基氯硅烷中的一种；
(2)所述烟酸乙酯、四乙酰核糖与催化剂的摩尔比为(1﹕1﹕1)～(1﹕2﹕2)；
(3)所述第一溶剂为二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、氯仿或乙腈中的任意一种；
(4)所述缩合反应的温度为0～50℃；
(5)所述缩合反应的时间为0.5～2h。
优选的，所述S2至少满足以下任意一项：
(1)所述氨气溶液与含有烟酸乙酯三乙酰核苷溶液的重量比为(1：3)～(1﹕10)；
(2)所述氨解反应的反应温度为-20～5℃；
(3)所述氨解反应的反应时间为1.0～36h。
更优选的，所述氨解反应的反应时间为20-36h。
优选的，所述氨气溶液至少包括甲醇、乙醇、乙酸乙酯和二氯甲烷中的一种。所述氨气溶液的摩尔浓度比为1.0-7.0mol/L，具体的，此处摩尔浓度比指“氨气摩尔浓度：(甲醇、乙醇、乙酸乙酯和二氯甲烷中的一种摩尔浓度)”。
更优选的，所述氨气溶液的摩尔浓度比为1.0-3.0mol/L。
更优选的，所述S2包括：
S21：含有烟酸乙酯三乙酰核苷的溶液经氨气溶液进行氨解反应；
S22：将氨解反应得到的溶液减压浓缩后加入含氯化氢的溶液，搅拌析出粘稠固体；
S23：过滤后，往粘稠固体中再加入析晶溶剂，在-5～5℃的条件下搅拌，析出固体即得到烟酰胺核苷盐酸盐。
应该理解，本发明不限于上述步骤，还可以包含其他的步骤，例如在步骤S1之前、步骤S21和S22之间、步骤S22和S23之间、步骤S23之后，还包含其他额外的步骤，而不超出本发明的保护范围。
优选的，所述含氯化氢的溶液中至少包括乙酸乙酯、二氯甲烷和甲基叔丁基醚中的一种或任意组合。
优选的，所述析晶溶剂包括丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲基叔丁基醚、正己烷、正庚烷中的任意一种或任意组合。
优选的，所述S3至少满足以下任意一项：
(1)所述烟酰胺核苷盐酸盐与三氯氧磷摩尔比为(1﹕1)～(1﹕5)；
(2)所述第二溶剂为极性非质子溶剂；
(3)所述第二溶剂与烟酰胺核苷盐酸盐的质量比为(1：3)～(1﹕10)；
(4)反应温度为-20～5℃；
优选的，所述S3包括：
S31：将烟酰胺核苷盐酸盐与三氯氧磷在第二溶剂中进行反应；
S32：调节pH值至pH值>5；
S33：使用有机溶剂萃取除去杂质，得到水相，将水相放置于-5～0℃，析出粗品；
S34：将粗品进行纯化处理得到β-烟酸胺单核苷酸。
应该理解，本发明不限于上述步骤，还可以包含其他的步骤，例如在步骤S31之前、步骤S31和S32之间、步骤S32和S33之间、步骤S33和S34之间、步骤S34之后，还包含其他额外的步骤，而不超出本发明的保护范围。
更优选的，所述第二溶剂为极性非质子溶剂。在本发明的一些优选的实施例中，所述第二溶剂为四氢呋喃、乙腈、磷酸三乙酯或磷酸三甲酯。
更优选的，所述有机溶剂为非极性溶剂，所述非极性溶剂包括乙酸乙酯、二氯甲烷、甲基异丁酮、甲基叔丁基醚、正己烷和正庚烷中的一种或者任意组合。
更优选的，在S32中，采用无机盐调节pH值；较佳的，所述无机盐为碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾或碳酸氢钾中的一种或任意组合。
更优选的，在S34中，采用离子交换树脂进行纯化处理；较佳的，所述离子交换树脂为弱碱性阴离子交换树脂。
在本发明的一些优选实施例中，制备β-烟酸胺单核苷酸的方法包括以下步骤：
a、缩合：烟酸乙酯、四乙酰核糖和催化剂在第一溶剂中0～50℃进行缩合反应0.5～2h，TLC监控反应完成，反应结束后，控制体系在-5℃以下，加入乙醇搅拌反应淬灭催化剂，得到含有烟酸乙酯三乙酰核苷的溶液；并且将反应溶液浓缩干，直接投下一步反应，所述催化剂为TMSOTf或TMSCl中任意一种；所述烟酸乙酯、四乙酰核糖与催化剂摩尔比为(1﹕1﹕1)～(1﹕2﹕1)；所述溶剂为二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、氯仿或乙腈中任意一种；
b、氨解脱乙酰基：将步骤a含有烟酸乙酯三乙酰核苷的与氨气溶液混合，在-20～20℃反应2～36h，反应结束后将反应溶剂减压蒸出，残留体系加入含氯化氢气体的溶剂，搅拌除去三氟甲磺酸，分离液体，再加入析晶溶剂，搅拌析晶得到得到β-烟酰胺核糖盐酸盐；所述氨气溶液为有氨气的甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷中任意一种或多种的组合溶液；最优为乙酸乙酯，二氯甲烷的氨溶液。所述氯化氢的溶液为氯化氢的乙酸乙酯、二氯甲烷、甲基叔丁基醚中的任意一种或多种的组合溶液；所述析晶的溶液为丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲基叔丁基醚、正己烷、正庚烷中的任意一种或多种的组合溶液。
c、磷酸化：将步骤b含有β-烟酰核糖盐酸盐与三氯氧磷于-20～5℃在溶剂中进行反应10～24h，反应结束后采用无机盐调节pH值，在用非极性溶剂除杂，最后降温在初期部分盐，最后产品使用离子交换树脂纯化的，得到高纯度的产品。调节pH值使用碳酸钠，碳酸氢钠，碳酸钾，碳酸氢钾中的一种或几种混合体系；所述除杂溶剂为乙酸乙酯，二氯甲烷，甲叔醚，正己烷，正庚烷中的一种或多种混合体系，最优选择甲叔醚或者乙酸乙酯与正己烷混合溶液。
本发明第二个方面公开了上述的方法制备得到的β-烟酸胺单核苷酸。
本发明第三个方面公开了上述的方法或上述的β-烟酸胺单核苷酸在医药领域中的应用。例如，所述β-烟酸胺单核苷酸可应用于心血管、癌症、脑细胞或美容等领域。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。
本发明相对于现有技术具有如下的显著优点及效果：
本发明以烟酸乙酯、四乙酰核糖为底物，经过缩合、氨解和磷酸化反应得到β-烟酰胺单核苷酸，该制备方法相比于常规方法，具有操作简单、易放大、易纯化以及收率高等优点。
附图说明
图1为本发明制备方法的工艺路线图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
本发明中β-烟酸胺单核苷酸的合成工艺路线图如图1所示，具体的，包括以下步骤：
S1、缩合反应：将烟酸乙酯、四乙酰核糖和催化剂在第一溶剂中进行缩合反应得到含有烟酸乙酯三乙酰核苷的溶液；
S2、氨解反应：将含有烟酸乙酯三乙酰核苷的溶液经氨气溶液进行氨解反应，得到烟酰胺核苷盐酸盐；
S3、磷酸化反应：将烟酰胺核苷盐酸盐与三氯氧磷在第二溶剂中进行反应，得到β-烟酸胺单核苷酸。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。
实施例1
本实施例公开了一种制备β-烟酸胺单核苷酸的方法，包括以下步骤：
a、缩合(即制备烟酸乙酯三乙酰核苷)：
500ml三口瓶中加入四乙酰核糖(50g，0.157mol)，100mL二氯甲烷，搅拌溶解，再加入烟酸乙酯(28.5g，0.188mol)，搅拌均匀；室温下，滴加用50mL二氯甲烷稀释的三氟甲磺酸三甲基硅酯(TMsOTf 41.8g，0.188mol)，滴加过程放热，控制温度在20℃以下，约0.5小时内加完，滴加完毕，接着搅拌反应1小时以完成反应(TLC监控四乙酰核糖消失)。反应完成，反应液冷却至-5℃以下，滴加15mL乙醇，加完搅拌15min以破坏TMSOTf淬灭反应，从而终止反应。将反应体系室温减压浓缩干，无需后处理直接用于下一步。
b、氨解脱乙酰基(制备烟酰胺核糖盐酸盐)：
在-5℃，向步骤a制得的含有烟酸乙酯三乙酰核苷体系加入5mol/L氨乙酸乙酯溶液300ml，在-5～0℃搅拌反应20小时以完成反应(TLC监控至原料和中间体1消失)。反应完成，低温减压浓缩除去溶剂；再加入含氯化氢的甲基叔丁醚溶液，体系变粘稠，析出固体，搅拌30min，过滤，固体再用400ml甲叔醚室温打浆2h，过滤干燥，得到36.5g产品(收率80.0％，纯度98.3％)。
c、磷酸化(即制备β-烟酰胺单核苷酸)：
称取步骤b所得β-烟酰胺核糖盐酸盐(14.6g，0.05mol)，加至250mL三口瓶，再加入磷酸三甲酯50ml，冷却至-5℃以下，滴加三氯氧磷(15.3g，0.10mol)，滴加过程放热，控制温度在5℃以下，约30分钟加完。接着在-10～-5℃搅拌反应过夜(20小时，HPLC监控)。反应完，往体系中加碳酸钾，条件pH值>5.0；搅拌，并且过滤，滤液加入50ml水，使用甲叔醚萃取分液除杂，将水相再放置-5～0℃，搅拌析出无机盐，过滤，液体用离子交换树脂进行纯化，得到β-烟酰胺单核苷酸14.1g(收率84.40％，纯度99.2％)。
其中收率的计算方法为：收率(％)＝实验得到的β-烟酰胺单核苷酸质量/理论β-烟酰胺单核苷酸质量。具体的，β-烟酰胺核糖盐酸盐分子量292.75，烟酰胺单核苷酸为：334.22，投料为14.6g，理论收率为16.7g。因此收率为：14.1/16.7＝84.4％。
其中纯度数据属于仪器数据，是根据高压液相检测面积积分得到。
实施例2
本实施例公开了一种制备β-烟酸胺单核苷酸的方法，包括以下步骤：
a、缩合(即制备烟酸乙酯三乙酰核苷)：
500ml三口瓶中加入四乙酰核糖(50g，0.157mol)，100mL二氯甲烷，搅拌溶解，再加入烟酸乙酯(35.5g，0.235mol)，搅拌均匀；室温下，滴加用50mL二氯甲烷稀释的三氟甲磺酸三甲基硅酯(TMsOTf52.2g，0.235mol)，滴加过程放热，控制温度在20℃以下，约0.5小时内加完，滴加完毕，接着搅拌反应1小时以完成反应(TLC监控四乙酰核糖消失)。反应完成，反应液冷却至-5℃以下，滴加25mL乙醇，加完搅拌15min以破坏TMSOTf淬灭反应，从而终止反应。将反应体系室温减压浓缩干，无需后处理直接用于下一步。
b、氨解脱乙酰基(制备烟酰胺核糖盐酸盐)：
在-5℃，向步骤a制得的含有烟酸乙酯三乙酰核苷体系加入4mol/L氨乙酸乙酯溶液300ml，在-5～0℃搅拌反应20小时以完成反应(TLC监控至原料和中间体1消失)。反应完成，低温减压浓缩除去溶剂；再加入含氯化氢的二氯甲烷溶液，体系变粘稠，析出固体，搅拌30min，过滤，固体再用250ml二氯甲烷室温打浆2h，过滤干燥，得到32.2g产品(收率70.6％，纯度98.8％)。
c、磷酸化(即制备β-烟酰胺单核苷酸)：
称取步骤b所得β-烟酰胺核糖盐酸盐(14.6g，0.05mol)，加至250mL三口瓶，再加入磷酸三乙酯45ml，冷却至-5℃以下，滴加三氯氧磷(12.2g，0.80mol)，滴加过程放热，控制温度在5℃以下，约30分钟加完。接着在-5～-2℃搅拌反应过夜(20小时，HPLC监控)。反应完，往体系中加碳酸钾，条件pH值>5.0；搅拌，并且过滤，滤液加入50ml水，使用乙酸乙酯萃取分液除杂，将水相再放置-5～0℃，搅拌析出无机盐，过滤，液体用离子交换树脂进行纯化，得到β-烟酰胺单核苷酸14.1g(收率4.4.0％，纯度99.2％)。
实施例3
本实施例公开了一种制备β-烟酸胺单核苷酸的方法，包括以下步骤：
a、缩合(即制备烟酸乙酯三乙酰核苷)：
500ml三口瓶中加入四乙酰核糖(50g，0.157mol)，100mL二氯甲烷，搅拌溶解，再加入烟酸乙酯(47.4g，0.314mol)，搅拌均匀；室温下，滴加用50mL二氯甲烷稀释的三甲基氯硅烷(TMsCl 33.9g，0.314mol)，滴加过程放热，控制温度在20℃以下，约0.5小时内加完，滴加完毕，接着搅拌反应1小时以完成反应(TLC监控四乙酰核糖消失)。反应完成，反应液冷却至-5℃以下，滴加30mL乙醇，加完搅拌15min以破坏TMSOTf淬灭反应，从而终止反应。将反应体系室温减压浓缩干，无需后处理直接用于下一步。
b、氨解脱乙酰基(制备烟酰胺核糖盐酸盐)：
在-5℃，向步骤a制得的含有烟酸乙酯三乙酰核苷体系加入7mol/L氨乙酸乙酯溶液250ml，在-5～0℃搅拌反应20小时以完成反应(TLC监控至原料和中间体1消失)。反应完成，低温减压浓缩除去溶剂；再加入含氯化氢的甲基叔丁醚溶液，体系变粘稠，析出固体，搅拌30min，过滤，固体再用300ml乙酸乙酯与正己烷(比例为1:3)室温打浆2h，过滤干燥，得到36.5g产品(收率80.0％，纯度98.3％)。
c、磷酸化(即制备β-烟酰胺单核苷酸)：
称取步骤b所得β-烟酰胺核糖盐酸盐(14.6g，0.05mol)，加至250mL三口瓶，再加入磷酸三甲酯50ml，冷却至-5℃以下，滴加三氯氧磷(18.4g，0.12mol)，滴加过程放热，控制温度在0℃以下，约30分钟加完。接着在-5～-2℃搅拌反应过夜(20小时，HPLC监控)。反应完，往体系中加碳酸钾，条件pH值>7.0；搅拌，并且过滤，滤液加入50ml水，使用乙酸乙酯萃取分液除杂，将水相再放置-5～0℃，搅拌析出无机盐，过滤，液体用离子交换树脂进行纯化，得到β-烟酰胺单核苷酸15.3g(收率91.6％，纯度98.3％)。
实施例4
本实施例公开了一种制备β-烟酸胺单核苷酸的方法，包括以下步骤：
a、缩合(即制备烟酸乙酯三乙酰核苷)：
500ml三口瓶中加入四乙酰核糖(50g，0.157mol)，100mL1,2-二氯乙烷，搅拌溶解，再加入烟酸乙酯(24.9g，0.165mol)，搅拌均匀；室温下，滴加用50mL二氯甲烷稀释的三氟甲磺酸三甲基硅酯(TMsOTf 36.6g，0.165mol)，滴加过程放热，控制温度在20℃以下，约0.5小时内加完，滴加完毕，接着搅拌反应1小时以完成反应(TLC监控四乙酰核糖消失)。反应完成，反应液冷却至-5℃以下，滴加15mL乙醇，加完搅拌15min以破坏TMSOTf淬灭反应，从而终止反应。将反应体系室温减压浓缩干，无需后处理直接用于下一步。
b、氨解脱乙酰基(制备烟酰胺核糖盐酸盐)：
在-5℃，向步骤a制得的含有烟酸乙酯三乙酰核苷体系加入5mol/L氨乙酸乙酯溶液300ml，在-5～0℃搅拌反应20小时以完成反应(TLC监控至原料和中间体1消失)。反应完成，低温减压浓缩除去溶剂；再加入含氯化氢的甲基叔丁醚溶液，体系变粘稠，析出固体，搅拌30min，过滤，固体再用300ml乙酸乙酯与正庚烷(比例为1:3)室温打浆2h，过滤干燥，得到34.5g产品(收率75.6％，纯度98.6％)。
c、磷酸化(即制备β-烟酰胺单核苷酸)：
称取步骤b所得β-烟酰胺核糖盐酸盐(14.6g，0.05mol)，加至250mL三口瓶，再加入磷酸三甲酯50ml，冷却至-5℃以下，滴加三氯氧磷(15.3g，0.10mol)，滴加过程放热，控制温度在5℃以下，约30分钟加完。接着在5-7℃搅拌反应过夜(20小时，HPLC监控)。反应完，往体系中加碳酸钠，条件pH值>5.0；搅拌，并且过滤，滤液加入50ml水，使用甲叔醚萃取分液除杂，将水相再放置-5～0℃，搅拌析出无机盐，过滤，液体用离子交换树脂进行纯化，得到β-烟酰胺单核苷酸13.65g(收率81.7％，纯度99.0％)。
实施例5
本实施例公开了一种制备β-烟酸胺单核苷酸的方法，包括以下步骤：
a、缩合(即制备烟酸乙酯三乙酰核苷)：
500ml三口瓶中加入四乙酰核糖(50g，0.157mol)，100mL乙腈，搅拌溶解，再加入烟酸乙酯(28.5g，0.188mol)，搅拌均匀；室温下，滴加用20mL乙腈稀释的三氟甲磺酸三甲基硅酯(TMsOTf 41.8g，0.188mol)，滴加过程放热，控制温度在20℃以下，约0.5小时内加完，滴加完毕，升温至50℃搅拌反应0.5小时以完成反应(TLC监控四乙酰核糖消失)。反应完成，反应液冷却至-5℃以下，滴加10mL乙醇，加完搅拌15min以破坏TMSOTf淬灭反应，从而终止反应。将反应体系室温减压浓缩干，无需后处理直接用于下一步。
b、氨解脱乙酰基(制备烟酰胺核糖盐酸盐)：
在-5℃，向步骤a制得的含有烟酸乙酯三乙酰核苷体系加入5mol/L氨乙醇溶液200ml，在-5～0℃搅拌反应20小时以完成反应(TLC监控至原料和中间体1消失)。反应完成，低温减压浓缩除去溶剂；再加入含氯化氢的乙酸乙酯溶液，体系变粘稠，析出固体，搅拌30min，过滤，固体再用二氯甲烷室温打浆2h，过滤干燥，得到37.2g产品(收率81.5％，纯度97.4％)。
c、磷酸化(即制备β-烟酰胺单核苷酸)：
称取步骤b所得β-烟酰胺核糖盐酸盐(14.6g，0.05mol)，加至250mL三口瓶，再加入磷酸三甲酯，冷却至-5℃以下，滴加三氯氧磷(23.0g，0.15mol)，滴加过程放热，控制温度在5℃以下，约30分钟加完。接着在-10～-5℃搅拌反应过夜(20小时，HPLC监控)。反应完，往体系中加碳酸钾，条件pH值>5.0；搅拌，并且过滤，滤液加入50ml水，使用乙酸乙酯萃取分液除杂，将水相再放置-5～0℃，搅拌析出无机盐，过滤，液体用离子交换树脂进行纯化，得到β-烟酰胺单核苷酸14.7g(收率88.0％，纯度99.0％)。
实施例6
本实施例公开了一种制备β-烟酸胺单核苷酸的方法，包括以下步骤：
a、缩合(即制备烟酸乙酯三乙酰核苷)：
500ml三口瓶中加入四乙酰核糖(50g，0.157mol)，100mL二氯甲烷，搅拌溶解，再加入烟酸乙酯(28.5g，0.188mol)，搅拌均匀；室温下，滴加用50mL二氯甲烷稀释的三氟甲磺酸三甲基硅酯(TMsOTf 41.8g，0.188mol)，滴加过程放热，控制温度在20℃以下，约0.5小时内加完，滴加完毕，接着搅拌反应1小时以完成反应(TLC监控四乙酰核糖消失)。反应完成，反应液冷却至-5℃以下，滴加15mL乙醇，加完搅拌15min以破坏TMSOTf淬灭反应，从而终止反应。将反应体系室温减压浓缩干，无需后处理直接用于下一步。
b、氨解脱乙酰基(制备烟酰胺核糖盐酸盐)：
在-5℃，向步骤a制得的含有烟酸乙酯三乙酰核苷体系加入3mol/L氨甲醇溶液200ml，在-5～0℃搅拌反应30小时以完成反应(TLC监控至原料和中间体1消失)。反应完成，低温减压浓缩除去溶剂；再加入含氯化氢的二氯甲烷溶液，体系变粘稠，析出固体，搅拌30min，过滤，固体再用200ml二氯甲烷与正己烷(比例为1:1)室温打浆2h，过滤干燥，得到38.4g产品(收率84.2％，纯度96.9％)。
c、磷酸化(即制备β-烟酰胺单核苷酸)：
称取步骤b所得β-烟酰胺核糖盐酸盐(14.6g，0.05mol)，加至250mL三口瓶，再加入磷酸三乙酯，冷却至-5℃以下，滴加三氯氧磷(11.4g，0.075mol)，滴加过程放热，控制温度在5℃以下，约30分钟加完。接着在-10～-5℃搅拌反应过夜(20小时，HPLC监控)。反应完，往体系中加碳酸氢钠，条件pH值>5.0；搅拌，并且过滤，滤液加入50ml水，使用甲叔醚萃取分液除杂，将水相再放置-5～0℃，搅拌析出无机盐，过滤，液体用离子交换树脂进行纯化，得到β-烟酰胺单核苷酸13.6g(收率81.4％，纯度98.7％)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种制备β-烟酸胺单核苷酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、缩合反应：将烟酸乙酯、四乙酰核糖和催化剂在第一溶剂中进行缩合反应得到含有烟酸乙酯三乙酰核苷的溶液；
S2、氨解反应：将含有烟酸乙酯三乙酰核苷的溶液经氨气溶液进行氨解反应，得到烟酰胺核苷盐酸盐；
S3、磷酸化反应：将烟酰胺核苷盐酸盐与三氯氧磷在第二溶剂中进行反应，得到β-烟酸胺单核苷酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述S1至少满足以下任意一项：
(1)所述催化剂为三氟甲磺酸三甲基硅脂或三甲基氯硅烷中的一种；
(2)所述烟酸乙酯、四乙酰核糖与催化剂的摩尔比为(1﹕1﹕1)～(1﹕2﹕2)；
(3)所述第一溶剂为二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、氯仿或乙腈中的任意一种；
(4)所述缩合反应的温度为0～50℃；
(5)所述缩合反应的时间为0.5～2h。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述S2至少满足以下任意一项：
(1)所述氨气溶液与含有烟酸乙酯三乙酰核苷溶液的重量比为(1：3)～(1﹕10)；
(2)所述氨解反应的反应温度为-20～5℃；
(3)所述氨解反应的反应时间为1.0～36h。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述S2包括：
S21：含有烟酸乙酯三乙酰核苷的溶液经氨气溶液进行氨解反应；
S22：将氨解反应得到的溶液减压浓缩后加入含氯化氢的溶液，搅拌析出粘稠固体；
S23：过滤后，往粘稠固体中再加入析晶溶剂，在-5～5℃的条件下搅拌，析出固体即得到烟酰胺核苷盐酸盐。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述含氯化氢的溶液中至少包括乙酸乙酯、二氯甲烷和甲基叔丁基醚中的一种或任意组合。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述S3至少满足以下任意一项：
(1)所述烟酰胺核苷盐酸盐与三氯氧磷摩尔比为(1﹕1)～(1﹕5)；
(2)所述第二溶剂为极性非质子溶剂；
(3)所述第二溶剂与烟酰胺核苷盐酸盐的质量比为(1：3)～(1﹕10)；
(4)反应温度为-20～5℃。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述S3包括：
S31：将烟酰胺核苷盐酸盐与三氯氧磷在第二溶剂中进行反应；
S32：调节pH值至pH值>5；
S33：使用有机溶剂萃取除去杂质，得到水相，将水相放置于-5～0℃，析出粗品；
S34：将粗品进行纯化处理得到β-烟酸胺单核苷酸。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在：所述有机溶剂为非极性溶剂，所述非极性溶剂包括乙酸乙酯、二氯甲烷、甲基异丁酮、甲基叔丁基醚、正己烷和正庚烷中的一种或者任意组合。
9.根据权利要求1-8任意一项所述的方法制备得到的β-烟酸胺单核苷酸。
10.根据权利要求1-8任一项所述的方法或权利要求9所述的β-烟酸胺单核苷酸在医药领域中的应用。
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