CN109593802A - 一种(r)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷或其盐的制备方法 - Google Patents

一种(r)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷或其盐的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种(R)‑2‑(2,5‑二氟苯基)吡咯烷或其盐的制备方法，N‑保护吡咯酮与2,5‑二氟苯基氯化镁格氏试剂进行格氏反应，得到式3所示的化合物；在酸性条件下，式3所示的化合物脱保护，关环，得到式4所示的化合物或其盐；在酶催化下，利用甲酸或甲酸盐为供氢体，采用辅因子，实现辅因子循环，将式4所示的化合物或其盐选择性还原合成光学纯化合物(R)‑2‑(2,5‑二氟苯基)吡咯烷或其盐；所述的酶为重组亚胺还原酶和甲酸脱氢酶的组合，所述辅因子为氧化型/还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或者氧化型/还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。本发明的方法工艺安全，操作简便且收率和产品光学纯度都较高。

Description

一种(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷或其盐的制备方法
技术领域
本发明属于药物化学领域，涉及一种吡咯烷，具体来说是一种(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷或其盐的制备方法。
背景技术
在近几年发现的新型的针对酪氨酸受体激酶(TRK)的抑制剂中，很多抑制剂具有吡唑并[1,5-a]吡啶(ZL20128006957.8，作为原肌球蛋白受体激酶(Trk)抑制剂的取代的吡唑并[1,5-a]吡啶)和吡唑并[1,5-a]嘧啶(US2016/0137654A1，(S)-N-(5-(-2-(2,5-二氟苯基)-吡咯烷-1-基)-吡咯并[1，5-A]嘧啶-3-基)-3-羟基吡咯烷-1-甲酰胺硫酸氢盐的晶型)的系列结构，用于所有表达有原肌球蛋白受体激酶(tropomyosin receptor kinase，TRK)的肿瘤患者，这种抑制剂对TRK有很强的选择性，通过抑制TRK信号通路，可以抑制肿瘤的生长。对多种成人和儿童实体瘤，包括乳腺癌、结直肠癌、肺癌，胰腺癌、甲状腺癌、以及各种肉瘤有效。
现有技术中关于(R)-2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷或其盐，主要采用化学方法合成制备，如：
方法1，专利WO2013088256和WO2013088257公开了如下方法：
该路线第三步需要用到手性叔丁基亚磺酰胺，试剂成本较高。第四步需要用三乙基硼氢化锂，在生产当中不易操作，危险性较大(遇空气易燃)，试剂成本较高，收率较低。
方法2，专利WO2011006074，WO2010048314和WO2010033941公开了如下方法：
该路线第一步采用的是一锅法合成化合物8，操作繁琐，反应条件苛刻(需无水无氧，低温-78度)，产物的e.e.值只能达到93％，且原料成本较高。
近来的生物催化技术显示出优势，无需低温和无水无氧操作、不用易燃易爆危险试剂、反应条件温和、水相反应，如文献ChemCatChem 2018,10,3236–3246，该文献采用亚胺还原酶合成手性吡咯烷类化合物。但该文献采用异丙醇为供氢体，随着反应的进行，反应体系会逐步累积副产物丙酮，一方面反应体系累积的丙酮抑制酶活性，降低反应速度，为此需要通气驱赶产生的副产物丙酮而增加能耗并增加处理挥发性丙酮及夹杂的异丙醇的环保费用，增加生产成本，另一方面，通气带入反应体系的氧气，对还原产生的胺产物产生氧化作用，生成副产物，影响产品的质量。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷或其盐的制备方法，所述的这种(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷或其盐的制备方法要解决现有技术中制备(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷或其盐的方法工艺复杂、反应条件苛刻、以及安全和环保的技术问题。
本发明提供了一种(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷或其盐的制备方法，包括如下步骤：
1)N-保护吡咯酮与2,5-二氟苯基氯化镁格氏试剂进行格氏反应，得到式3所示的化合物；
N-保护基R为甲氧羰基、乙氧羰基、叔丁氧羰基、苄氧羰基、芴甲氧羰酰基、烯丙氧羰基、对甲氧基苄基或苄基；
2)在酸性条件下，式3所示的化合物脱保护，关环，得到式4所示的化合物或其盐；
所述的酸为无机酸或有机酸，X为无机酸或有机酸或无；
3)在酶催化下，利用甲酸或甲酸盐为供氢体，在缓冲溶液、助溶剂、采用辅因子存在下、在pH4—10的水相反应体系、温度10-50℃条件下，催化底物式4所示的化合物或其盐选择性还原合成光学纯化合物(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷或其盐；所述的酶为重组亚胺还原酶和甲酸脱氢酶的组合，所述辅因子为氧化型/还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或者氧化型/还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；所述的重组亚胺还原酶的DNA序列如SEQ IDNo.1-15中任一项所示；
进一步的，在步骤2)中，所述的酸或有机酸为三氟乙酸、或氢溴酸的醋酸溶液。
进一步的，在步骤2)、步骤3)中，X为无机酸或有机酸或无；所述的无机酸为硫酸、磷酸、硝酸、氢氟酸或者氢溴酸，所述的有机酸为草酸、乳酸、苹果酸、琥珀酸或者酒石酸。
进一步的，在步骤3)中，所述的缓冲溶液、助溶剂、供氢体、辅因子、重组亚胺还原酶、甲酸脱氢酶、底物的物料质量比为6.81-10.53：0-0.6：0.13-0.22：0.00014-0.00022：0.0029—0.0044：0.00115-0.0018：1。
进一步的，在步骤3)中，所述的还原反应在助溶剂存在条件下进行，所述助溶剂为二甲亚砜(DMSO)、甲苯、异丙醇中的一种或二种的组合。
进一步的，在步骤3)中，所述的供氢体为甲酸、甲酸钠、甲酸铵、甲酸钙、甲酸镁中的一种或多种的组合。
进一步的，在步骤3)中，所述的缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液或碳酸盐缓冲溶液。
进一步的，在步骤3)中，所述的酶催化反应在表面活性剂参与下进行。
进一步的，在步骤3)中，所述的表面活性剂包括聚乙二醇、吐温80、曲拉通X-114、脂肪醇聚氧乙烯醚(3)磺基琥珀酸单酯二钠(MES)、十四烷酰胺丙基羟丙基磺基甜菜碱、十八烷基二甲基苄基季铵氯化物中的一种或多种的组合。
进一步的，在步骤3)中，所述的表面活性剂与底物的重量投料比为0.011-0.022：1。
具体的，SEQ ID No.1-15的重组亚胺还原酶为非天然序列，可通过商业化的全基因合成服务制得。
本发明与现有技术相比，其技术进步是显著的。与现有技术相比具有如下优点：
1)在步骤1)中，使用2-氯-1，4-二氟苯替代现有技术中的2-溴-1，4-二氟苯制备2,5-二氟苯基氯化镁格氏试剂，合成条件温和，降低原材料成本，提高原料原子经济性；
2)在步骤2)、步骤3)中，反应体系成盐采用硫酸、磷酸、硝酸、氢氟酸、氢溴酸等无机酸，或草酸、乳酸、苹果酸、琥珀酸或者酒石酸等有机酸，操作方便，所得中间体稳定性好；
3)在步骤3)中，使用酶制剂替代现有技术中的化学手性试剂，可以在很大程度上解决现有技术需要手性诱导剂的难题；相对于金属催化，酶催化反应还具有成本低廉，反应选择性好，产品转化率和光学纯度高，反应过程操作简单，环境友好，可以大大减少因使用有机溶剂的安全风险和环保处理费用，适用于大规模工业生产等优势；
4)在步骤3)中，采用甲酸或甲酸盐为供氢体的辅酶循环再生的酶催化反应，简化工业生产后处理步骤，提升产品的品质，为创制优质原料药和制剂提供了核心竞争力；
5)在步骤3)中，采用添加表面活性剂，并优化反应条件，改善了重组亚胺还原酶催化反应的立体选择性，提高了产品的光学纯度；
6)本发明的方法工艺安全，操作简便且收率和产品光学纯度都较高。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。反应所用的物质除重组亚胺还原酶外，均可通过商购获得。
实施例1 重组亚氨还原酶的制备
从甘油管或转化平板将含有亚氨还原酶基因(SEQ ID No.1-15)的基因片段(由上海捷瑞生物科技公司合成)，与pET28a质粒(购自Invitrogen公司)的酶切产物连接，转入感受态E.coliBL21(DE3)菌株(购自北京全式金生物技术有限公司)，筛选得到阳性克隆子，接种到含(100ug/mL)氨苄青霉素抗性的4mL液体LB培养基中，于37℃下活化过夜12～16小时，将活化后得到的培养物以2％接种量转接含(100ug/mL)氨苄青霉素抗性的100mL液体LB培养基，于37℃、220rpm振荡培养至OD 600值达到约0.6，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至终浓度0.8mmol/L，于30℃继续培养过夜。离心(4℃,5000rpm,15min)收集细胞，用10mL磷酸缓冲液(100mM，pH7.0)悬浮细胞。细胞悬浮液置于冰浴中超声波破碎10分钟，再离心(4℃,12000rpm,15min)，上清液于-20℃预冻过夜，然后冷冻干燥34～40小时，即得冻干粉状的重组亚氨还原酶。
实施例2
步骤1 叔丁基(4-(2,5-二氟苯基)4-羰丁基)氨基甲酸酯(化合物3)的合成
在2000毫升带机械搅拌的四颈瓶中，氮气保护下加入30.0g镁条和80mL无水2-甲基四氢呋喃，加入2,5-二氟氯苯(148.54g,1mol)和300mL2-甲基四氢呋喃组成的混合溶液约30毫升，慢慢加热，搅拌下滴加2-3mL 1,2-二溴乙烷，使反应引发，在回流温度下滴加剩余2,5-二氟氯苯(148.54g,1mol)和300mL 2-甲基四氢呋喃组成的混合溶液，大约2小时加完，滴加完毕，继续回流6小时，取样跟踪，样品冷却至室温后，加入甲醇分解格氏试剂，经过GC定量分析，2,5-二氟氯苯剩余量低于0.5％，对二氟苯高于99％，停止反应，降温至25℃以下，得到2,5-二氟苯基氯化镁格氏试剂。
向2,5-二氟苯基氯化镁格氏试剂的溶液中，添加N-Boc保护吡咯烷酮(185.3g,1mol)溶于100mL 2-甲基四氢呋喃的溶液，控制滴加速度，使温度控制在10℃左右，滴加完毕，继续反应2小时。升至室温，TLC检测反应结束。滴加稀硫酸淬灭至反应液pH 6-7，混合液分层，水层使用2-甲基四氢呋喃萃取二次，每次50mL,合并2-甲基四氢呋喃有机相，降温至10℃以下，滴加亚硫酸氢钠的饱和水溶液(400mL)，滴完，继续搅拌1小时，过滤析出的固体，将固体加入到稀硫酸溶液中，以2-甲基四氢呋喃萃取三次，每次200mL，合并有机相，无水硫酸镁干燥过滤，滤液减压浓缩，得到产品即为叔丁基(4-(2,5-二氟苯基)4-羰丁基)氨基甲酸酯(化合物3)(白色固体256.8g，收率85.8％)。
所得产品核磁数据如下：
1H NMR,400MHz,CDCl3δ:δ7.55-7.25(m,3H),6.58(bs,1H),3.18(t,J＝7.1Hz,2H),2.93(t,J＝7.1Hz,2H),1.84(p,J＝7.0Hz,2H),1.38(s,9H).
13C NMR,100MHz,CDCl3δ:199.9,158.6(d,J＝254.9),157.8，155.6,130.5(d,J＝3.1),121.6(d,J＝9.7),118.6(d,J＝22.3),116.7,78.9,40.0,35.5,28.3,24.4.
LC-ESI-MS(m/z):[M+H]+300.13，计算值C15H19F2NO3：299.32
步骤2 5-(2,5-二氟苯)-3，4-二氢-2H-吡咯(化合物4游离碱)的合成
在100mL烧瓶中，加入叔丁基(4-(2,5-二氟苯基)4-羰丁基)氨基甲酸酯(化合物3)(14.97g，0.05mol)，50mL二氯甲烷，搅拌至溶解，加入三氟乙酸(17.1g,0.15mol)，室温下搅拌反应，薄板层析跟踪反应至化合物3原料消失。反应混合物降温至25℃以下，用20％氢氧化钠溶液调节pH值至10，加入二氯甲烷30mL分层，水层用二氯甲烷萃取三次，每次30mL,合并有机相，无水硫酸钠干燥后过滤，减压浓缩，得到油状液体5-(2,5-二氟苯)-3，4-二氢-2H-吡咯(化合物4游离碱)7.85g，收率86.5％。
所得产品核磁数据如下：
1H NMR,400MHz,CD3ODδ:7.78(m,1H),7.43-7.34(m,2H),3.54(m,2H),2.12(dt,J＝10.3,2.0Hz,2H),1.97(dt,J＝15.8,7.9Hz,2H).
13C NMR,100MHz,CD3ODδ:176.2,158.2(d,J＝260.3),155.0(d,J＝10.3),124.0(d,J＝3.1),119.4(d,J＝23.5),118.4(d,J＝23.5),115.6,62.3,36.5,21.0.
步骤3 (R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷(化合物5游离碱)的合成
在10mL反应瓶中，加入4.75mL(重量约4.75g)的0.1mol/L,pH 7.0的磷酸盐缓冲液，依次加入0.25mL DMSO(重量约0.27g)，加入0.1g甲酸钠,加入化合物4游离碱0.451g，加入2mg重组亚胺还原酶干粉(SEQ ID No.1)、0.8mg甲酸脱氢酶、和0.1mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+),反应温度保持在25℃，搅拌速度1000rpm，反应24小时，HPLC检测转化率，NAD样品转化率56.8％，NADP转化率14.5％。
实施例3
步骤1 叔丁基(4-(2,5-二氟苯基)4-羰丁基)氨基甲酸酯(化合物3)的合成同实施例2，步骤1；
步骤2 5-(2,5-二氟苯)-3，4-二氢-2H-吡咯(化合物4游离碱)的合成
同实施例2，步骤2；
步骤3 (R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷(化合物5游离碱)的合成
在10mL反应瓶中，加入4.75mL(重量约4.75g)的0.1mol/L,pH 5.0-10.0的磷酸盐或碳酸盐缓冲液，依次加入0.25mL DMSO(重量约0.27g)，加入0.1g甲酸钠,加入化合物4游离碱0.451g，加入2mg重组亚胺还原酶干粉(SEQ ID No.1)、0.8mg甲酸脱氢酶、和0.1mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+),反应温度保持在25℃，搅拌速度1000rpm，反应21小时，HPLC检测转化率，pH 5.0(磷酸盐)样品转化率36.6％，pH 6.0(磷酸盐)样品转化率45.4％，pH 7.5(磷酸盐)样品转化率61.3％，pH 8.6(碳酸盐)样品转化率65.4％，pH 9.0(碳酸盐)样品转化率55.2％。
实施例4
步骤1 叔丁基(4-(2,5-二氟苯基)4-羰丁基)氨基甲酸酯(化合物3)的合成
同实施例2，步骤1；
步骤2 5-(2,5-二氟苯)-3，4-二氢-2H-吡咯(化合物4游离碱)的合成
同实施例2，步骤2；
步骤3 (R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷(化合物5游离碱)的合成
在10mL反应瓶中，加入4.75mL(重量约4.75g)的0.1mol/L,pH 8.6碳酸盐缓冲液，依次加入0.25mL DMSO(重量约0.27g)，加入0.1g甲酸钠,加入化合物4游离碱0.451g，加入2mg重组亚胺还原酶干粉(SEQ ID No.1)、0.8mg甲酸脱氢酶、和0.1mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+),反应温度保持一定温度下，搅拌速度1000rpm，反应18小时，HPLC检测转化率，15℃样品转化率32.3％，20℃样品转化率43.5％，30℃样品转化率85.3％，35℃样品转化率99.4％，38℃样品转化率99.9％，42℃样品转化率99.9％，45℃样品转化率95.1％。
实施例5
步骤1 叔丁基(4-(2,5-二氟苯基)4-羰丁基)氨基甲酸酯(化合物3)的合成
同实施例2，步骤1；
步骤2 5-(2,5-二氟苯)-3，4-二氢-2H-吡咯(化合物4游离碱)的合成
同实施例2，步骤2；
步骤3 (R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷(化合物5游离碱)的合成
在10mL反应瓶中，加入4.75mL(重量约4.75g)的0.1mol/L,pH 8.6碳酸盐缓冲液，依次加入0.25mL DMSO(重量约0.27g)，加入0.1g甲酸或甲酸盐,加入化合物4游离碱0.451g，加入2mg重组亚胺还原酶干粉(SEQ ID No.1)、0.8mg甲酸脱氢酶、和0.1mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+),反应温度38℃下，搅拌速度1000rpm，反应18小时，HPLC检测转化率，0.1g甲酸样品转化率99.3％，0.1g甲酸钾样品转化率99.9％，0.1g甲酸铵样品转化率99.9％，0.1g甲酸钙样品转化率96.3％，0.1g甲酸镁样品转化率97.1％。
实施例6
步骤1 叔丁基(4-(2,5-二氟苯基)4-羰丁基)氨基甲酸酯(化合物3)的合成
同实施例2，步骤1；
步骤2 5-(2,5-二氟苯)-3，4-二氢-2H-吡咯(化合物4游离碱)的合成
同实施例2，步骤2；
步骤3 (R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷(化合物5游离碱)的合成
在10mL反应瓶中，加入4.75mL(重量约4.75g)的0.1mol/L,pH 8.6碳酸盐缓冲液，依次加入助溶剂，加入0.1g甲酸钠,加入化合物4游离碱0.451g，加入2mg重组亚胺还原酶干粉(SEQ ID No.1)、0.8mg甲酸脱氢酶、和0.1mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+),反应温度38℃下，搅拌速度1000rpm，反应16小时，HPLC检测转化率，0.25g异丙醇样品转化率99.5％，0.25g甲苯样品转化率63.8％，0.01g聚乙二醇样品转化率99.3％，0.01g吐温80样品转化率99.9％，0.01g脂肪醇聚氧乙烯醚(3)磺基琥珀酸单酯二钠(MES)样品转化率97.9％，0.01g十四烷酰胺丙基羟丙基磺基甜菜碱样品转化率96.3％，0.01g曲拉通X-114样品转化率95.1％,0.01g十八烷基二甲基苄基季铵氯化物样品转化率87.1％。
实施例7
步骤1 叔丁基(4-(2,5-二氟苯基)4-羰丁基)氨基甲酸酯(化合物3)的合成
在250毫升带机械搅拌的四颈瓶中，氮气保护下加入3.0g镁条和30mL无水2-甲基四氢呋喃，加入2,5-二氟氯苯(14.85g,0.1mol)和50mL无水2-甲基四氢呋喃组成的混合溶液约3mL，慢慢加热，搅拌下滴加0.2-0.3mL 1,2-二溴乙烷，使反应引发，在回流温度下滴加剩余2,5-二氟氯苯(14.85g,0.1mol)和50mL 2-甲基四氢呋喃组成的混合溶液，大约2小时加完，滴加完毕，继续回流6小时，取样跟踪，样品冷却至室温后，加入甲醇分解格氏试剂，经过GC定量分析，2,5-二氟氯苯剩余量低于0.5％，对二氟苯高于99％，停止反应，降温至25℃以下，得到2,5-二氟苯基氯化镁格氏试剂。
向2,5-二氟苯基氯化镁格氏试剂的溶液中，添加N-Boc保护吡咯烷酮(18.53g,0.1mol)溶于30mL 2-甲基四氢呋喃的溶液，控制滴加速度，使温度控制在10℃左右，滴加完毕，继续反应2小时。升至室温，TLC检测反应结束。滴加稀硫酸淬灭至反应液pH 6-7，混合液分层，水层使用2-甲基四氢呋喃萃取二次，每次30mL,合并2-甲基四氢呋喃有机相，降温至10℃以下，滴加亚硫酸氢钠的饱和水溶液(60mL)，滴完，继续搅拌1小时，过滤析出的固体，将固体加入到稀硫酸溶液中，以2-甲基四氢呋喃萃取三次，每次20mL，合并有机相，无水硫酸镁干燥过滤，滤液减压浓缩，得到产品即为叔丁基(4-(2,5-二氟苯基)4-羰丁基)氨基甲酸酯(化合物3)(白色固体25.6g，收率85.4％)。
所得产品核磁数据如下：
1H NMR,400MHz,CDCl3δ:δ7.55-7.25(m,3H),6.58(bs,1H),3.18(t,J＝7.1Hz,2H),2.93(t,J＝7.1Hz,2H),1.84(p,J＝7.0Hz,2H),1.38(s,9H).
13C NMR,100MHz,CDCl3δ:199.9,158.6(d,J＝254.9),157.8，155.6,130.5(d,J＝3.1),121.6(d,J＝9.7),118.6(d,J＝22.3),116.7,78.9,40.0,35.5,28.3,24.4.
LC-ESI-MS(m/z):[M+H]+300.13，计算值C15H19F2NO3：299.32
步骤2 5-(2,5-二氟苯)-3，4-二氢-2H-吡咯(化合物4硫酸氢盐)的合成
在100mL烧瓶中，加入叔丁基(4-(2,5-二氟苯基)4-羰丁基)氨基甲酸酯(化合物3)(14.97g，0.05mol)，50mL甲基叔丁基醚，搅拌至溶解，加入三氟乙酸(11.4g,0.1mol)，室温下搅拌反应，薄板层析跟踪反应至化合物3原料消失。反应混合物降温至25℃以下，用20％氢氧化钠溶液调节pH值至10，加入甲基叔丁基醚25mL分层，水层用甲基叔丁基醚萃取三次，每次20mL,合并有机相，无水硫酸钠干燥后过滤，滤液降温至0℃以下，滴加95％硫酸(4.9g,0.05mol)，搅拌2小时，抽滤析出的固体，滤饼以冰冷无水乙醇洗涤，减压干燥得白色固体粉末化合物4的硫酸氢盐(12.1g，收率86.6％)。
所得化合物4游离碱的核磁数据如下：
1H NMR,400MHz,CD3ODδ:7.78(m,1H),7.43-7.34(m,2H),3.54(m,2H),2.12(dt,J＝10.3,2.0Hz,2H),1.97(dt,J＝15.8,7.9Hz,2H).
13C NMR,100MHz,CD3ODδ:176.2,158.2(d,J＝260.3),155.0(d,J＝10.3),124.0(d,J＝3.1),119.4(d,J＝23.5),118.4(d,J＝23.5),115.6,62.3,36.5,21.0.
步骤3 (R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷(化合物5硫酸氢盐)的合成
在1000mL反应瓶中，加入475mL(重量约475g)的0.1mol/L,pH 8.6碳酸盐缓冲液，依次加入助溶剂DMSO(10.8g)，异丙醇(7.86g)混合溶剂，加入甲酸钠(6.8g)和甲酸(2.3g)混合物,加入5-(2,5-二氟苯)-3，4-二氢-2H-吡咯(化合物4硫酸氢盐)(69.8g，0.25mol)，加入0.2g重组亚胺还原酶干粉(SEQ ID No.1)、0.08g甲酸脱氢酶、和0.01g烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+),加入0.8g吐温80，反应温度38℃下，搅拌速度1000rpm，反应21小时，HPLC检测转化率99.9％。加入20％wtNaOH水溶液，调节pH值至7以上，反应液经过硅藻土过滤除酶蛋白，滤液用二氯甲烷萃取三次，每次500mL，合并二氯甲烷相，经饱和食盐水洗，用无水硫酸钠干燥，过滤，降温至-5度以下，将浓硫酸(24.5g，0.25mol)滴加至冷却的混合溶液中，搅拌3小时，过滤析出固体，丙酮洗涤，减压去溶剂,得白色固体产物(R)-2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷硫酸氢盐(化合物5硫酸氢盐)67.1g，收率95.2％,97.1％e.e.[化合物5游离碱，(R)-2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷的光学纯度]。
化合物5游离碱的核磁数据如下：
1H NMR,400MHz,CDCl3δ:7.29(m,1H),7.02(m,1H)，6.96(m,1H),4.09(t,J＝7.8Hz，1H),3.16(m，1H)，3.04(m，1H)，2.21-2.30(m，1H)，1.77-1.95(m，3H)，1.57-1.67(m，1H)。
LC-ESI-MS(m/z)：184.1[M+H]+,计算值C10H11F2N：183.20。
实施例8
步骤1 叔丁基(4-(2,5-二氟苯基)4-羰丁基)氨基甲酸酯(化合物3)的合成
同实施例7，步骤1；
步骤2 5-(2,5-二氟苯)-3，4-二氢-2H-吡咯(化合物4硫酸氢盐)的合成
同实施例7，步骤2；
步骤3 (R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷(化合物5.D-酒石酸盐)的合成
在100mL反应瓶中，加入47.5mL(重量约47.5g)的0.1mol/L,pH 8.6碳酸盐缓冲液，依次加入0.4g甲酸钠,0.3g甲酸铵,0.3甲酸,加入化合物4硫酸氢盐6.98g，0.03g聚乙二醇,0.05g脂肪醇聚氧乙烯醚(3)磺基琥珀酸单酯二钠(MES),0.02g曲拉通X-114,加入20mg重组亚胺还原酶干粉(SEQ ID No.1)、8mg甲酸脱氢酶、和1mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+),反应温度38℃下，搅拌速度1000rpm，反应16小时，HPLC检测转化率99.9％。加入20％wtNaOH水溶液，调节pH值至7以上，反应液经过硅藻土过滤除酶蛋白，滤液用二氯甲烷萃取三次，每次50mL，合并二氯甲烷相，经饱和食盐水洗，用无水硫酸钠干燥，过滤得滤液，搅拌下，将D-酒石酸(3.75g，0.025mol)分批加入到滤液中，搅拌3小时，过滤析出固体，丙酮洗涤，减压去溶剂,得白色固体产物(R)-2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷D-酒石酸盐(化合物5.D-酒石酸盐)7.47g，收率89.7％，99.2％e.e.[化合物5游离碱，(R)-2-(2，5-二氟苯基)吡咯烷的光学纯度]。
化合物5游离碱的核磁数据如下：
1H NMR,400MHz,CDCl3δ:7.29(m,1H),7.02(m,1H)，6.96(m,1H),4.09(t,J＝7.8Hz，1H),3.16(m，1H)，3.04(m，1H)，2.21-2.30(m，1H)，1.77-1.95(m，3H)，1.57-1.67(m，1H)。
LC-ESI-MS(m/z)：184.1[M+H]+,计算值C10H11F2N：183.20。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 上海健康医学院
<120> 一种(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷或其盐的制备方法
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 882
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaagaacg acggggtgac gaagggatcg gtcgcccttc tggggctcgg cgagatgggg 60
cgggtgctcg cggaacggct cctcgacgcc ggatatccgg tgacggtctg gaaccggacc 120
ccgggccggg acacggcgct cgtggaacgc ggggcacggc gagcggagac ggtacgggag 180
gcggtcaccg ccgcgacgac cgtcgtcacc tgcctcttcg accacgcgtc ggtgcgggag 240
acactcgaac cggtgggcgc cgacctggcc ggcaggaccc tggtcgacct caccacgacg 300
accccgaacg aggcccgatg gctgggcgga tgggccgagg aacggggcat cgagcacctc 360
gacggcgcca tcatggcgac cccgtcgatg atcggcgctc ccgaggcgtc gctcctctac 420
agcgggtccg ccgaggcctt cggacgccac aggaccctct tcgaggtctg ggggagcgcc 480
acctacgacg gagcggacca cggggcggcg tcgctgttcg atctggccct cctgtcgggg 540
atgtacacga tgttcaccgg tttcgcgcac ggggccgcca tggtcacgtc ggcgggggtc 600
accgcggagg agttcgccca tcgatccgca cggctcttgt ccgccatgac cggggtgttc 660
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tggaccgcca cggccttgga caccatcgcg cgcgcctcgg ccgagcaggg ggtctctccc 780
gggccgatcg agatgacgcg ggcgctcgtc ctcgcccaga tcgaggccgg atacgggaac 840
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttggttacta catcagacaa agagggtgaa aactctgagt tagaaaagca cattcctgac 180
gctgatgtga ttatttccac tccattccat ccagcctaca tcacgaagga gagaatccaa 240
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acctacgacg gagcggacca cggggcggcg tcgctgttcg atctggccct cctgtcgggg 540
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ccgatgacgg cgaaggtgat cgacgagggc gactacaccg ggcccgggca gagcctcgaa 720
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gggccgatcg agatgacgcg ggcgctcgtc ctcgcccaga tcgaggccgg atacgggaac 840
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<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atgaagaacg acggggtgac gaagggatcg gtcgcccttc tggggctcgg cgagatgggg 60
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acactcgaac cggtgggcgc cgacctggcc ggcaggaccc tggtcgacct caccacgacg 300
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Claims (10)

1.一种(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷或其盐的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
1)N-保护吡咯酮与2,5-二氟苯基氯化镁格氏试剂进行格氏反应，得到式3所示的化合物；
N-保护基R为甲氧羰基、乙氧羰基、叔丁氧羰基、苄氧羰基、芴甲氧羰酰基、烯丙氧羰基、对甲氧基苄基或苄基；
2)在酸性条件下，式3所示的化合物脱保护，关环，得到式4所示的化合物或其盐；
所述的酸为无机酸或有机酸，X为无机酸或有机酸或无；
3)在酶催化下，利用甲酸或甲酸盐为供氢体，在缓冲溶液、助溶剂、采用辅因子存在下、在pH4—10的水相反应体系、温度10-50℃条件下，催化底物式4所示的化合物或其盐选择性还原合成光学纯化合物(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷或其盐；所述的酶为重组亚胺还原酶和甲酸脱氢酶的组合，所述辅因子为氧化型/还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸或者氧化型/还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；所述的重组亚胺还原酶的DNA序列如SEQ ID No.1-15中任一项所示；
2.根据权利要求1所述的一种(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷或其盐的制备方法，其特征在于：在步骤2)中，所述的酸或有机酸为三氟乙酸、或氢溴酸的醋酸溶液。
3.根据权利要求1所述的一种(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷或其盐的制备方法，其特征在于：在步骤2)、步骤3)中，X为无机酸或有机酸或无；所述的无机酸为硫酸、磷酸、硝酸、氢氟酸或者氢溴酸，所述的有机酸为草酸、乳酸、苹果酸、琥珀酸或者酒石酸。
4.根据权利要求1所述的一种(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷或其盐的制备方法，其特征在于：在步骤3)中，所述的缓冲溶液、助溶剂、供氢体、辅因子、重组亚胺还原酶、甲酸脱氢酶、底物的物料质量比为6.81-10.53：0-0.6：0.13-0.22：0.00014-0.00022：0.0029—0.0044：0.00115-0.0018：1。
5.根据权利要求1所述的一种(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷或其盐的制备方法，其特征在于：在步骤3)中，所述的还原反应在助溶剂存在条件下进行，所述助溶剂为二甲亚砜(DMSO)、甲苯、异丙醇中的一种或二种的组合。
6.根据权利要求1所述的一种(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷或其盐的制备方法，其特征在于：在步骤3)中，所述的供氢体为甲酸、甲酸钠、甲酸铵、甲酸钙、甲酸镁中的一种或多种的组合。
7.根据权利要求1所述的一种(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷或其盐的制备方法，其特征在于：在步骤3)中，所述的缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液或碳酸盐缓冲溶液。
8.根据权利要求1所述的一种(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷或其盐的制备方法，其特征在于：在步骤3)中，所述的酶催化反应在表面活性剂参与下进行。
9.根据权利要求1所述的一种(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷或其盐的制备方法，其特征在于：在步骤3)中，所述的表面活性剂包括聚乙二醇、吐温80、曲拉通X-114、脂肪醇聚氧乙烯醚(3)磺基琥珀酸单酯二钠(MES)、十四烷酰胺丙基羟丙基磺基甜菜碱、十八烷基二甲基苄基季铵氯化物中的一种或多种的组合。
10.根据权利要求1所述的一种(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷或其盐的制备方法，其特征在于：在步骤3)中，所述的表面活性剂与底物的重量投料比为0.011-0.022：1。
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