CN111057729A

CN111057729A - 一种(r)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷及其制备方法和应用

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Publication number: CN111057729A
Application number: CN201910477404.2A
Authority: CN
Inventors: 王舒; 丁少南; 程占冰; 田振华; 肖宇; 焦琦; 汪媚妮
Original assignee: Abiochem Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Yikelai Biotechnology Group Co ltd
Priority date: 2019-06-03
Filing date: 2019-06-03
Publication date: 2020-04-24
Anticipated expiration: 2039-06-03
Also published as: CN111057729B

Abstract

本发明公开了一种(R)‑2‑(2,5‑二氟苯基)吡咯烷及其制备方法和应用。所述的制备方法包括：在亚胺还原酶和还原型辅酶NADPH的存在下，将5‑(2,5‑二氟苯基)‑3,4‑二氢‑2H‑吡咯进行加氢还原反应，即可。利用本发明的制备方法制备得到的R型的2‑(2,5‑二氟苯基)吡咯烷，ee值至少可达94％，通过HPLC检测转化率至少可达84％；满足了(R)‑2‑(2,5‑二氟苯基)吡咯烷和larotrectinib的工业化生产需求；且本发明制备方法比化学方法成本更低，环境更加友好。

Description

一种(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物催化领域，具体涉及一种(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷及其制备方法和应用。

背景技术

larotrectinib(中文名拉罗替尼)是一种强效、口服、选择性原肌球蛋白受体激酶(TRK)抑制剂，当癌细胞中的TRK基因与其他基因之一融合时出现的遗传异常的产物。larotrectinib由Array BioPharma公司开发，由Loxo Oncology进行临床研究。2017年6月4日，一年一度的美国临床肿瘤学会(ASCO)年会上公布了larotrectinib的临床试验结果，试验结果显示：在17种不同类型晚期肿瘤患者(包括儿童和成年人)的临床试验中，使用larotrectinib治疗后76％的患者达到缓解，并且larotrectinib的缓解较持久，在开始治疗后79％的患者缓解可持续12个月。目前，larotrectinib有望成为第一个通过“篮子”临床试验(basket trial)获批的靶向药物。larotrectinib的具体化学结构式如下所示：

(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷，CAS号为：1218935-59-1，分子式为：C₁₀H₁₁F₂N，分子量为：183.20，化学结构式为：

该化合物是合成larotrectinib的关键中间体，目前larotrectinib的制备通常都是采用一定的工艺路线先合成(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷，然后将(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷进行后续合成，最终制得larotrectinib。

专利US2016/137654和US20170281632A1报道了以2-溴-1,4-二氟苯为原料经2步反应得到5-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2H-吡咯，5-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2H-吡咯再经金属催化剂不对称催化可制得(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷，转化率95％～100％，ee值75～85％。但是此方法使用贵重金属作为催化剂，成本较高，且存在重金属污染等环节问题，因此不适于工业大生产。

专利WO2009/140128和WO2013/88256报道了5-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2H-吡咯经硼氢化钠还原制得2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷，但是制得的2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷没有立体选择性，还需要进一步拆分，原料利用率低，成本较高。

因此，本领域急需开发新的(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的制备方法以尽量避免上述缺陷。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中制备(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的的方法存在的成本高、污染严重、以及立体选择性差等缺陷，提供一种(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷及其制备方法和应用。

本发明提供一种(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的制备方法，所述方法包括：在亚胺还原酶和还原型辅酶NADPH的存在下，将5-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2H-吡咯进行加氢还原反应，即可。

所述的亚胺还原酶可为本领域常规的亚胺还原酶，较佳地：所述的亚胺还原酶为氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.17所示的酶和/或氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.19所示的酶。

为保证所述加氢还原反应的有效进行，在所述加氢还原反应的体系中：

所述5-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2H-吡咯在所述加氢还原反应中的初始浓度较佳地为0.01～0.05g/mL，例如0.02g/mL、0.03g/mL或者0.04g/mL。

所述亚胺还原酶来自菌体，所述的菌体的用量与5-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2H-吡咯的用量的质量比较佳地为0.8:1～2.4:1，例如；1.92:1或者1.44:1。

所述亚胺还原酶的浓度较佳地为0.5～5U/mL，例如2.35U/mL、3.14U/mL或者3.92U/mL。

所述还原型辅酶NADPH的用量与所述5-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2H-吡咯的用量的质量比较佳地为1:200～1:10，优选1:100。

所述的加氢还原反应可根据本领域常规进行，较佳地，所述的加氢还原反应在水中进行。

本发明中，所述的加氢还原反应的反应体系的pH较佳地为6～7，更佳地为6.4～6.6，例如6.5。

本发明中，所述的加氢还原反应较佳地在20～50℃下进行，更佳地在28～40℃下进行，例如30℃或者35℃。

如上所述的制备方法还包括：在脱氢酶以及供氢体的存在下，将氧化型辅酶NADP⁺进行还原反应，得到所述的还原型辅酶NADPH即可。

所述的还原反应较佳地在水中进行。

所述还原反应的反应体系的pH较佳地为6～7，更佳地为6.4～6.6，例如6.5。

所述还原反应的反应体系的温度较佳地为20～50℃，更佳地为28～30℃。

其中，所述的脱氢酶较佳地为葡萄糖脱氢酶、醇脱氢酶或甲酸脱氢酶。

相对应地，所述的供氢体较佳地为葡萄糖、异丙醇或甲酸盐。

即：当所述的脱氢酶为醇脱氢酶时，所述的供氢体为异丙醇；当所述的脱氢酶为葡萄糖脱氢酶时，所述的供氢体为葡萄糖；当所述的脱氢酶为甲酸脱氢酶时，所述的供氢体为甲酸盐；其中，所述脱氢酶的形式可为菌泥、静息细胞、粗酶液以及纯酶液中的一种或是多种。方便起见，本发明所用脱氢酶的形式为菌泥，例如E.coli菌泥。

所述的加氢还原反应和所述的还原反应可分开进行，也可同时(同一反应体系)进行。在本发明一较佳的实施例中，如上所述的制备方法包括：在所述葡萄糖脱氢酶、所述葡萄糖、所述氧化型辅酶NADP⁺、所述亚胺还原酶的存在下，将5-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2H-吡咯进行加氢还原反应，即可。

较佳地，所述的氧化型辅酶NADP⁺的与所述5-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2H-吡咯的用量的质量比为：1:200～1:10，优选1:100。

较佳地，所述的葡萄糖的用量与所述的5-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2H-吡咯的摩尔比为2:1～5:1。

所述葡萄糖脱氢酶的菌泥用量与所述的葡萄糖的相对用量质量比较佳地为0.1:1～0.3:1；所述菌泥的酶活较佳地为7400U/g。

所述脱氢酶的浓度较佳地为74U/mL～550U/mL，例如148U/mL或者222U/mL。

本发明还提供根据如上所述的制备方法制备得到的(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷。

本发明还提供一种拉罗替尼的制备方法，其包括下述步骤：

(1)按照权如上所述的(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的制备方法制得(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷；

(2)利用步骤(1)制备得到的(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷制备所述拉罗替尼。

本发明还提供一种亚胺还原酶在制备(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷中的应用；较佳地，所述的亚胺还原酶为氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.17所示的酶和/或氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.19所示的酶。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

利用本发明的制备方法制备得到的R型的2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷，ee值至少可达94％，通过HPLC检测转化率至少可达84％；满足了(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷和larotrectinib的工业化生产需求；且本发明制备方法比化学方法成本更低，环境更加友好。

附图说明

图1为底物5-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2H-吡咯的HNMR图谱。

图2为底物5-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2H-吡咯的HPLC图谱。

图3为(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷标准品HPLC图谱。

图4为实施例6中IRED72酶催化反应完反应液的HPLC图谱。

图5为2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷消旋体手性HPLC图谱。

图6为(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷标准品手性HPLC图谱。

图7为实施例6中IRED72酶催化反应完产物的手性HPLC图谱。

图8为产物(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的HNMR图谱。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

pET28a购买自Novagen公司；NdeI酶、HindIII酶购买自Thermo Fisher公司，E.coli BL21(DE3)感受态细胞购买自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；NADP+、NADPH购买自深圳邦泰生物工程有限公司；5-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2H-吡咯为本公司实验室自行合成(核磁氢谱HNMR见图1)；(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷标准品购买自上海毕得医药科技有限公司得到。

产物的手性HPLC分析方法为：

色谱条件：Daicel Chiralpak IA，5μm，250*4.6mm；流动相：正己烷：乙醇：DEA＝99：5：0.1；检测波长：268nm；流速：0.8mL/min；柱温：25℃；进样体积：10μL。

底物转化率HPLC分析方法为：

色谱条件：Agilent Eclipse plus C18，3.5μm，150*4.6mm；流动相A：0.1％TFA水溶液，流动相B：0.1％TFA乙腈溶液；梯度洗脱：90％A+10％B(0min)，100％B(10min)，100％B(11min)，90％A+10％B(11.5min)，90％A+10％B(16min)；检测波长：210nm；流速：1mL/min；柱温：30℃；进样体积：5μL。

实施例1亚胺还原酶的制备

1.1亚胺还原酶基因的获得

根据编码NCBI上已报道的亚胺还原酶SEQ ID NO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19的基因序列SEQ ID NO.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20全基因合成亚胺还原酶基因。

各基因信息如下表1。

表1

1.2亚胺还原酶的制备

LB液体培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，用去离子水溶解后定容，121℃灭菌20min，待用。

合成的亚胺还原酶基因连接到pET28a载体上，酶切位点NdeI&HindIII，将酶连好的载体转化至宿主E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到含有IRED基因的工程菌株。

将含有亚胺还原酶基因的工程菌在经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/ml卡那霉素的5ml LB液体培养基中，37℃震荡培养12h。按2v/v％接种量转接至50ml同样含50μg/ml卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD₆₀₀达到0.8左右时，加入IPTG至其终浓度为0.1mM，25℃诱导培养16h。培养结束后，将培养液10000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体。

将收集到的菌体10g，用50mM pH6.0的磷酸缓冲液洗涤菌体两次，之后将菌体重悬于50mL 50mM pH6.0的磷酸缓冲液中，低温高压均质破碎，加入10％PEI絮凝使终浓度为2‰，4000rpm离心5min去除沉淀，得到的上清液为亚胺还原酶粗酶液，去离子水稀释10倍后测酶活。

底物溶液配制：1mL底物，5mL甲醇，25mL 200mM的pH 6.0的磷酸缓冲液，去离子水定容至100mL。

酶活测定方法：反应总体积为3mL。30℃将比色皿池预热5min，反应液也30℃水浴预热10min。取2870μL底物溶液加入到比色皿中，340nm处调零，加入30μL 25mM NADPH，充分混匀，加入100μL酶液，充分混匀。在波长340nm处记录吸光值的变化，每0.5min读取一个数值，记录5min的反应过程。以时间和吸光值做坐标曲线，得出每分钟吸光值变化值K。最终根据吸光值和NADPH浓度的变化，计算出酶活。酶活数据见表2。

表2

实施例2葡萄糖脱氢酶基因的获取和表达

根据来源于枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)168(NCBI登录号为NP_388275.1)的葡萄糖脱氢酶基因序列，全合成葡萄糖脱氢酶基因。

葡萄糖脱氢酶基因连pET28a，酶切位点NdeI&HindIII，将酶连好的载体转化至宿主E.coli BL21(DE3)感受态细胞，得到含有葡萄糖脱氢酶基因的工程菌株。将含有葡萄糖脱氢酶基因的工程菌在经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/ml卡那霉素的5ml LB液体培养基中，37℃震荡培养12h。按2v/v％接种量转接至50ml同样含50μg/ml卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，37℃震荡至OD₆₀₀达到0.8左右时，加入IPTG至其终浓度为0.5mM，18℃诱导培养16h。培养结束后，将培养液10000rpm离心10min，弃上清液，收集菌体，置于-20℃冰箱中保存，待用。

实施例3葡萄糖脱氢酶酶粗酶液的制备及酶活测定

将实施例2中收集到的菌体3g，用0.1M pH 7.0磷酸缓冲液洗涤菌体两次，之后将菌体重悬于15mL pH 7.0的磷酸缓冲液中，低温高压均质破碎，破碎液离心去除沉淀，得到的上清液为含重组葡萄糖脱氢酶粗酶液。

酶活检测方法：反应总体积为1mL。取光径为1.0cm的比色杯，分别加入880μL含有400mM葡萄糖的100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0),100μL 25mM的NADP⁺溶液，置于比色槽中，开启紫外分光光度计上的保温装置，25，保温10min，将制备的酶液去离子水稀释200倍，取20μL立即加入到比色杯中，混匀，在340nm波长下连续跟踪其吸光度的变化，连续测1min，每隔6s读取。以时间和吸光值做坐标曲线，得出每分钟吸光值变化值K。

酶活定义为：在上述条件下，每分钟产生1μmol NADPH所需要的酶量为1U，则酶活计算公式为如下：酶活力单位(U/mL)＝(K/e)*10000，其中e为NADPH在340nm处的毫摩尔消光系数。

按照上述方法检测得出，葡萄糖脱氢酶液活力为1480U/mL，以下实施例中所用到的葡萄糖脱氢酶粗酶液的制备方法均采用以上方法。

实施例4亚胺还原酶用于制备(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷

分别称取实施例1收集的各亚胺还原酶6g菌体，用30mL0.1M pH 7.5磷酸缓冲液溶解，超声破碎，离心去除沉淀，得各亚胺还原酶上清液粗酶液。

称取实施例2收集的6g GDH(Glucose Dehydrogenase，葡萄糖脱氢酶)菌体，用30mL 0.1M pH7.0磷酸缓冲液溶解，超声破碎，离心去除沉淀，得GDH上清液粗酶液。

15mL反应体系中，加入底物5-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2H-吡咯0.2g，葡萄糖1g，DMSO 1.5mL，NADP⁺5mg，葡萄糖脱氢酶0.5mL(1480U/mL)，亚胺还原酶酶液1mL，加入0.1MpH为7.5的磷酸缓冲液，28℃摇床200rpm反应，反应18h后，HPLC检测产物生成量，乙酸乙酯萃取并旋干产物测ee值。

表3

其中筛选出IRED71和IRED72是R立体选择性的。

实施例5IRED71和IRED72用于制备(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷

分别称取实施例1收集的6g IRED71和IRED72菌体用30mL0.1M pH 7.5磷酸缓冲液溶解，超声破碎得IRED71和IRED72粗酶液。

称取实施例2收集的3g GDH(Glucose Dehydrogenase，葡萄糖脱氢酶)菌体用15mL0.1M pH7.0磷酸缓冲液溶解，超声破碎得GDH粗酶液。

5.1底物浓度的选择

反应瓶中加入上述30mL IRED72和7.5mLGDH酶，NADP⁺0.025g，葡萄糖12.4g，0.1MpH 7.0磷酸缓冲液定容至50mL，不同量的底物5-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2H-吡咯流加到反应体系中，搅拌开始反应，底物5～6h全部滴加完全。恒温水浴锅控制温度30℃，20％碳酸钠溶液与1N(1N盐酸＝1mol/L盐酸)稀盐酸控制反应液pH在7.0范围。16h后HPLC检测转化率。结果如下表4所示。

表4

pH	温度(℃)	底物浓度(g/mL)	转化率(％)
				7.0	30	0.01	大于99％
7.0	30	0.02	大于99％
				7.0	30	0.03	大于99％
7.0	30	0.04	大于99％
				7.0	30	0.05	大于99％

以下实施例中选取0.05g/mL的底物浓度参与反应。

5.2pH条件的筛选

反应瓶中加入上述30mL IRED72和7.5mLGDH酶，NADP⁺0.025g，葡萄糖12.4g，0.1MpH 7.0磷酸缓冲液定容至50mL，底物5-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2H-吡咯2.5g流加到反应体系中，搅拌开始反应，底物5～6h全部滴加完全。恒温水浴锅控制温度30℃，20％碳酸钠溶液与1N稀盐酸控制反应液pH在6.0～7.5范围。16h后HPLC检测转化率。结果如下表5所示。

表5

pH	温度(℃)	底物浓度(g/mL)	转化率(％)
				6.0	30	0.05	大于99％
6.5	30	0.05	大于99％
				7.0	30	0.05	大于99％
7.5	30	0.05	75％

由此可知，pH在6.0～7.0，反应转化率都能达到99％，以下实施例选取pH 6.4～6.6作为反应pH条件。

5.3反应合适温度的筛选

反应瓶中加入上述30mL IRED72和7.5mLGDH酶，NADP⁺0.025g，葡萄糖12.4g，0.1MpH 7.0磷酸缓冲液定容至50mL，底物5-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2H-吡咯2.5g流加到反应体系中，搅拌开始反应，底物5～6h全部滴加完全。恒温水浴锅控制温度30～40℃，20％碳酸钠溶液与1N稀盐酸控制反应液pH在6.4～6.6范围。16h后HPLC检测转化率。结果如下表6所示。

表6

pH	温度(℃)	底物浓度(g/mL)	转化率(％)
				6.4～6.6	30	0.05	大于99％
6.4～6.6	35	0.05	73％
				6.4～6.6	40	0.05	71％

以下实施例中选择30℃进行反应。

5.4葡萄糖用量的选择

反应瓶中加入上述30mL IRED72和7.5mLGDH酶，NADP⁺0.025g，葡萄糖加入量从2eq到5eq，0.1M pH 7.0磷酸缓冲液定容至50mL，底物5-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2H-吡咯2.5g流加到反应体系中，搅拌开始反应，底物5～6h全部滴加完全。恒温水浴锅控制温度30℃，20％碳酸钠溶液与1N稀盐酸控制反应液pH在6.4～6.6范围。16h后HPLC检测转化率。结果如下表7所示。

表7

pH	温度(℃)	底物浓度(g/mL)	葡萄糖用量	转化率(％)
					6.4～6.6	30	0.05	5g(2eq)	大于99％
6.4～6.6	30	0.05	9.9g(4eq)	大于99％
					6.4～6.6	30	0.05	12.4g(5eq)	大于99％

因此实施例中选择2倍底物摩尔量的葡萄糖参与反应。

5.5辅酶NADP⁺的用量的筛选

反应瓶中加入上述30mL IRED72和7.5mL GDH酶，不同量的NADP⁺，葡萄糖5g，0.1MpH 7.0磷酸缓冲液定容至50mL，底物5-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2H-吡咯2.5g流加到反应体系中，搅拌开始反应，底物5～6h全部滴加完全。恒温水浴锅控制温度30℃，20％碳酸钠溶液与1N稀盐酸控制反应液pH在6.4～6.6范围。16h后HPLC检测转化率。结果如下表8所示。

表8

因此以下实施例中选择1％质量比的NADP⁺的添加量。

5.6GDH用量的筛选

反应瓶中加入上述30mL IRED72和不同量的GDH酶，NADP⁺0.025g，葡萄糖5g(2eq)，0.1M pH 7.0磷酸缓冲液定容至50mL，底物5-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2H-吡咯2.5g流加到反应体系中，搅拌开始反应，底物5～6h全部滴加完全。恒温水浴锅控制温度30℃，20％碳酸钠溶液与1N稀盐酸控制反应液pH在6.4～6.6范围。16h后HPLC检测转化率。结果如下表9所示。

表9

pH	温度(℃)	底物浓度(g/mL)	葡萄糖用量	GDH用量	转化率(％)
						6.4～6.6	30	0.05	5g(2eq)	7.5mL	99％
6.4～6.6	30	0.05	5g(2eq)	5.0mL	97％
						6.4～6.6	30	0.05	5g(2eq)	2.5mL	97％
6.4～6.6	30	0.05	5g(2eq)	1.3mL	42％

综合考虑酶的用量与转化率，以下实施例中选择2.5mL(0.5g菌泥)的GDH参与反应。

5.7IRED酶用量的筛选

反应瓶中加入上述不同量的IRED72和2.5mLGDH酶，NADP⁺0.025g，葡萄糖5g(2eq)，0.1M pH 7.0磷酸缓冲液定容至50mL，底物5-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2H-吡咯2.5g流加到反应体系中，搅拌开始反应，底物5～6h全部滴加完全。恒温水浴锅控制温度30℃，20％碳酸钠溶液与1N稀盐酸控制反应液pH在6.4～6.6范围。16h后HPLC检测转化率。结果如下表10所示。

表10

因此，选择30mL(6g菌泥)的IRED酶参与反应。

5.8IRED71和IRED72分别用于制备(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷

分别称取6g IRED71和IRED72菌泥用30mL0.1M pH 7.5磷酸缓冲液溶解，超声破碎得IRED71和IRED72粗酶液。

称取3g GDH菌泥用15mL0.1M pH7.0磷酸缓冲液溶解，超声破碎得GDH粗酶液。

反应瓶中加入上述30mLIRED72和2.5mLGDH酶，NADP⁺0.025g，葡萄糖5.0g，0.1MpH7.0磷酸缓冲液定容至50mL，底物5-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2H-吡咯2.5g流加到反应体系中，搅拌开始反应，底物5～6h全部滴加完全。恒温水浴锅控制温度28～30℃，20％碳酸钠溶液控制反应液pH在6.4～6.6范围内。16h后HPLC检测反应转化率大于99％时停止反应，检测图谱见图4。反应液用浓盐酸调节pH在1～2之间，升温至50℃，搅拌1h灭活，加入7.5g硅藻土，搅拌30min后抽滤，滤饼用10mL水打浆，过滤，合并水相。30％液碱调pH 10之间，50mL乙酸乙酯萃取水相，重复操作两次，合并有机相。减压蒸馏除乙酸乙酯得到产品(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷2.3g。产品核磁鉴定图谱如图8，收率91％。

上述16h后测定的反应液的HPLC图谱图4，其中，保留时间4.433为(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的峰，保留时间为3.681的5-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2H-吡咯已经检测不到。(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷标准品的HPLC图谱为图3，(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的保留时间为4.509；5-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2H-吡咯的HPLC图谱为图2，其保留时间为3.681。图4中(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的出峰时间与图3中标准品的出峰位置基本一致，因此该实施例5-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2H-吡咯已经反应完全，转化为2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷。

产物的ee值测定见图7，其中，保留时间7.430是(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷，保留时间8.266是(S)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷。2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷消旋体的手性HPLC图谱见图5，(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的HPLC图谱见图6，其保留时间为7.543，图7中(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的出峰位置与图6的基本一致，因此该实施例5-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2H-吡咯转化为R型的2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷，且ee值为97.6％。

反应瓶中加入上述30mL IRED71和2.5mL GDH酶，NADP⁺0.025g，葡萄糖5g，0.1M pH7.5磷酸缓冲液定容至50mL，底物5-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2H-吡咯2.5g流加到反应体系中，搅拌开始反应，底物5～6h全部滴加完全。恒温水浴锅控制温度28～30℃，20％碳酸钠溶液控制反应液pH在6.4～6.6范围内。16h后HPLC检测转化率84％，ee值94％。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海弈柯莱生物医药科技有限公司

<120> 一种(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷及其制备方法和应用

<130> P19010836C

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 293

<212> PRT

<213> Actinomadura madurae

<400> 1

Met Asp Asn Glu Thr Ala Pro Val Thr Val Ile Gly Leu Gly Leu Met

1 5 10 15

Gly Arg Ala Leu Ala Gly Ala Phe Leu Arg Ala Gly His Pro Thr Thr

20 25 30

Val Trp Asn Arg Thr Ala Ser Lys Ala Glu Gln Leu Val Ala Glu Gly

35 40 45

Ala Arg Leu Ala Pro Thr Val Gly Asp Ala Leu Glu Ala Ser Ser Val

50 55 60

Ala Ile Val Cys Leu Thr Asp Tyr Glu Val Val His Glu Leu Leu Gly

65 70 75 80

Ala Gly Glu Ile Lys Leu Asp Gly Thr Leu Leu Ile Asn Leu Thr Ser

85 90 95

Gly Asp Ser Thr Gln Ala Arg Glu Ala Ala Arg Trp Ala Glu Gln Arg

100 105 110

Gly Ala Arg Tyr Leu Asp Gly Ala Ile Met Ala Val Pro Pro Ala Ile

115 120 125

Gly Thr Ala Glu Ala Met Ile Leu Leu Ser Gly Pro Gln Ser Asp Phe

130 135 140

Glu Ser His Lys Ala Met Leu Gly Ala Leu Gly Gly Thr Thr Tyr Leu

145 150 155 160

Gly Ala Asp His Gly Leu Ala Ser Leu Tyr Asp Val Ala Gly Leu Ala

165 170 175

Met Met Trp Ser Ile Leu Asn Ala Trp Leu Gln Gly Ser Ala Leu Val

180 185 190

Gly Thr Ala Asp Val Asp Ala Ala Thr Phe Thr Pro Phe Ala Gln Gln

195 200 205

Leu Ala Ser Val Val Val Glu Trp Leu Pro Gly Tyr Ala Glu Gln Val

210 215 220

Asp Ser Gly Ser Phe Pro Ala Glu Val Ser Ala Leu Glu Thr Asp Val

225 230 235 240

Arg Ala Met Thr His Leu Ile Glu Glu Ser Glu Ala Val Gly Val Asn

245 250 255

Ala Glu Met Pro Arg Leu Phe Lys Ala Ile Ala Asp Arg Ser Ile Val

260 265 270

Ala Gly His Gly Gly Glu Gln Tyr Pro Val Leu Ile Glu Glu Phe Arg

275 280 285

Lys Pro Arg Asp Thr

290

<210> 2

<211> 879

<212> DNA

<213> Actinomadura madurae

<400> 2

atggataatg aaaccgcccc ggttaccgtg attggcctgg gcttaatggg tcgcgcactg 60

gcaggtgcct ttctgcgtgc cggccatccg accaccgtgt ggaatcgcac cgcaagcaaa 120

gccgaacaac tggttgccga aggtgcacgt ctggcaccga ccgtgggtga tgccctggag 180

gcaagcagcg tggccatcgt gtgcctgacc gactatgaag tggtgcatga actgctgggc 240

gccggcgaaa tcaaactgga tggcaccctg ctgatcaatc tgaccagcgg tgacagcacc 300

caagcccgtg aagcagcacg ctgggcagaa cagcgcggtg cacgttatct ggatggtgcc 360

attatggccg ttcctccggc cattggcacc gccgaagcca tgatcctgct gagcggtccg 420

cagagcgatt tcgagagcca taaagccatg ctgggtgcac tgggcggtac cacctatctg 480

ggcgccgatc atggcctggc cagtctgtat gatgtggcag gcctggccat gatgtggagc 540

attctgaatg cctggctgca gggtagcgca ctggttggca ccgccgatgt ggatgccgca 600

acctttaccc cgttcgcaca gcagctggca agcgtggtgg tggaatggct gccgggctat 660

gcagaacagg tggatagcgg cagctttccg gcagaagtga gcgccctgga aaccgatgtg 720

cgtgccatga cccacctgat cgaagaaagc gaagccgtgg gtgttaacgc agagatgccg 780

cgcctgttta aagccatcgc cgatcgcagt atcgttgccg gtcacggtgg tgaacagtac 840

ccggtgctga ttgaggagtt tcgcaaaccg cgtgatacc 879

<210> 3

<211> 296

<212> PRT

<213> Verrucosispora

<400> 3

Met Ala Ala Asp Ser Arg Ala Pro Val Thr Val Ile Gly Leu Gly Ala

1 5 10 15

Met Gly Ser Ala Leu Ala Arg Ala Phe Leu Ala Ala Gly His Pro Thr

20 25 30

Thr Val Trp Asn Arg Ser Pro Asp Lys Ala Asp Asp Leu Val Gly Gln

35 40 45

Gly Ala Val Arg Ala Ala Thr Val Ala Asp Ala Met Ser Ala Gly Asn

50 55 60

Leu Ile Val Ile Cys Val Leu Asp Tyr Arg Ala Met Arg Glu Ile Ile

65 70 75 80

Asp Ser Thr Gly His Ser Pro Ala Asp Arg Val Ile Val Asn Leu Thr

85 90 95

Ser Gly Thr Pro Gly Asp Ala Arg Ala Thr Ala Ala Trp Ala Gln Glu

100 105 110

Gln Gly Met Glu Tyr Ile Asp Gly Ala Ile Met Ala Thr Pro Ser Met

115 120 125

Ile Gly Ser Glu Glu Thr Leu Ile Phe Tyr Gly Gly Pro Gln Glu Val

130 135 140

Tyr Asp Ala His Ala Asp Thr Leu Arg Ser Ile Ala Gly Ala Gly Thr

145 150 155 160

Tyr Leu Gly Glu Glu Pro Gly Leu Pro Ser Leu Tyr Asp Val Ala Leu

165 170 175

Leu Gly Leu Met Trp Thr Thr Trp Ala Gly Phe Met His Ser Ala Ala

180 185 190

Leu Leu Ala Ser Glu Lys Val Pro Ala Ala Ala Phe Leu Pro Tyr Ala

195 200 205

Gln Ala Trp Phe Glu Tyr Val Ile Ser Pro Glu Val Pro Asn Leu Ala

210 215 220

Thr Gln Val Asp Thr Gly Ala Tyr Pro Asp Asn Asp Ser Thr Leu Gly

225 230 235 240

Met Gln Thr Val Ala Ile Glu His Leu Val Glu Ala Ser Arg Thr Gln

245 250 255

Gly Val Asp Pro Thr Leu Pro Glu Phe Leu His Ala Arg Ala Glu Gln

260 265 270

Ala Ile Arg Arg Gly His Ala Gly Asp Gly Phe Gly Ala Val Phe Glu

275 280 285

Val Leu Arg Ala Pro Ala Ala Gln

290 295

<210> 4

<211> 888

<212> DNA

<213> Verrucosispora

<400> 4

atggcagccg atagccgtgc cccggttacc gtgattggcc tgggtgcaat gggtagcgca 60

ctggcacgtg cctttctggc cgcaggccat ccgaccaccg tgtggaatcg tagcccggat 120

aaggcagatg atctggttgg tcagggtgcc gtgcgtgcag ccaccgttgc agatgccatg 180

agcgccggca atctgatcgt gatttgcgtt ctggactacc gcgccatgcg cgaaattatc 240

gatagcaccg gtcacagccc ggcagatcgc gtgatcgtta atctgaccag cggtaccccg 300

ggtgatgcac gtgcaaccgc agcctgggcc caggaacagg gtatggagta tatcgatggc 360

gccattatgg ccaccccgag catgattggc agtgaagaaa ccctgatctt ctacggcggc 420

ccgcaggaag tttatgatgc ccacgccgat accctgcgta gcattgcagg cgccggtacc 480

tatctgggcg aagaaccggg cctgccgagc ctgtatgatg ttgccctgct gggcctgatg 540

tggaccacct gggccggctt tatgcatagc gcagccctgc tggccagcga aaaagttccg 600

gccgccgcct ttctgccgta tgcacaggcc tggttcgaat acgtgatcag cccggaggtg 660

ccgaatctgg ccacccaggt tgataccggc gcctatccgg ataatgatag caccctgggc 720

atgcagaccg tggccattga acatctggtg gaagccagcc gtacccaggg tgttgatccg 780

accctgccgg agtttctgca tgcacgcgca gaacaggcaa tccgccgtgg tcatgccggc 840

gatggctttg gtgcagtgtt tgaggtgctg cgcgccccgg cagcacag 888

<210> 5

<211> 295

<212> PRT

<213> Streptomyces viridochromogenes

<400> 5

Met Asp Met Asn Ala Glu His Ser Ala Val Thr Val Leu Gly Leu Gly

1 5 10 15

Ser Met Gly Ser Ala Leu Ala Ala Ala Leu Leu Asp Arg Gly His Pro

20 25 30

Thr Thr Val Trp Asn Arg Ser Pro Asp Lys Ala Arg Ser Leu Ala Glu

35 40 45

Arg Gly Ala Arg Leu Ala Ala Thr Pro Gln Glu Ala Val Ala Ala Ser

50 55 60

Pro Leu Val Ile Ala Cys Val Leu Asp Tyr Glu Ala Leu Tyr Thr Val

65 70 75 80

Leu Asp Pro Val Ala Gly Asp Leu Ala Gly Arg Thr Leu Val Asn Leu

85 90 95

Thr Ser Gly Ser Pro Glu Gln Ala Gln Glu Ala Val Arg Trp Ala His

100 105 110

Ser His Gly Val Asp Tyr Leu Asp Gly Ala Ile Met Thr Thr Pro Pro

115 120 125

Gly Val Gly Asp Pro Ala Val Met Leu Leu Tyr Ser Gly Ser Arg Gln

130 135 140

Val Phe Glu Ala His Arg Pro Thr Leu Ala Thr Leu Gly Asp Pro Leu

145 150 155 160

His Leu Gly Thr Asp Pro Gly Leu Ala Ser Leu Tyr Asp Ala Ala Leu

165 170 175

Leu Gly Leu Met Trp Ser Thr Met Thr Gly Trp Leu His Gly Thr Ala

180 185 190

Leu Val Gly Thr Glu Gly Thr Pro Ala Thr Asp Phe Thr Pro Val Ala

195 200 205

Ile Arg Trp Leu Asp Thr Val Ala Arg Leu Leu Thr Thr Tyr Ala Pro

210 215 220

Gln Val Asp Ala Gly His Tyr Pro Gly Asp Asp Ala Thr Val Asp Val

225 230 235 240

Gln Ile Ala Ala Ile Asp His Leu Ile His Ala Ala Ala Ala Arg Gly

245 250 255

Ile Asp Asn Ala Leu Pro Glu Leu Leu Arg Ala Ala Met Glu Lys Ala

260 265 270

Gly Ala Gln Gly His Gly Lys Asp Ser Tyr Ala Ser Leu Ile Glu Val

275 280 285

Leu Arg Pro Ala Pro Arg Asp

290 295

<210> 6

<211> 885

<212> DNA

<213> Streptomyces viridochromogenes

<400> 6

atggatatga atgccgagca tagcgcagtg accgttctgg gtctgggtag tatgggtagc 60

gccctggccg cagcactgtt agatcgcggc catccgacca ccgtgtggaa ccgtagtccg 120

gataaagcac gcagcctggc agaacgtggt gcacgcctgg cagcaacacc gcaggaagcc 180

gttgccgcaa gcccgctggt gattgcctgc gtgctggact atgaagcact gtacaccgtt 240

ctggatccgg tggcaggtga cctggccggt cgtaccctgg ttaatctgac cagcggtagt 300

cctgaacagg cccaggaagc agttcgttgg gcccacagcc atggcgtgga ctacctggac 360

ggtgccatta tgaccacccc tccgggtgtg ggcgatcctg ccgttatgct gctgtatagc 420

ggtagccgcc aggtgtttga agcacatcgc ccgaccttag ccacactggg tgatccgctg 480

catctgggta ccgatccggg cctggcaagt ctgtacgacg ccgcactgct gggtctgatg 540

tggagcacca tgaccggctg gctgcatggt accgcactgg ttggcaccga aggtaccccg 600

gccaccgatt tcacaccggt ggcaattcgc tggctggata ccgtggcccg tctgctgaca 660

acctatgcac cgcaggttga tgcaggccat tatccgggtg acgatgcaac agtggatgtg 720

cagatcgcag ccatcgacca tctgattcat gcagccgcag cccgtggtat tgataacgcc 780

ctgccggagc tgttacgtgc cgccatggaa aaagcaggtg cccagggtca cggcaaggac 840

agctatgcaa gcctgatcga agtgctgcgt ccggcccctc gcgat 885

<210> 7

<211> 306

<212> PRT

<213> Streptomyces aurantiacus

<400> 7

Met Ser Ala Glu Arg His Ala Ser Ala Pro Ala Pro Val Thr Val Ile

1 5 10 15

Gly Leu Gly Asn Met Gly Thr Ala Leu Ala Ala Ala Phe Leu Glu Arg

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Gly His Pro Thr Thr Val Trp Asn Arg Ser Pro Glu Lys Ala Lys Ala

35 40 45

Leu Gly Glu Arg Gly Ala Arg Val Ala Ala Thr Pro Glu Glu Ala Val

50 55 60

Gly Ala Ala Asp Leu Val Ile Ala Cys Val Leu Asp His Asp Ala Leu

65 70 75 80

His Gly Val Leu Asp Pro Val Ala Asp Arg Leu Ala Gly Arg Thr Leu

85 90 95

Val Asn Val Thr Ser Gly Ser Pro Glu Gln Ala Arg Glu Phe Thr Lys

100 105 110

Trp Ala Asp Gly His Ala Val Ala Tyr Leu Asp Gly Ala Ile Met Thr

115 120 125

Thr Pro Pro Gly Val Gly Ser Pro Asp Met Met Phe Leu Tyr Ser Gly

130 135 140

Ser Glu Ala Ala Phe Thr Ala Gln Arg Gln Thr Leu Glu Val Leu Gly

145 150 155 160

Asp Pro Leu Tyr Val Gly Ala Asp Pro Gly Ala Ala Ser Leu Tyr Asp

165 170 175

Ala Ala Leu Leu Gly Leu Met Trp Ser Thr Phe Thr Gly Trp Leu His

180 185 190

Gly Thr Ala Leu Val Gly Ala Asp Gly Val Ala Ala Thr Asp Phe Thr

195 200 205

Ala Leu Ala Thr Arg Trp Leu Gly Gly Ala Val Ser Gly Phe Leu Ala

210 215 220

Arg Tyr Ala Ala Gln Val Asp Asp Gly Arg Tyr Pro Gly Asp Asp Ala

225 230 235 240

Thr Leu Asp Val Gln Ile Val Ala Ile Asp His Leu Ile His Ala Ala

245 250 255

Ala Asp Arg Gly Val Asp Asn Ala Leu Pro Glu Leu Leu Lys Ala Thr

260 265 270

Met Glu Arg Ala Lys Ala Ala Gly His Gly Gly Asp Ser Tyr Ala Ser

275 280 285

Val Ile Glu Val Leu Arg Gly Glu Arg Arg Ala Gly Val Pro Thr Ala

290 295 300

Ala His

305

<210> 8

<211> 918

<212> DNA

<213> Streptomyces aurantiacus

<400> 8

atgagcgccg agcgtcatgc aagcgcaccg gcaccggtta ccgtgattgg cctgggcaat 60

atgggtaccg ccctggcagc cgcatttctg gaacgcggcc atccgaccac cgtgtggaat 120

cgcagcccgg aaaaagccaa agcactgggt gaacgtggcg cacgcgttgc agcaaccccg 180

gaagaagcag tgggtgcagc cgatctggtg atcgcctgtg ttctggacca tgatgccctg 240

cacggtgtgc tggatccggt ggccgatcgc ttagcaggcc gcacactggt gaacgtgacc 300

agtggtagcc cggaacaggc ccgtgaattt accaaatggg cagatggcca tgccgtggcc 360

tatctggatg gtgccattat gaccaccccg ccgggtgttg gtagcccgga catgatgttt 420

ctgtacagcg gcagcgaagc agcctttaca gcccagcgtc agacactgga agtgctgggc 480

gatccgctgt atgtgggtgc agatcctggc gcagcaagcc tgtatgatgc agcactgctg 540

ggtctgatgt ggagcacctt taccggttgg ctgcatggta cagccctggt tggtgccgat 600

ggcgttgccg caaccgattt taccgcactg gccacccgtt ggctgggtgg tgccgttagc 660

ggtttcctgg cacgttatgc cgcccaggtt gatgacggtc gctatcctgg cgatgatgca 720

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gttccgaccg cagcccat 918

<210> 9

<211> 290

<212> PRT

<213> Saccharomonospora xinjiangensis

<400> 9

Met Thr His Asn Thr Asp Thr Pro Val Thr Ile Leu Gly Leu Gly Leu

1 5 10 15

Met Gly Gln Ala Leu Ala Gly Ala Phe Leu Lys Ala Gly His Pro Val

20 25 30

Thr Val Trp Asn Arg Thr Ala Ser Lys Ala Asp Arg Leu Val Ala Glu

35 40 45

Gly Ala Gln Pro Ala Pro Thr Val Gly Asp Ala Leu Lys Ala Gly Ala

50 55 60

Leu Thr Ile Val Cys Leu Thr Asp Tyr Gln Ala Val His Asp Val Leu

65 70 75 80

Asp Thr Gly Val Asn Leu Asp Gly Thr Thr Leu Val Asn Leu Thr Ser

85 90 95

Gly Asp Ser Ala Gln Ala Arg Asp Thr Ala Arg Trp Ala Trp Gln Arg

100 105 110

Gly Ala Arg Tyr Leu Asp Gly Ala Ile Met Ala Ile Pro Ser Ala Ile

115 120 125

Gly Thr Ala Glu Ala Val Ile Leu His Ser Gly Pro Lys Pro Asp Phe

130 135 140

Asp Ala His Ala Ala Thr Leu Gly Ala Leu Gly Thr Val Thr Tyr Leu

145 150 155 160

Gly Glu Asp Pro Gly Leu Ala Ser Leu Tyr Asp Val Ala Gly Leu Thr

165 170 175

Met Met Trp Ser Val Leu Asn Ala Trp Leu Gln Gly Thr Ala Leu Leu

180 185 190

Arg Ala Ala Gly Ile Asp Ala Ala Thr Phe Ala Pro Phe Ala Ala Gln

195 200 205

Ile Ala Thr Gly Val Ala Gly Trp Leu Pro Gly Tyr Ala Glu Gln Ile

210 215 220

Asp Asn Gly Ser Phe Pro Ala Glu Val Ser Ala Leu Glu Thr Asp Val

225 230 235 240

Arg Ala Met Lys His Met Val Gln Glu Asn Glu Thr Ala Gly Ile Asn

245 250 255

Ala Glu Leu Pro Lys Leu Ile Lys Ala Met Ala Asp Arg Ala Ile Ala

260 265 270

Ala Gly His Gly Lys Glu Gln Tyr Pro Val Leu Ile Glu Glu Phe Thr

275 280 285

Lys Pro

290

<210> 10

<211> 870

<212> DNA

<213> Saccharomonospora xinjiangensis

<400> 10

atgacccata acaccgatac ccctgtgaca attctgggcc tgggtctgat gggtcaggca 60

ctggccggtg ccttcctgaa agcaggccac ccggttaccg tgtggaaccg caccgccagt 120

aaagccgatc gtctggttgc cgaaggtgca cagccggcac cgaccgttgg cgatgcactg 180

aaagccggcg ccctgaccat cgtgtgtctg acagactacc aagccgttca tgacgttctg 240

gataccggtg tgaacctgga tggcaccacc ctggtgaatc tgaccagcgg cgatagtgcc 300

caggcccgtg ataccgcacg ttgggcatgg cagcgtggtg cacgctacct ggatggtgca 360

atcatggcaa ttccgagcgc cattggtacc gccgaagccg tgatcctgca tagtggtccg 420

aaaccggact ttgatgccca cgccgcaacc ttaggtgcac tgggcaccgt tacctatctg 480

ggtgaggatc cgggtctggc aagcctgtat gacgtggccg gtctgaccat gatgtggagt 540

gtgctgaatg cctggctgca gggcaccgca ttactgcgtg cagcaggcat cgacgcagcc 600

accttcgcac cgtttgccgc ccagattgca accggtgtgg caggttggct gcctggctat 660

gccgaacaga ttgataacgg cagcttcccg gccgaagtta gcgccctgga aaccgatgtt 720

cgcgccatga aacacatggt gcaggaaaac gagaccgccg gcatcaatgc cgagctgccg 780

aaactgatca aagcaatggc cgatcgcgcc attgcagccg gtcatggcaa agaacagtac 840

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<210> 11

<211> 289

<212> PRT

<213> Nocardia cyriacigeorgica

<400> 11

Met Thr Asn Asn Ala Thr Pro Val Ser Ile Leu Gly Leu Gly Leu Met

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Gly Gln Ala Leu Ala Arg Ala Phe Leu Lys Ala Gly His Pro Thr Thr

20 25 30

Val Trp Asn Arg Thr Pro Gly Lys Ala Asp Gln Leu Met Ala Glu Gly

35 40 45

Ala Gln Val Ala Pro Thr Ala Ala Glu Ala Ile Asp Ala Ser Ser Leu

50 55 60

Thr Val Ile Cys Val Ser Asp Tyr Pro Ala Met Tyr Glu Leu Leu Asp

65 70 75 80

Ala Ser Asp Leu Ala Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Thr Ser Gly Asp

85 90 95

Ser Ala Gln Ala Arg Gln Ala Ala Arg Trp Ala Glu Gln Arg Gly Ala

100 105 110

His Tyr Leu Asp Gly Ala Ile Met Ala Ile Pro Gln Ala Ile Gly Thr

115 120 125

Asp Asp Ala Val Ile Leu Ile Ser Gly Ala Gln Ala Asp Ala Asp Ala

130 135 140

His Arg Pro Thr Leu Glu Ala Leu Gly Thr Leu Thr Tyr Leu Gly Ala

145 150 155 160

Asp His Gly Leu Ala Ser Leu Tyr Asp Val Ala Gly Leu Ala Met Met

165 170 175

Trp Ser Val Leu Asn Ala Trp Leu Gln Gly Thr Ala Leu Leu Arg Thr

180 185 190

Ala Gly Val Asp Ala Ala Thr Phe Ala Pro Phe Ala Gln Gln Met Ala

195 200 205

Ala Gly Val Ala Gly Trp Leu Pro Gly His Ala Gln Glu Ile Asp Ala

210 215 220

Gly Ser Phe Ala Thr Glu Val Ala Ser Leu Asp Thr His Val Arg Thr

225 230 235 240

Met Asp His Leu Ile Glu Glu Cys Glu Ala Ala Gly Ile Asn Ala Glu

245 250 255

Leu Pro Arg Leu Ile Lys Ser Met Ala Asp Arg Ser Leu Ala Ala Gly

260 265 270

His Gly Ala Ala Ser Tyr Ser Val Leu Ile Glu Glu Phe Ala Lys Pro

275 280 285

Ala

<210> 12

<211> 867

<212> DNA

<213> Nocardia cyriacigeorgica

<400> 12

atgaccaata atgccacccc ggtgagcatt ctgggtctgg gtctgatggg tcaggcactg 60

gcccgcgcat ttctgaaagc cggccatccg accaccgtgt ggaatcgtac cccgggtaag 120

gcagatcagc tgatggccga aggtgcccag gtggcaccga cagcagcaga agccattgat 180

gcaagcagcc tgaccgtgat ctgcgtgagt gattacccgg ccatgtatga gctgctggat 240

gccagcgatc tggcaggcac caccctgctg aatctgacca gtggcgatag cgcacaggca 300

cgccaggcag cacgttgggc agagcagcgt ggcgcccatt atctggatgg cgccattatg 360

gccatcccgc aggccattgg caccgatgat gccgtgatcc tgattagcgg tgcacaggcc 420

gatgcagatg cccatcgccc gaccctggaa gccctgggta cattaaccta tctgggcgcc 480

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aatgcctggc tgcagggcac agcactgctg cgtaccgcag gtgtggatgc agcaacattt 600

gcaccgttcg cccagcagat ggcagcaggc gttgcaggtt ggttaccggg ccatgcacag 660

gaaattgacg caggcagctt tgccacagaa gttgccagcc tggataccca tgtgcgcacc 720

atggatcatc tgatcgaaga gtgcgaagcc gccggtatta atgccgagct gccgcgtctg 780

attaagagca tggcagatcg cagtctggca gccggccatg gcgcagcaag ttatagtgtg 840

ctgatcgaag aatttgccaa accggca 867

<210> 13

<211> 303

<212> PRT

<213> Streptomyces sp.

<400> 13

Met Thr His Gln Pro Ser Thr Arg Ser Gln Asp Asn Pro Val Thr Val

1 5 10 15

Ile Gly Leu Gly Pro Met Gly Leu Ala Leu Ala Glu Thr Leu Leu Lys

20 25 30

Asn Gly His Pro Thr Thr Val Trp Asn Arg Thr Pro Gly Arg Ala Arg

35 40 45

Asp Leu Val Ala Arg Gly Ala Arg Leu Ala Gly Ser Val Ala Asp Ala

50 55 60

Val Ala Ala Gly Pro Leu Thr Leu Val Cys Leu Lys Asp Tyr Pro Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Glu Val Leu Gly Arg Asp Asp Gly Ala Ser Ala Gly Arg Thr

85 90 95

Leu Val Asn Leu Asn Ser Gly Thr Pro Lys Glu Ala His Ala Ala Ala

100 105 110

Ser Trp Ala Ala Glu Arg Gly Val Ser Tyr Leu Asp Gly Ala Val Met

115 120 125

Val Pro Pro Pro Leu Val Gly Asp Pro Gly Ser Leu Phe Leu Phe Ser

130 135 140

Gly Pro Arg Glu Val Phe Asp Ala His Arg Ala Thr Leu Ala Ser Leu

145 150 155 160

Gly Asp Pro Arg Tyr Leu Gly Ser Asp Pro Gly Leu Ala Val Leu His

165 170 175

Asn Ala Ala Leu Leu Gly Leu Met Tyr Ala Thr Met Asn Gly Phe Leu

180 185 190

His Ala Thr Ala Leu Val Gly Ser Ala Gly Val Arg Ala Glu Glu Phe

195 200 205

Ala Asp Leu Ala Val Asn Arg Phe Leu Pro Thr Val Val Asp Ala Thr

210 215 220

Leu Ala Glu Gln Ala Pro Asp Leu Asp Val Gly Arg Tyr Pro Gly Glu

225 230 235 240

Leu Gly Thr Leu His Met Asn Leu Asn Ala Leu Glu His Ile Val Arg

245 250 255

Thr Cys Glu Glu Gln Gly Val His Thr Ala Gln Pro Arg Leu Met Arg

260 265 270

Asp Ile Ala Ala Gln Ala Ile Glu Gly Gly His Gly Gly Ser Asn Tyr

275 280 285

Leu Ala Val Phe Glu Val Phe Arg Lys Ala Ala Pro His Thr Arg

290 295 300

<210> 14

<211> 909

<212> DNA

<213> Streptomyces sp.

<400> 14

atgacccatc agccgagcac acgtagccaa gataatccgg tgaccgtgat tggcctgggt 60

cctatgggcc tggcactggc agaaacactg ctgaaaaacg gccatccgac caccgtgtgg 120

aatcgtaccc cgggtcgcgc ccgtgattta gttgcacgtg gcgcacgtct ggccggtagc 180

gttgcagatg ccgtggcagc aggcccgtta acactggtgt gcctgaagga ctatccgacc 240

ctgtatgaag tgctgggtcg tgatgatggc gccagcgcag gtcgcaccct ggtgaatctg 300

aatagcggca caccgaaaga ggcccatgca gccgcaagct gggcagcaga acgcggtgtg 360

agctatctgg atggtgccgt tatggttccg cctccgctgg tgggtgaccc gggtagtctg 420

tttctgttta gcggcccgcg cgaagtgttc gatgcacatc gtgccacact ggcaagcctg 480

ggcgatcctc gctatctggg cagcgatccg ggcctggcag ttctgcataa tgccgccctg 540

ctgggtctga tgtacgccac catgaatggc tttctgcatg ccaccgcact ggttggcagt 600

gccggtgttc gcgccgaaga atttgccgac ctggcagtga accgcttcct gccgacagtt 660

gtggatgcca ccctggcaga acaggcaccg gatctggatg tgggtcgcta tcctggcgag 720

ctgggcaccc tgcacatgaa tctgaatgcc ctggagcata ttgtgcgcac ctgtgaagaa 780

cagggcgtgc atacagccca gccgcgctta atgcgtgata ttgccgccca ggccattgaa 840

ggcggtcatg gtggcagcaa ttacctggcc gtgttcgaag tgtttcgcaa agccgcaccg 900

catacccgt 909

<210> 15

<211> 304

<212> PRT

<213> Paenibacillus mucilaginosus

<400> 15

Met Met Asn Lys Glu Gln Ala Gln Ile Arg Met Asn Pro Glu Asp Arg

1 5 10 15

Pro Pro Val Thr Val Val Gly Leu Gly Pro Met Gly Arg Ala Leu Ala

20 25 30

Gly Ala Phe Leu Arg Gly Gly His Pro Val Thr Val Trp Asn Arg Thr

35 40 45

Ala Gly Lys Ala Gly Glu Leu Val Ala Gln Gly Ala Phe Leu Ala Asp

50 55 60

Ser Leu Thr Ala Ala Ile Ser Ala Ser Pro Leu Val Ile Val Cys Val

65 70 75 80

Leu Asp Tyr His Val Val Arg Thr Leu Leu Gly Pro Glu Ala Gln Ala

85 90 95

Leu Gly Gly Arg Thr Leu Val Asn Leu Thr Ala Asp Thr Pro Ser Arg

100 105 110

Ser Arg Glu Met Ala Ala Trp Ala Ala Gly Tyr Gly Ile Asp Tyr Leu

115 120 125

Asp Gly Ala Ile Met Thr Pro Thr Pro Thr Ile Gly Ser Pro Ala Ala

130 135 140

Val Val Leu Tyr Ser Gly Pro Glu Ala Val Tyr Glu Ala Ser Arg Pro

145 150 155 160

Ala Leu Ala Ala Ile Gly Gly Ser Ala Ser Tyr Leu Gly Thr Asp Pro

165 170 175

Gly Arg Ala Ala Ala Tyr Asp Val Ala Leu Leu Asp Val Phe Trp Thr

180 185 190

Ala Met Ser Gly Tyr Thr His Ala Leu Ala Leu Ala Arg Ala Glu Arg

195 200 205

Ile Ala Pro Arg Glu Phe Ala Ala Tyr Ala Lys Gly Ile Ala Ala Ile

210 215 220

Leu Pro Asp Ile Met Glu Tyr Met Ala Ala Phe Val Glu Glu Gly His

225 230 235 240

His Pro Gly Asp Ala Ser Asn Leu Asn Ser Ala Ala Ala Gly Met Asp

245 250 255

His Ile Ile Gln Ala Ser Glu Asp His Gly Met Glu Ala Gly Val Met

260 265 270

Lys Ala Ala Arg Ala Leu Val Gln Arg Ala Leu Asp Ala Gly His Gly

275 280 285

Asn Asp Gly Phe Ser Trp Leu Thr Gly Leu Leu Glu Lys Asp Ser Val

290 295 300

<210> 16

<211> 912

<212> DNA

<213> Paenibacillus mucilaginosus

<400> 16

atgatgaaca aagaacaggc ccagatccgc atgaatccgg aagatcgccc gccggtgacc 60

gttgtgggtc tgggtccgat gggtcgcgca ttagccggtg catttctgcg cggtggtcat 120

ccggttaccg tttggaatcg caccgccggt aaagccggcg aactggttgc acagggtgcc 180

tttctggcag atagcctgac cgccgcaatt agcgcaagcc cgctggttat cgtgtgcgtg 240

ctggattatc acgtggtgcg taccctgctg ggtccggaag cacaagccct gggtggtcgc 300

accctggtga atctgaccgc agataccccg agccgcagtc gtgaaatggc cgcatgggca 360

gccggctatg gtatcgacta tctggatggc gccatcatga caccgacccc gacaattggt 420

agtccggccg ccgtggtgct gtatagtggt ccggaagccg tgtatgaagc aagccgcccg 480

gcactggcag caattggtgg cagtgccagt tatctgggta ccgatccggg tcgtgcagca 540

gcctatgacg ttgccctgct ggatgtgttt tggacagcca tgagcggcta tacacacgca 600

ctggcactgg cccgtgcaga acgtattgcc ccgcgtgaat ttgcagccta tgccaagggc 660

atcgccgcca tcctgccgga tattatggag tacatggccg cctttgtgga agaaggtcat 720

catccgggtg acgccagcaa tctgaatagc gcagccgccg gcatggatca catcattcag 780

gccagcgaag atcatggcat ggaagccggc gtgatgaagg cagcccgtgc actggttcag 840

cgcgcactgg atgcaggtca cggtaatgat ggtttcagct ggctgaccgg tctgctggaa 900

aaagatagcg tt 912

<210> 17

<211> 309

<212> PRT

<213> Paenibacillus elgii

<400> 17

Met Asn Ser Ser Asn Pro Lys Asp Asn Ile Ser Val Gly Ser Ala Ser

1 5 10 15

Thr Ala Thr Asn Arg Lys Ser Val Thr Val Met Gly Leu Gly Pro Met

20 25 30

Gly Gln Ala Met Ala Gly Val Phe Leu Glu Ser Gly Tyr Glu Val Thr

35 40 45

Val Trp Asn Arg Thr Ala Ser Lys Ala Asp Glu Leu Val Ala Lys Gly

50 55 60

Ala Ile Arg Ala Ser Thr Val Asp Glu Ala Leu Ala Ala Asn Glu Leu

65 70 75 80

Val Ile Leu Ser Leu Thr Asp Tyr Asp Ala Met Tyr Ala Ile Leu Glu

85 90 95

Pro Ser Ser Ala Asn Leu Ser Gly Lys Val Leu Val Asn Leu Ser Ser

100 105 110

Asp Thr Pro Glu Lys Val Arg Glu Ala Ala Lys Trp Leu Ala Asp Arg

115 120 125

Gly Ala Arg His Val Thr Gly Gly Val Gln Val Pro Pro Ser Gly Ile

130 135 140

Gly Lys Pro Glu Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ser Gly Pro Arg Glu Val Phe

145 150 155 160

Glu Ala His Arg Glu Ser Leu Glu Ile Leu Thr Gly Thr Asp Tyr Arg

165 170 175

Gly Glu Asp Pro Gly Leu Ala Met Leu Tyr Tyr Gln Ile Gln Met Asp

180 185 190

Ile Phe Trp Thr Ser Met Leu Ser Tyr Leu His Ala Leu Ala Val Ala

195 200 205

Lys Ala Asn Gly Ile Thr Ala Lys Gln Phe Leu Pro Tyr Ala Ser Ala

210 215 220

Thr Leu Ser Ser Leu Pro Gln Phe Val Glu Phe Tyr Thr Pro Arg Leu

225 230 235 240

Asp Glu Gly Lys His Pro Gly Asp Val Asp Arg Leu Ala Met Gly Leu

245 250 255

Ala Ser Val Glu His Ile Val His Thr Thr Glu Asp Ala Gly Ile Asp

260 265 270

Thr Thr Leu Pro Ala Ala Val Leu Glu Ile Phe Lys Arg Gly Met Glu

275 280 285

Asn Gly His Ala Gly Asp Ser Phe Thr Ser Leu Ile Glu Ile Phe Lys

290 295 300

Asn Pro Val Arg Ser

305

<210> 18

<211> 927

<212> DNA

<213> Paenibacillus elgii

<400> 18

atgaacagca gcaatccgaa ggataacatc agcgtgggta gcgccagcac cgccaccaat 60

cgcaaaagtg tgaccgtgat gggtctgggt ccgatgggtc aggcaatggc aggcgttttt 120

ctggagagcg gctatgaagt gaccgtttgg aatcgtaccg ccagcaaagc cgatgaactg 180

gttgccaaag gcgcaatccg tgcaagtacc gttgatgaag ccctggccgc aaacgaactg 240

gtgatcctga gcctgaccga ttacgacgcc atgtacgcca ttctggaacc gagcagcgca 300

aatctgagcg gcaaagtgct ggtgaatctg agtagcgaca caccggaaaa ggtgcgcgaa 360

gccgccaaat ggctggccga tcgcggtgca cgtcatgtga ccggcggtgt gcaagttccg 420

ccgagcggta tcggtaagcc ggaaagctac acctattaca gcggcccgcg cgaagttttt 480

gaagcccacc gtgaaagcct ggagattctg accggtaccg attatcgcgg tgaggatccg 540

ggtctggcca tgctgtatta ccagatccag atggacatct tctggaccag catgctgagc 600

tatctgcatg ccctggccgt tgcaaaagcc aacggtatca ccgccaaaca atttctgccg 660

tacgccagtg ccaccctgag tagcctgccg cagttcgtgg agttctatac accgcgtctg 720

gatgagggta aacatccggg cgacgttgat cgtctggcca tgggcctggc aagtgtggag 780

catatcgtgc ataccaccga agatgccggc attgatacaa ccctgccggc agccgtgctg 840

gagatcttta agcgcggtat ggagaatggc catgcaggcg atagcttcac aagcctgatt 900

gagatcttca agaacccggt gcgcagc 927

<210> 19

<211> 310

<212> PRT

<213> Paenibacillus mucilaginosus

<400> 19

Met Lys Ser Ser Asn Arg Ser Glu Asn Ile Arg Val Gly Thr Glu Asn

1 5 10 15

Thr Val Gly Lys Ser Lys Ser Val Thr Val Ile Gly Leu Gly Pro Met

20 25 30

Gly Lys Ala Met Ala Ala Ala Phe Leu Glu His Gly Tyr Lys Val Thr

35 40 45

Val Trp Asn Arg Thr Ser Asn Lys Ala Asp Glu Leu Ile Thr Lys Gly

50 55 60

Ala Val Arg Ala Ser Thr Val His Glu Ala Leu Ala Ala Asn Glu Leu

65 70 75 80

Val Ile Leu Ser Leu Thr Asp Tyr Asp Ala Met Tyr Thr Ile Leu Glu

85 90 95

Pro Ala Ser Glu Asn Leu Ser Gly Lys Val Leu Val Asn Leu Ser Ser

100 105 110

Asp Thr Pro Asp Lys Ala Arg Glu Ala Ala Lys Trp Leu Ala Asn Arg

115 120 125

Gly Ala Gly His Ile Thr Gly Gly Val Gln Val Pro Pro Ser Gly Ile

130 135 140

Gly Lys Pro Glu Ser Ser Thr Tyr Tyr Ser Gly Pro Lys Glu Val Phe

145 150 155 160

Glu Ala Asn Lys Glu Thr Leu Glu Val Leu Thr Gly Thr Asp Tyr Arg

165 170 175

Gly Glu Asp Pro Gly Leu Ala Ala Leu Tyr Tyr Gln Ile Gln Met Asp

180 185 190

Met Phe Trp Thr Ala Met Leu Ser Tyr Leu His Ala Thr Ala Val Ala

195 200 205

Gln Ala Asn Gly Ile Thr Ala Glu Gln Phe Leu Pro Tyr Ala Ala Glu

210 215 220

Thr Met Ser Ser Leu Pro Lys Phe Ile Glu Phe Tyr Thr Pro Arg Ile

225 230 235 240

Asn Ala Gly Glu Tyr Pro Gly Asp Val Asp Arg Leu Ala Met Gly Met

245 250 255

Ala Ser Val Glu His Val Val His Thr Thr Gln Asp Ala Gly Ile Asp

260 265 270

Ile Thr Leu Pro Thr Ala Val Leu Glu Val Phe Arg Arg Gly Met Glu

275 280 285

Asn Gly His Ala Gly Asn Ser Phe Thr Ser Leu Ile Glu Ile Phe Lys

290 295 300

Lys Ser Asp Ile Arg Pro

305 310

<210> 20

<211> 930

<212> DNA

<213> Paenibacillus mucilaginosus

<400> 20

atgaagagta gcaatcgcag cgagaacatt cgcgttggca ccgaaaatac cgtgggcaaa 60

agcaagagcg tgaccgtgat tggcctgggt ccgatgggca aggcaatggc cgcagccttc 120

ctggaacacg gctataaggt gaccgtttgg aaccgcacca gcaacaaggc agacgaactg 180

atcaccaaag gcgcagttcg tgccagtacc gtgcatgaag ccctggccgc aaacgaactg 240

gtgatcctga gcctgaccga ttatgatgcc atgtatacca tcctggagcc ggccagcgaa 300

aatctgagcg gcaaggtgct ggttaacctg agcagcgata caccggataa agcccgcgaa 360

gccgccaaat ggctggccaa tcgtggtgca ggtcacatta ccggtggtgt gcaggtgcct 420

ccgagcggta ttggcaaacc ggagagtagc acctactaca gcggcccgaa agaggtgttc 480

gaagccaaca aagagaccct ggaagtgctg accggcaccg attatcgtgg tgaagatccg 540

ggcctggccg cactgtatta ccagatccag atggacatgt tttggaccgc catgctgagc 600

tatctgcatg ccaccgccgt ggcacaggcc aatggcatta ccgccgaaca gtttctgccg 660

tatgcagcag agaccatgag cagcctgccg aagtttatcg agttctacac cccgcgtatc 720

aatgccggtg aatatccggg cgatgttgac cgcctggcca tgggtatggc cagcgttgaa 780

catgtggttc acaccaccca ggacgccggc attgatatta ccctgccgac cgccgttctg 840

gaagtttttc gccgcggcat ggaaaacggc cacgcaggta acagctttac cagcctgatt 900

gagattttta agaaatctga tatccgtcct 930

Claims

1.一种(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的制备方法，其特征在于，其包括：在亚胺还原酶和还原型辅酶NADPH的存在下，将5-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2H-吡咯进行加氢还原反应，即可。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的亚胺还原酶为氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.17所示的酶和/或氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.19所示的酶。

3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，在所述的加氢还原反应的体系中：

所述的5-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2H-吡咯在所述的加氢还原反应中的初始浓度为0.01～0.05g/mL，例如0.02g/mL、0.03g/mL或者0.04g/mL；

所述的亚胺还原酶来自菌体，所述的菌体的用量与5-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2H-吡咯的用量的质量比为0.8:1～2.4:1，例如；1.92:1或者1.44:1；

所述的还原型辅酶NADPH的用量与所述的5-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2H-吡咯的用量的质量比为1:200～1:10，优选1:100；

较佳地，所述的亚胺还原酶的浓度为0.5～5U/mL，例如2.35U/mL、3.14U/mL或者3.92U/mL。

4.如权利要求1～3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述的加氢还原反应在水中进行；

所述的加氢还原反应的体系的pH为6～7，较佳地为6.4～6.6，例如6.5；

和/或，所述的加氢还原反应在20～50℃下进行，较佳地在28～40℃下进行，例如30℃或者35℃。

5.如权利要求1～4所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法还包括：在脱氢酶以及供氢体的存在下，将氧化型辅酶NADP⁺进行还原反应，得到所述的还原型辅酶NADPH即可；

所述的还原反应优选在水中进行；

所述的还原反应的反应体系的pH优选6～7，更优选6.4～6.6，例如6.5；

所述的还原反应的反应体系的温度优选20～50℃，更优选28～30℃。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的脱氢酶为葡萄糖脱氢酶、醇脱氢酶或甲酸脱氢酶；

和/或，所述的供氢体为葡萄糖、异丙醇或甲酸盐；

较佳地，当所述的脱氢酶为醇脱氢酶时，所述的供氢体为异丙醇；当所述的脱氢酶为葡萄糖脱氢酶时，所述的供氢体为葡萄糖；当所述的脱氢酶为甲酸脱氢酶时，所述的供氢体为甲酸盐；其中，所述的脱氢酶的形式优选菌泥。

7.如权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括：在所述的葡萄糖脱氢酶、所述的葡萄糖、所述的氧化型辅酶NADP⁺、所述的亚胺还原酶的存在下，将5-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2H-吡咯进行加氢还原反应，即可。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的氧化型辅酶NADP⁺的与所述的5-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2H-吡咯的用量的质量比为：1:200～1:10，优选1:100；

和/或，所述的葡萄糖的用量与所述的5-(2,5-二氟苯基)-3,4-二氢-2H-吡咯的摩尔比为2:1～5:1；

和/或，所述的葡萄糖脱氢酶来自菌泥，所述的菌泥用量与所述的葡萄糖的质量比为0.1:1～0.3:1；所述的菌泥的酶活为7400U/g；

和/或，所述的葡萄糖脱氢酶的浓度为74U/mL～550U/mL，例如148U/mL或者222U/mL。

9.根据如权利要求1～8任一项所述的制备方法制备得到的(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷。

10.一种拉罗替尼的制备方法，其特征在于，其包括下述步骤：

(1)按照权利要求1～8任一项所述的制备方法制得(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷；

(2)利用步骤(1)制备得到的(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷制备所述的拉罗替尼。

11.一种亚胺还原酶在制备(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷中的应用；较佳地，所述的亚胺还原酶为氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.17所示的酶和/或氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.19所示的酶。