CN117964672A - 一种β-烟酰胺单核苷酸的大孔吸附树脂分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种β‑烟酰胺单核苷酸的分离纯化方法，其特征在于：步骤一：将含有β‑烟酰胺单核苷酸的酶催化反应液的pH值调节至3.5‑4.8，得到待纯化液；步骤二：将待纯化液流经装有大孔吸附树脂的分离柱，用纯水洗脱盐和杂质，再用醇溶液洗脱产品，收集洗脱液；步骤三：纯化洗脱液，得到纯化后的β‑烟酰胺单核苷酸成品。
Description
技术领域
本发明属于生物产品分离提纯领域，具体涉及一种β-烟酰胺单核苷酸的分离纯化方法。
背景技术
β-烟酰胺单核苷酸(NMN)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的前体，近年来的研究表明，通过调节生物体内的NMN水平，能有效防治衰老引起的各种疾病，对治疗帕金森等老年病，调节胰岛素分泌，防治糖尿病和肥胖等代谢性疾病具有较好的修复和医疗保健效果。
目前NMN的大规模生产主要是通过酶促反应实现的，相比化学合成法，酶催化法更为高效，绿色，环保，但酶催化反应液中的杂质往往比较复杂，含有大量的盐及二价金属离子，还包含一些副反应产物、酶催化蛋白、糖类、多磷离子等杂质。而市场对NMN的纯度需求较高，目前阶段NMN主要分离纯化方法为离子交换法、反向层析法等。
专利CN111424064A公开了一种基于酶法的反向层析法制备高纯度NMN的方法，反应液经反向液相色谱梯度洗脱分离，再经纳滤浓缩，结晶，得到高纯度的NMN产品。但反向层析填料昂贵，成本较高。
专利CN108026132A公开了一种基于生物催化法的离子交换法纯化NMN的方法，该方法将生物催化法制备的粗品反应液经阴离子树脂处理，纳滤浓缩后，再经螯合树脂处理，纳滤浓缩后冻干得到NMN纯品。但离子树脂对反应液中的杂质去除效果有限，体系中的大量的盐导致上样量小，纯化效率低，再生用水量大，三废增加。
酶反应过程中产生部分副反应，其中NMN分解产生的烟酸单核苷酸与产品性质相似，并且在用离子交换树脂吸附洗脱解离产品的过程还会导致NMN进一步分解，烟酸单核苷酸杂质增大，通过结晶难以去除，影响最终产品的质量。
因此，需要开发一种新的分离纯化方法，有效分离酶法制备的NMN中的杂质。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种用大孔吸附树脂分离提纯β-烟酰胺单核苷酸的方法，解决酶反应体系含盐量高，杂质复杂，去除困难，纯化效率低的问题。
酶反应制备的NMN粗品溶液中成分复杂，体系含盐量高，有大量磷酸盐和多磷离子，还有部分副反应产物，如烟酸单核苷酸，烟酰胺核糖(NR)，5-磷酸核糖，烟酸等，以及未反应完全的原料烟酰胺和核糖等。其中烟酸单核苷酸与产品结构相近，很难通过离子交换树脂等常规方法彻底去除。通过对NMN的性质研究发现，NMN是一个两性分子，在等电点时为内盐形态，在高于等电点和低于等电点时呈阴离子和阳离子形态，本发明利用该特性，在烟酰胺单核苷酸的等电点3.7附近选择合适的pH，使NMN呈内盐形态，吸附到大孔吸附树脂上，而烟酸单核苷酸在这个pH下为阴离子形态，不被树脂吸附。通过简单水洗即可将体系内的磷酸盐，多磷离子，以及烟酸单核苷酸，烟酰胺核糖等杂质彻底去除，再解吸附即得到高纯度的NMN产品。
基于此，本发明提供的一种β-烟酰胺单核苷酸的分离纯化方法，其特征在于：步骤一：将含有β-烟酰胺单核苷酸的酶催化反应液的pH值调节至3.5-4.8，得到待纯化液；
步骤二：将待纯化液流经装有大孔吸附树脂的分离柱，用纯水洗脱盐和杂质，再用醇溶液洗脱产品，收集洗脱液；
步骤三：纯化洗脱液，得到纯化后的β-烟酰胺单核苷酸成品。
在一个实施方案中，步骤一中所述含有β-烟酰胺单核苷酸的酶催化反应液为：以D-核糖、烟酰胺、腺嘌呤核苷三磷酸ATP、多聚磷酸盐为原料，在磷酸核糖焦磷酸合成酶、核糖激酶以及烟酰胺磷酸核糖转移酶的共同催化作用下合成β-烟酰胺单核苷酸得到的反应液。
在一个实施方案中，步骤一为：向含有β-烟酰胺单核苷酸的酶催化反应液中加入吸附剂搅拌后过滤，再将所得过滤清液的pH值调节至3.5-4.8，得到待纯化液，或者为：将含有β-烟酰胺单核苷酸的酶催化反应液的pH值调节至3.5-4.8，向反应液中加入吸附剂搅拌后过滤，所得过滤清液为待纯化液；
在一个实施方案中，步骤一为：将含有β-烟酰胺单核苷酸的酶催化反应液的pH值调节至2.5-3.0，加入吸附剂搅拌后过滤，再将所得过滤清液的pH值调节至3.5-4.8，得到待纯化液；
将反应液的pH值先调至2.5至3.0，可以在酸性条件下使蛋白变性析出，提高除杂效果。
在一个实施方案中，步骤一中使用盐酸和/或NaOH调节pH值。
在一个实施方案中，步骤一所述吸附剂选自活性炭。
在一个实施方案中，步骤二中所用的纯水为2-4倍柱体积；
在一个实施方案中，步骤二中使用乙醇溶液洗脱产品；
在一个实施方案中，步骤二中使用30-70％的乙醇溶液洗脱产品；
在一个实施方案中，步骤三中，纯化洗脱液步骤包括纳滤、结晶。
在一个实施方案中，步骤三中，结晶溶剂为乙醇。
与现有技术相比，本发明提供的一种酶催化合成的β-烟酰胺单核苷酸的纯化工艺，通过调节溶液的pH，使产品和杂质的电离状态不同，经大孔吸附树脂吸附产品，用水洗脱不被树脂吸附的杂质和无机盐，再用乙醇溶液洗脱产品，以很高收率得到纯化的NMN溶液。吸附和洗脱条件温和，避免了离子交换树脂洗脱时的强酸造成产品分解的风险，保证产品的提纯效果，步骤简单，杂质去除效果好，烟酸单核苷酸杂质可控制在0.1％以下。本发明制得的β-烟酰胺单核苷酸的纯度≥99.8％，收率超过80％。
附图说明
图1：本发明β-烟酰胺单核苷酸粗品反应液的液相图谱；
图2：本发明实施例3的β-烟酰胺单核苷酸纯品的液相图谱。
具体实施方式
本发明可通过以下具体实施方案来实现，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1：
酶反应制备β-烟酰胺单核苷酸
在30L反应瓶中依次加入100g D-核糖，97.4g烟酰胺，3.66g ATP，447.55g六偏磷酸钠，203g MgCl2·6H2O，加5L 0.1M pH9.0 TrisHCl缓冲液，搅拌溶解，再加1％核糖激酶、1％焦磷酸水解酶、3％磷酸核糖焦磷酸合成酶、1％腺苷酸激酶、1％多聚磷酸激酶、5％烟酰胺磷酸核糖转移酶，最后用纯水定容至10L，35℃搅拌反应过夜，用NaOH控制pH在8-8.5，最终摩尔收率为92％。HPLC谱图如图1所示。
实施例2：
大孔吸附树脂分离纯化β-烟酰胺单核苷酸
酶催化反应生成β-烟酰胺单核苷酸的粗品溶液5L，浓度20.5g/L，烟酸单核苷酸0.269％。将反应液用盐酸调节pH至2.5，加入活性炭吸附，过滤。滤液用氢氧化钠调节pH至3.5，上样至大孔吸附树脂柱，检测流出液产品浓度。上样结束后，用3BV纯水淋洗树脂柱，监控流出液电导率。用30％乙醇溶液洗脱，收集产品洗脱液，检测流出液产品浓度，待浓度下降至1g/L以下时停止收集。洗脱液纳滤浓缩至150g/L，加入1.5L乙醇，有大量固体析出，过滤，30℃真空干燥，得到90.4g白色固体，收率88.2％，纯度99.85％，烟酸单核苷酸0.055％。
实施例3：
大孔吸附树脂分离纯化β-烟酰胺单核苷酸
β-烟酰胺单核苷酸的粗品溶液5L，浓度20.5g/L，烟酸单核苷酸0.269％。将反应液用盐酸调节pH至3.0，加入活性炭吸附，过滤。滤液用氢氧化钠调节pH至4.3，上样至大孔吸附树脂柱，检测流出液产品浓度。上样结束后，用2.5BV纯水淋洗树脂柱，监控流出液电导率。用50％乙醇溶液洗脱，收集产品洗脱液，检测流出液产品浓度，待浓度下降至1g/L以下时停止收集。洗脱液纳滤浓缩至150g/L，加入2L乙醇，有大量固体析出，过滤，30℃真空干燥，得到88.5g白色固体，收率86.3％，纯度99.93％，烟酸单核苷酸0.025％。
实施例4：
大孔吸附树脂分离纯化β-烟酰胺单核苷酸
β-烟酰胺单核苷酸的粗品溶液5L，浓度20.5g/L，烟酸单核苷酸0.269％。将反应液用盐酸调节pH至3.0，加入活性炭吸附，过滤。滤液用氢氧化钠调节pH至4.8，上样至大孔吸附树脂柱，检测流出液产品浓度。上样结束后，用2BV纯水淋洗树脂柱，监控流出液电导率。用70％乙醇溶液洗脱，收集产品洗脱液，检测流出液产品浓度，待浓度下降至1g/L以下时停止收集。洗脱液纳滤浓缩至150g/L，加入1.6L乙醇，有大量固体析出，过滤，30℃真空干燥，得到82.5g白色固体，收率80.5％，纯度99.97％，烟酸单核苷酸0.011％。
对比例1：
大孔吸附树脂分离纯化β-烟酰胺单核苷酸，降低上样pH
β-烟酰胺单核苷酸的粗品溶液5L，浓度20.5g/L，烟酸单核苷酸0.269％。将反应液用盐酸调节pH至2.5，加入活性炭吸附，过滤。滤液pH2.5，上样至大孔吸附树脂柱，检测流出液产品浓度。上样结束后，用2.0BV纯水淋洗树脂柱，监控流出液电导率。用50％乙醇溶液洗脱，收集产品洗脱液，检测流出液产品浓度，待浓度下降至1g/L以下时停止收集。洗脱液纳滤浓缩至150g/L，加入1.5L乙醇，有大量固体析出，过滤，30℃真空干燥，得到80.1g白色固体，收率78.1％，纯度99.05％，烟酸单核苷酸0.244％。
对比例2：
大孔吸附树脂分离纯化β-烟酰胺单核苷酸，升高上样pH
β-烟酰胺单核苷酸的粗品溶液5L，浓度20.5g/L，烟酸单核苷酸0.269％。将反应液用盐酸调节pH至2.5，加入活性炭吸附，过滤。滤液用氢氧化钠调节pH至5.5，上样至大孔吸附树脂柱，检测流出液产品浓度。上样结束后，用2.0BV纯水淋洗树脂柱，监控流出液电导率。用50％乙醇溶液洗脱，收集产品洗脱液，检测流出液产品浓度，待浓度下降至1g/L以下时停止收集。洗脱液纳滤浓缩至150g/L，加入1.5L乙醇，有大量固体析出，过滤，30℃真空干燥，得到50.32g白色固体，收率49.1％，纯度99.85％，烟酸单核苷酸0.007％。
对比例3：
离子交换树脂分离纯化β-烟酰胺单核苷酸
β-烟酰胺单核苷酸的粗品溶液5L，浓度20.5g/L，烟酸单核苷酸0.269％。将反应液用盐酸调节pH至2.5，加入活性炭吸附，过滤。滤液用氢氧化钠调节pH至3.0，上样至阳离子交换树脂柱，检测流出液产品浓度。上样结束后，用2.0BV纯水淋洗树脂柱，监控流出液电导率。用1％盐酸溶液洗脱，收集产品洗脱液，检测流出液产品浓度，待浓度下降至1g/L以下时停止收集。洗脱液纳滤浓缩至150g/L，加入0.3L乙醇，有大量固体析出，过滤，30℃真空干燥，得到21.37g白色固体，收率20.5％，纯度98.55％，烟酸单核苷酸0.951％。
分别对反应液粗品、实施例2-4和对比例1-3的产品的HPLC纯度和杂质进行分析，以及计算纯化收率。具体结果见表1。
表1
从上表数据结果可知，实施例粗品溶液在NMN等电点附近上样吸附，烟酸单核苷酸杂质去除效果较好，其他杂质也基本完全去除，NMN纯度可提高至99.9％以上，收率80.5-88.2％。本发明实施方案的pH值可以在等电点附近有一定的选择范围，因为NMN为两性分子，分子结构中的磷酸基团有一定的pH缓冲区间，pH值3.5-4.8仍在等电点的缓冲区间内。
对比例1粗品溶液在pH2.5下上样吸附，烟酸单核苷酸的羧基没有电离，也和产品一起吸附到树脂上，没有去除效果。但该pH下部分产品以阳离子状态存在，在上样过程中随盐和杂质一起被洗出，纯化收率偏低。对比例2的粗品溶液在pH5.5上样，烟酸单核苷酸完全电离，去除效果较好，但产品大部分以阴离子形式存在，在上样过程中随盐和杂质一起被洗出，纯化收率仅49.1％。对比例3使用阳离子交换树脂吸附纯化，用盐酸洗脱产品。由于体系中的含盐量太高，大大减小了NMN的吸附量，NMN在上样过程中大部分随盐一起被洗出。并且用盐酸洗脱时，NMN在酸性环境下分解成烟酸单核苷酸和烟酰胺，成品中的烟酸单核苷酸含量上升，产品纯度仅98.5％。由以上分析可知，本发明的技术方案能制备得到高纯度的β-烟酰胺单核苷酸产品，杂质去除效果好且收率高，纯化效率高。
上述实施方式仅为本发明最佳实施方式，对本发明的保护范围无限制作用。本专业领域的技术从业人员在本发明的基础上所作的一切非实质性的变更及调整，均属于本发明所主张的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种β-烟酰胺单核苷酸的分离纯化方法，其特征在于：
步骤一：将含有β-烟酰胺单核苷酸的酶催化反应液的pH值调节至3.5-4.8，得到待纯化液；
步骤二：将待纯化液流经装有大孔吸附树脂的分离柱，用纯水洗脱盐和杂质，再用醇溶液洗脱产品，收集洗脱液；
步骤三：纯化洗脱液，得到纯化后的β-烟酰胺单核苷酸成品。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一中所述含有β-烟酰胺单核苷酸的酶催化反应液为：以D-核糖、烟酰胺、腺嘌呤核苷三磷酸ATP、多聚磷酸盐为原料，在磷酸核糖焦磷酸合成酶、核糖激酶以及烟酰胺磷酸核糖转移酶的共同催化作用下合成β-烟酰胺单核苷酸得到的反应液。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一为：向含有β-烟酰胺单核苷酸的酶催化反应液中加入吸附剂搅拌后过滤，再将所得过滤清液的pH值调节至3.5-4.8，得到待纯化液，或者为：将含有β-烟酰胺单核苷酸的酶催化反应液的pH值调节至3.5-4.8，向反应液中加入吸附剂搅拌后过滤，所得过滤清液为待纯化液。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一为：将含有β-烟酰胺单核苷酸的酶催化反应液的pH值调节至2.5-3.0，加入吸附剂搅拌后过滤，再将所得过滤清液的pH值调节至3.5-4.8，得到待纯化液。
5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，步骤一中使用盐酸和/或NaOH调节pH值。
6.如权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，步骤一所述吸附剂选自活性炭。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤二中所用的纯水为2-4倍柱体积。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤二中使用乙醇溶液洗脱产品。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤三中，纯化洗脱液步骤包括纳滤、结晶。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤三中，结晶溶剂为乙醇。
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