CN112851720A - 一种利用超滤和纳滤的技术制备高纯度nmn的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用超滤和纳滤的技术制备高纯度NMN的方法，该方法通过选用合适的超滤膜和纳滤膜能成功实现酶催化NMN和化学合成NMN的有效分离，高产率获得高纯度的NMN产品。对于酶催化制备的NMN，先过滤回收固定化酶催化剂。然后用超滤膜除去体系中的大分子化合物如ATP，ADP。用纳滤膜除去小分子的化合物如烟酰胺，核糖等；最后，经浓缩析晶制得高纯NMN。对于化学合成方法制备的NMN，反应淬灭中和后先用纳滤膜除去反应中的盐和烟酰胺，核糖，溶剂残留。然后用超滤膜除去大分子杂质，如双磷酸化杂质，三磷酸化杂质。最后经纳滤浓缩后析晶制得高纯度NMN。

Description

一种利用超滤和纳滤的技术制备高纯度NMN的方法
技术领域
本发明涉及合成工程剂领域，具体为一种利用超滤和纳滤的技术制备高纯度NMN的方法。
背景技术
烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide mononucleotide，简称NMN)是一种人体内重要的物质，同时在一些水果和蔬菜中也有发现。NMN有2种不规则存在形式，α和β；β异构体是NMN的活性形式，分子量为334.221g/mol。因烟酰胺属于维生素B3，因此NMN属于维生素B族衍生物范畴，其广泛参与人体多项生化反应，与免疫、代谢息息相关。在人体中NMN是NAD+最直接的前体，其功能是通过NAD+体现。NAD+又叫辅酶Ⅰ，全称烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，存在于每一个细胞中，参与了上千项反应。在多种细胞代谢反应中，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）分子都扮演着重要角色，是细胞保持活力的重要支撑。近年来随着关于NMN的各种功效研究的不断深入，市场对于NMN的追捧也是与日俱增。这同时也对高纯度NMN的制备提出了更加迫切的需求。
目前，β-烟酰胺单核苷酸的合成方法主要包括两种途径，即酶催化合成和有机化学合成。 酶催化合成β-烟酰胺单核苷酸时，以烟酰胺、三磷酸腺苷和D-核糖作为底物，在核糖激酶 (RK)和烟酰胺核糖磷酸转移酶(NAMPT)作为催化剂的作用下催化制备β-烟酰胺单核苷酸。这种方法所用的酶的价格较高，而且来源有限，因此采用该方法制备β-烟酰胺单核苷酸时，产能较低，生产成本较高。化学合成一般用β-烟酰胺核苷和磷酸化试剂反应生成NMN，再经树脂柱洗脱得到β-烟酰胺单核苷酸水溶液产品。但是由于NMN在碱性水溶液中稳定性较差，所以产品收率较低，纯度也不高。基于NMN的反应液体系中含有化合物杂质的分子量，电性差别比较大的特点，本发明采用了选择合适的纳滤和超滤体系，能对酶催化和化学合成的NMN反应液以实现精准的提纯分离。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供一种利用超滤和纳滤的技术制备高纯度NMN的方法，以解决上述背景技术提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种利用超滤和纳滤的技术制备高纯度NMN的方法，具体步骤如下：
S1：先对酶法和合成法的反应液做一定的预处理；
S11:对于酶法的反应液需先通过过滤方法除去固定化酶催化剂；
S12:对于合成法反应液需要先加水淬灭反应体系，并用有机溶剂萃取除去反应溶剂磷酸三乙酯，加入合适的碱液调节pH值至4左右；
S2：采用适合孔径的超滤和纳滤膜对反应体系中的杂质进行精确分离。
作为本发明的一种优选技术方案，所述S2中所使用的纳滤膜的规格为200-800道尔顿，所使用的超滤膜为1000-5000道尔顿。
作为本发明的一种优选技术方案，所述S1中酶的反应液，需先用超滤膜除去三磷酸腺苷和二磷酸腺苷，再用纳滤膜除去各种盐和核糖，烟酰胺；合成法反应液，需要先用纳滤膜除去反应液中残留的溶剂和中和所产生的盐如氯化钠，磷酸二氢钠，以及烟酰胺，核糖和原料烟酰胺核苷。
作为本发明的一种优选技术方案，所述S2中对于进行超滤或者纳滤的样品水溶液固含量控制在5-10%。
作为本发明的一种优选技术方案，所述S2中对于超滤膜所使用增压泵的压力不能超过0.8MPa。
作为本发明的一种优选技术方案，所述S2中对于纳滤膜所以使用增压泵的压力不能超过2.5Mpa。
作为本发明的一种优选技术方案，所述S2中对于超滤膜样品浓缩后的固含量超过20%后，需要加入适量的水稀释至5-10%，才能重新开始超滤；
作为本发明的一种优选技术方案，所述所述S2中对于纳滤膜，样品固含量超过30%后需要稀释至5-10%后再重新进行纳滤；对于所述超滤和纳滤的温度控制在15-20℃为宜。
本发明的有益效果是：该方法用结合超滤和纳滤的方法来提纯分离NMN反应液，替代现在普遍使用的树脂柱洗脱的方法，提高分离效率，避免使用了酸洗碱洗步骤，降低了大量的盐分的产生，减少工厂含盐废水处理难度。本发明所用的纳滤机组和纳滤膜、超滤膜技术已经相当成熟，价廉易得，而且能反复使用，适用于工业化生产。
附图说明
图1是本发明实施例1的具体操作流程；
图2是本发明实施例2的具体操作流程。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易被本领域人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
请参阅图1-2，本发明提供一种技术方案：一种利用超滤和纳滤的技术制备高纯度NMN的方法，具体步骤如下：
S1：先对酶法和合成法的反应液做一定的预处理；
S11:对于酶法的反应液需先通过过滤方法除去固定化酶催化剂；
S12:对于合成法反应液需要先加水淬灭反应体系，并用有机溶剂萃取除去反应溶剂磷酸三乙酯，加入合适的碱液调节pH值至4左右；
S2：采用适合孔径的超滤和纳滤膜对反应体系中的杂质进行精确分离。
所述S2中所使用的纳滤膜的规格为200-800道尔顿，所使用的超滤膜为1000-5000道尔顿。所述S1中酶的反应液，需先用超滤膜除去三磷酸腺苷和二磷酸腺苷，再用纳滤膜除去各种盐和核糖，烟酰胺；合成法反应液，需要先用纳滤膜除去反应液中残留的溶剂和中和所产生的盐如氯化钠，磷酸二氢钠，以及烟酰胺，核糖和原料烟酰胺核苷。所述S2中对于进行超滤或者纳滤的样品水溶液固含量控制在5-10%。所述S2中对于超滤膜所使用增压泵的压力不能超过0.8MPa。所述S2中对于纳滤膜所以使用增压泵的压力不能超过2.5Mpa。所述S2中对于超滤膜样品浓缩后的固含量超过20%后，需要加入适量的水稀释至5-10%，才能重新开始超滤；所述所述S2中对于纳滤膜，样品固含量超过30%后需要稀释至5-10%后再重新进行纳滤；对于所述超滤和纳滤的温度控制在15-20℃为宜。
在进行超滤或者纳滤之前要先对反应液进行必要的预处理。
举例说，酶催化的反应液，先通过离心过滤回收固定酶催化剂，用酸调节pH值至4左右。而化学合成的反应液需要先淬灭反应液，用二氯甲烷萃取反应溶剂磷酸三乙酯，用碱调节反应液的pH值至4左右。
反应体系中残留的原料，试剂，盐分和杂质需要根据实际需要选用合适的纳滤膜和超滤膜来进行分离提纯。
实施例1：
对于酶催化的反应体系，经过滤和pH调节后的反应液，其固含量在6%，pH值为4.2，HPLC含量标定为3.8%。首先，取20升已做过预处理的反应液，加入超滤机中，超滤膜的型号是苏伊士(Suez) GH1812C50膜，截留分子量为2500道尔顿。控制增压泵压力为0.8MPa，冷水机制冷温度18℃。当浓缩液的固含量大于20%时，补水至固含量降低到5%左右继续浓缩除杂，这个过程前后重复3次，最后母液固含量降低为1%，经检测母液中主要含有原料三磷酸腺苷（ATP）和二磷酸腺苷（ADP）总体积降低为500mL。收集，前期过滤的滤液并合并后待用。将超滤机组用纯水反复冲洗多次后，换上超滤膜具体型号苏伊士(Suez) GE1812F50膜，截留分子量为1000道尔顿。将前面收集的超滤液加入后，控制增压泵压力为0.8MPa，冷水机制冷控制温度18℃。开启超滤机组，当浓缩液固含量大于20后，加入纯水稀释至5%的固含量，如此重复四次后，反应液中的烟酰胺，核糖，各种盐分的含量降低至1%以下。最后，收集母液经纳滤苏伊士(Suez) DK1812C50膜浓缩后至固含量25%后，加乙醇析晶，冷冻干燥后得产品598g，回收率为78.6%。产品纯度99.89%。具体操作流程见附图1。
实施例2：
对化学合成的反应体系，反应液经加水淬灭，二氯甲烷萃取，氢氧化钠调碱后，其固含量在16%左右。HPLC标定的NMN的含量为3.2%, 取20L反应液，加入到含苏伊士(Suez)UE1812的纳滤膜中，截留分子量为800道尔顿。当浓缩液固含量大于20后，加入纯水稀释至5%的固含量，如此重复四次后，反应液中的烟酰胺，烟酰胺核糖，氯化钠和磷酸二氢钾的含量降低至1%以下。浓缩液稀释至5%的固含量后，加入到加入超滤机中，超滤膜的型号是苏伊士(Suez) GH1812C50膜，截留分子量为2500道尔顿。控制增压泵压力为0.8MPa，冷水机制冷温度18℃。当浓缩液的固含量大于20%时，补水至固含量降低到5%左右继续浓缩除杂，这个过程前后重复3次，最后母液固含量降低为1%，总体积为430mL后。母液中残留的主要是2’,5’或者3’,5’-二磷酸杂质。收集流出液，经纳滤苏伊士(Suez) DK1812C50膜浓缩后至固含量25%后，加乙醇析晶，冷冻干燥后得产品522g，回收率为81.5%。产品纯度99.84%。具体操作流程见附图2。
该方法用结合超滤和纳滤的方法来提纯分离NMN反应液，替代现在普遍使用的树脂柱洗脱的方法，提高分离效率，避免使用了酸洗碱洗步骤，降低了大量的盐分的产生，减少工厂含盐废水处理难度。本发明所用的纳滤机组和纳滤膜、超滤膜技术已经相当成熟，价廉易得，而且能反复使用，适用于工业化生产。
上实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种利用超滤和纳滤的技术制备高纯度NMN的方法，其特征在于：具体步骤如下：
S1：先对酶法和合成法的反应液做一定的预处理；
S11:对于酶法的反应液需先通过过滤方法除去固定化酶催化剂；
S12:对于合成法反应液需要先加水淬灭反应体系，并用有机溶剂萃取除去反应溶剂磷酸三乙酯，加入合适的碱液调节pH值至4左右；
S2：采用适合孔径的超滤和纳滤膜对反应体系中的杂质进行精确分离。
2.根据权利要求1所述的一种利用超滤和纳滤的技术制备高纯度NMN的方法，其特征在于：所述S2中所使用的纳滤膜的规格为200-800道尔顿，所使用的超滤膜为1000-5000道尔顿。
3.根据权利要求1所述的一种利用超滤和纳滤的技术制备高纯度NMN的方法，其特征在于：所述S1中酶的反应液，需先用超滤膜除去三磷酸腺苷和二磷酸腺苷，再用纳滤膜除去各种盐和核糖，烟酰胺；合成法反应液，需要先用纳滤膜除去反应液中残留的溶剂和中和所产生的盐如氯化钠，磷酸二氢钠，以及烟酰胺，核糖和原料烟酰胺核苷。
4.根据权利要求1所述的一种利用超滤和纳滤的技术制备高纯度NMN的方法，其特征在于：所述S2中对于进行超滤或者纳滤的样品水溶液固含量控制在5-10%。
5.根据权利要求1所述的一种利用超滤和纳滤的技术制备高纯度NMN的方法，其特征在于：所述S2中对于超滤膜所使用增压泵的压力不能超过0.8MPa。
6.根据权利要求1所述的一种利用超滤和纳滤的技术制备高纯度NMN的方法，其特征在于：所述S2中对于纳滤膜所以使用增压泵的压力不能超过2.5Mpa。
7.根据权利要求1所述的一种利用超滤和纳滤的技术制备高纯度NMN的方法，其特征在于：所述S2中对于超滤膜样品浓缩后的固含量超过20%后，需要加入适量的水稀释至5-10%，才能重新开始超滤。
8.根据权利要求1所述的一种利用超滤和纳滤的技术制备高纯度NMN的方法，其特征在于：所述所述S2中对于纳滤膜，样品固含量超过30%后需要稀释至5-10%后再重新进行纳滤；对于所述超滤和纳滤的温度控制在15-20℃为宜。
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