WO2023027178A1 - シチジン－５'－ジリン酸化合物の製造方法 - Google Patents

シチジン－５'－ジリン酸化合物の製造方法 Download PDF

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WO2023027178A1
WO2023027178A1 PCT/JP2022/032235 JP2022032235W WO2023027178A1 WO 2023027178 A1 WO2023027178 A1 WO 2023027178A1 JP 2022032235 W JP2022032235 W JP 2022032235W WO 2023027178 A1 WO2023027178 A1 WO 2023027178A1
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diphosphate
compound
cdp
choline
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拓海 宮▲崎▼
一成 福本
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協和発酵バイオ株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a cytidine-5'-diphosphate compound.
  • cytidine-5'-diphosphate compounds such as cytidine-5'-diphosphate choline (hereinafter also abbreviated as CDP-choline) include chemical synthesis methods, fermentation methods using microorganisms, and enzymatic methods. It has been known. In any method, cytidine-5'-phosphate (hereinafter also abbreviated as 5'-CMP) or its highly reactive derivative undergoes a condensation reaction with phosphocholine, phosphoethanolamine, or the like. 5′-CMP produced as a by-product exists as an impurity in the system. Further, the cytidine-5'-diphosphate compound is hydrolyzed by heating to produce 5'-CMP as a by-product.
  • CDP-choline Industrial methods for producing cytidine-5'-diphosphate compounds such as cytidine-5'-diphosphate choline (hereinafter also abbreviated as CDP-choline) include chemical synthesis methods, fermentation methods
  • a common method for purifying a cytidine-5'-diphosphate compound from a solution containing the cytidine-5'-diphosphate compound includes, for example, column chromatography using an ion exchange resin.
  • Patent Documents 1 to 3 disclose a method of adsorbing crude CDP-choline on an anion exchange resin and then eluting it with extremely dilute formic acid or hydrochloric acid of about 0.005 to 0.10 mol/L. disclosed.
  • Patent Document 4 discloses a technique using an aqueous sodium chloride solution as an eluent.
  • Patent Document 5 discloses a method in which crude CDP-choline is passed through a weakly basic anion exchange resin to selectively adsorb and remove only 5′-CMP as an impurity. .
  • the cytidine-5'-diphosphate compound and contaminants, especially 5'-CMP are efficiently separated from the solution containing the crude cytidine-5'-diphosphate compound, and the concentration of cytidine is higher than before purification.
  • Obtaining a solution containing a -5'-diphosphate compound is an important issue in producing a highly pure cytidine-5'-diphosphate compound.
  • Cited Document 4 is not suitable as an industrial production method because it is difficult to finally remove the eluent mixed in the fraction containing the cytidine-5'-diphosphate compound.
  • Patent Document 5 it is necessary to wash the inside of the resin tower with water after passing the liquid to recover the cytidine-5′-diphosphate compound, and similarly to the methods described in Patent Documents 1 to 3, cytidine-5 Since the concentration of the '-diphosphoric acid compound is lower than that before passing through the column, the application as an industrial production method is limited to a passing liquid having a certain concentration or higher, and versatility is low.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing an acid compound.
  • the present inventors have found that the cytidine-5'-diphosphate compound can be efficiently purified and concentrated by elution using a specific organic acid solution.
  • the inventors have found that CMP can be efficiently separated and an eluate containing a cytidine-5′-diphosphate compound at a higher concentration than before purification can be obtained, thus completing the present invention.
  • the present invention is as follows. 1. A method for producing a cytidine-5'-diphosphate compound, comprising the following steps (1) and (2), wherein the cytidine-5'-diphosphate compound has a cationic substituent. A manufacturing method, which is an acid compound.
  • the concentration of the cytidine-5′-diphosphate compound contained in the eluate in the step (2) is equal to the cytidine-5′-diphosphate compound in the solution containing the cytidine-5′-diphosphate compound in the step (1).
  • 3. The production method according to 1 or 2 above, wherein in the step (2), the temperature at which the cytidine-5′-diphosphate compound is eluted from the basic ion exchange resin is 20° C. or higher. 4. 4.
  • the cytidine-5′-diphosphate compound having a cationic substituent is a compound in which a cationic substituent is bound to the ⁇ -phosphate group of cytidine-5′-diphosphate.
  • the manufacturing method described in . 8. The production method according to any one of 1 to 7 above, wherein the organic acid having 2 or more carbon atoms is a carboxylic acid having 2 or more carbon atoms.
  • the cytidine-5′-diphosphate compound having a cationic substituent is at least one selected from cytidine-5′-choline diphosphate and cytidine-5′-ethanolamine diphosphate. 1.
  • the production method of the present invention by including an elution step using an organic acid solution having 2 or more carbon atoms such as acetic acid and propionic acid instead of conventional formic acid, 5'-CMP is efficiently removed, It is possible to obtain an eluate containing a cytidine-5′-diphosphate compound at a higher concentration than before purification, and to produce a highly pure cytidine-5′-diphosphate compound with high efficiency.
  • an organic acid solution having 2 or more carbon atoms such as acetic acid and propionic acid
  • FIG. 1 is a diagram showing the CDP-choline concentration and 5'-CMP concentration for each eluted fraction in Comparative Example 2.
  • RV on the horizontal axis is an abbreviation for resin volume, and represents the volume ratio of the eluate when the resin volume is 1.
  • FIG. 2 is a diagram showing the CDP-choline concentration and 5'-CMP concentration for each eluted fraction in Example 2.
  • RV on the horizontal axis is an abbreviation for resin volume, and represents the volume ratio of the eluate when the resin volume is 1.
  • FIG. 3 is a diagram showing the CDP-choline concentration and 5'-CMP concentration for each eluted fraction in Example 4.
  • RV on the horizontal axis is an abbreviation for resin volume, and represents the volume ratio of the eluate when the resin volume is 1.
  • the manufacturing method of the present invention is characterized by including the following steps (1) and (2).
  • the cytidine-5'-diphosphate compound is a cytidine-5'-diphosphate compound having a cationic substituent.
  • cytidine-5'-diphosphate compounds having a cationic substituent include compounds in which cytidine-5'-diphosphate and a cationic substituent are bonded.
  • a cytidine-5'-diphosphate compound having a cationic substituent is a compound in which a cationic substituent is bound to the ⁇ -phosphate group of cytidine-5'-diphosphate.
  • Cationic substituents include, for example, substituents having onium ions such as ammonium, oxonium, phosphonium, sulfonium, iminium, nitrilium, nitrosonium, diazonium, nitronium or diazenium, among which those having ammonium ions. is preferred.
  • Cytidine-5'-diphosphate compounds having a cationic substituent include, for example, cytidine-5'-choline diphosphate and cytidine-5'-diphosphate ethanolamine. Therefore, cytidine-5'-choline diphosphate or cytidine-5'-diphosphate ethanolamine is preferred, and cytidine-5'-choline diphosphate is more preferred. These may be contained singly in the solution, or may be contained in combination of two or more. Modification with a functional group to the cytidine-5'-diphosphate compound is also allowed as long as the separation from 5'-CMP is maintained.
  • the solution containing the cytidine-5'-diphosphate compound to be brought into contact with the basic ion exchange resin may be any solution containing the cytidine-5'-diphosphate compound. It may be a solution prepared by the method of, for example, a solution produced by a chemical synthesis method, a fermentation method, or a method using a biocatalyst.
  • Examples of methods for chemically synthesizing CDP-choline include the methods described in K. Kikugawa, M. Ichino, Chem. Pharm. Bull., 19, 1011, 1971.
  • a chemical synthesis method of CDP-ethanolamine for example, H. Ngo, M. F. Dunn et al. Biochemistry, 46, 7713, 2007.; T. Tanaka yakugakuzasshi, 80, 439, 1959.; K. Oertell, C. E. McKenna, M. F. Goodman et al. Biochemistry, 53, 1842, 2014.; T. Tanaka et al. yakugakuzasshi, 85, 863, 1965.; T. Tanaka et al. yakugakuzasshi, 85, 863, 1965, etc. can be used.
  • the solution containing the cytidine-5'-diphosphate compound used in step (1) in the production method of the present invention is obtained by removing solids from a solution obtained by a fermentation method or a method using a biocatalyst. It is preferably a solution that can be
  • a solution containing the cytidine-5'-diphosphate compound in step (1) in the production method of the present invention a solution produced by a chemical synthesis method, a fermentation method, or a method using a biocatalyst is strongly acidic.
  • a solution that has been treated with an ion-exchange resin to reduce or remove contaminants in advance may also be used.
  • activated carbon treatment or non-polar porous synthetic adsorbents such as Mitsubishi Chemical's Diaion HP series (eg, HP20, HP21, etc.), Mitsubishi Chemical Corporation's Diaion SP800 series (eg, SP825, SP850, etc.) ), Mitsubishi Chemical's Diaion SP200 series (e.g., SP207, etc.), Rohm and Haas Co., Ltd.'s Amberlite XAD series (e.g., XAD4, XAD7HP, XAD16HP, XAD1180, XAD2000, etc.).
  • a solution may be used.
  • Cytidine-5'-diphosphate compounds and 5'-CMP can be analyzed by a conventional method using high performance liquid chromatography (UV detection).
  • the concentration of the cytidine-5'-diphosphate compound in the solution containing the cytidine-5'-diphosphate compound in step (1) is not particularly limited, it is preferably 100 g/L or less from the viewpoint of purification efficiency. , more preferably 85 g/L or less, still more preferably 40 g/L or less, even more preferably 15 g/L or less, and most preferably 13 g/L or less.
  • the lower limit of the concentration of the cytidine-5'-diphosphate compound in the solution containing the cytidine-5'-diphosphate compound in step (1) is not particularly limited, it is preferably 0.1 g/L or more, and more It is preferably 0.2 g/L or more, more preferably 0.3 g/L or more, and most preferably 0.4 g/L or more.
  • the ratio of the concentration of 5'-CMP to the concentration of cytidine-5'-diphosphate compound in the solution containing cytidine-5'-diphosphate compound in step (1) (“concentration of 5'-CMP (g /L)/concentration of cytidine-5′-diphosphate compound (g/L) ⁇ 100 (%)”, hereinafter referred to as “5′-CMP ratio (relative to cytidine-5′-diphosphate compound %)” is not particularly limited, but from the viewpoint of purification efficiency, it is preferably 150% or less, more preferably 100% or less, still more preferably 50% or less, and most preferably 15% or less.
  • the basic ion-exchange resin of the present invention is not particularly limited.
  • An ion exchange resin having a quaternary ammonium in the exchange group in is mentioned.
  • the ion-exchange resin having a quaternary ammonium group either type I having a trimethylammonium group or triethylammonium group or type II having a dimethylethanolammonium group can be suitably used.
  • Examples of the basic ion-exchange resin matrix include porous type, macroporous type, gel type, styrene type, and acrylic type.
  • basic ion exchange resins include Dow Chemical Co. Marathon series (e.g., Marathon A, Marathon MSA, Marathon A2, etc.), Dow Chemical Co. Monosphere series (e.g., Monosphere 77, Monosphere 550A etc.), 1 ⁇ 2, 1 ⁇ 4, 1 ⁇ 8, 22, 66, MSA-2 manufactured by Dow Chemical Company, A400, A600, SGA550, A200, A300, A500, A501P, A502PS, A503, A510 manufactured by Purolite , A850, A860, A870, SSTA63, SSTA64, PFA520E, A100, A103S, A110, A111S, A133S, A830W, A845, A847, Organo IRA400J, IRA402BL, IRA900J, IRA4580, SCAV4, JIRAPR41400, JIRAPR41402, HPR4780, IRA67, IRA96SB, IRA98, Mitsubishi Chemical Diaion PA series (for example, PA306S, PA30, PA
  • an ion-exchange resin having a quaternary ammonium as an exchange group in a strongly basic anion-exchange resin is more preferable.
  • Specific examples of ion exchange resins having quaternary ammonium groups in strongly basic anion exchange resins include 1 ⁇ 2, 1 ⁇ 4, 1 ⁇ 8, 22 and MSA-2 manufactured by The Dow Chemical Company.
  • the amount of the basic ion exchange resin used is determined by the amount of cations in the solution containing the cytidine-5'-diphosphate compound, that is, the contaminant amino acids contained in the liquid in addition to the cytidine-5'-diphosphate compound,
  • the total molar equivalents of organic acids, chloride ions, etc. should be within the total exchange capacity of the basic ion exchange resin.
  • the ionic form of the basic ion exchange resin any one of hydroxide ions, or a state in which an organic acid having 2 or more carbon atoms used for elution is bound, or a combination thereof can be used. .
  • the degree of cross-linking of the basic ion exchange resin is not particularly limited as long as the degree of cross-linking can separate the cytidine-5'-diphosphate compound and 5'-CMP, but is preferably 1 to 16%, more preferably 2 to 12%, more preferably 4-10%.
  • the basic ion exchange resin may be used by a method that allows a solution containing the cytidine-5'-diphosphate compound to be brought into contact with the basic ion exchange resin, but it can be used in the present invention in a form packed in a column. Preferably, any column may be used in the present invention.
  • a solution containing a cytidine-5'-diphosphate compound is passed through a column or the like packed with a basic ion-exchange resin and brought into contact with the resin, thereby causing the cytidine-5'-diphosphate compound to be adsorbed on the resin.
  • the column velocity when passing through a column packed with a basic ion exchange resin having a degree of cross-linking of 1 to 16% is space velocity (space velocity, when the resin volume of the ion exchange resin is 1
  • step (2) A step of obtaining an eluate by eluting the cytidine-5'-diphosphate compound adsorbed on the basic ion exchange resin using an aqueous solution containing an organic acid having 2 or more carbon atoms.
  • an aqueous solution containing an organic acid having 2 or more carbon atoms is passed through the basic ion exchange resin on which the cytidine-5'-diphosphate compound was adsorbed in step (1) to obtain an eluate.
  • step (3) to elute the cytidine-5′-diphosphate compound from the resin to separate and purify the cytidine-5′-diphosphate compound.
  • the organic acid having 2 or more carbon atoms is preferably a carboxylic acid having 2 or more carbon atoms.
  • organic acids having 2 or more carbon atoms include acetic acid, propionic acid, butyric acid, valeric acid, lactic acid, glycolic acid, pyruvic acid, gluconic acid, tartaric acid, oxalic acid, malonic acid, succinic acid, glutaric acid, adipic acid, Malic acid, fumaric acid, maleic acid, citric acid, isocitric acid, ascorbic acid.
  • acetic acid, propionic acid and butyric acid are preferred, and acetic acid and propionic acid are more preferred.
  • the organic acids having 2 or more carbon atoms may be used singly or in combination.
  • the upper limit of the carbon number of the organic acid is not particularly limited, it preferably has 8 or less carbon atoms, more preferably 6 or less carbon atoms, and still more preferably 3 or less carbon atoms from the viewpoint of water solubility.
  • the organic acid having 2 or more carbon atoms may be a salt of an organic acid having 2 or more carbon atoms.
  • the concentration of the organic acid having 2 or more carbon atoms in the aqueous solution containing the organic acid having 2 or more carbon atoms is preferably 0.1 mol/L or more from the viewpoint of increasing the purification efficiency of the cytidine-5'-diphosphate compound. , more preferably 0.35 mol/L or more.
  • the upper limit of the concentration of the organic acid having 2 or more carbon atoms in the aqueous solution is not particularly limited. It is 0 mol/L or less, more preferably 0.6 mol/L or less, and most preferably 0.45 mol/L or less.
  • the eluate (eluate containing a cytidine-5'-diphosphate compound, hereinafter also abbreviated as an eluate containing a cytidine-5'-diphosphate compound) in step (2) contains contaminants and cytidine-5'-diphosphate.
  • an aqueous solution containing an organic acid having 2 or more carbon atoms is passed through a basic ion exchange resin. It is obtained by dividing the obtained liquid into two or more fractions and recovering them.
  • Two or more fractions containing the obtained cytidine-5'-diphosphate compound may be mixed to obtain an eluate containing the cytidine-5'-diphosphate compound. More preferably, 3 or more fractions, more preferably 4 or more fractions can be collected.
  • a step of analyzing contaminants such as cytidine-5'-diphosphate and 5'-CMP contained in each fraction by HPLC before the step of mixing fractions containing cytidine-5'-diphosphate. may contain Contaminants such as cytidine-5'-diphosphate compounds and 5'-CMP can be analyzed by a conventional method using, for example, high performance liquid chromatography (UV detection).
  • the concentration of the cytidine-5'-diphosphate compound contained in the eluate in step (2) is the same as the cytidine-5'-diphosphate compound in the solution containing the cytidine-5'-diphosphate compound in step (1). is preferably equal to or higher than the concentration of Specifically, for example, the concentration ratio, that is, the concentration (g / L) of the cytidine-5'-diphosphate compound contained in the eluate in step (2) / contact with the basic ion exchange resin in step (1)
  • the concentration (g/L) of the cytidine-5'-diphosphate compound in the solution is preferably 1.0 times or more, more preferably 1.1 times or more.
  • the upper limit of the concentration rate is not particularly limited, it is, for example, 160 times or less.
  • the 5′-CMP ratio of the eluate in step (2) (ratio to cytidine-5′-diphosphate compound %) is preferably 1.00% or less, more preferably 0.20% or less, still more preferably 0.10% or less.
  • the lower limit of the ratio to cytidine-5'-diphosphate is not particularly limited, it is, for example, 0% or more.
  • Recovery rate (%) of cytidine-5'-diphosphate compound in step (2) that is, mass (g) of cytidine-5'-diphosphate compound contained in eluate in step (2)/step (1)
  • the mass (g) of the cytidine-5'-diphosphate compound contained in the solution containing the cytidine-5'-diphosphate compound in ⁇ 100 (%) is preferably 60% or more, more preferably 80%. 89% or more, more preferably 89% or more.
  • the upper limit of the recovery rate is not particularly limited, it is, for example, less than 100%.
  • the temperature at which the cytidine-5'-diphosphate compound is eluted from the basic ion exchange resin is determined from the viewpoint of enhancing the separation between the cytidine-5'-diphosphate compound and 5'-CMP during elution. , preferably 20° C. or higher, more preferably 30° C. or higher, and still more preferably 40° C. or higher.
  • the upper limit of the elution temperature is not particularly limited, it is preferably 60° C. or less from the viewpoint of suppressing the generation of 5′-CMP due to thermal decomposition of the cytidine-5′-diphosphate compound.
  • the elution temperature refers to the temperature of the column and/or the temperature of the aqueous solution containing the organic acid having 2 or more carbon atoms.
  • the elution temperature is 30 to 60. °C, more preferably 40 to 60°C.
  • the elution temperature is preferably 20 to 60°C, more preferably 30 to 60°C. It is more preferably 40 to 60°C.
  • the cytidine-5'-diphosphate compound and contaminants contained in the solution such as 5'-CMP, UMP, UDP, UTP, UDP-choline, UDP-ethanolamine, CDP, CTP, inorganic phosphoric acid and polyphosphoric acid can be efficiently separated, and a highly pure cytidine-5'-diphosphate compound can be produced.
  • the cytidine-5'-diphosphate compound and 5'-CMP can be efficiently separated by the steps (1) and (2).
  • the eluate containing the cytidine-5'-diphosphate compound obtained in the elution step may be treated with activated carbon or a nonpolar porous synthetic adsorbent, such as Mitsubishi Chemical's Diaion HP series (eg, HP20, HP21, etc.), Mitsubishi Chemical Corporation's Diaion SP800 series (e.g., SP825, SP850, etc.), Mitsubishi Chemical Corporation's Diaion SP200 series (e.g., SP207, etc.), Rohm and Haas Co., Ltd.'s Amberlite XAD series (e.g., XAD4 , XAD7HP, XAD16HP, XAD1180, XAD2000, etc.) may be used for decolorization.
  • a nonpolar porous synthetic adsorbent such as Mitsubishi Chemical's Diaion HP series (eg, HP20, HP21, etc.), Mitsubishi Chemical Corporation's Diaion SP800 series (e.g., SP825, SP850, etc.), Mitsubishi Chemical Corporation
  • the above-mentioned cytidine-5'-diphosphate compound-containing eluate or liquid after decolorization treatment is preferably treated with acid or alkali as necessary. is adjusted to pH 2.0 to 4.0, and after concentration as necessary, the concentration of the cytidine-5'-diphosphate compound is preferably adjusted to 50 to 800 g / L, more preferably 100 to 700 g / L, Cytidine-5'-diphosphate compound crystals can be obtained using an organic solvent, preferably a hydrophilic organic solvent such as acetone, ethanol, methanol, or propanol.
  • an organic solvent preferably a hydrophilic organic solvent such as acetone, ethanol, methanol, or propanol.
  • the above-mentioned cytidine-5'-diphosphate compound-containing eluate is adjusted to preferably pH 5.0 to 9.5 with sodium hydroxide.
  • the concentration of the cytidine-5′-diphosphate compound is preferably adjusted to 50 to 800 g/L, more preferably 100 to 700 g/L, and an organic solvent,
  • a cytidine-5′-diphosphate compound sodium salt crystal can be obtained preferably using a hydrophilic organic solvent such as acetone, ethanol, methanol, propanol, or the like.
  • Methods for obtaining cytidine-5′-diphosphate compound crystals using an organic solvent include, for example, a method of adding an organic solvent to a cytidine-5′-diphosphate compound solution to precipitate crystals, or a method of precipitating crystals in a large amount of an organic solvent.
  • a method of precipitating crystals by dropping a hecytidine-5'-diphosphate compound solution may be mentioned.
  • Each eluted fraction in step (2) was diluted 100 times or adjusted to approach the concentration of the standard and used for analysis.
  • the concentrations of CDP-choline, 5'-CMP and CDP-ethanolamine contained in each eluted fraction were adjusted to 0.02 g/L CDP-choline, 0.01 g/L 5'-CMP and 0 Using .018 g/L of CDP-ethanolamine, quantification was carried out by the one-point calibration curve method from the peak area value of the sample.
  • FIG. 1 shows the results of quantifying the CDP-choline concentration and 5'-CMP concentration for each elution fraction by HPLC.
  • FIG. 2 shows the results of quantifying the CDP-choline concentration and 5′-CMP concentration for each elution fraction by HPLC.
  • FIG. 3 shows the results of quantifying the CDP-choline concentration and 5'-CMP concentration for each elution fraction by HPLC.
  • the fractions containing CDP-choline were combined to yield 349 mL of solution with a CDP-choline concentration of 71.4 g/L.
  • the 5′-CMP concentration of the same solution was 0.03 g/L (ratio to CDP-choline 0.04%).
  • the recovery rate of CDP-choline was 96.1%.
  • Table 1 shows a summary of the above results.
  • Example 10 Organic chemical synthesis of CDP-choline followed a known method (K. Kikugawa, M. Ichino, Chem. Pharm. Bull., 19, 1011, 1971.). After adding 6.6 g of Phosphocholine Chloride Calcium Salt Tetrahydrate (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) to 20 mL of water, the mixture was stirred at 80° C. until dissolved. After adding 2.52 g of oxalic acid dihydrate (reagent special grade manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to this solution, the solution was stirred for 10 minutes.
  • Phosphocholine Chloride Calcium Salt Tetrahydrate manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.
  • the fractions containing CDP-choline were combined to obtain 106 mL of solution with a CDP-choline concentration of 10.7 g/L.
  • the 5′-CMP concentration of the same solution was 0.003 g/L (ratio to CDP-choline 0.03%).
  • the recovery rate of CDP-choline was 95.3%. From this result, it was found that the production method of the present invention can also be applied to a solution containing a cytidine-5'-diphosphate compound obtained by an organic synthesis method.
  • Example 11 After obtaining a culture solution with a CDP-choline concentration of 30.8 g/L by the method described in Japanese Patent No. 3369236, the pH was adjusted to 3.0 with sulfuric acid. Next, the cells were separated by centrifugation (8000 rpm, 10 minutes), and water was added to the resulting supernatant to obtain 12.2 g of CDP-choline as a solution containing cytidine-5'-diphosphate compound. 10.9 L of an aqueous solution containing a concentration of /L was obtained.
  • Synthesis of compound 4 was performed with reference to a known document (T. Tanaka et al. yakugakuzasshi, 85, 863, 1965.). 2.00 g of the previously synthesized compound 2 was added to 178 mL of water and dissolved. Cyclohexylamine was removed by passing this through an H + -type strongly acidic cation exchange resin, followed by washing with water to obtain a total of 300 mL of eluate. Next, water was distilled off under reduced pressure, and then an appropriate amount of DMF was added and distilled off again. DMF was added to this again and dissolved. Furthermore, compound 3 synthesized separately was dissolved in DMF, and the two were mixed and stirred overnight at room temperature.
  • CDP-ethanolamine was synthesized with reference to a known document (T. Tanaka et al. yakugakuzasshi, 85, 863, 1965.). 11.2 mL of water was added to the previously synthesized compound 4 to dissolve it. After replacing this with a nitrogen atmosphere, 636 mg of 5% by mass Pd/C (STD type for organic synthesis manufactured by NE CHEMCAT) was added and stirred. Then, the atmosphere was replaced with a hydrogen atmosphere, and the mixture was vigorously stirred at room temperature for 4 hours. After purging into a nitrogen atmosphere again, Pd/C was removed from the reaction solution by suction filtration. Further, residual Pd/C was removed with a membrane filter having a pore size of 0.45 ⁇ m.
  • the solution containing the cytidine-5'-diphosphate compound contained 1.17 g/L of CDP-ethanolamine and 0.0334 g/L of 5'-CMP (relative to CDP-ethanolamine: 2.9%). contained in concentrations.
  • the 5′-CMP concentration of the same solution was 0.008 g/L (ratio to CDP-ethanolamine 0.11%).
  • the recovery rate of CDP-ethanolamine was 96.8%. From this result, it was found that the production method of the present invention can also be applied to the CDP-ethanolamine solution obtained by the synthetic method.

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Abstract

本発明は、（１）シチジン－５'－ジリン酸化合物を含有する溶液を塩基性イオン交換樹脂と接触させて、前記塩基性イオン交換樹脂にシチジン－５'－ジリン酸化合物を吸着させる工程及び（２）炭素数２以上の有機酸を含有する水溶液を用いて、前記塩基性イオン交換樹脂に吸着した前記シチジン－５'－ジリン酸化合物を溶出させて溶出液を得る工程を含み、前記シチジン－５'－ジリン酸化合物がカチオン性置換基を有するシチジン－５'－ジリン酸化合物である、シチジン－５'－ジリン酸化合物の製造方法に関する。

Description

シチジン－５’－ジリン酸化合物の製造方法
　本発明は、シチジン－５’－ジリン酸化合物の製造方法に関する。
　シチジン－５’－ジリン酸コリン（以下、ＣＤＰ－コリンとも略す）をはじめとするシチジン－５’－ジリン酸化合物の工業的生産方法には、化学合成法と微生物を用いた発酵法及び酵素法が知られている。いずれの方法においても、シチジン－５’－リン酸（以下、５’－ＣＭＰとも略す）やその反応性に富んだ誘導体をホスホコリン又はホスホエタノールアミン等と縮合させる反応を経由するため、原料に由来するまたは副生した５’－ＣＭＰが系中に不純物として存在する。またシチジン－５’－ジリン酸化合物は加熱により加水分解され、５’－ＣＭＰが副生する。
　従来、シチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する溶液からシチジン－５’－ジリン酸化合物を精製する一般的な方法としては、例えば、イオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィー法が挙げられる。例えば、特許文献１～３には、粗製のＣＤＰ－コリンを陰イオン交換樹脂に吸着させたのちに、０．００５～０．１０ｍｏｌ／Ｌ程度の極めて薄いギ酸または塩酸を用いて溶出する手法が開示されている。
　また、特許文献４には、溶出剤として塩化ナトリウム水溶液を用いる手法が開示されている。さらに別の手法として、特許文献５には、弱塩基性陰イオン交換樹脂に粗製のＣＤＰ－コリンを通過させ、不純物である５’－ＣＭＰのみを選択的に吸着除去する手法が開示されている。
日本国特開昭４８－８６８６９号公報 日本国特開昭４７－１８８８１号公報 インド国特許出願公開第２０１２ＭＵＭ０２５３４号明細書 中国特許出願公開第１０１１３０７９７号明細書 日本国特公平６－３１３０６号公報
　シチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する溶液からシチジン－５’－ジリン酸化合物を精製する過程において、夾雑物、特に物理化学的性質が近い５’－ＣＭＰを最終産物から除去することは難しく、従来のカラムクロマトグラフィー法による５’－ＣＭＰの除去においては、該溶液中のシチジン－５’－ジリン酸化合物が希釈されてしまい、その後の濃縮に時間とコストを要するという問題がある。また、濃縮工程における加熱によるシチジン－５’－ジリン酸化合物の分解によって５’－ＣＭＰ等の不純物が発生するリスクもある。
　そのため、粗製のシチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する溶液からシチジン－５’－ジリン酸化合物と夾雑物、特に５’－ＣＭＰとを効率よく分離し、かつ精製前よりも高濃度のシチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する溶液を得ることは、高純度のシチジン－５’－ジリン酸化合物を製造するうえで重要な課題である。
　しかしながら、特許文献１～３に記載の手法では、特に５’－ＣＭＰとシチジン－５’－ジリン酸化合物とを分離するために、緩やかな溶出条件で大量の溶出液を用いてシチジン－５’－ジリン酸化合物を回収する必要があり、溶出液中のシチジン－５’－ジリン酸化合物の濃度が低下してしまうため、結晶化等を行うためには濃縮工程が必要である。特に、ギ酸や塩酸など揮発性の酸を用いて溶出する場合、これらの溶出剤を蒸発除去するには主に加熱による減圧下濃縮が行われるが、その際加熱によりシチジン－５’－ジリン酸化合物が分解して５’－ＣＭＰが再び増加することから、工業的生産方法としては問題点を含む。
　引用文献４に記載の方法は、シチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する画分に混入した溶出剤を最終的に取り除くことが困難であることから工業的生産方法として適していない。また、特許文献５に記載の手法では通液後にレジン塔内を水洗してシチジン－５’－ジリン酸化合物を回収する必要があり、特許文献１～３に記載の方法と同様にシチジン－５’－ジリン酸化合物濃度は通塔前に比べて低下してしまうことから、工業的生産方法としての適用には、一定以上の濃度を有する通塔液に限定され、汎用性が低い。
　上記したように、粗製のシチジン－５’－ジリン酸化合物から５’－ＣＭＰを分離し、かつシチジン－５’－ジリン酸化合物を精製前より高い濃度まで濃縮する手法は報告されていない。したがって、本発明は、粗製のシチジン－５’－ジリン酸化合物から５’－ＣＭＰを効率よく除去し、精製前より高い濃度にシチジン－５’－ジリン酸化合物を濃縮できるシチジン－５’－ジリン酸化合物の製造方法の提供を目的とする。
　本発明者らは、特定の有機酸溶液を用いた溶出により、シチジン－５’－ジリン酸化合物を効率よく精製及び濃縮し得ることを見出し、特にシチジン－５’－ジリン酸化合物と５’－ＣＭＰを効率よく分離するとともに、精製前よりも高濃度のシチジン－５’－ジリン酸化合物を含む溶出液が得られることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
１．シチジン－５’－ジリン酸化合物の製造方法であって、以下の工程（１）及び（２）を含み、前記シチジン－５’－ジリン酸化合物がカチオン性置換基を有するシチジン－５’－ジリン酸化合物である、製造方法。
（１）シチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する溶液を塩基性イオン交換樹脂と接触させて、前記塩基性イオン交換樹脂に前記シチジン－５’－ジリン酸化合物を吸着させる工程
（２）炭素数２以上の有機酸を含有する水溶液を用いて、前記塩基性イオン交換樹脂に吸着した前記シチジン－５’－ジリン酸化合物を溶出させて溶出液を得る工程　
２．前記工程（２）における前記溶出液に含有される前記シチジン－５’－ジリン酸化合物の濃度が、前記工程（１）における前記シチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する溶液中の前記シチジン－５’－ジリン酸化合物の濃度と同等以上である、前記１に記載の製造方法。
３．前記工程（２）において、前記塩基性イオン交換樹脂から前記シチジン－５’－ジリン酸化合物を溶出する温度が２０℃以上である、前記１または２に記載の製造方法。
４．前記炭素数２以上の有機酸が酢酸、プロピオン酸及び酪酸から選ばれる少なくとも１以上の有機酸である、前記１～３のいずれか１に記載の製造方法。
５．前記工程（２）において、前記水溶液に含有される前記有機酸の濃度が０．１ｍｏｌ／Ｌ以上である、前記１～４のいずれか１に記載の製造方法。
６．前記カチオン性置換基を有するシチジン－５’－ジリン酸化合物が、シチジン－５’－ジリン酸とカチオン性置換基とが結合した化合物である、前記１～５のいずれか１に記載の製造方法。
７．前記カチオン性置換基を有するシチジン－５’－ジリン酸化合物が、シチジン－５’－ジリン酸のβ－リン酸基にカチオン性置換基が結合した化合物である、前記１～６のいずれか１に記載の製造方法。
８．前記炭素数２以上の有機酸が、炭素数２以上のカルボン酸である、前記１～７のいずれか１に記載の製造方法。
９．前記カチオン性置換基を有するシチジン－５’－ジリン酸化合物が、シチジン－５’－ジリン酸コリンおよびシチジン－５’－ジリン酸エタノ－ルアミンから選ばれる少なくとも１である、前記１～８のいずれか１に記載の製造方法。
　本発明の製造方法によれば、従来のギ酸ではなく、酢酸やプロピオン酸などの炭素数２以上の有機酸溶液を用いた溶出工程を含むことにより、５’－ＣＭＰの効率的な除去と、精製前よりも高濃度のシチジン－５’－ジリン酸化合物を含む溶出液を得ることとを両立でき、高純度のシチジン－５’－ジリン酸化合物を高効率で製造し得る。
図１は、比較例２の溶出画分ごとのＣＤＰ－コリン濃度および５’－ＣＭＰ濃度を示す図である。横軸のＲＶはｒｅｓｉｎ　ｖｏｌｕｍｅの略であり、レジン体積を１としたときの溶出液の体積比を表す。 図２は、実施例２の溶出画分ごとのＣＤＰ－コリン濃度および５’－ＣＭＰ濃度を示す図である。横軸のＲＶはｒｅｓｉｎ　ｖｏｌｕｍｅの略であり、レジン体積を１としたときの溶出液の体積比を表す。 図３は、実施例４の溶出画分ごとのＣＤＰ－コリン濃度および５’－ＣＭＰ濃度を示す図である。横軸のＲＶはｒｅｓｉｎ　ｖｏｌｕｍｅの略であり、レジン体積を１としたときの溶出液の体積比を表す。
＜製造方法＞
　本発明の製造方法は、以下の工程（１）及び（２）を含むことを特徴とする。
（１）シチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する溶液を塩基性イオン交換樹脂と接触させて、塩基性イオン交換樹脂にシチジン－５’－ジリン酸化合物を吸着させる工程
（２）炭素数２以上の有機酸を含有する水溶液を用いて、塩基性イオン交換樹脂に吸着したシチジン－５’－ジリン酸化合物を溶出させて溶出液を得る工程　
（１）シチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する溶液を塩基性イオン交換樹脂と接触させて、塩基性イオン交換樹脂にシチジン－５’－ジリン酸化合物を吸着させる工程
　本発明において、シチジン－５’－ジリン酸化合物はカチオン性置換基を有するシチジン－５’－ジリン酸化合物である。カチオン性置換基を有するシチジン－５’－ジリン酸化合物としては、シチジン－５’－ジリン酸とカチオン性置換基とが結合した化合物が挙げられる。より具体的には、カチオン性置換基を有するシチジン－５’－ジリン酸化合物はシチジン－５’－ジリン酸のβ－リン酸基にカチオン性置換基が結合した化合物である。ここで、シチジン－５’－ジリン酸における、リン酸基の位置は、シチジンに近い方から順にα－リン酸基、β－リン酸基とされる（化学と教育、４６巻６号、１９９８年、３３４～３３７ページ）。カチオン性置換基としては、例えば、アンモニウム、オキソニウム、ホスホニウム、スルホニウム、イミニウム、ニトリリウム、ニトロソニウム、ジアゾニウム、ニトロニウムまたはジアゼニウムなどのオニウムイオンを有する置換基などが挙げられ、これらの中でもアンモニウムイオンを有するものが好ましい。カチオン性置換基を有するシチジン－５’－ジリン酸化合物としては、例えば、シチジン－５’－ジリン酸コリン、シチジン－５’－ジリン酸エタノ－ルアミンが挙げられ、これらの中でも、精製効率の観点から、シチジン－５’－ジリン酸コリンまたはシチジン－５’－ジリン酸エタノ－ルアミンが好ましく、より好ましくはシチジン－５’－ジリン酸コリンである。これらは１種を単独で前記溶液に含んでもよいし、２種以上の組合せで含んでもよい。また５’－ＣＭＰとの分離性が維持される限り、シチジン－５’－ジリン酸化合物に対する官能基による修飾も許容される。
　本発明の製造方法における工程（１）において、塩基性イオン交換樹脂と接触させるシチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する溶液としては、シチジン－５’－ジリン酸化合物を含む溶液であればいずれの方法で調製された溶液であってもよいが、例えば、化学合成法、発酵法、生体触媒を用いた方法により製造される溶液が挙げられる。
　ＣＤＰ－コリンの化学合成法としては、例えば、K. Kikugawa, M. Ichino, Chem. Pharm. Bull., 19, 1011, 1971.等に記載の方法が挙げられる。ＣＤＰ－エタノールアミンの化学合成法としては、例えば、H. Ngo, M. F. Dunn et al. Biochemistry, 46, 7713, 2007.；T. Tanaka yakugakuzasshi, 80, 439, 1959.；K. Oertell, C. E. McKenna, M. F. Goodman et al. Biochemistry, 53, 1842, 2014.；T. Tanaka et al. yakugakuzasshi, 85, 863, 1965.；T. Tanaka et al. yakugakuzasshi, 85, 863, 1965.等に記載の方法が挙げられる。
　発酵法または生体触媒を用いた方法としては、例えば、日本国特許第３３６９２３６号公報；Y. Liu et al. Appl. Microbiol. Biotechnol., 101, 1409, 2017.等に記載の方法が挙げられる。本発明の製造方法における工程（１）で用いられるシチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する溶液としては、発酵法または生体触媒を用いた方法で得られた溶液から固形分を除去して得られる溶液であることが好ましい。
　また、本発明の製造方法における工程（１）のシチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する溶液としては、化学合成法、発酵法、生体触媒を用いた方法により製造される溶液を強酸性陽イオン交換樹脂により処理し、あらかじめ夾雑物を低減または除去した溶液を用いてもよい。また、必要に応じて活性炭処理または非極性多孔質合成吸着剤、例えば三菱ケミカル社製ダイヤイオンＨＰシリーズ（例えば、ＨＰ２０、ＨＰ２１等）、三菱ケミカル社製ダイヤイオンＳＰ８００シリーズ（例えば、ＳＰ８２５、ＳＰ８５０等）、三菱ケミカル社製ダイヤイオンＳＰ２００シリーズ（例えばＳＰ２０７等）、ローム・アンド・ハース社製アンバーライトＸＡＤシリーズ（例えば、ＸＡＤ４、ＸＡＤ７ＨＰ、ＸＡＤ１６ＨＰ、ＸＡＤ１１８０、ＸＡＤ２０００等）等を用いて脱色処理を行った溶液を用いてもよい。
　シチジン－５’－ジリン酸化合物や５’－ＣＭＰは高速液体クロマトグラフィー（ＵＶ検出）を用いた常法により分析できる。
　工程（１）におけるシチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する溶液中のシチジン－５’－ジリン酸化合物の濃度は特に制限されないが、精製効率の観点から、１００ｇ／Ｌ以下であることが好ましく、より好ましくは８５ｇ／Ｌ以下、さらに好ましくは４０ｇ／Ｌ以下、さらに好ましくは１５ｇ／Ｌ以下、最も好ましくは１３ｇ／Ｌ以下である。工程（１）におけるシチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する溶液中のシチジン－５’－ジリン酸化合物の濃度の下限は特に制限されないが、０．１ｇ／Ｌ以上であることが好ましく、より好ましくは０．２ｇ／Ｌ以上、さらに好ましくは０．３ｇ／Ｌ以上、最も好ましくは０．４ｇ／Ｌ以上である。
　また、工程（１）におけるシチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する溶液中のシチジン－５’－ジリン酸化合物の濃度に対する５’－ＣＭＰの濃度の比率（「５’－ＣＭＰの濃度（ｇ／Ｌ）／シチジン－５’－ジリン酸化合物の濃度（ｇ／Ｌ）×１００（％）」、以下、「５’－ＣＭＰ比率（対シチジン－５’－ジリン酸化合物比％）」と表記する）は特に制限されないが、精製効率の観点から、１５０％以下であることが好ましく、より好ましくは１００％以下、さらに好ましくは５０％以下、最も好ましくは１５％以下である。
　本発明の塩基性イオン交換樹脂としては、特に限定されず、例えば、弱塩基性陰イオン交換樹脂における交換基に第一～三級アミンやポリアミンを有するイオン交換樹脂、強塩基性陰イオン交換樹脂における交換基に第四級アンモニウムを有するイオン交換樹脂が挙げられる。第四級アンモニウムを有するイオン交換樹脂としては、トリメチルアンモニウム基やトリエチルアンモニウム基などを有するＩ型とジメチルエタノールアンモニウム基を有するＩＩ型、いずれの種類も好適に用いることができる。また、塩基性イオン交換樹脂の母体としては、例えば、ポーラス型、マクロポーラス型、ゲル型、スチレン型、アクリル型が挙げられる。
　塩基性イオン交換樹脂としては、具体的には例えば、ダウケミカル社製マラソンシリーズ（例えば、マラソンＡ、マラソンＭＳＡ、マラソンＡ２等）、ダウケミカル社製モノスフィアーシリーズ（例えば、モノスフィアー７７、モノスフィアー５５０Ａ等）、ダウケミカル社製１×２、１×４、１×８、２２、６６、ＭＳＡ－２、ピュロライト社製Ａ４００、Ａ６００、ＳＧＡ５５０、Ａ２００、Ａ３００、Ａ５００、Ａ５０１Ｐ、Ａ５０２ＰＳ、Ａ５０３、Ａ５１０、Ａ８５０、Ａ８６０、Ａ８７０、ＳＳＴＡ６３、ＳＳＴＡ６４、ＰＦＡ５２０Ｅ、Ａ１００、Ａ１０３Ｓ、Ａ１１０、Ａ１１１Ｓ、Ａ１３３Ｓ、Ａ８３０Ｗ、Ａ８４５、Ａ８４７、オルガノ社製ＩＲＡ４００Ｊ、ＩＲＡ４０２ＢＬ、ＩＲＡ９００Ｊ、ＩＲＡ４５８０、ＳＣＡＶ４、ＨＰＲ４００２、ＩＲＡ４１０Ｊ、ＩＲＡ９１０ＣＴ、ＨＰＲ４０１０、ＨＰＲ４７８０、ＩＲＡ６７、ＩＲＡ９６ＳＢ、ＩＲＡ９８、三菱ケミカル社製ダイヤイオンＰＡシリーズ（例えば、ＰＡ３０６Ｓ、ＰＡ３０８、ＰＡ３０８Ｌ、ＰＡ３１２、ＰＡ３１２Ｌ、ＰＡ３１２ＬＯＨ、ＰＡ３１２ＬＴＵ、ＰＡ３１２ＬＴＵＭＢ、ＰＡ３１６、ＰＡ３１６Ｌ、ＰＡ３１８Ｌ、ＰＡ３１８ＬＯＨ、ＰＡ４０８、ＰＡ４１２、ＰＡ４１８、ＰＡ４１８Ｌ、ＰＡ４１８ＬＬ、ＰＡＦ３０８Ｌ、ＨＰＡ２５Ｌ、ＨＰＡ２５Ｍ、ＨＰＡ５１２Ｌ、ＨＰＡ７１６等）（ＰＡは商標）、三菱ケミカル社製ダイヤイオンＳＡシリーズ（例えば、ＳＡ１０Ａ、ＳＡ１０ＡＬ、ＳＡ１０ＡＬＬＰ、ＳＡ１０ＡＯＨ、ＳＡ１０ＡＰ、ＳＡ１０ＤＬ、ＳＡ１１Ａ、ＳＡ１１ＡＬ、ＳＡ１２Ａ、ＳＡ１２ＡＬ、ＳＡ１２ＡＬＬ、ＳＡ２０Ａ、ＳＡ２０ＡＬＬ、ＳＡ２０ＡＬＬＰ、ＳＡ２０ＡＰ、ＳＡ２０ＡＰ２、ＳＡＦ１１ＡＬ、ＳＡＮＵＰＢ、ＳＡＴ１０Ｌ、ＳＡＴ２０Ｌ等）、三菱ケミカル社製ダイヤイオンＵＢＡシリーズ（例えば、ＵＢＡ１００、ＵＢＡ１００ＯＨ、ＵＢＡ１００ＯＨＵＰ、ＵＢＡ１２０、ＵＢＡ１２０ＯＨ、ＵＢＡ１２０ＯＨＵＰ、ＵＢＡ１５０、ＵＢＡ２００等）、三菱ケミカル社製ダイヤイオンＷＡシリーズ（例えば、ＷＡ１０、ＷＡ２０、ＷＡ２１Ｊ、ＷＡ３０、ＷＡ３０Ｃ、ＷＡ３０ＬＬ、ＷＡ５５等）が挙げられる。
　本発明の塩基性イオン交換樹脂としては、強塩基性陰イオン交換樹脂における交換基に第四級アンモニウムを有するイオン交換樹脂がより好ましい。強塩基性陰イオン交換樹脂における交換基に第四級アンモニウムを有するイオン交換樹脂としては、具体的には例えば、ダウケミカル社製１×２、１×４、１×８、２２、ＭＳＡ－２、マラソンＡ、マラソンＡ２、マラソンＭＳＡ、モノスフィアー５５０Ａ、ピュロライト社製Ａ４００、Ａ６００、ＳＧＡ５５０、Ａ２００、Ａ３００、Ａ５００、Ａ５０１Ｐ、Ａ５０２ＰＳ、Ａ５０３、Ａ５１０、Ａ８５０、Ａ８６０、Ａ８７０、ＳＳＴＡ６３、ＳＳＴＡ６４、ＰＦＡ５２０Ｅ、オルガノ社製ＩＲＡ４００Ｊ、ＩＲＡ４０２ＢＬ、ＩＲＡ９００Ｊ、ＩＲＡ４５８０、ＳＣＡＶ４、ＨＰＲ４００２、ＩＲＡ４１０Ｊ、ＩＲＡ９１０ＣＴ、ＨＰＲ４０１０、三菱ケミカル社製ダイヤイオンＰＡシリーズ（例えば、ＰＡ３０６Ｓ、ＰＡ３０８、ＰＡ３０８Ｌ、ＰＡ３１２、ＰＡ３１２Ｌ、ＰＡ３１２ＬＯＨ、ＰＡ３１２ＬＴＵ、ＰＡ３１２ＬＴＵＭＢ、ＰＡ３１６、ＰＡ３１６Ｌ、ＰＡ３１８Ｌ、ＰＡ３１８ＬＯＨ、ＰＡ４０８、ＰＡ４１２、ＰＡ４１８、ＰＡ４１８Ｌ、ＰＡ４１８ＬＬ、ＰＡＦ３０８Ｌ、ＨＰＡ２５Ｌ、ＨＰＡ２５Ｍ、ＨＰＡ５１２Ｌ、ＨＰＡ７１６等）（ＰＡは商標）、三菱ケミカル社製ダイヤイオンＳＡシリーズ（例えば、ＳＡ１０Ａ、ＳＡ１０ＡＬ、ＳＡ１０ＡＬＬＰ、ＳＡ１０ＡＯＨ、ＳＡ１０ＡＰ、ＳＡ１０ＤＬ、ＳＡ１１Ａ、ＳＡ１１ＡＬ、ＳＡ１２Ａ、ＳＡ１２ＡＬ、ＳＡ１２ＡＬＬ、ＳＡ２０Ａ、ＳＡ２０ＡＬＬ、ＳＡ２０ＡＬＬＰ、ＳＡ２０ＡＰ、ＳＡ２０ＡＰ２、ＳＡＦ１１ＡＬ、ＳＡＮＵＰＢ、ＳＡＴ１０Ｌ、ＳＡＴ２０Ｌ等）、三菱ケミカル社製ダイヤイオンＵＢＡシリーズ（例えば、ＵＢＡ１００、ＵＢＡ１００ＯＨ、ＵＢＡ１００ＯＨＵＰ、ＵＢＡ１２０、ＵＢＡ１２０ＯＨ、ＵＢＡ１２０ＯＨＵＰ、ＵＢＡ１５０、ＵＢＡ２００等）が挙げられる。
　塩基性イオン交換樹脂の使用量は、シチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する溶液中のカチオン量、すなわちシチジン－５’－ジリン酸化合物の他に液中に含まれている夾雑物アミノ酸、有機酸、塩化物イオンなどの総モル当量が塩基性イオン交換樹脂の総交換容量以内となるようにすればよい。また塩基性イオン交換樹脂のイオン型としては、水酸化物イオン、または溶出に用いる炭素数２以上の有機酸を結合させた状態のいずれか１つ、またはこれらを組み合わせたものを用いることができる。
　塩基性イオン交換樹脂の架橋度は、シチジン－５’－ジリン酸化合物と５’－ＣＭＰとを分離できる架橋度であれば特に制限はないが、１～１６％が好ましく、より好ましくは２～１２％、さらに好ましくは４～１０％である。塩基性イオン交換樹脂はシチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する溶液を塩基性イオン交換樹脂と接触させることができる方法で用いればよいが、カラムに充填された形で本発明に用いることが好ましく、本発明に用いられるカラムはどのようなものでもよい。
　シチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する溶液を塩基性イオン交換樹脂が充填されたカラムに通塔等して該樹脂に接触させることによりシチジン－５’－ジリン酸化合物を該樹脂に吸着させる場合は、例えば、架橋度１～１６％の塩基性イオン交換樹脂の充填されたカラムに通塔する際の通塔速度はｓｐａｃｅ　ｖｅｌｏｃｉｔｙ（空間速度、イオン交換樹脂のレジン体積を１としたときに１時間あたりに通塔する溶液の体積比（／時間）、以下「ＳＶ」と表記する）がＳＶ＝０．１～５であることが好ましく、より好ましくはＳＶ＝０．２～４、さらに好ましくはＳＶ＝０．４～３である。
（２）炭素数２以上の有機酸を含有する水溶液を用いて、塩基性イオン交換樹脂に吸着したシチジン－５’－ジリン酸化合物を溶出させて溶出液を得る工程　
　工程（２）は工程（１）においてシチジン－５’－ジリン酸化合物を吸着させた塩基性イオン交換樹脂に炭素数２以上の有機酸を含有する水溶液を通塔させて、溶出液を得ることにより、シチジン－５’－ジリン酸化合物を樹脂から溶離させて、シチジン－５’－ジリン酸化合物を分離精製する工程である。
　炭素数２以上の有機酸は、炭素数２以上のカルボン酸であることが好ましい。炭素数２以上の有機酸としては、例えば、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、乳酸、グリコール酸、ピルビン酸、グルコン酸、酒石酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、リンゴ酸、フマル酸、マレイン酸、クエン酸、イソクエン酸、アスコルビン酸が挙げられる。これらの中でも、酢酸、プロピオン酸、酪酸が好ましく、酢酸およびプロピオン酸がより好ましい。炭素数２以上の有機酸は、１種を単独で用いてもよいし、複数を組み合わせて用いてもよい。有機酸の炭素数の上限は特に制限されないが、水への溶解度の観点から、炭素数８以下が好ましく、より好ましくは炭素数６以下、さらに好ましくは炭素数３以下である。炭素数２以上の有機酸は、炭素数２以上の有機酸の塩であってもよい。
　炭素数２以上の有機酸を含有する水溶液における炭素数２以上の有機酸の濃度は、シチジン－５’－ジリン酸化合物の精製効率を高める観点から、０．１ｍｏｌ／Ｌ以上であることが好ましく、より好ましくは０．３５ｍｏｌ／Ｌ以上である。前記水溶液における炭素数２以上の有機酸の濃度の上限は特に制限されないが、有機酸の使用量と効果のバランスの観点から、２．０ｍｏｌ／Ｌ以下であることが好ましく、より好ましくは１．０ｍｏｌ／Ｌ以下、さらに好ましくは０．６ｍｏｌ／Ｌ以下、最も好ましくは０．４５ｍｏｌ／Ｌ以下である。
　工程（２）における溶出液（シチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する溶出液、以下、シチジン－５’－ジリン酸化合物含有溶出液とも略す）は、夾雑物とシチジン－５’－ジリン酸化合物を分離するとともに、必要に応じてシチジン－５’－ジリン酸化合物を濃縮することも可能とするために、炭素数２以上の有機酸を含有する水溶液を塩基性イオン交換樹脂に通塔して得られる液を２以上の分画に分けて回収することで得られる。なお、得られたシチジン－５’－ジリン酸化合物を含む２以上の分画を混合してシチジン－５’－ジリン酸化合物含有溶出液としてもよい。分画はより好ましくは３以上、さらに好ましくは４以上に分けて回収することができる。シチジン－５’－ジリン酸化合物を含む分画を混合する工程の前に、ＨＰＬＣ法により各画分に含まれるシチジン－５’－ジリン酸化合物や５’－ＣＭＰなどの夾雑物を分析する工程を含んでいてもよい。シチジン－５’－ジリン酸化合物や５’－ＣＭＰ等の夾雑物は、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＵＶ検出）を用いた常法により分析できる。
　工程（２）における溶出液に含有されるシチジン－５’－ジリン酸化合物の濃度は、工程（１）におけるシチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する溶液中のシチジン－５’－ジリン酸化合物の濃度と同等以上であることが好ましい。具体的には例えば、濃縮率、すなわち工程（２）における溶出液に含有されるシチジン－５’－ジリン酸化合物の濃度（ｇ／Ｌ）／工程（１）における塩基性イオン交換樹脂と接触させる溶液中のシチジン－５’－ジリン酸化合物の濃度（ｇ／Ｌ）が１．０倍以上であることが好ましく、より好ましくは１．１倍以上である。濃縮率の上限は特に制限されないが、例えば１６０倍以下である。
　工程（２）における溶出液の５’－ＣＭＰ比率（対シチジン－５’－ジリン酸化合物比％）は１．００％以下であることが好ましく、より好ましくは０．２０％以下、さらに好ましくは０．１０％以下である。対シチジン－５’－ジリン酸化合物比の下限は特に制限されないが、例えば０％以上である。
　工程（２）におけるシチジン－５’－ジリン酸化合物の回収率（％）、すなわち工程（２）における溶出液に含有されるシチジン－５’－ジリン酸化合物の質量（ｇ）／工程（１）におけるシチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する溶液に含有されるシチジン－５’－ジリン酸化合物の質量（ｇ）×１００（％）は６０％以上であることが好ましく、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８９％以上である。回収率の上限は特に制限されないが、例えば１００％未満である。
　工程（２）において、塩基性イオン交換樹脂からシチジン－５’－ジリン酸化合物を溶出する温度は、溶出時のシチジン－５’－ジリン酸化合物と５’－ＣＭＰとの分離性を高める観点から、２０℃以上であることが好ましく、より好ましくは３０℃以上、さらに好ましくは４０℃以上である。該溶出する温度の上限は特に制限されないが、シチジン－５’－ジリン酸化合物の熱分解による５’－ＣＭＰの生成を抑制する観点から、６０℃以下であることが好ましい。なお、本発明において、溶出する温度とは、カラムの温度および／または炭素数２以上の有機酸を含有する水溶液の温度をいう。
　シチジン－５’－ジリン酸化合物と５’－ＣＭＰとの分離性を高める観点から、溶出に用いる有機酸が炭素数２の有機酸（例えば、酢酸）である場合、溶出する温度は３０～６０℃であることが好ましく、より好ましくは４０～６０℃である。一方、溶出に用いる有機酸が炭素数３以上の有機酸（例えば、プロピオン酸等）である場合には、溶出する温度は２０～６０℃であることが好ましく、より好ましくは３０～６０℃、さらに好ましくは４０～６０℃である。
　イオン交換反応において温度を変化させると、分離平衡、拡散速度、解離度、溶離液の粘性などの変化により、化合物の保持時間が変化することが知られている。イオン交換反応における温度の影響は化合物によって異なり、担体や溶離液によっても変わるとされているが、本発明者らは溶出する温度を上げることで、シチジン－５’－ジリン酸化合物と５’－ＣＭＰとの分離性が向上する傾向を見出した。さらに本発明者らは、加熱によるシチジン－５’－ジリン酸化合物の加水分解は３０℃においても進行し、４０℃以上の条件では２０℃の条件と比較して１０倍以上の５’－ＣＭＰが副生するなど、顕著に分解が進行することを確認したが、溶出する温度を上げることによるシチジン－５’－ジリン酸化合物と５’－ＣＭＰとの分離性の向上効果は加熱による分解のデメリットよりも大きいことを見出した。
　工程（２）において、塩基性イオン交換樹脂に炭素数２以上の有機酸を含有する水溶液を通塔させる通塔速度はＳＶ＝０．１～２であることが好ましく、より好ましくはＳＶ＝０．２～１．５、さらに好ましくはＳＶ＝０．４～１である。
　上記工程（１）及び（２）により、シチジン－５’－ジリン酸化合物と、溶液中に含まれる夾雑物、例えば５’－ＣＭＰ、ＵＭＰ、ＵＤＰ、ＵＴＰ、ＵＤＰ－コリン、ＵＤＰ－エタノールアミン、ＣＤＰ、ＣＴＰ、無機リン酸、ポリリン酸とを効率よく分離でき、高純度のシチジン－５’－ジリン酸化合物を製造することができる。特に、上記工程（１）及び（２）により、シチジン－５’－ジリン酸化合物と５’－ＣＭＰとを効率よく分離できる。
　なお、溶出工程により得られたシチジン－５’－ジリン酸化合物含有溶出液は、必要に応じて活性炭処理または非極性多孔質合成吸着剤、例えば三菱ケミカル社製ダイヤイオンＨＰシリーズ（例えば、ＨＰ２０、ＨＰ２１等）、三菱ケミカル社製ダイヤイオンＳＰ８００シリーズ（例えば、ＳＰ８２５、ＳＰ８５０等）、三菱ケミカル社製ダイヤイオンＳＰ２００シリーズ（例えばＳＰ２０７等）、ローム・アンド・ハース社製アンバーライトＸＡＤシリーズ（例えば、ＸＡＤ４、ＸＡＤ７ＨＰ、ＸＡＤ１６ＨＰ、ＸＡＤ１１８０、ＸＡＤ２０００等）等を用いて脱色処理を行ってもよい。
　さらに、シチジン－５’－ジリン酸化合物のフリー体結晶を得るためには、上記のシチジン－５’－ジリン酸化合物含有溶出液または脱色処理後の液を、必要に応じて酸またはアルカリで好ましくはｐＨ２．０～４．０に調整し、必要に応じて濃縮後、シチジン－５’－ジリン酸化合物の濃度を好ましくは５０～８００ｇ／Ｌ、より好ましくは１００～７００ｇ／Ｌに調整し、有機溶媒、好ましくはアセトン、エタノール、メタノール、プロパノール等の親水性の有機溶媒を用いてシチジン－５’－ジリン酸化合物結晶を取得できる。
　また、シチジン－５’－ジリン酸化合物の塩結晶を得るためには、例えば、上記のシチジン－５’－ジリン酸化合物含有溶出液を水酸化ナトリウムにて好ましくはｐＨ５．０～９．５に調整し、必要に応じて脱色処理や濃縮処理を行った後、シチジン－５’－ジリン酸化合物濃度を好ましくは５０～８００ｇ／Ｌ、より好ましくは１００～７００ｇ／Ｌに調整し、有機溶媒、好ましくはアセトン、エタノール、メタノール、プロパノール等の親水性の有機溶媒を用いて、シチジン－５’－ジリン酸化合物ナトリウム塩結晶を取得できる。
　有機溶媒を用いてシチジン－５’－ジリン酸化合物結晶を取得する方法としては、例えば、シチジン－５’－ジリン酸化合物溶液に有機溶媒を添加し結晶を析出させる方法、または大量の有機溶媒中へシチジン－５’－ジリン酸化合物溶液を滴下して結晶を析出させる方法が挙げられる。
　以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［分析例１］
　ＨＰＬＣによるＣＤＰ－コリン、５’－ＣＭＰ、及びＣＤＰ－エタノールアミンの定量分析は、下記の条件で実施した。
使用機器：システムコントローラー（ＣＢＭ－２０Ａ）、検出器（ＳＰＤ－２０Ａ）、ポンプ（ＬＣ－２０ＡＴ）、オ－トサンプラー（ＳＩＬ－２０ＡＣＸＲ）、カラムオ－ブン（ＣＴＯ－１０ＡＳｖｐ）、デ－タ解析ソフト（ＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　５．８５）（いずれも島津製作所社製）
検出器：紫外吸光光度計（測定波長　２５４ｎｍ）
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ　Ａｓａｈｉｐａｋ　ＮＨ２Ｐ－５０　４Ｅ　４．６×２５０ｍｍ（昭和電工社製）
移動相：リン酸でｐＨ３．５に調整された０．０３ｍｏｌ／Ｌのリン酸二水素カリウム水溶液（リン酸二水素カリウム　２０．４１ｇを５Ｌの蒸留水に溶解させたのち、リン酸を加えてｐＨ３．５に調整した）。
カラム温度：４０℃
流速：０．５０ｍＬ／ｍｉｎ
試料注入量：１０μＬ
保持時間：ＣＤＰ－コリン　７．３ｍｉｎ、５’－ＣＭＰ　１６．０ｍｉｎ、ＣＤＰ－エタノールアミン　９．１ｍｉｎ
　工程（２）における各溶出画分は１００倍希釈あるいは標品の濃度に近づくよう調整して希釈し、分析に用いた。各溶出画分に含まれるＣＤＰ－コリン、５’－ＣＭＰ、ＣＤＰ－エタノールアミンの濃度を、標品としてそれぞれ０．０２ｇ／ＬのＣＤＰ－コリン、０．０１ｇ／Ｌの５’－ＣＭＰ、０．０１８ｇ／ＬのＣＤＰ－エタノールアミンを用い、標品のピ－クエリア値から１点検量線法で定量を行った。
　例えばＣＤＰ－コリンに関しては、ＣＤＰ－コリン標品のピ－クエリア値をＡ、ｘ倍希釈した溶出画分のピ－クエリア値をＢとすると、（溶出画分のＣＤＰ－コリン濃度（ｇ／Ｌ））＝０．０２×Ｂ／Ａ×ｘで算出される。
［分析例２］
　ＨＰＬＣによるＣＤＰ　ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔの定量分析は、下記の条件で実施した。
使用機器：システムコントローラー（ＣＢＭ－２０Ａ）、検出器（ＳＰＤ－２０Ａ）、ポンプ（ＬＣ－２０ＡＤ）、オ－トサンプラー（ＳＩＬ－２０ＡＣ）、カラムオ－ブン（ＣＴＯ－２０ＡＣ）、デ－タ解析ソフト（ＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　５．７１　ＳＰ１）（いずれも島津製作所社製）
検出器：紫外吸光光度計（測定波長　２５４ｎｍ）
カラム：Ｐａｒｔｉｓｉｌ　１０　ＳＡＸ　４．０×２５０ｍｍを２本直列連結（Ｈｉｃｈｒｏｍ）
移動相：リン酸でｐＨ３．５に調整された０．０６ｍｏｌ／Ｌのリン酸二水素カリウム水溶液（リン酸二水素カリウム　４０．８３ｇを５Ｌの蒸留水に溶解させたのち、リン酸を加えてｐＨ３．５に調整した）。
カラム温度：３０℃
流速：０．４５ｍＬ／ｍｉｎ
試料注入量：１０μＬ
保持時間：ＣＤＰ　ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ　８２．５ｍｉｎ　
［比較例１］
　インド国特許出願公開第２０１２ＭＵＭ０２５３４号明細書を参考に、０．１０ｍｏｌ／Ｌギ酸水溶液を用いて実験を行った。シチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する溶液としてＣＤＰ－コリン（協和発酵バイオ社製）を７．０２ｇ／Ｌ、５’－ＣＭＰ（東京化成工業社製）を０．３７ｇ／Ｌ［溶液中のＣＤＰ－コリン濃度に対する５’－ＣＭＰ濃度の比率（以降、「対ＣＤＰ－コリン比」と記載する）は５．３％］の濃度で含有する水溶液２１０ｍＬを調製し、ＯＨ－型のマラソンＡ（ダウケミカル社製）１５０ｍＬにＳＶ＝１．２５で通塔し吸着させた。
　次にカラム外側が２０℃となるように調整し、ＳＶ＝１．１０で水を２２５ｍＬ通塔した。最後にカラムを２０℃に保持したままＳＶ＝０．８５で０．１０ｍｏｌ／Ｌギ酸水溶液（富士フイルム和光純薬社製試薬特級を希釈）を３Ｌ通塔し、２９．９ｍＬずつ溶出液を取得した。ＣＤＰ－コリンを含んだ分画を混合した結果、ＣＤＰ－コリン濃度が６．０８ｇ／Ｌの溶液を２３９ｍＬ得た。同溶液の５’－ＣＭＰ濃度は０．４０ｇ／Ｌ（対ＣＤＰ－コリン比６．６％）であった。またＣＤＰ－コリンの回収率は９８．６％であった。
［比較例２］
　シチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する溶液としてＣＤＰ－コリンを７．１１ｇ／Ｌ、５’－ＣＭＰを０．３６ｇ／Ｌ（対ＣＤＰ－コリン比５．１％）の濃度で含有する水溶液３．２０Ｌを調製し、ＯＨ－型のマラソンＭＳＡ（ダウケミカル社製）１５０ｍＬにＳＶ＝１．２５で通塔し吸着させた。次にカラム外側が２０℃となるよう調整し、ＳＶ＝１．１０で水を２２５ｍＬ通塔した。最後にカラムを２０℃に保持したままＳＶ＝０．８５で０．３５ｍｏｌ／Ｌギ酸水溶液を１３５０ｍＬ通塔し、１４．１ｍＬずつ溶出液を取得した。溶出画分ごとのＣＤＰ－コリン濃度および５’－ＣＭＰ濃度をＨＰＬＣ法により定量した結果を図１に示す。
　ＣＤＰ－コリンを含んだ分画を混合した結果、ＣＤＰ－コリン濃度が５９．７ｇ／Ｌの溶液を３８１ｍＬ得た。同溶液の５’－ＣＭＰ濃度は２．７ｇ／Ｌ（対ＣＤＰ－コリン比４．５％）であった。またＣＤＰ－コリンの回収率は１００％であった。
［実施例１］
　シチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する溶液としてＣＤＰ－コリンを７．１１ｇ／Ｌ、５’－ＣＭＰを０．３６ｇ／Ｌ（対ＣＤＰ－コリン比５．１％）の濃度で含有する水溶液３．２０Ｌを調製し、ＯＨ－型のマラソンＭＳＡ（ダウケミカル社製）１５０ｍＬにＳＶ＝１．２５で通塔し吸着させた。次にカラム外側が２０℃となるよう調整し、ＳＶ＝１．１０で水を２２５ｍＬ通塔した。最後にカラムを２０℃に保持したままＳＶ＝０．８５で０．３５ｍｏｌ／Ｌ酢酸水溶液（富士フイルム和光純薬社製試薬特級を希釈）を１３５０ｍＬ通塔し、１４．６ｍＬずつ溶出液を取得した。ＣＤＰ－コリンを含んだ分画を混合した結果、ＣＤＰ－コリン濃度が６５．３ｇ／Ｌの溶液を３５１ｍＬ得た。同溶液の５’－ＣＭＰ濃度は０．１０ｇ／Ｌ（対ＣＤＰ－コリン比０．１５％）であった。またＣＤＰ－コリンの回収率は１００％であった。
［実施例２］
　シチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する溶液としてＣＤＰ－コリンを７．１３ｇ／Ｌ、５’－ＣＭＰを０．３８ｇ／Ｌ（対ＣＤＰ－コリン比５．３％）の濃度で含有する水溶液３．２１Ｌを調製し、ＯＨ－型のマラソンＭＳＡ（ダウケミカル社製）１５０ｍＬにＳＶ＝１．２５で通塔し吸着させた。次にカラム外側が２０℃となるよう調整し、ＳＶ＝１．１０で水を２２５ｍＬ通塔した。最後にカラムを２０℃に保持したままＳＶ＝０．８５で０．３５ｍｏｌ／Ｌプロピオン酸水溶液（富士フイルム和光純薬社製和光特級を希釈）を１３５０ｍＬ通塔し、１５．６ｍＬずつ溶出液を取得した。溶出画分ごとのＣＤＰ－コリン濃度および５’－ＣＭＰ濃度をＨＰＬＣ法により定量した結果を図２に示す。
　ＣＤＰ－コリンを含んだ分画を混合した結果、ＣＤＰ－コリン濃度が７８．２ｇ／Ｌの溶液を２８１ｍＬ得た。同溶液の５’－ＣＭＰ濃度は０．０３ｇ／Ｌ（対ＣＤＰ－コリン比０．０４％）であった。またＣＤＰ－コリンの回収率は９６．０％であった。
［実施例３］
　シチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する溶液としてＣＤＰ－コリンを７．１２ｇ／Ｌ、５’－ＣＭＰを０．４１ｇ／Ｌの濃度（対ＣＤＰ－コリン比５．８％）で含有する水溶液３．６４Ｌを調製し、ＯＨ－型のマラソンＡ（ダウケミカル社製）１５０ｍＬにＳＶ＝１．２５で通塔し吸着させた。次にカラム外側が２０℃となるよう調整し、ＳＶ＝１．１０で水を２２５ｍＬ通塔した。最後にカラムを２０℃に保持したままＳＶ＝０．８５で０．４５ｍｏｌ／Ｌ酢酸水溶液を１３５０ｍＬ通塔し、１４．８ｍＬずつ溶出液を取得した。ＣＤＰ－コリンを含んだ分画を混合した結果、ＣＤＰ－コリン濃度が６３．２ｇ／Ｌの溶液を４１５ｍＬ得た。同溶液の５’－ＣＭＰ濃度は０．３２ｇ／Ｌ（対ＣＤＰ－コリン比０．５１％）であった。またＣＤＰ－コリンの回収率は１００％であった。
［実施例４］
　シチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する溶液としてＣＤＰ－コリンを７．１２ｇ／Ｌ、５’－ＣＭＰを０．４１ｇ／Ｌ（対ＣＤＰ－コリン比５．８％）の濃度で含有する水溶液３．６４Ｌを調製し、ＯＨ－型のマラソンＡ（ダウケミカル社製）１５０ｍＬにＳＶ＝１．２５で通塔し吸着させた。次にカラム外側が３０℃となるよう調整し、ＳＶ＝１．１０で水を２２５ｍＬ通塔した。最後にカラムを３０℃に保持したままＳＶ＝０．８５で０．４５ｍｏｌ／Ｌ酢酸水溶液を１３５０ｍＬ通塔し、１４．６ｍＬずつ溶出液を取得した。溶出画分ごとのＣＤＰ－コリン濃度および５’－ＣＭＰ濃度をＨＰＬＣ法により定量した結果を図３に示す。ＣＤＰ－コリンを含んだ分画を混合した結果、ＣＤＰ－コリン濃度が７１．４ｇ／Ｌの溶液を３４９ｍＬ得た。同溶液の５’－ＣＭＰ濃度は０．０３ｇ／Ｌ（対ＣＤＰ－コリン比０．０４％）であった。またＣＤＰ－コリンの回収率は９６．１％であった。
［実施例５］
　シチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する溶液としてＣＤＰ－コリンを７．１３ｇ／Ｌ、５’－ＣＭＰを０．３８ｇ／Ｌ（対ＣＤＰ－コリン比５．３％）の濃度で含有する水溶液３．６４Ｌを調製し、ＯＨ－型のマラソンＡ（ダウケミカル社製）１５０ｍＬにＳＶ＝１．２５で通塔し吸着させた。次にカラム外側を６０℃まで加温し、ＳＶ＝１．１０で水を２２５ｍＬ通塔した。最後にカラムを６０℃に保持したままＳＶ＝０．８５で０．４５ｍｏｌ／Ｌ酢酸水溶液を１３５０ｍＬ通塔し、１４．８ｍＬずつ溶出液を取得した。ＣＤＰ－コリンを含んだ分画を混合した結果、ＣＤＰ－コリン濃度が７１．２ｇ／Ｌの溶液を３５４ｍＬ得た。同溶液の５’－ＣＭＰ濃度は０．０１ｇ／Ｌ（対ＣＤＰ－コリン比０．０１％）であった。またＣＤＰ－コリンの回収率は９７．１％であった。
［比較例３］
　シチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する溶液としてＣＤＰ－コリンを７．１０ｇ／Ｌ、５’－ＣＭＰを０．３８ｇ／Ｌ（対ＣＤＰ－コリン比５．４％）の濃度で含有する水溶液３．２０Ｌを調製し、ＯＨ－型のマラソンＭＳＡ（ダウケミカル社製）１５０ｍＬにＳＶ＝１．２５で通塔し吸着させた。次にカラム外側を４０℃まで加温し、ＳＶ＝１．１０で水を２２５ｍＬ通塔した。最後にカラムを４０℃に保持したままＳＶ＝０．８５で０．４５ｍｏｌ／Ｌのギ酸水溶液を１３５０ｍＬ通塔し、１４．７ｍＬずつ溶出液を取得した。ＣＤＰ－コリンを含んだ分画を混合した結果、ＣＤＰ－コリン濃度が６７．４ｇ／Ｌの溶液を３２３ｍＬ取得した。同溶液の５’－ＣＭＰ濃度は３．５ｇ／Ｌ（対ＣＤＰ－コリン比５．２％）であった。またＣＤＰ－コリンの回収率は９５．８％であった。
［実施例６］
　シチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する溶液としてＣＤＰ－コリンを７．１０ｇ／Ｌ、５’－ＣＭＰを０．３８ｇ／Ｌ（対ＣＤＰ－コリン比５．４％）の濃度で含有する水溶液３．２０Ｌを調製し、ＯＨ－型のマラソンＭＳＡ（ダウケミカル社製）１５０ｍＬにＳＶ＝１．２５で通塔し吸着させた。次にカラム外側を４０℃まで加温し、ＳＶ＝１．１０で水を２２５ｍＬ通塔した。最後にカラムを４０℃に保持したままＳＶ＝０．８５で０．４５ｍｏｌ／Ｌ酢酸水溶液を１３５０ｍＬ通塔し、１５．２ｍＬずつ溶出液を取得した。ＣＤＰ－コリンを含んだ分画を混合した結果、ＣＤＰ－コリン濃度が７０．８ｇ／Ｌの溶液を３０５ｍＬ得た。同溶液の５’－ＣＭＰ濃度は０．０５ｇ／Ｌ（対ＣＤＰ－コリン比０．０７％）であった。またＣＤＰ－コリンの回収率は９５．０％であった。
［実施例７］
　シチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する溶液としてＣＤＰ－コリンを７．０５ｇ／Ｌ、５’－ＣＭＰを０．３７ｇ／Ｌ（対ＣＤＰ－コリン比５．２％）の濃度で含有する水溶液２．９０Ｌを調製し、ＯＨ－型のマラソンＡ（ダウケミカル社製）１５０ｍＬにＳＶ＝１．２５で通塔し吸着させた。次にカラム外側を４０℃まで加温し、ＳＶ＝１．１０で水を２２５ｍＬ通塔した。最後にカラムを４０℃に保持したままＳＶ＝０．８５で０．１０ｍｏｌ／Ｌ酢酸水溶液を３Ｌ通塔し、２６．８ｍＬずつ溶出液を取得した。ＣＤＰ－コリンを含んだ分画を混合した結果、ＣＤＰ－コリン濃度が２２．６ｇ／Ｌの溶液を８８５ｍＬ得た。同溶液の５’－ＣＭＰ濃度は０．００３ｇ／Ｌ（対ＣＤＰ－コリン比０．０１％）であった。またＣＤＰ－コリンの回収率は９７．８％であった。
［実施例８］
　シチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する溶液としてＣＤＰ－コリンを７．２４ｇ／Ｌ、５’－ＣＭＰを０．３８ｇ／Ｌ（対ＣＤＰ－コリン比５．２％）の濃度で含有する水溶液２．１５Ｌを調製し、ＯＨ－型のＰＦＡ５２０Ｅ（ピュロライト社製）１３９ｍＬにＳＶ＝１．２５で通塔し吸着させた。次にカラム外側を４０℃まで加温し、ＳＶ＝１．１０で水を２０９ｍＬ通塔した。最後にカラムを４０℃に保持したままＳＶ＝０．８５で０．１０ｍｏｌ／Ｌ酢酸水溶液を１５００ｍＬ通塔し、１３．９ｍＬずつ溶出液を取得した。ＣＤＰ－コリンを含んだ分画を混合した結果、ＣＤＰ－コリン濃度が３１．０ｇ／Ｌの溶液を４８７ｍＬ得た。同溶液の５’－ＣＭＰ濃度は０．００５ｇ／Ｌ（対ＣＤＰ－コリン比０．０２％）であった。またＣＤＰ－コリンの回収率は９７．０％であった。
［実施例９］
　シチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する溶液としてＣＤＰ－コリンを７．０４ｇ／Ｌ、５’－ＣＭＰを０．３７ｇ／Ｌ（対ＣＤＰ－コリン比５．３％）の濃度で含有する水溶液１．００Ｌを調製し、ＯＨ－型のモノスフィアー７７（ダウケミカル社製）１００ｍＬにＳＶ＝１．２５で通塔し吸着させた。次にカラム外側を４０℃まで加温し、ＳＶ＝１．１０で水を１５０ｍＬ通塔した。最後にカラムを４０℃に保持したままＳＶ＝０．８５で０．４０ｍｏｌ／Ｌ酢酸水溶液を１５００ｍＬ通塔し、１５．０ｍＬずつ溶出液を取得した。ＣＤＰ－コリンを含んだ分画を混合した結果、ＣＤＰ－コリン濃度が２４．４ｇ／Ｌの溶液を２８５ｍＬ得た。同溶液の５’－ＣＭＰ濃度は０．００５ｇ／Ｌ（対ＣＤＰ－コリン比０．０２％）であった。またＣＤＰ－コリンの回収率は９８．８％であった。
　上記の結果をまとめたものを表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示すように、シチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する溶液を塩基性イオン交換樹脂と接触させて、該塩基性イオン交換樹脂にシチジン－５’－ジリン酸化合物を吸着させた後に炭素数２以上の有機酸を含有する水溶液を用いて、該塩基性イオン交換樹脂に吸着した該シチジン－５’－ジリン酸化合物を溶出させて溶出液を得た実施例１～９は、炭素数１の有機酸を含有する水溶液を用いてシチジン－５’－ジリン酸化合物を溶出させた比較例１～３と比較して、高純度のシチジン－５’－ジリン酸化合物を高効率で得られることがわかった。
［実施例１０］
　ＣＤＰ－コリンの有機化学合成法は既知の方法（K. Kikugawa, M. Ichino, Chem. Pharm. Bull., 19, 1011, 1971.）に従った。水２０ｍＬに対してＰｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ　Ｃａｌｃｉｕｍ　Ｓａｌｔ　Ｔｅｔｒａｈｙｄｒａｔｅ（東京化成工業社製）を６．６ｇ加えたのち溶解するまで８０℃で撹拌した。この溶液に対してシュウ酸二水和物（富士フイルム和光純薬工業社製試薬特級）を２．５２ｇ加えたのちに１０分間撹拌した。
　生じた白色沈殿物をろ取して得られたろ液を減圧下５０℃で濃縮した。さらにＤＭＦ（富士フイルム和光純薬社製有機合成用）を１６ｍＬ加えたのちに減圧下７０℃で濃縮した。０℃に冷却後、塩化ｐ－トルエンスルホニル（ナカライテスク社製）４．４ｇをＤＭＦ　６ｍＬに溶かした溶液を滴下し均一になるまで撹拌した。これに対してＣｙｔｉｄｉｎｅ　５’－Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅを２．０ｇ加え、室温で一晩撹拌した。再度０℃に冷却後に水を２５０ｍＬ加え、２８質量％アンモニア水（富士フイルム和光純薬社製試薬特級）によりｐＨ３．５に調整した。以上の操作を同時に２つ行い、両者を混合したのちに水を加えて５０５０ｍＬのシチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する溶液を得た。このときシチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する溶液は、ＣＤＰ－コリンを０．４８６ｇ／Ｌ、５’－ＣＭＰを０．０７１７ｇ／Ｌ（対ＣＤＰ－コリン比１４．８％）の濃度で含有していた。
　このようにして得たシチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する溶液２４５０ｍＬを、ＯＨ－型のＰＡ４１２（三菱ケミカル社製）１５０ｍＬにＳＶ＝１．２５で通塔し吸着させた。その後、カラム外側を６０℃まで加温し、ＳＶ＝１．１０で水を２２５ｍＬ通塔した。最後にカラムを６０℃に保持したままＳＶ＝０．８５で０．５０ｍｏｌ／Ｌプロピオン酸水溶液を１３５０ｍＬ通塔し、１５．２ｍＬずつ溶出液を取得した。ＣＤＰ－コリンを含んだ分画を混合した結果、ＣＤＰ－コリン濃度が１０．７ｇ／Ｌの溶液を１０６ｍＬ得た。同溶液の５’－ＣＭＰ濃度は０．００３ｇ／Ｌ（対ＣＤＰ－コリン比０．０３％）であった。またＣＤＰ－コリンの回収率は９５．３％であった。この結果から、本発明の製造方法は有機合成法で得たシチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する溶液にも適用できることが分かった。
［実施例１１］
　日本国特許第３３６９２３６号公報記載の方法によりＣＤＰ－コリン濃度が３０．８ｇ／Ｌの培養液を取得したのちに、硫酸にてｐＨを３．０に調整した。次に遠心分離（８０００ｒｐｍ、１０分間）により菌体を分離し、得られた上澄み液に水を添加することで、シチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する溶液としてＣＤＰ－コリンを１２．２ｇ／Ｌの濃度で含有する水溶液を１０．９Ｌ取得した。
　このシチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する溶液をＨ＋型の強酸性陽イオン交換樹脂８．４ＬにＳＶ＝０．２６、カラム外温を１０℃に保って通塔し吸着させた。続いて１０℃の冷水を通塔しＣＤＰ－コリンの溶出が開始したところで、ＯＨ－型のＰＡ４１２　９００ｍＬに連続的に通塔し吸着させた。その後、ＰＡ４１２のカラム外側を４０℃まで加温しＳＶ＝１．１０で水を２．７Ｌ通塔した。最後にカラムを４０℃に保持したままＳＶ＝０．８５で０．４７ｍｏｌ／Ｌ酢酸水溶液を５．４Ｌ通塔し、６１ｍＬずつ溶出液を取得した。
　ＣＤＰ－コリンを含んだ分画を混合した結果、ＣＤＰ－コリン濃度が４２．８ｇ／Ｌの溶液を２．８５Ｌ得た。同溶液の５’－ＣＭＰ濃度は０．０１ｇ／Ｌ以下（対ＣＤＰ－コリン比０．０２％以下）であった。またＣＤＰ－コリンの回収率は９１．７％であった。この結果から、本発明の製造方法は、培養法で得たシチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する溶液にも適用できることが分かった。
［実施例１２］
　ＣＤＰ－エタノールアミンの有機合成における反応式を下記に示す。下記反応式において、「ｒｔ」は室温をさす。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　化合物２の合成は公知の文献（H. Ngo, M. F. Dunn et al. Biochemistry, 46, 7713, 2007.；T. Tanaka yakugakuzasshi, 80, 439, 1959.）を参考に行った。水１８．９ｍＬに対して水酸化ナトリウム（富士フイルム和光純薬社製試薬特級）６．８０ｇを加え完全に溶解するまで撹拌した。この液を０℃まで冷却したのちに、ホスホエタノールアミン（東京化成工業社製）８．００ｇを加え溶解するまで撹拌した。これに対してＺ－クロリド（東京化成工業社製）７．９９ｍＬを滴下し、室温にて２時間撹拌した。さらに５０℃で１時間撹拌を行った後に、室温で一晩撹拌した。そこへ水１Ｌを加えて調製した液をＨ＋型の強酸性カチオン交換樹脂８５０ｍＬに通塔した。通塔後は水洗し、計５Ｌの溶出液を得た。この液を減圧下濃縮し５００ｍＬの粗生成液を取得した。
　ｐＨ４．５になるまでシクロヘキシルアミン（富士フイルム和光純薬社製和光特級）で中和したのちに、減圧下で溶媒を完全に留去した。析出した白色固体に水９８ｍＬとエタノール（富士フイルム和光純薬社製試薬特級）２８ｍＬを加え、６６℃にて完全に溶解させた。この液を室温まで徐冷し一晩静置した。析出した白色結晶を吸引ろ過により取得し、減圧下で一晩乾燥させた。収量は１２．２ｇであった。
　化合物３の合成は公知の文献（K. Oertell, C. E. McKenna, M. F. Goodman et al. Biochemistry, 53, 1842, 2014.）を参考に行った。ｔ－ＢｕＯＨ（富士フイルム和光純薬工業社製和光特級）１６．８ｍＬと水１６．８ｍＬの混合溶媒に対して、Ｃｙｔｉｄｉｎｅ　５’－Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ　９５３ｍｇとモルホリン（富士フイルム和光純薬社製和光特級）０．７７ｍＬを加え、還流しながら撹拌することで完全に溶解させた。またＮ，Ｎ’－Ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（富士フイルム和光純薬社製和光一級）１．８３ｇをｔ－ＢｕＯＨ　１９．３ｍＬに溶解させた。
　この液の８分の１を先のＣｙｔｉｄｉｎｅ　５’－Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ溶液に対して１５分に１回加え続けた。全量投入後さらに２．５時間還流させた。室温まで冷却した粗生成液に水を５０ｍＬ程度加えたのちに、生じた白色固体を吸引ろ過により取り除いた。さらに孔径０．４５μｍのメンブレンフィルタ－でろ液が清澄になるまでろ過を行った。減圧下で溶媒を留去したのちＤＭＦを加え再度留去し、精製することなく次の反応に使用した。
　化合物４の合成は公知の文献（T. Tanaka et al. yakugakuzasshi, 85, 863, 1965.）を参考に行った。水１７８ｍＬに対して先に合成した化合物２を２．００ｇ加え溶解させた。これをＨ＋型の強酸性カチオン交換樹脂に通塔することでシクロヘキシルアミンを除去したのちに水洗を行い、計３００ｍＬの溶出液を取得した。次に減圧下で水を留去したのち適量のＤＭＦを加え再度留去した。これに再度ＤＭＦを加え溶解させた。さらに別途合成した化合物３をＤＭＦに溶解させたのち両者を混合させて室温で一晩撹拌した。このとき、洗いこみを含めて１６．２ｍＬのＤＭＦを用いた。翌日６０℃に昇温後５時間撹拌し反応を完結させた。減圧下で溶媒を留去したのち水を加え再度留去し、精製することなく次の反応に使用した。
　ＣＤＰ－エタノールアミンの合成は公知の文献（T. Tanaka et al. yakugakuzasshi, 85, 863, 1965.）を参考に行った。先に合成した化合物４に対して水を１１．２ｍＬ加えて溶解させた。これを窒素雰囲気下へ置換したのちに５質量％　Ｐｄ／Ｃ（Ｎ．Ｅ．ＣＨＥＭＣＡＴ社製有機合成用ＳＴＤタイプ）を６３６ｍｇ加えて撹拌した。次に水素雰囲気下へ置換し、室温で４時間強く撹拌した。再度窒素雰囲気下へ置換したのちに、吸引ろ過で反応液からＰｄ／Ｃを除去した。さらに孔径０．４５μｍのメンブレンフィルタ－で残ったＰｄ／Ｃを除去した。このようにして得たろ液に水を加えて１０２０ｍＬのシチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する溶液を得た。このときシチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する溶液は、ＣＤＰ－エタノールアミンを１．１７ｇ／Ｌ、５’－ＣＭＰを０．０３３４ｇ／Ｌ（対ＣＤＰ－エタノールアミン比２．９％）の濃度で含有していた。
　以上より得たシチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する溶液１０００ｍＬを、ＯＨ－型のＰＡ４１２　１５０ｍＬにＳＶ＝１．２５で通塔し吸着させた。その後カラム外側を６０℃まで加温し、ＳＶ＝１．１０で水を２２５ｍＬ通塔した。最後にカラムを６０℃に保持したままＳＶ＝０．８５で０．５ｍｏｌ／Ｌプロピオン酸水溶液を１５００ｍＬ通塔し、１５．１ｍＬずつ溶出液を取得した。ＣＤＰ－エタノールアミンを含んだ分画を混合した結果、ＣＤＰ－エタノールアミン濃度が７．５０ｇ／Ｌの溶液を１５１ｍＬ得た。同溶液の５’－ＣＭＰ濃度は０．００８ｇ／Ｌ（対ＣＤＰ－エタノールアミン比０．１１％）であった。またＣＤＰ－エタノールアミンの回収率は９６．８％であった。この結果から、本発明の製造方法は、合成法で得たＣＤＰ－エタノールアミン溶液にも適用できることが分かった。
［比較例４］
　ＣＤＰ　ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ（Ｃｏｍｂｉ－Ｂｌｏｃｋｓ社製、Ｌｏｔ：Ｂ１２５６０）を６．６７ｇ／Ｌ、５’－ＣＭＰを０．４３ｇ／Ｌの濃度で含有する水溶液１４０ｍＬを調製し、ＯＨ－型のマラソンＡ（ダウケミカル社製）１００ｍＬにＳＶ＝１．２５で通塔し吸着させた。次にカラム外側を４０℃まで加温し、ＳＶ＝１．１０で水を１５０ｍＬ通塔した。最後にカラムを４０℃に保持したままＳＶ＝０．８５で０．５０ｍｏｌ／Ｌ酢酸水溶液を１５００ｍＬ通塔し、１５．０ｍＬずつ溶出液を取得した。いずれの分画にもＣＤＰ　ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔは含まれていなかった。この結果から、本発明の製造方法は、ＣＤＰ　ｔｒｉｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔには適用できないことが分かった。
［実施例１３］
　シチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する溶液としてＣＤＰ－コリンを７．０９ｇ／Ｌ、５’－ＣＭＰを０．４５ｇ／Ｌ（対ＣＤＰ－コリン比６．３％）の濃度で含有する水溶液１４０ｍＬを調製し、ＯＨ－型のマラソンＡ（ダウケミカル社製）１００ｍＬにＳＶ＝１．２５で通塔し吸着させた。次にカラム外側を４０℃まで加温し、ＳＶ＝１．１０で水を１５０ｍＬ通塔した。最後にカラムを４０℃に保持したままＳＶ＝０．８５で０．５０ｍｏｌ／Ｌ酢酸水溶液を１０００ｍＬ通塔し、１０．０ｍＬずつ溶出液を取得した。ＣＤＰ－コリンを含んだ分画を混合した結果、ＣＤＰ－コリン濃度が８．０６ｇ／Ｌの溶液を１１０ｍＬ得た。同溶液に５’－ＣＭＰは含まれず、ＣＤＰ－コリンの回収率は８９．３％であった。
　本発明を特定の態様を参照して詳細に説明したが、本発明の精神と範囲を離れることなく様々な変更および修正が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０２１年８月２６日付けで出願された国際出願（ＰＣＴ／ＪＰ２０２１／０３１４２９）に基づいており、その全体が引用により援用される。また、ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。

Claims (9)

  1. 　シチジン－５’－ジリン酸化合物の製造方法であって、以下の工程（１）及び（２）を含み、前記シチジン－５’－ジリン酸化合物がカチオン性置換基を有するシチジン－５’－ジリン酸化合物である、製造方法。
    （１）シチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する溶液を塩基性イオン交換樹脂と接触させて、前記塩基性イオン交換樹脂に前記シチジン－５’－ジリン酸化合物を吸着させる工程
    （２）炭素数２以上の有機酸を含有する水溶液を用いて、前記塩基性イオン交換樹脂に吸着した前記シチジン－５’－ジリン酸化合物を溶出させて溶出液を得る工程　
  2. 　前記工程（２）における前記溶出液に含有される前記シチジン－５’－ジリン酸化合物の濃度が、前記工程（１）における前記シチジン－５’－ジリン酸化合物を含有する溶液中の前記シチジン－５’－ジリン酸化合物の濃度と同等以上である、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記工程（２）において、前記塩基性イオン交換樹脂から前記シチジン－５’－ジリン酸化合物を溶出する温度が２０℃以上である、請求項１または２に記載の製造方法。
  4. 　前記炭素数２以上の有機酸が酢酸、プロピオン酸及び酪酸から選ばれる少なくとも１以上の有機酸である、請求項１～３のいずれか１項に記載の製造方法。
  5. 　前記工程（２）において、前記水溶液に含有される前記有機酸の濃度が０．１ｍｏｌ／Ｌ以上である、請求項１～４のいずれか１項に記載の製造方法。　
  6. 　前記カチオン性置換基を有するシチジン－５’－ジリン酸化合物が、シチジン－５’－ジリン酸とカチオン性置換基とが結合した化合物である、請求項１～５のいずれか１項に記載の製造方法。
  7. 　前記カチオン性置換基を有するシチジン－５’－ジリン酸化合物が、シチジン－５’－ジリン酸のβ－リン酸基にカチオン性置換基が結合した化合物である、請求項１～６のいずれか１項に記載の製造方法。
  8. 　前記炭素数２以上の有機酸が、炭素数２以上のカルボン酸である、請求項１～７のいずれか１項に記載の製造方法。
  9. 　前記カチオン性置換基を有するシチジン－５’－ジリン酸化合物が、シチジン－５’－ジリン酸コリンおよびシチジン－５’－ジリン酸エタノ－ルアミンから選ばれる少なくとも１である、請求項１～８のいずれか１項に記載の製造方法。
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