CN109593803A - (r)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷或其盐的制备方法 - Google Patents

(r)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷或其盐的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种(R)‑2‑(2,5‑二氟苯基)吡咯烷或其盐的制备方法，N‑保护吡咯酮与1,4‑二氟‑氯苯进行格氏反应，得到式3所示的化合物；在酸性条件下，式3所示的化合物脱保护，关环，得到式4所示的化合物或其盐；在酶催化下，式4所示的化合物或其盐选择性还原合成光学纯化合物(R)‑2‑(2,5‑二氟苯基)吡咯烷或其盐；所述的酶为重组亚胺还原酶，并利用葡萄糖和葡萄糖脱氢酶进行辅酶循环。本发明使用酶制剂替代化学手性试剂，解决了现有技术需要手性诱导剂的难题；相对于金属催化，酶催化反应具有成本低廉，反应选择性好，产品转化率和光学纯度高，反应过程操作简单，环境友好的特点，适用于大规模工业生产。

Description

(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷或其盐的制备方法
技术领域
本发明属于药物化学领域，涉及一种吡咯烷，具体来说是一种(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷或其盐的制备方法。
背景技术
在近几年发现的新型的针对酪氨酸受体激酶(TRK)的抑制剂中，很多抑制剂具有吡唑并[1,5-a]吡啶(ZL20128006957.8，作为原肌球蛋白受体激酶(Trk)抑制剂的取代的吡唑并[1,5-a]吡啶)和吡唑并[1,5-a]嘧啶(US2016/0137654A1，(S)-N-(5-(-2-(2,5-二氟苯基)-吡咯烷-1-基)-吡咯并[1，5-A]嘧啶-3-基)-3-羟基吡咯烷-1-甲酰胺硫酸氢盐的晶型)的系列结构，用于所有表达有原肌球蛋白受体激酶(tropomyosin receptor kinase，TRK)的肿瘤患者，这种抑制剂对TRK有很强的选择性，通过抑制TRK信号通路，可以抑制肿瘤的生长。对多种成人和儿童实体瘤，包括乳腺癌、结直肠癌、肺癌，胰腺癌、甲状腺癌、以及各种肉瘤有效。
现有技术中关于(R)-2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷或其盐，主要采用化学方法合成制备，如：
方法1，专利WO2013088256和WO2013088257公开了如下方法：
该路线第三步需要用到手性叔丁基亚磺酰胺，试剂成本较高。第四步需要用三乙基硼氢化锂，在生产当中不易操作，危险性较大(遇空气易燃)，试剂成本较高，收率较低。
方法2，专利WO2011006074，WO2010048314和WO2010033941公开了如下方法：
该路线第一步采用的是一锅法合成化合物8，操作繁琐，反应条件苛刻(需无水无氧，低温-78度)，产物的e.e.值只能达到93％，且原料成本较高。近来的生物催化技术显示出优势，无需低温和无水无氧操作、不用易燃易爆危险试剂、反应条件温和、水相反应，如文献ChemCatChem 2018,10,3236–3246，该文献采用亚胺还原酶合成手性吡咯烷类化合物。但该文献采用异丙醇为供氢体，随着反应的进行，反应体系会逐步累积副产物丙酮，一方面反应体系累积的丙酮抑制酶活性，降低反应速度，为此需要通气驱赶产生的副产物丙酮而增加能耗并增加处理挥发性丙酮及夹杂的异丙醇的环保费用，增加生产成本，另一方面，通气带入反应体系的氧气，对还原产生的胺产物产生氧化作用，生成副产物，影响产品的质量。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷或其盐的制备方法，所述的这种(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷或其盐的制备方法要解决现有技术中制备(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷或其盐的方法工艺复杂、反应条件苛刻、以及安全和环保的技术问题。
本发明提供了一种(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷或其盐的制备方法，包括如下步骤：
1)N-保护吡咯酮在格氏试剂参与下与1,4-二氟-氯苯进行格氏反应，得到式3所示的化合物；
N-保护基R为甲氧羰基、乙氧羰基、叔丁氧羰基、苄氧羰基、芴甲氧羰酰基、烯丙氧羰基、对甲氧基苄基或苄基；
2)在酸性条件下，式3所示的化合物脱保护，关环，得到式4所示的化合物或其盐；
所述的酸为无机酸或有机酸，具体指三氟乙酸或氢溴酸的醋酸溶液；X为无机酸或有机酸或无；
3)在酶催化下，利用葡萄糖为供氢体，采用辅因子，实现辅因子循环，将式4所示的化合物或其盐选择性还原合成光学纯化合物(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷或其盐；所述的酶为重组亚胺还原酶和葡萄糖脱氢酶的组合，所述辅因子为氧化型/还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或者氧化型/还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；
进一步的，所述的格氏试剂为二异丙基镁氯化锂。
进一步的，N-保护基团R为叔丁氧羰基。
进一步的，在步骤1)中，在氮气保护下，在一个第一容器中加入N-Boc保护吡咯烷酮，将N-Boc保护吡咯烷酮溶解于有机溶剂中，然后冷却到25度以下，加入2,5-二氟苯基镁氯化锂格氏试剂，所述的N-保护吡咯烷酮、2,5-二氟苯基镁氯化锂格氏试剂的物料摩尔比1：1.15-1.4，滴加完毕，再升至25-35度，维持25-35度下反应3-5小时，再TLC检测反应结束后，淬灭至反应液pH 6-7，再进行萃取、干燥，减压浓缩，即得式3所示的化合物粗品。再经过亚硫酸氢钠成盐纯化，即得式3所示的化合物。其中，反应开始时，式1所示的化合物与有机溶剂的质量体积比浓度为0.37-0.55g/mL,所述有机溶剂为四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、四氢呋喃和甲苯的混合溶液、乙二醇二甲醚或者乙二醇二乙醚或其混合物。
进一步的，在步骤2)中，在一个第二容器中，加入式3所示的化合物和无机酸或者有机酸中，所述的式3所示的化合物和无机酸或者有机酸的物料用量摩尔比为1：2.5-4.0，20-80℃下搅拌反应，薄板层析跟踪反应至式3所示的化合物消失，反应混合物降温在0-25℃下，调节pH值至7-10，再萃取、干燥、减压浓缩，得到式4所示的化合物游离碱。所述有机溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯、甲基叔丁基酮、甲苯、或醋酸异丙酯。
进一步的，在一个第三容器中，加入磷酸盐缓冲液，助溶剂，葡萄糖、式4所示的化合物、重组亚胺还原酶干粉、葡萄糖脱氢酶、和辅因子，所述的磷酸盐缓冲液，助溶剂，葡萄糖、葡萄糖脱氢酶、辅因子、重组亚胺还原酶干粉和式4所示的化合物的物料质量比为6.83-17.0：0.0-0.60：0.78-1.86：0.00115-0.0018：0.00014-0.00022：0.0022-0.0055：1，置于25～35℃水浴条件下反应16-24小时，TLC检测反应结束，调节至pH值大于7，再进行萃取、水洗、干燥，过滤，减压浓缩，得到(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷游离碱。其中，反应开始时，式4所示的化合物与磷酸盐缓冲液的质量体积比浓度为0.059-0.146g/mL,所述磷酸盐缓冲液的摩尔浓度为0.1–0.12mol/L,pH6.8-7.0,所述助溶剂为二甲亚砜或乙腈或二者组合，所述辅因子为：氧化型/还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+/NADPH)或者氧化型/还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+/NADH)。
进一步的，在步骤2)中，在一个第二容器中，加入式3所示的化合物，无机酸或者有机酸，所述的式3所示的化合物和无机酸或者有机酸的物料用量摩尔比为1：2.5-4.0，20-80度下搅拌反应，TLC薄板层析跟踪反应至式3所示的化合物消失，调节pH值为7-10，再进行萃取、干燥后过滤，滤液降温至0℃以下，滴加质量百分比浓度为80～98％的硫酸溶液，搅拌，抽滤析出的固体，滤饼以冰冷无水乙醇或甲基叔丁基醚或丙酮洗涤，减压干燥得式4所示的化合物其盐。
进一步的，在步骤3)中，在一个第三容器中，加入磷酸盐缓冲液、葡萄糖、式4所示的化合物、重组亚胺还原酶干粉、葡萄糖脱氢酶、和辅因子，所述的磷酸盐缓冲液、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶、辅因子、重组亚胺还原酶干粉和式4所示的化合物的物料质量比为6.83-17.0：0.78-1.86：0.00115-0.0018：0.00014-0.00022：0.0022-0.0055：1；置于25～35℃水浴条件下反应16-24小时，TLC检测反应结束，调节pH值至7以上，再进行萃取、水洗、干燥，过滤，滤液降温至-5度以下，滴加入质量百分比浓度为80～98％的硫酸溶液或者草酸或者D-乳酸，搅拌，过滤析出固体，减压去溶剂，得到(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷其盐，其中，反应开始时，式4所示的化合物与磷酸盐缓冲液的质量体积比浓度为0.059-0.146g/mL,所述磷酸盐缓冲液的摩尔浓度为0.1–0.12mol/L,pH 6.8-7.0,所述辅因子为：氧化型/还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+/NADPH)或者氧化型/还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+/NADH)。
进一步的，在步骤3)中，在一个第三容器中，加入化合物4游离碱，加入无水甲醇，降温至0℃，加入NaBH4，化合物4游离碱、无水甲醇、NaBH4，的物料质量比为1：2.62–3.0：0.25–0.3,,0℃搅拌30分钟后，升至室温搅拌1～3小时，加入冰水淬灭反应，用醋酸异丙酯萃取，合并醋酸异丙酯相，并用无水硫酸镁干燥，旋干除去溶剂，得到外消旋体的2,5-二氟苯基吡咯烷。
进一步的，所述的有机溶剂为四氢呋喃、二甲基四氢呋喃、四氢呋喃和甲苯的混合溶液、乙二醇二甲醚或者乙二醇二乙醚。
具体的，所述的无机酸为硫酸、磷酸、硝酸、氢氟酸、氢溴酸，所述的有机酸为草酸、乳酸、苹果酸、琥珀酸。
本发明与现有技术相比，其技术进步是显著的。与现有技术相比具有如下优点：
1)在步骤1)中，使用2-氯-1，4-二氟苯替代现有技术中的2-溴-1，4-二氟苯，采用二异丙基镁氯化锂格氏试剂，合成条件温和，降低原材料成本，提高原料原子经济性；
2)在步骤2)、步骤3)中，反应体系成盐采用硫酸、磷酸、硝酸、氢氟酸、氢溴酸等无机酸，或草酸、乳酸、苹果酸、琥珀酸等有机酸，操作方便，所得中间体稳定性好；
3)在步骤3)中，使用酶制剂替代现有技术中的化学手性试剂，可以在很大程度上解决现有技术需要手性诱导剂的难题；相对于金属催化，酶催化反应还具有成本低廉，反应选择性好，产品转化率和光学纯度高，反应过程操作简单，环境友好，适用于大规模工业生产等优势。采用葡萄糖为供氢体的酶催化反应，可以大大减少因使用有机溶剂的安全风险和环保处理费用，提升产品的质量，简化工业生产后处理步骤，为创制优质原料药和制剂提供了核心竞争力；
4)本发明的方法工艺安全，操作简便且收率和产品光学纯度都较高。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。反应所用的物质除重组亚胺还原酶外，均可通过商购获得。
实施例1重组亚氨还原酶的制备
从甘油管或转化平板将含有亚氨还原酶基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含(100ug/mL)氨苄青霉素抗性的4mL液体LB培养基中，于37℃下活化过夜12～16小时，将活化后得到的培养物以2％接种量转接含(100ug/mL)氨苄青霉素抗性的100mL液体LB培养基，于37℃、220rpm振荡培养至OD 600值达到约0.6，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至终浓度0.8mmol/L，于30℃继续培养过夜。离心(4℃,5000rpm,15min)收集细胞，用10mL磷酸缓冲液(100mM，pH7.0)悬浮细胞。细胞悬浮液置于冰浴中超声波破碎10分钟，再离心(4℃,12000rpm,15min)，上清液于-20℃预冻过夜，然后冷冻干燥34～40小时，即得冻干的粉状重组亚氨还原酶。
实施例2 (R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷(化合物5游离碱)的合成步骤1叔丁基(4-(2,5-二氟苯基)4-羰丁基)氨基甲酸酯(化合物3)的合成
在250mL烧瓶中，氮气保护下，加入N-Boc保护吡咯烷酮(18.5g,0.1mol),50mL四氢呋喃，冷却到25℃以下，滴加2,5-二氟苯基镁氯化锂格氏试剂(120mL,0.12mol,1M四氢呋喃溶液，通过二异丙基镁氯化锂格氏交换得到)，滴加完毕，升温至25℃，保持该温度搅拌反应5小时，TLC检测反应结束。滴加稀盐酸淬灭至反应液pH 6-7，混合液使用二氯甲烷萃取三次，每次60mL,合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到粗产品。将粗品加入到50mL亚硫酸氢钠的乙醇饱和溶液中，搅拌2小时，过滤析出的固体，将固体加入到稀盐酸溶液中，以二氯甲烷萃取三次，每次40mL，合并有机相，无水硫酸钠干燥过滤，滤液减压浓缩，得到产品即为叔丁基(4-(2,5-二氟苯基)4-羰丁基)氨基甲酸酯(化合物3)(白色固体24.1g，收率80.5％)。
所得产品核磁数据如下：
1H NMR,400MHz,CDCl3δ:δ7.55-7.25(m,3H),6.58(bs,1H),3.18(t,J＝7.1Hz,2H),2.93(t,J＝7.1Hz,2H),1.84(p,J＝7.0Hz,2H),1.38(s,9H).
13C NMR,100MHz,CDCl3δ:199.9,158.6(d,J＝254.9),157.8，155.6,130.5(d,J＝3.1),121.6(d,J＝9.7),118.6(d,J＝22.3),116.7,78.9,40.0,35.5,28.3,24.4.
LC-ESI-MS(m/z):[M+H]+300.13，计算值C15H19F2NO3：299.32
步骤2 5-(2,5-二氟苯)-3，4-二氢-2H-吡咯(化合物4游离碱)的合成
在100mL烧瓶中，加入叔丁基(4-(2,5-二氟苯基)4-羰丁基)氨基甲酸酯(化合物3)(14.97g，0.05mol)，三氟乙酸(14.86mL,22.8g,0.2mol)室温下搅拌反应，薄板层析跟踪反应至化合物3原料消失。反应混合物降温至0℃以下，用20％氢氧化钠溶液调节pH值至10，加入二氯甲烷50mL分层，水层用二氯甲烷萃取三次，每次50mL,合并有机相，无水硫酸钠干燥后过滤，减压浓缩，得到油状液体5-(2,5-二氟苯)-3，4-二氢-2H-吡咯(化合物4游离碱)7.85g，收率86.7％。
所得产品核磁数据如下：
1H NMR,400MHz,CD3ODδ:7.78(m,1H),7.43-7.34(m,2H),3.54(m,2H),2.12(dt,J＝10.3,2.0Hz,2H),1.97(dt,J＝15.8,7.9Hz,2H).
13C NMR,100MHz,CD3ODδ:176.2,158.2(d,J＝260.3),155.0(d,J＝10.3),124.0(d,J＝3.1),119.4(d,J＝23.5),118.4(d,J＝23.5),115.6,62.3,36.5,21.0.
步骤3 (R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷(化合物5游离碱)的合成
在100mL反应瓶中加入47.5mL(重量约47.5g)的0.1mol/L,pH 7.0的磷酸盐缓冲液，加入2.5mL DMSO(重量约2.7g)，加入5.4g葡萄糖,加入化合物4游离碱4.51g，加入25mg重组亚胺还原酶干粉、8mg葡萄糖脱氢酶、和1mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+),反应温度保持在25度，搅拌速度220rpm，反应24小时，反应液的pH通过pH滴定仪滴加饱和碳酸氢钠溶液调节，控制pH在7.0，TLC检测反应结束。加入饱和碳酸氢钠至pH值大于7，反应液经过硅藻土过滤除酶蛋白，滤液用醋酸异丙酯萃取三次，每次30mL，合并醋酸异丙酯相，经饱和食盐水洗，用无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压去溶剂,硅胶柱层析得微红色油状物(R)-2-(2，5-二氟苯基)四氢吡咯烷(化合物5游离碱)3.84g，收率83.8％，93.3％e.e.。
所得产品核磁数据如下：
1H NMR,400MHz,CDCl3δ:7.29(m,1H),7.02(m,1H)，6.96(m,1H),4.09(t,J＝7.8Hz，1H),3.16(m，1H)，3.04(m，1H)，2.21-2.30(m，1H)，1.77-1.95(m，3H)，1.57-1.67(m，1H)。
LC-ESI-MS(m/z)：184[M+H]+,计算值C10H11F2N：183.20。
实施例3 (R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷(化合物5硫酸氢盐)的合成步骤1叔丁基(4-(2,5-二氟苯基)4-羰丁基)氨基甲酸酯(化合物3)的合成
在250mL烧瓶中，氮气保护下，加入N-Boc保护吡咯烷酮(18.5g,0.1mol),2-甲基四氢呋喃(40mL)，冷却到25℃以下，滴加2,5-二氟苯基镁氯化锂格氏试剂(140mL,0.14mol,1M2-甲基四氢呋喃溶液，通过二异丙基镁氯化锂格氏交换得到)，滴加完毕，升至30℃，保持该温度搅拌反应4小时，TLC检测反应结束。滴加稀硫酸淬灭至反应液pH 6-7，混合液分层，水层使用2-甲基四氢呋喃萃取二次，每次50mL,合并有机相，降温至10度以下，滴加亚硫酸氢钠的饱和水溶液(40mL)，滴完，继续搅拌1小时，过滤析出的固体，将固体加入到稀硫酸溶液中，以2-甲基四氢呋喃萃取三次，每次30mL，合并有机相，无水硫酸镁干燥过滤，滤液减压浓缩，得到产品即为叔丁基(4-(2,5-二氟苯基)4-羰丁基)氨基甲酸酯(化合物3)(白色固体24.9g，收率83.2％)。
所得产品核磁数据如下：
1H NMR,400MHz,CDCl3δ:δ7.55-7.25(m,3H),6.58(bs,1H),3.18(t,J＝7.1Hz,2H),2.93(t,J＝7.1Hz,2H),1.84(p,J＝7.0Hz,2H),1.38(s,9H).
13C NMR,100MHz,CDCl3δ:199.9,158.6(d,J＝254.9),157.8，155.6,130.5(d,J＝3.1),121.6(d,J＝9.7),118.6(d,J＝22.3),116.7,78.9,40.0,35.5,28.3,24.4.
LC-ESI-MS(m/z):300.13[M+H]+，计算值C15H19F2NO3：299.32
步骤2 5-(2,5-二氟苯)-3，4-二氢-2H-吡咯(化合物4硫酸氢盐)的合成
在100mL烧瓶中，加入叔丁基(4-(2,5-二氟苯基)4-羰丁基)氨基甲酸酯(化合物3)(14.97g，0.05mol)，三氟乙酸(22.3mL,34.2g,0.3mol)，室温下搅拌反应，TLC薄板层析跟踪反应至化合物3原料消失。向反应体系缓慢滴加饱和碳酸氢钠溶液中和至pH 7，加入乙酸乙酯(50mL)分层，水层用乙酸乙酯萃取三次，每次(50mL),合并有机相，无水硫酸镁干燥后过滤，滤液降温至0℃以下，滴加95％硫酸(4.9g,0.05mol)，搅拌2小时，抽滤析出的固体，滤饼以冰冷无水乙醇洗涤，减压干燥得白色固体粉末化合物4的硫酸氢盐(11.67克，收率83.6％)。
化合物4游离碱的核磁数据如下：
1H NMR,400MHz,CD3ODδ:7.78(m,1H),7.43-7.34(m,2H),3.54(m,2H),2.12(dt,J＝10.3,2.0Hz,2H),1.97(dt,J＝15.8,7.9Hz,2H).
13C NMR,100MHz,CD3ODδ:176.2,158.2(d,J＝260.3),155.0(d,J＝10.3),124.0(d,J＝3.1),119.4(d,J＝23.5),118.4(d,J＝23.5),115.6,62.3,36.5,21.0.
步骤3 (R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷(化合物5硫酸氢盐)的合成
在100mL反应瓶中加入47.5mL(重量约47.5g)的0.1M pH 6.8的磷酸盐缓冲液，加入5.4g葡萄糖、加入5-(2,5-二氟苯)-3，4-二氢-2H-吡咯(化合物4硫酸氢盐)(6.95g，0.025mol)，加入15mg重组亚胺还原酶干粉、8mg葡萄糖脱氢酶、和1mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)，反应温度保持在30℃、220rpm反应18小时，反应液的pH通过pH滴定仪滴加20wt％NaOH水溶液调节，控制pH在6.8。TLC检测反应结束，加入20wt％NaOH水溶液，调节pH值至7以上，反应液经过硅藻土过滤除酶蛋白，滤液用二氯甲烷萃取三次，每次50mL，合并二氯甲烷相，经饱和食盐水洗，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液降温至-5度以下，滴加90％硫酸(2.73克,0.028mol)，搅拌3小时，过滤析出固体，减压去溶剂,得白色固体产物(R)-2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷硫酸氢盐(化合物5硫酸氢盐)6.6g，收率93.6％,95.5％e.e.[化合物5游离碱,(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的光学纯度]。
所得化合物5游离碱的产品核磁数据如下：
1H NMR,400MHz,CDCl3δ:7.29(m,1H),7.02(m,1H)，6.96(m,1H),4.09(t,J＝7.8Hz，1H),3.16(m，1H)，3.04(m，1H)，2.21-2.30(m，1H)，1.77-1.95(m，3H)，1.57-1.67(m，1H)。
LC-ESI-MS(m/z)：184[M+H]+,计算值C10H11F2N：183.20。
实施例4 (2,5-二氟苯基)吡咯烷外消旋体(化合物5外消旋体)的合成步骤1(4-(2,5-二氟苯基)4-羰丁基)氨基甲酸苄基酯(化合物3)的合成
在250mL烧瓶中，氮气保护下，加入N-Cbz保护吡咯烷酮(21.9g,0.1mol),40mL四氢呋喃和甲苯混合物(1：4，v/v)，冷却到25℃以下，滴加2,5-二氟苯基镁氯化锂格氏试剂(115mL,0.115mol,1M四氢呋喃溶液，通过二异丙基镁氯化锂格氏交换得到)，滴加完毕，升温至35℃，保持该温度搅拌反应3小时，TLC检测反应结束。滴加稀盐酸淬灭至反应液pH 6-7，混合液使用甲苯萃取三次，每次40mL,合并有机相，降温至10度以下，滴加亚硫酸氢钠的饱和水溶液(40mL)，滴完，继续搅拌1小时，过滤析出的固体，将固体加入到稀硫酸溶液中，以甲苯萃取二次，每次25mL，合并有机相，无水硫酸镁干燥过滤，滤液减压浓缩，得到产品即为(4-(2,5-二氟苯基)4-羰丁基)氨基甲酸苄基酯(化合物3)(白色固体26.2g，收率78.6％)。
所得产品核磁数据如下：
1H NMR,400MHz,CDCl3δ:δ7.55(m,1H),7.35-7.25(m,7H),6.88(bs,1H),5.08(s,2H),3.18(t,J＝7.1Hz,2H),2.93(t,J＝7.1Hz,2H),1.84(p,J＝7.0Hz,2H).
13C NMR,100MHz,CDCl3δ:199.9,158.6(d,J＝254.9),157.8，155.6,136.3,128.6,127.8,127.5,127,2,1271,121.6(d,J＝9.7),118.6(d,J＝22.3),116.7,68.9,40.0,35.5,24.4.
LC-ESI-MS(m/z):334.12[M+H]+，计算值C18H17F2NO3：333.33
步骤2 5-(2,5-二氟苯)-3，4-二氢-2H-吡咯(化合物4游离碱)的合成
在100mL烧瓶中，加入(4-(2,5-二氟苯基)4-羰丁基)氨基甲酸苄基酯(化合物3)(16.67g，0.05mol)，33wt％氢溴酸乙酸溶液(30ml，44.7g,0.32mol)，加热至80℃，搅拌反应，TLC薄板层析跟踪反应至化合物3原料消失。向反应体系缓慢滴加饱和碳酸钠溶液中和至pH 9，加入甲基叔丁基酮(30mL)分层，水层用甲基叔丁基酮萃取二次，每次30mL,合并有机相，无水硫酸镁干燥后过滤，减压浓缩得化合物4游离碱油状液体(6.97g，收率76.9％)。
核磁数据如下：
1H NMR,400MHz,CD3ODδ:7.78(m,1H),7.43-7.34(m,2H),3.54(m,2H),2.12(dt,J＝10.3,2.0Hz,2H),1.97(dt,J＝15.8,7.9Hz,2H).
13C NMR,100MHz,CD3ODδ:176.2,158.2(d,J＝260.3),155.0(d,J＝10.3),124.0(d,J＝3.1),119.4(d,J＝23.5),118.4(d,J＝23.5),115.6,62.3,36.5,21.0.
步骤3 (2,5-二氟苯基)吡咯烷外消旋体(化合物5外消旋体游离碱)的合成
在100mL反应瓶中,加入化合物4游离碱(9.06g,0.05mmol)，加入无水甲醇30mL(23.7g)，降温至0℃，加入NaBH4(2.28g,0.06mmol),0℃搅拌30分钟后，升至室温搅拌2小时，加入10mL冰水淬灭反应，用醋酸异丙酯萃取三次，每次20mL，合并醋酸异丙酯相，并用无水硫酸镁干燥30分钟，旋干除去溶剂，得到外消旋体的2,5-二氟苯基吡咯烷(化合物5外消旋体游离碱)为红色油状液体7.9克，收率86.3％。
核磁数据如下：
1H NMR,400MHz,CDCl3δ:7.29(m,1H),7.02(m,1H)，6.96(m,1H),4.09(t,J＝7.8Hz，1H),3.16(m，1H)，3.04(m，1H)，2.21-2.30(m，1H)，1.77-1.95(m，3H)，1.57-1.67(m，1H)。
LC-ESI-MS(m/z)：184[M+H]+,计算值C10H11F2N：183.20。
实施例5 (R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷(化合物5硫酸氢盐)的合成
步骤1叔丁基(4-(2,5-二氟苯基)4-羰丁基)氨基甲酸酯(化合物3)的合成
在2000mL烧瓶中，氮气保护下，加入N-Boc保护吡咯烷酮(92.6g,0.5mol),200mL乙二醇二甲醚，冷却到25℃以下，滴加2,5-二氟苯基镁氯化锂格氏试剂(700mL,0.7mol,1M乙二醇二甲醚溶液，通过二异丙基镁氯化锂格氏交换得到)，滴加完毕，升温至25℃，保持该温度搅拌反应5小时，TLC检测反应结束，减压回收乙二醇二甲醚，剩余物滴加稀硫酸淬灭至反应液pH 6-7，混合液使用乙酸乙酯萃取三次，每次250mL,合并有机相，降温至10度以下，滴加亚硫酸氢钠的饱和水溶液(200mL)，滴完，继续搅拌1小时，过滤析出的固体，将固体加入到稀硫酸溶液中，以乙酸乙酯萃取三次，每次200mL，合并有机相，无水硫酸镁干燥过滤，滤液减压浓缩，得到产品即为叔丁基(4-(2,5-二氟苯基)4-羰丁基)氨基甲酸酯(化合物3)(白色固体125.1g，收率83.6％)。
所得产品核磁数据如下：
1H NMR,400MHz,CDCl3δ:δ7.55-7.25(m,3H),6.58(bs,1H),3.18(t,J＝7.1Hz,2H),2.93(t,J＝7.1Hz,2H),1.84(p,J＝7.0Hz,2H),1.38(s,9H).
13C NMR,100MHz,CDCl3δ:199.9,158.6(d,J＝254.9),157.8，155.6,130.5(d,J＝3.1),121.6(d,J＝9.7),118.6(d,J＝22.3),116.7,78.9,40.0,35.5,28.3,24.4.
LC-ESI-MS(m/z):300.13[M+H]+，计算值C15H19F2NO3：299.32
步骤2 5-(2,5-二氟苯)-3，4-二氢-2H-吡咯(化合物4硫酸氢盐)的合成
在1000mL烧瓶中，加入叔丁基(4-(2,5-二氟苯基)4-羰丁基)氨基甲酸酯(化合物)(149.7g，0.5mol)，三氟乙酸(185.7ml,285.1g,2.5mol)，室温下搅拌反应，TLC薄板层析跟踪反应至化合物3原料消失。向反应体系缓慢滴加饱和碳酸氢钠溶液中和至pH 8，加入甲苯300mL分层，水层用甲苯萃取两次，每次100mL,合并有机相，无水硫酸镁干燥后过滤，滤液降温至-5度以下，滴加85％硫酸(57.64g,0.58mol)，搅拌2小时，过滤析出固体，滤饼以甲基叔丁基醚洗涤，减压去溶剂,得白色固体(化合物4硫酸氢盐)120.5g，收率86.4％。
化合物4游离碱的核磁数据如下：
1H NMR,400MHz,CD3ODδ:7.78(m,1H),7.43-7.34(m,2H),3.54(m,2H),2.12(dt,J＝10.3,2.0Hz,2H),1.97(dt,J＝15.8,7.9Hz,2H).
13C NMR,100MHz,CD3ODδ:176.2,158.2(d,J＝260.3),155.0(d,J＝10.3),124.0(d,J＝3.1),119.4(d,J＝23.5),118.4(d,J＝23.5),115.6,62.3,36.5,21.0.
步骤3 (R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷(化合物5硫酸氢盐)的合成
在5000mL反应瓶中加入2375mL(重量约2375g)的0.12mol/L,pH 7.0的磷酸盐缓冲液，加入260g葡萄糖,加入5-(2,5-二氟苯)-3，4-二氢-2H-吡咯(化合物4硫酸氢盐)139.63g，加入75mg重组亚胺还原酶干粉、20mg葡萄糖脱氢酶、和2mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)，反应温度保持在30℃、220rpm反应20小时，反应液的pH通过pH滴定仪滴加20wt％NaOH水溶液调节，控制pH在7.0。TLC检测反应结束，加入20％wtNaOH水溶液，调节pH值至7以上，反应液经过硅藻土过滤除酶蛋白，滤液用二氯甲烷萃取三次，每次500mL，合并二氯甲烷相，经饱和食盐水洗，用无水硫酸钠干燥，过滤，降温至-5度以下，将浓硫酸(49g，0.5mol)滴加至冷却的混合溶液中，搅拌3小时，过滤析出固体，丙酮洗涤，减压去溶剂,得白色固体产物(R)-2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷硫酸氢盐(化合物5硫酸氢盐)132.4g，收率93.8％,95.6％e.e.[化合物5游离碱,(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的光学纯度]。
化合物5游离碱的核磁数据如下：
1H NMR,400MHz,CDCl3δ:7.29(m,1H),7.02(m,1H)，6.96(m,1H),4.09(t,J＝7.8Hz，1H),3.16(m，1H)，3.04(m，1H)，2.21-2.30(m，1H)，1.77-1.95(m，3H)，1.57-1.67(m，1H)。
LC-ESI-MS(m/z)：184.1[M+H]+,计算值C10H11F2N：183.20。
实施例6 (R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷(化合物5草酸盐)的合成步骤1叔丁基(4-(2,5-二氟苯基)4-羰丁基)氨基甲酸酯(化合物3)的合成
在2000mL烧瓶中，氮气保护下，加入N-Boc保护吡咯烷酮(92.6g,0.5mol),200mL乙二醇二乙醚，冷却到25℃以下，滴加2,5-二氟苯基镁氯化锂格氏试剂(700mL,0.7mol,1M乙二醇二乙醚溶液，通过异丙基镁氯化锂格氏交换得到)，滴加完毕，升温至25℃，保持该温度搅拌反应5小时，TLC检测反应结束，减压回收乙二醇二乙醚，剩余物滴加稀硫酸淬灭至反应液pH 6-7，混合液使用醋酸异丙酯萃取三次，每次250mL,合并有机相，降温至10度以下，滴加亚硫酸氢钠的饱和水溶液(200mL)，滴完，继续搅拌1小时，过滤析出的固体，将固体加入到稀硫酸溶液中，以醋酸异丙酯萃取三次，每次200mL，合并有机相，无水硫酸镁干燥过滤，滤液减压浓缩，得到产品即为叔丁基(4-(2,5-二氟苯基)4-羰丁基)氨基甲酸酯(化合物3)(白色固体125.5g，收率83.7％)。
所得产品核磁数据如下：
1H NMR,400MHz,CDCl3δ:δ7.55-7.25(m,3H),6.58(bs,1H),3.18(t,J＝7.1Hz,2H),2.93(t,J＝7.1Hz,2H),1.84(p,J＝7.0Hz,2H),1.38(s,9H).
13C NMR,100MHz,CDCl3δ:199.9,158.6(d,J＝254.9),157.8，155.6,130.5(d,J＝3.1),121.6(d,J＝9.7),118.6(d,J＝22.3),116.7,78.9,40.0,35.5,28.3,24.4.
LC-ESI-MS(m/z):300.13[M+H]+，计算值C15H19F2NO3：299.32
步骤2 5-(2,5-二氟苯)-3，4-二氢-2H-吡咯(化合物4硫酸氢盐)的合成
在1000mL烧瓶中，加入叔丁基(4-(2,5-二氟苯基)4-羰丁基)氨基甲酸酯(化合物)(149.7g，0.5mol)，三氟乙酸(185.7ml,285.1g,2.5mol)，室温下搅拌反应，TLC薄板层析跟踪反应至化合物3原料消失。向反应体系缓慢滴加饱和碳酸氢钠溶液中和至pH 8-9，加入醋酸异丙酯300mL分层，水层用醋酸异丙酯萃取两次，每次300mL,合并有机相，无水硫酸镁干燥后过滤，滤液降温至-5度以下，将浓硫酸(49g，0.5mol)滴加至冷却的混合溶液中，搅拌3小时，过滤析出固体，冰冷丙酮洗涤，减压去溶剂,得白色固体产物(化合物4硫酸氢盐)120.6g，收率86.4％.
化合物4游离碱的核磁数据如下：
1H NMR,400MHz,CD3ODδ:7.78(m,1H),7.43-7.34(m,2H),3.54(m,2H),2.12(dt,J＝10.3,2.0Hz,2H),1.97(dt,J＝15.8,7.9Hz,2H).
13C NMR,100MHz,CD3ODδ:176.2,158.2(d,J＝260.3),155.0(d,J＝10.3),124.0(d,J＝3.1),119.4(d,J＝23.5),118.4(d,J＝23.5),115.6,62.3,36.5,21.0.
步骤3 (R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷(化合物5草酸盐)的合成
在5000mL反应瓶中加入2375mL(重量约2375g)的0.1mol/L,pH 7.0的磷酸盐缓冲液，加入250g葡萄糖，加入5-(2,5-二氟苯)-3，4-二氢-2H-吡咯(化合物4硫酸氢盐)139.6g，加入75mg重组亚胺还原酶干粉、20mg葡萄糖脱氢酶、和2mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)，反应温度保持在35℃、220rpm反应20小时，反应液的pH通过pH滴定仪滴加20wt％NaOH水溶液调节，控制pH在7.0。TLC检测反应结束，加入20wt％NaOH水溶液，调节pH值至7以上，反应液经过硅藻土过滤除酶蛋白，滤液用醋酸异丙酯萃取三次，每次300mL，合并醋酸异丙酯相，经饱和食盐水洗，用无水硫酸钠干燥，过滤，滤液降温至10度以下，加入草酸(40g)，搅拌4小时，过滤析出固体，减压去溶剂,得白色固体产物(R)-2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷草酸盐(化合物5草酸盐)117.8g，收率
86.2％,95.4％e.e.[化合物5游离碱,(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的光学纯度]。化合物5游离碱的核磁数据如下：
1H NMR,400MHz,CDCl3δ:7.29(m,1H),7.02(m,1H)，6.96(m,1H),4.09(t,J＝7.8Hz，1H),3.16(m，1H)，3.04(m，1H)，2.21-2.30(m，1H)，1.77-1.95(m，3H)，1.57-1.67(m，1H)。
LC-ESI-MS(m/z)：184[M+H]+,计算值C10H11F2N：183.20。
实施例7 (R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷(化合物5.D-乳酸盐)的合成
步骤1叔丁基(4-(2,5-二氟苯基)4-羰丁基)氨基甲酸酯(化合物3)的合成同实施例6步骤1.
步骤2 5-(2,5-二氟苯)-3，4-二氢-2H-吡咯(化合物4硫酸氢盐)的合成同实施例6步骤2.
步骤3 (R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷(化合物5.D-乳酸盐)的合成
在5000mL反应瓶中加入2375mL(重量约2375g)的0.1mol/L,pH 7.0的磷酸盐缓冲液，加入250g葡萄糖，加入5-(2,5-二氟苯)-3，4-二氢-2H-吡咯(化合物4硫酸氢盐)139.6g，加入75mg重组亚胺还原酶干粉、20mg葡萄糖脱氢酶、和2mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)，反应温度保持在35℃、220rpm反应20小时，反应液的pH通过pH滴定仪滴加20wt％NaOH水溶液调节，控制pH在7.0。TLC检测反应结束，加入20wt％NaOH水溶液，调节pH值至7以上，反应液经过硅藻土过滤除酶蛋白，滤液用醋酸异丙酯萃取三次，每次300mL，合并醋酸异丙酯相，经饱和食盐水洗，用无水硫酸钠干燥，过滤得滤液，加入D-乳酸(25克)，搅拌4小时，过滤析出固体，减压去溶剂,得白色固体产物(R)-2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷.D-乳酸盐(化合物5.D-乳酸盐)114.5g，收率83.8％,99.1％e.e.[化合物5游离碱,(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的光学纯度]。
化合物5游离碱的核磁数据如下：
1H NMR,400MHz,CDCl3δ:7.29(m,1H),7.02(m,1H)，6.96(m,1H),4.09(t,J＝7.8Hz，1H),3.16(m，1H)，3.04(m，1H)，2.21-2.30(m，1H)，1.77-1.95(m，3H)，1.57-1.67(m，1H)。
LC-ESI-MS(m/z)：184[M+H]+,计算值C10H11F2N：183.20。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷或其盐的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
1)N-保护吡咯酮在格氏试剂参与下与1,4-二氟-氯苯进行格氏反应，得到式3所示的化合物；
N-保护基R为甲氧羰基、乙氧羰基、叔丁氧羰基、苄氧羰基、芴甲氧羰酰基、烯丙氧羰基或者对甲氧基苄基或苄基；
2)在酸性条件下，式3所示的化合物脱保护，关环，得到式4所示的化合物或其盐；
所述的酸为无机酸或有机酸；X为无机酸或有机酸或无；
3)在酶催化下，利用葡萄糖为供氢体，采用辅因子，实现辅因子循环，将式4所示的化合物或其盐选择性还原合成光学纯化合物(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷或其盐；所述的酶为重组亚胺还原酶和葡萄糖脱氢酶的组合，所述辅因子为氧化型/还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或者氧化型/还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；
2.根据权利要求1所述的一种(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷或其盐的制备方法，其特征在于：所述的格氏试剂为二异丙基镁氯化锂。
3.根据权利要求1所述的一种(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷或其盐的制备方法，其特征在于：N-保护基团R为叔丁氧羰基。
4.根据权利要求1所述的一种(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷或其盐的制备方法，其特征在于：在步骤1)中，在氮气保护下，将制备好的2,5-二氟苯基镁氯化锂格氏试剂冷却至25℃以下。在一个第一容器中加入N-保护吡咯烷酮，将N-保护吡咯烷酮溶解于有机溶剂中，然后冷却到25度以下，加入2,5-二氟苯基镁氯化锂格氏试剂，所述的N-保护吡咯烷酮、2,5-二氟苯基镁氯化锂格氏试剂的物料摩尔比1：1.15-1.4，滴加完毕，再升至25-35度，维持25-35度下反应3-5小时，TLC检测反应结束后，淬灭至反应液pH 6-7，再进行萃取、干燥，减压浓缩，得式3化合物粗品，再经过亚硫酸氢钠成盐纯化，即得式3所示的化合物。其中，反应开始时，式4所示的化合物与有机溶剂的质量体积比浓度为0.37-0.55g/mL,所述有机溶剂为四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、四氢呋喃和甲苯的混合溶液、乙二醇二甲醚或者乙二醇二乙醚或其混合物。
5.根据权利要求1所述的一种(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷或其盐的制备方法，其特征在于：在步骤2)中，在一个第二容器中，加入式3所示的化合物和无机酸或者有机酸中，所述的式3所示的化合物和无机酸或者有机酸的摩尔比为1：2.5-4.0，20-80℃下搅拌反应，薄板层析跟踪反应至式3所示的化合物消失，反应混合物在0-25℃下，调节pH值至7-10，再有机溶剂萃取、干燥、减压浓缩去有机溶剂，得到式4所示的化合物游离碱。所述有机溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯、甲基叔丁基酮、甲苯、或醋酸异丙酯。
6.根据权利要求1所述的一种(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷或其盐的制备方法，其特征在于：在步骤2)、步骤3)中，X为无机酸或有机酸或无；所述的无机酸为硫酸、磷酸、硝酸、氢氟酸、氢溴酸，所述的有机酸为草酸、乳酸、苹果酸、琥珀酸。
7.根据权利要求1所述的一种(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷或其盐的制备方法，其特征在于：在步骤3)中，在一个第三容器中，加入磷酸盐缓冲液，助溶剂，葡萄糖、葡萄糖脱氢酶、辅因子、式4所示的化合物和重组亚胺还原酶干粉，所述的磷酸盐缓冲液，助溶剂，葡萄糖、葡萄糖脱氢酶、辅因子、重组亚胺还原酶干粉和式4所示的化合物的物料质量比为6.83-17.0：0.0-0.60：0.78-1.86：0.00115-0.0018：0.00014-0.00022：0.0022-0.0055：1，置于25～35℃水浴条件下反应16-24小时，TLC检测反应结束，调节至pH值大于7，再进行萃取、水洗、干燥，过滤，减压浓缩，得到(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷游离碱；其中，反应开始时，式4所示的化合物与磷酸盐缓冲液的质量体积比浓度为0.059-0.146g/mL,所述磷酸盐缓冲液的摩尔浓度为0.1–0.12mol/L,pH 6.8-7.0，所述助溶剂为二甲亚砜、乙腈中的任意一种或者两种的混合，所述辅因子为氧化型/还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+/NADPH)或者氧化型/还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+/NADH)。
8.根据权利要求1所述的一种(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷或其盐的制备方法，其特征在于：在步骤2)中，在一个第二容器中，加入式3所示的化合物，无机酸或者有机酸，所述的式3所示的化合物和无机酸或者有机酸的摩尔比为1：2.5-4.0，20-80℃下搅拌反应，TLC薄板层析跟踪反应至式3所示的化合物消失，调节pH值为7-10，再进行萃取、干燥后过滤，滤液降温至0℃以下，滴加质量百分比浓度为80～98％的硫酸溶液，搅拌，抽滤析出的固体，滤饼以冰冷无水乙醇或甲基叔丁基醚或丙酮洗涤，减压干燥得式4所示的化合物其盐。
9.根据权利要求1所述的一种(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷或其盐的制备方法，其特征在于：在步骤3)中，在一个第三容器中，加入磷酸盐缓冲液、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶、辅因子、式4所示的化合物和重组亚胺还原酶干粉，所述的磷酸盐缓冲液、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶、辅因子、重组亚胺还原酶干粉和式4所示的化合物的物料质量比为6.83-17.0：0.78-1.86：0.00115-0.0018：0.00014-0.00022：0.0022-0.0055：1；置于25～35℃水浴条件下反应16-24小时，TLC检测反应结束，调节pH值至7以上，再进行萃取、水洗、干燥，过滤，滤液降温至-5度以下，滴加入质量百分比浓度为80～98％的硫酸溶液或者草酸或者D-乳酸，搅拌，过滤析出固体，减压去溶剂，得到式5所示的(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷其盐；其中，反应开始时，式4所示的化合物与磷酸盐缓冲液的质量体积比浓度为0.059-0.146g/mL,所述磷酸盐缓冲液的摩尔浓度为0.1–0.12mol/L,pH 6.8-7.0，所述辅因子为氧化型/还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+/NADPH)或者氧化型/还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+/NADH)。
10.根据权利要求4所述的一种(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷或其盐的制备方法，其特征在于：所述的有机溶剂为四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、四氢呋喃和甲苯的混合溶液、乙二醇二甲醚或者乙二醇二乙醚或其混合物。
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