CN112175892A - 一种共表达l-苏氨酸醛缩酶与plp合酶的工程菌及应用 - Google Patents

一种共表达l-苏氨酸醛缩酶与plp合酶的工程菌及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种共表达L‑苏氨酸醛缩酶与PLP合酶的工程菌及应用。一种共表达L‑苏氨酸醛缩酶与PLP合酶的工程菌，在表达菌株中转入L‑苏氨酸醛缩酶基因和PLP合酶基因而得。本发明工程菌中外源导入L‑苏氨酸醛缩酶基因与PLP合酶基因，两个酶共表达，PLP合酶过表达能够提高菌株内源性辅酶PLP的合成量，将共表达后的工程菌破碎制备粗酶液，然后将L‑苏氨酸醛缩酶和辅酶PLP共固定化制备的共固定化酶能够显著降低L‑syn‑对甲砜基苯丝氨酸生产过程中外源PLP的使用量，提高了L‑苏氨酸醛缩酶和PLP的使用效率，降低生产成本。本方法反应条件温和、绿色环保、生产工艺简单、重复利用效率高、成本低廉，在L‑syn‑对甲砜基苯丝氨酸生产中具有广阔的应用前景。

Description

一种共表达L-苏氨酸醛缩酶与PLP合酶的工程菌及应用
技术领域
本发明涉及酶工程技术领域，特别是涉及一种共表达L-苏氨酸醛缩酶与PLP合酶的工程菌及应用。
背景技术
L-syn-对甲砜基苯丝氨酸是一种重要的医药中间体，应用于多种抗生素的合成，如甲砜霉素、氟苯尼考等。
化学法合成L-syn-对甲砜基苯丝氨酸，大量使用硫酸铜，在高温强碱条件下利用金属离子的络合作用生成两种syn式的产物：L-syn-对甲砜基苯丝氨酸铜盐和D-syn-对甲砜基苯丝氨酸铜盐，再使用手性试剂进行拆分从而制得光学纯的L-syn-对甲砜基苯丝氨酸。化学法主要存在理论收率、工艺条件复杂苛刻、环境污染大等缺点。生物法合成一般使用L-苏氨酸醛缩酶催化甘氨酸和对甲砜基苯甲醛生成L-syn-对甲砜基苯丝氨酸。
L-苏氨酸醛缩酶是一种PLP依赖型的酶，利用该酶能够一步合成高光学纯度的L-syn-对甲砜基本丝氨酸(图1)。相对于步骤繁多的化学合成法，该方法具有生产工艺简单，反应条件温和，产品光学纯度高，原子利用率高和生产过程污染较小等优点。使用L-苏氨酸醛缩酶制备L-syn-对甲砜基本丝氨酸过程中需要添加50-100μM的PLP做为辅酶。PLP是一种多功能辅酶，参与包括消旋、转氨、脱羧、醛缩等多种反应。然而辅酶PLP价格昂贵，增加了L-syn-对甲砜基本丝氨酸的生产成本。同时，添加的PLP在产品提纯过程中不易被分离，降低产品纯度。在L-syn-对甲砜基苯丝氨酸生物合成工艺中如何能够减少甚至不加入PLP的情况下能够保证L-苏氨酸醛缩酶的正常催化、提高生产效率、降低生成成本是一个重要的研究方向。通过代谢调节促进大肠杆菌包内PLP浓度的相关研究已经成为当下热点，但是目前在L-苏氨酸醛缩酶的应用中没有相关报道。因此构建能够高效共表达PLP和L-苏氨酸醛缩酶的工程菌意义重大。
目前已知的PLP代谢途径3种：5-磷酸脱氧核酮糖依赖途径，非5-磷酸脱氧核酮糖依赖途径和补救途径。PLP的5-磷酸脱氧核酮糖依赖合成途径比较复杂，需要PdxF,PdxB,GapA/B,Dxs,PdxA,PdxJ,and PdxH等7中酶参与反应。PLP的补救途径比较简单，吡哆醛，吡哆醇，吡哆胺等前体经过一到两反应可以得到。但是这些前体价格昂贵。非5-磷酸脱氧核酮糖依赖途径获得广泛关注，该途径只需要一种PLP合酶就能够将核糖-5-磷酸、甘油醛-3-磷酸和谷氨酰胺合成PLP。因此，如果将该PLP合成途径引入大肠杆菌有望提高细胞体内的PLP浓度，以满足共表达苏氨酸醛缩酶对PLP的需求。实现在不添加外源PLP的情况下完成反应。
尽管L-苏氨酸醛缩酶有较高的选择性，应用前景广阔，但是游离的酶稳定性差，不能重复利用，而且难与产物分离，限制了其在工业化中的应用。固定化酶技术在生物催化过程中应用比较广泛。固定化酶能够提高酶的稳定性，提高催化效率，提高酶的利用率，降低生产成本。然而在利用L-苏氨酸醛缩酶生产L-syn-对甲砜基本丝氨酸的研究中，较少有固定化酶工艺的报道。同样，通过对PLP固定化的方式提高PLP的利用效率有助于降低PLP的用量，但是目前在L-苏氨酸醛缩酶的应用中没有相关报道。特别是共固定化L-苏氨酸醛缩酶和PLP的研究几乎处于空白。研究共固定化L-苏氨酸醛缩酶和PLP的工作意义重大，够有效推动L-苏氨酸醛缩酶在合成L-syn-对甲砜基苯丝氨酸方面的工业应用。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的L-苏氨酸醛缩酶使用时辅酶PLP用量大，及游离酶利用率低等问题，提供了一种共表达L-苏氨酸醛缩酶与PLP合酶的工程菌及应用。
一种共表达L-苏氨酸醛缩酶与PLP合酶的工程菌，在表达菌株中转入L-苏氨酸醛缩酶基因和PLP合酶基因而得。
其中，L-苏氨酸醛缩酶基因的序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示。三种L-苏氨酸醛缩酶基因对应的氨基酸序列分别为GenBank登录号为WP_015261381.1、WP_016204489.1和WP_023973138.1。
PLP合酶基因的序列如SEQ ID No.4所示，该PLP合酶为异源二聚体结构，两个亚基的GenBank登录号分别为QJR44475.1和QJR44476.1。
所述表达菌株为大肠杆菌，将L-苏氨酸醛缩酶基因和PLP合酶基因构建在同一质粒上或者两个不同质粒上，在大肠杆菌中进行共表达。
当L-苏氨酸醛缩酶基因和PLP合酶基因构建在同一质粒上时，使用的质粒载体为pRSF-Duet-1；当构建在两个不同质粒上时，L-苏氨酸醛缩酶基因构建在质粒pET-23a上，而PLP合酶基因构建在pRSF-Duet-1上。
本发明又提供了所述工程菌在制备L-syn-对甲砜基苯丝氨酸中的应用。
一种L-syn-对甲砜基苯丝氨酸的制备方法，包括以下步骤：
(1)培养所述工程菌，收集菌体、破碎制备粗酶液；
(2)使用交联剂预处理的固定化材料对预混液进行固定化，制得L-苏氨酸醛缩酶与辅酶PLP的共固定化酶；
(3)使用所述共固定化酶作为催化剂，以对甲砜基苯甲醛和甘氨酸为底物进行催化反应，制备L-syn-对甲砜基苯丝氨酸。
步骤(3)中催化反应的反应体系如下：1L 100mM pH 8的NaOH-Gly缓冲液中溶解0.1M对甲砜基苯甲醛、1M甘氨酸，50-150g共固定化酶，30℃，磁力搅拌，反应1-3h。
步骤(2)中固定化时使用的固定化载体为氨基树脂、环氧树脂或Fe3O4，交联剂为聚乙烯亚胺、聚乙二醇或乙醇胺。
固定化载体使用前进行预处理，预处理方法如下：
(a)将氨基树脂、环氧树脂或Fe3O4用水溶性有机溶剂浸泡3个小时并不断搅拌，然后减压过滤取滤饼，并使用蒸馏水清洗3次；
(b)氨基树脂或Fe3O4用0.4％的戊二醛浸泡3小时并不断搅拌，然后减压过滤取滤饼，并用蒸馏水清洗3次。环氧树脂不需要此步骤；
(c)将清洗后的环氧树脂、氨基树脂或Fe3O4分别使用0.5％的聚乙烯亚胺、0.5％聚乙二醇和0.5％乙醇胺碳酸氢钙溶液浸泡3个小时进行包裹交联，温度为20℃-40℃，搅拌转速为100rpm-200rpm，然后减压过滤取滤饼，并用蒸馏水清洗3次。
本发明工程菌中外源导入L-苏氨酸醛缩酶基因与PLP合酶基因，两个酶共表达，PLP合酶过表达能够提高菌株内源性辅酶PLP的合成量，将共表达后的工程菌破碎制备粗酶液，然后将L-苏氨酸醛缩酶和辅酶PLP共固定化制备的共固定化酶能够显著降低L-syn-对甲砜基苯丝氨酸生产过程中外源PLP的使用量，提高了L-苏氨酸醛缩酶和PLP的使用效率，降低生产成本。本方法反应条件温和、绿色环保、生产工艺简单、重复利用效率高、成本低廉，在L-syn-对甲砜基苯丝氨酸生产中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为使用L-苏氨酸醛缩酶催化甘氨酸和对甲砜基苯甲醛生成L-syn-对甲砜基苯丝氨酸的反应方程式。
图2为苏氨酸醛缩酶基因和PLP合酶基因的核酸胶图。
图3胞内PLP浓度测定
图4工程菌酶活比较
具体实施方式
DNA聚合酶、重组酶均购自TaKaRa；小剂量质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自Axygen。E.coli BL21(DE3)、质粒pRSFDuet-1为实验室保藏；DNA marker、琼脂糖电泳试剂购自北京全式金生物技术有限公司；引物合成与基因测序工作由杭州擎科梓熙生物技术有限公司完成。甘氨酸、对甲砜基苯甲醛、L-syn-对甲砜基苯丝氨酸、磷酸吡哆醛均为市售分析纯。本发明用到的树脂购自西安蓝晓科技新材料股份有限公司，Fe3O4为实验室制备。
本发明通过高效液相色谱(HPLC)分析反应液中底物、产物的浓度，监测反应进行。HPLC分析方法如下：
色谱柱型号：
Figure BDA0002665589320000031
AQ-C18(4.6×250mm,5μm粒径)。流动相：KH2PO4(50mM)∶乙腈＝79∶21，pH＝8.0；检测波长：225nm，流速：1.0mL/min，柱温：40℃。产物的手性分析分析需柱前衍生化。
本发明通过高效液相色谱(HPLC)分析粗酶液中PLP浓度，具体方法如下
色谱柱型号：
Figure BDA0002665589320000041
AQ-C18(4.6×250mm,5μm粒径)。流动相：离子对缓冲液∶乙腈＝92∶8；检测波长：292nm，流速：0.7mL/min，柱温：40℃。离子对缓冲液为50mM(NH4)2HPO4，0.1％的四丁基氢氧化铵，50％磷酸调pH至3.6。
实施例1：工程菌构建
来源于Desulfitobacterium dichloroeliminans的L苏氨酸醛缩酶(以下简称DdLTA)NCBI登录号是WP_015261381.1。来源于Bacillus nealsonii的L苏氨酸醛缩酶(以下简称BnLTA)NCBI登录号是WP_016204489.1。来源于Clostridium beijerinckii的L苏氨酸醛缩酶(以下简称CbLTA)NCBI登录号是WP_023973138.1。上述三种酶根据大肠杆菌中基因序列优化后分别获得如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的基因序列。
来源于Bacillus subtilis的PLP合酶(以下简称ST)为异源多聚体结构，两个亚基的NCBI登录号分别为QJR44475.1和QJR44476.1，将两个亚基的基因序列根据大肠杆菌中基因序列优化后，再连接在一起得到SEQ ID No.4所示的基因序列。
一、PCR扩增获得苏氨酸醛缩酶基因和PLP合酶基因(由杭州擎科生物技术公司合成)
PCR扩增体系：
DNA聚合酶25μL，上游引物1μL，下游引物1μL，模板0.5μL，ddH2O 22.5μL。
PCR扩增条件：
1)预变性：98℃，5min；
2)变性：98℃，30s；退火：60℃，30s；延伸：72℃，30-90s；共循环30次；
3)后延伸：72℃，10min；
4)4℃保存。
PCR扩增结束后，扩增产物用0.9％琼脂糖凝胶电泳来检测，结果显示扩增产物为单一条带，苏氨酸醛缩酶基因大小为1000bp左右，PLP合酶基因大小为1500bp左右，载体基因大小为3800bp左右(图2)。
基因和载体重组体系：
基因片段6μL，载体片段1μL，重组酶1μL，Buffer 2μL。将混合液置于37℃保温箱孵育30min。然后利用化学转化法将重组质粒导入大肠杆菌感受态。
化转步骤：将感受态从-80℃取出放在冰上融化，取重组质粒10μL加入融化的感受态，缓慢搅拌使混合均匀。重新放置冰上30分钟，然后42℃热激90s，迅速放置冰上冷却5分钟。最后加入600μL预冷的LB培养基，放入37℃摇床复苏1h后均匀的涂布在含有硫酸相应抗生素的LB固体培养上，37℃培养过夜。挑取单菌落至LB液体培养基37℃培养10h。测序鉴定构建成功的阳性转化子加入终浓度为25％的无菌甘油置于-80℃保藏备用。
通过以上步骤得到工程菌株如下
1)单质粒单表达苏氨酸醛缩酶工程菌：BL-DdLTA(含有质粒pRSF-Duet-1+DdLTA)、BL-BnLTA(含有质粒pRSF-Duet-1+BnLTA)、BL-CbLTA(含有质粒pRSF-Duet-1+CbLTA)。
2)单质粒单表达PLP合酶工程菌：BL-ST1(含有质粒pRSF-Duet-1+ST)、BL-ST2含有质粒pET-23a+ST)
3)单质粒共表达工程菌：BL-DdLTA-ST1(含有质粒pRSF-Duet-1+DdLTA+ST)、BL-BnLTA-ST1(含有质粒pRSF-Duet-1+BnLTA+ST)和BL-CbLTA-ST1(含有质粒pRSF-Duet-1+CbLTA+ST)。
4)双质粒共表达类型工程菌:BL-DdLTA-ST2(含有质粒pRSF-Duet-1+DdLTA和pET-23a+ST)、BL-BnLTA-ST2(含有质粒pRSF-Duet-1+BnLTA和pET-23a+ST)和BL-CbLTA-ST2(含有质粒pRSF-Duet-1+CbLTA和pET-23a+ST)。
扩增基因和载体引物如下：
表1.引物
编号 引物
DdLTAF CTTTAATAAGGAGATATACCATGATCAGTTTCAAGAA
DdLTAR TAAGCATTATGCGGCCGCAAGCTTTTACAGAATCTTTTTC
BnLTAF CTTTAATAAGGAGATATACCATGGGCAGCAGCCATCACCAT
BnLTAR TAAGCATTATGCGGCCGCAAGCTTTTAAATTTCATTAATAAAGG
CbLTAF CTTTAATAAGGAGATATACCATGTACAGCTTTAAGAACGA
CbLTAR TAAGCATTATGCGGCCGCAAGCTTTTACAGATGCAGATCCTCAATG
S/T2F AATGGGTCGCGGATCCATGGCTCAAACAGGTACTG
S/T2R TTTACCAGACTCGAGTTATACAAGTGCCTTTTG
S/T1F GATATACATATGGCAGATCTATGGCTCAAACAGGTACTGA
S/T1R GTTTCTTTACCAGACTCGAGTTATACAAGTGCCTTTTGC
Z1F GGTATATCTCCTTATTAAAG
Z1R AAGCTTGCGGCCGCATAATGCTTA
Z2F TAAGCATTATGCGGCCGCAAGCTT
Z2R CTCGAGTCTGGTAAAGAAAC
实施例2：菌体的培养及粗酶液的制备
一、菌体的培养
LB液体培养基组成：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，用去离子水溶解后定容，115℃灭菌30min，待用。
将共表达工程菌在经平皿划线，37℃活化12h，挑单菌落接种至含相应抗生素(50μg/mL)的5mL LB液体培养基中，37℃震荡培养8-10h。按1％的接种量转接至50mL含相应抗生素(50μg/ml)的LB液体培养基中，37℃震荡培养2h左右至OD600达到0.6，加入IPTG诱导，终浓度为0.5mM，18℃下诱导培养16-18h。培养结束后，将培养液12000rpm离心2min收集菌体，弃上清，-80℃超低温冰箱中保存，待用。
二、粗酶液的制备
将培养结束后收集到的菌体，用磷酸盐缓冲液(50mM pH 8.0)洗涤两次。之后将菌体重悬于pH 8.0的磷酸盐缓冲液中，使用匀浆破碎仪破碎细胞，全程低温。将此细胞破碎液12000rpm 4℃离心10min，去除沉淀，得到的上清为粗酶液。
实施例3：固定化材料预处理
首先使用蒸馏水对固定化载体进行清洗：将氨基树脂HA、环氧树脂HFA和Fe3O4用蒸馏水浸泡3个小时，期间不时搅拌，重复3三次。然后减压过滤取滤饼。
氨基树脂HA和Fe3O4需要使用戊二醛交联活化，将HA和Fe3O4使用0.4％的戊二醛3小时并不断搅拌，然后减压过滤取滤饼，并用蒸馏水清洗3次。
将清洗后的环氧树脂HFA和活化的HA、Fe3O4分别使用0.5％的聚乙烯亚胺(PEI)、聚乙二醇(PEG)和乙醇胺(EA)的碳酸氢钙溶液浸泡3个小时进行包裹，反应温度为20℃-40℃，搅拌转速为100rpm-200rpm。然后减压过滤取滤饼，并用蒸馏水清洗3次。得到9种固定化载体HA-PEI、HFA-PEI、Fe3O4-PEI、HA-PEG、HFA-PEG、Fe3O4-PEG、HA-EA、HFA-EA和Fe3O4-EA。
实施例4：单质粒共表达菌株共固定化
将实施例2中制备的BL-DdLTA-ST1、BL-BnLTA-ST1和BL-CbLTA-ST1粗酶液用磷酸盐缓冲液(50mM，pH 8.0)稀释10倍，并额外加入100μM。然后分别将预处理的9种载体与以上3种单质粒共表达的工程菌粗酶液进行共固定化。取100g载体加入1L酶液稀释液，30℃搅拌3h，充分固定。最后得到27种共固定化酶HA-PEI-DdLTA1、HFA-PEI-DdLTA1、Fe3O4-PEI-DdLTA1、HA-PEI-BnLTA1、HFA-PEI-BnLTA1、Fe3O4-PEI-BnLTA1、HA-PEI-CbLTA1、HFA-PEI-CbLTA1、Fe3O4-PEI-CbLTA1、HA-PEG-BnLTA1、HFA-PEG-BnLTA1、Fe3O4-PEG-BnLTA1、HA-PEG-DdLTA1、HFA-PEG-DdLTA1、Fe3O4-PEG-DdLTA1、HA-PEG-CbLTA1、HFA-PEG-CbLTA1、Fe3O4-PEG-CbLTA1、HA-EA-CbLTA1、HFA-EA-CbLTA1和Fe3O4-EA-CbLTA1、HA-EA-DdLTA1、HFA-EA-DdLTA1和Fe3O4-EA-DdLTA1、HA-EA-BnLTA1、HFA-EA-BnLTA1和Fe3O4-EA-BnLTA1。
实施例5：双质粒共表达菌株共固定化
将实施例2中制备的BL-DdLTA-ST2、BL-BnLTA-ST2和BL-CbLTA-ST2粗酶液用磷酸盐缓冲液(50mM，pH 8.0)稀释10倍，并额外加入100μM。然后分别将预处理的9种载体与以上3种双质粒共表达的工程菌粗酶液进行共固定化。取100g载体加入1L酶液稀释液，30℃搅拌3h，充分固定。最后得到27种共固定化酶HA-PEI-DdLTA2、HFA-PEI-DdLTA2、Fe3O4-PEI-DdLTA2、HA-PEI-BnLTA2、HFA-PEI-BnLTA2、Fe3O4-PEI-BnLTA2、HA-PEI-CbLTA2、HFA-PEI-CbLTA2、Fe3O4-PEI-CbLTA2、HA-PEG-BnLTA2、HFA-PEG-BnLTA2、Fe3O4-PEG-BnLTA2、HA-PEG-DdLTA2、HFA-PEG-DdLTA2、Fe3O4-PEG-DdLTA2、HA-PEG-CbLTA2、HFA-PEG-CbLTA2、Fe3O4-PEG-CbLTA2、HA-EA-CbLTA2、HFA-EA-CbLTA2和Fe3O4-EA-CbLTA2、HA-EA-DdLTA2、HFA-EA-DdLTA2和Fe3O4-EA-DdLTA2、HA-EA-BnLTA2、HFA-EA-BnLTA2和Fe3O4-EA-BnLTA2。
实施例6：PLP浓度测定
按照实施例2培养E.coli BL21(DE3)、工程菌BL-ST1和BL-ST2，并得到粗酶液。使用HPLC测定E.coli BL21(DE3)和BL-ST1和BL-ST2细胞体内PLP浓度。结果如图3所示，E.coli BL21(DE3)的胞内PLP浓度仅为9.5μmol/gDCW，而引入PLP合酶的工程菌BL-ST1和BL-ST2的胞内PLP浓度达到48.5μmol/gDCW和46.5μmol/gDCW，提高了将近5倍(图3)。
实施例7：游离酶活力测定
按照实施例2培养工程菌BL-DdLTA、BL-BnLTA、BL-CbLTA、BL-DdLTA-ST1、BL-BnLTA-ST1、BL-CbLTA-ST1、BL-DdLTA-ST2、BL-BnLTA-ST2和BL-CbLTA-ST2并得到粗酶液。测定粗酶液酶活，反应体系如下：1mL 100mM pH 8的NaOH-Gly缓冲液中加入0.1M对甲砜基苯甲醛、1M甘氨酸，加入100μL粗酶液。通过水浴控制反应温度为30℃，磁力搅拌，反应5-10分钟后利用HPLC检测酶活。结果如图4所示。苏氨酸醛缩酶和PLP合酶的共表达菌株表显出更高的催化活力。
实施例8：单质粒共表达菌株固定化酶在L-syn-对甲砜基苯丝氨酸制备中的应用
表2
Figure BDA0002665589320000071
Figure BDA0002665589320000081
按实施例4的方法获得共固定化酶。定量称取0.1M对甲砜基苯甲醛、1M甘氨酸到1L反应器中，定容到1L，并用5M NaOH调节pH至8.0，加入25g固定化酶。通过水浴控制反应温度为30℃，磁力搅拌，反应1-3h后利用液相色谱检测转换率和de值，结果如表2所示。每一批反应结束后减压过滤出固定化酶，并使用蒸馏水对固定化酶进行清洗，然后投入下一批反应。结果如表2所示，所有的固定化酶展现出了良好的稳定性，在L-syn-对甲砜基苯丝氨酸合成中部分固定化酶实现超过100次的循环使用，反应过程中不需要补加PLP。
实施例9：双质粒共表达菌株固定化酶在L-syn-对甲砜基苯丝氨酸制备中的应用
表3
Figure BDA0002665589320000082
Figure BDA0002665589320000091
按实施例5的方法获得共固定化酶。定量称取0.1M对甲砜基苯甲醛、1M甘氨酸到1L反应器中，定容到1L，并用5M NaOH调节pH至8.0，加入25g固定化酶。通过水浴控制反应温度为30℃，磁力搅拌，反应1-3h后利用液相色谱检测转换率和de值，结果如表3所示。每一批反应结束后减压过滤出固定化酶，并使用蒸馏水对固定化酶进行清洗，然后投入下一批反应。结果如表3所示，所有的固定化酶展现出了良好的稳定性，在L-syn-对甲砜基苯丝氨酸合成中部分固定化酶实现超过100次的循环使用，反应过程中不需要补加PLP。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种耦联表达L-苏氨酸醛缩酶与PLP合酶的工程菌及应用
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1023
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgatcagtt tcaagaacga ttacagcgaa ggtgcccatc cgcgtattct ggaagcactg 60
ctgaaaagta atctgattca ggaacagggt tatggtgaag atagcttttg cctgggtgcc 120
agcgaactgc tgcgcgaacg tctgggcaat aaggatctga ccattcatta tctgaccggc 180
ggtacacagg caaatctggt ggccattagc gcctttctgc gtccgcatga agccgccatt 240
gccgcacaga ccggccatat ttttgtgcat gaaaccggcg ccattgaagc aaccggccat 300
aaagtgctga ccagcgaaag caaagatggt aaactgaccc cggcacagat tcaggaagtt 360
ctgaccgcac ataccgatga acacatggtg aaaccgaaac tggtttatat tagcaatacc 420
accgaagttg gtacagttta tagtaaaagc gaactgcagg cactgagtca gttttgccgt 480
gaaaagaatc tgtatctgtt tatggatggc gcacgcctgg gtagtgccct gtgtagcgaa 540
ggcaatgatc tggatctggc agatctgccg aaactggtgg atgcctttta tattggcggt 600
acaaaaaatg gcgcactgct gggcgaagca ctggtgctgt gtaatgaagc actgaaaccg 660
gattttcgtt atcacatgaa acagaaaggt gcactgctgg ccaaaggccg tgttattggc 720
ctgcagtttc tggaactgtt tcgtgataat ctgtattttg atctggcaat tcatgcaaat 780
accatggcat ataaactgcg tgatgaactg aaagaagcag gtgttaaatt tctggccgaa 840
agtagtagta atcaggtgtt tccgattttt agcgatgcca ttgttgaaca gctgaaagtg 900
aattatcatt ttgaaatctg gggtaaagtg ggcacccaga ccgccattcg cctggttacc 960
agttgggcca cccgtgaaga agccgtggat agctttatgg cagatctgaa aaagattctg 1020
taa 1023
<210> 2
<211> 1011
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgtacagtt tcaacaacga ttacagtgaa ggcgcacatc cgcgtattct gcaggcactg 60
gtggaaagca atctgcagca ggaaattggt tatggtcagg atagttttac caataaggcc 120
gccgaagttc tgaaaaccaa aatgaatagc gatgaagttg atgtgcatct gctggttggc 180
ggtacccaga ccaatctgat tgcaattagt gcctttctgc gcccgcatga agcagcaatt 240
gcagccagta ccggtcatat ttttgttcat gaaaccggtg caattgaagc aaccggtcat 300
aaagtgatta ccgttgatgc caaatatggt aaactgaccc cgagtctggt tcagagcgtg 360
ctggatgaac ataccgatga acatatggtg aaaccgaaac tggtttatat tagcaatagt 420
accgaaattg gcaccatcta tagtaaaagc gaactggaac agctgagtca gttttgccag 480
attaataatc tgattttcta catggacggc gcccgcctgg gtagtgccct gtgtgcaaaa 540
gataatgatc tggttctgag tgattttccg aaactgctgg atgcctttta tattggcggc 600
accaaaaatg gtgcactgat gggcgaagcc ctggttatta agaatgatag tctgaaaacc 660
gatttccgtt atcatattaa gcagaaaggt gccatgctgg caaaaggccg cctgctgggt 720
attcagtttt atgaactgtt taaagacgac ctgtttttcg aactggcaga atatgccaat 780
aagatggcag aacgtctgaa tattgccctg gccgaaaaag attatcgttt tctgaccccg 840
tcaagcacca atcaggtgtt tccgattttt agtaatgaaa aaatcaccat gctgcagaaa 900
aattatcagt ttaatatctg ggagaagatc gataaagatc atagtgccat tcgtctggtg 960
accagctggg caaccaaaga agcagaagtt gaagccttta ttaatgaaat t 1011
<210> 3
<211> 1017
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgtacagct ttaagaacga ttacagtgaa ggtgcccata gccgcattct gaatgcactg 60
gttgaaacca atctggaaca gaccgatggt tatggcaccg atcagtatac cgaacgcagt 120
gttaatctgc tgaaaaagaa aattgaccgc gaagatgttg atattcatct gctggttggc 180
ggtacccagg tgaatctgac cgcaattagc gcatttctgc gcccgcatca ggcaaccatt 240
ggcgcagata ccagtcatat taattgtcat gaaaccggcg ccattgaagc aaccggtcat 300
aaagttatta ccatgaaaac caatgacggt aaactgaccc cgaatctgat tcagaatgtg 360
gttgatagtc atagtgatga acatatggtt cagccgaaac tggtttatat tagcaatagc 420
accgaactgg gcaccctgta taccaaagca gaactgattg atctgcgcga ttgttgtaaa 480
cgtaataagc tgctgctgta tctggatggt gcccgtctgg gtagcgcact ggttgccgaa 540
gaaaatgatc tgaccctggc cgatattgca aaactggttg atgcctttta tattggtggt 600
accaaaaatg gtgcactgtt tggcgaagca ctggttattt gcaatgatga actgaaagaa 660
gatttcatct atttcatcaa gcagaaaggt ggtctgctgg caaaaggtcg tctgctgggt 720
attcagtttg aagaactgtt taaagatgac ctgtattttg aactggcaaa acatgcaaat 780
aagatggcac tgatgctgaa aggtgcaatt gtggatgaag aatataaatt tctgaccgaa 840
agttttacca accagcagtt tccgattttt ccgaataatc tgattgaaaa actgagtgaa 900
aagtacagct ttaatatcga acgcgtgatt gatagtaatt ataccgccat tcgcctggtt 960
accagctggg caaccaaaga agaaattgtt ctggaattca ttgaggatct gcatctg 1017
<210> 4
<211> 1497
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggctcaaa caggtactga acgtgtaaaa cgcggaatgg cagaaatgca aaaaggcggc 60
gtcatcatgg acgtcatcaa tgcggaacaa gcgaaaatcg ctgaagaagc tggagctgtc 120
gctgtaatgg cgctagaacg tgtgccagca gatattcgcg cggctggagg agttgcccgt 180
atggctgacc ctacaatcgt ggaagaagta atgaatgcag tatctatccc ggtaatggca 240
aaagcgcgta tcggacatat tgttgaagcg cgtgtgcttg aagctatggg tgttgactat 300
attgatgaaa gtgaagttct gacgccggct gacgaagaat ttcatttaaa taaaaatgaa 360
tacacagttc cttttgtctg tggctgccgt gatcttggtg aagcaacacg ccgtattgcg 420
gaaggtgctt ctatgcttcg cacaaaaggt gagcctggaa caggtaatat tgttgaggct 480
gttcgccata tgcgtaaagt taacgctcaa gtgcgcaaag tagttgcgat gagtgaggat 540
gagctaatga cagaagcgaa aaacctaggt gctccttacg agcttcttct tcaaattaaa 600
aaagacggca agcttcctgt cgttaacttt gccgctggcg gcgtagcaac tccagctgat 660
gctgctctca tgatgcagct tggtgctgac ggagtatttg ttggttctgg tatttttaaa 720
tcagacaacc ctgctaaatt tgcgaaagca attgtggaag caacaactca ctttactgat 780
tacaaattaa tcgctgagtt gtcaaaagag cttggtactg caatgaaagg gattgaaatc 840
tcaaacttac ttccagaaca gcgtatgcaa gaacgcggct ggtaagaaca taggagcgct 900
gctgacatgt taacaatagg tgtactagga cttcaaggag cagttagaga gcacatccat 960
gcgattgaag catgcggcgc ggctggtctt gtcgtaaaac gtccggagca gctgaacgaa 1020
gttgacgggt tgattttgcc gggcggtgag agcacgacga tgcgccgttt gatcgatacg 1080
tatcaattca tggagccgct tcgtgaattc gctgctcagg gcaaaccgat gtttggaaca 1140
tgtgccggat taattatatt agcaaaagaa attgccggtt cagataatcc tcatttaggt 1200
cttctgaatg tggttgtaga acgtaattca tttggccggc aggttgacag ctttgaagct 1260
gatttaacaa ttaaaggctt ggacgagcct tttactgggg tattcatccg tgctccgcat 1320
attttagaag ctggtgaaaa tgttgaagtt ctatcggagc ataatggtcg tattgtagcc 1380
gcgaaacagg ggcaattcct tggctgctca ttccatccgg agctgacaga agatcaccga 1440
gtgacgcagc tgtttgttga aatggttgag gaatataagc aaaaggcact tgtataa 1497
<210> 5
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctttaataag gagatatacc atgatcagtt tcaagaa 37
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
taagcattat gcggccgcaa gcttttacag aatctttttc 40
<210> 7
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctttaataag gagatatacc atgggcagca gccatcacca t 41
<210> 8
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
taagcattat gcggccgcaa gcttttaaat ttcattaata aagg 44
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctttaataag gagatatacc atgtacagct ttaagaacga 40
<210> 10
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
taagcattat gcggccgcaa gcttttacag atgcagatcc tcaatg 46
<210> 17
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aatgggtcgc ggatccatgg ctcaaacagg tactg 35
<210> 18
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tttaccagac tcgagttata caagtgcctt ttg 33
<210> 11
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gatatacata tggcagatct atggctcaaa caggtactga 40
<210> 12
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gtttctttac cagactcgag ttatacaagt gccttttgc 39
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggtatatctc cttattaaag 20
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aagcttgcgg ccgcataatg ctta 24
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
taagcattat gcggccgcaa gctt 24
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ctcgagtctg gtaaagaaac 20

Claims (10)

1.一种共表达L-苏氨酸醛缩酶与PLP合酶的工程菌，其特征在于，在表达菌株中转入L-苏氨酸醛缩酶基因和PLP合酶基因而得。
2.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，L-苏氨酸醛缩酶基因的序列如SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示。
3.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，PLP合酶基因的序列如SEQ ID No.4所示。
4.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述表达菌株为大肠杆菌，将L-苏氨酸醛缩酶基因和PLP合酶基因构建在同一质粒上或者两个不同质粒上，在大肠杆菌中进行共表达。
5.如权利要求4所述的工程菌，其特征在于，当L-苏氨酸醛缩酶基因和PLP合酶基因构建在同一质粒上时，使用的质粒载体为pRSF-Duet-1；当构建在两个不同质粒上时，L-苏氨酸醛缩酶基因构建在质粒pET-23a上，而PLP合酶基因构建在pRSF-Duet-1上。
6.如权利要求1所述工程菌在制备L-syn-对甲砜基苯丝氨酸中的应用。
7.一种L-syn-对甲砜基苯丝氨酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)培养权利要求1～5任一所述工程菌，收集菌体、破碎制备粗酶液；
(2)使用交联剂预处理的固定化材料对预混液进行固定化，制得L-苏氨酸醛缩酶与辅酶PLP的共固定化酶；
(3)使用所述共固定化酶作为催化剂，以对甲砜基苯甲醛和甘氨酸为底物进行催化反应，制备L-syn-对甲砜基苯丝氨酸。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中催化反应的反应体系如下：1L100mM pH 8的NaOH-Gly缓冲液中溶解0.1M对甲砜基苯甲醛、1M甘氨酸，50-150g共固定化酶，30℃，磁力搅拌，反应1-3h。
9.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中固定化时使用的固定化载体为氨基树脂、环氧树脂或Fe3O4，交联剂为聚乙烯亚胺、聚乙二醇或乙醇胺。
10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，固定化载体使用前进行预处理，预处理方法如下：
(a)将氨基树脂、环氧树脂或Fe3O4用水溶性有机溶剂浸泡3个小时并不断搅拌，然后减压过滤取滤饼，并使用蒸馏水清洗3次；
(b)氨基树脂或Fe3O4用0.4％的戊二醛浸泡3小时并不断搅拌，然后减压过滤取滤饼，并用蒸馏水清洗3次。环氧树脂不需要此步骤；
(c)将清洗后的环氧树脂、氨基树脂或Fe3O4分别使用0.5％的聚乙烯亚胺、0.5％聚乙二醇和0.5％乙醇胺碳酸氢钙溶液浸泡3个小时进行包裹交联，温度为20℃-40℃，搅拌转速为100rpm-200rpm，然后减压过滤取滤饼，并用蒸馏水清洗3次。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110272856A (zh) * 2019-05-08 2019-09-24 江南大学 一种表达d-苏氨酸醛缩酶的重组菌及其构建方法与应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109777813A (zh) * 2019-01-25 2019-05-21 浙江工业大学 一种转氨酶-plp共固定化酶及其制备与应用
CN110106130A (zh) * 2019-05-23 2019-08-09 浙江工业大学 一种转氨酶-辅酶共固定化工程菌细胞及应用
CN110577948A (zh) * 2019-09-05 2019-12-17 福建昌生生物科技发展有限公司 一种l-苏氨酸醛缩酶及其在对甲砜基苯丝氨酸合成中的应用
CN111139230A (zh) * 2020-01-17 2020-05-12 浙江大学 一种L-苏氨酸醛缩酶突变体、基因及制备L-syn-对甲砜基苯丝氨酸的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109777813A (zh) * 2019-01-25 2019-05-21 浙江工业大学 一种转氨酶-plp共固定化酶及其制备与应用
CN110106130A (zh) * 2019-05-23 2019-08-09 浙江工业大学 一种转氨酶-辅酶共固定化工程菌细胞及应用
CN110577948A (zh) * 2019-09-05 2019-12-17 福建昌生生物科技发展有限公司 一种l-苏氨酸醛缩酶及其在对甲砜基苯丝氨酸合成中的应用
CN111139230A (zh) * 2020-01-17 2020-05-12 浙江大学 一种L-苏氨酸醛缩酶突变体、基因及制备L-syn-对甲砜基苯丝氨酸的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANA I. BENÍTEZ-MATEOS ET AL.: "Self-Sufficient Flow-Biocatalysis by Coimmobilization of Pyridoxal 5′-Phosphate and ω‑Transaminases onto Porous Carriers", 《ACS SUSTAINABLE CHEM. ENG.》 *
SUSANA VELASCO-LOZANO ET AL.: "Co-immobilized Phosphorylated Cofactors and Enzymes as Self-Sufficient Heterogeneous Biocatalysts for Chemical Processes", 《ANGEW. CHEM. INT. ED.》 *
WEICHAO MA ET AL.: "Engineering a pyridoxal 5’-phosphate supply for cadaverine production by using Escherichia coli whole-cell biocatalysis", 《SCI. REP.》 *
XIAO-JIAN ZHANG ET AL.: "A novel self-sufficient biocatalyst based on transaminase and pyridoxal 5′-phosphate covalent co-immobilization and its application in continuous biosynthesis of sitagliptin", 《ENZYME AND MICROBIAL TECHNOLOGY》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110272856A (zh) * 2019-05-08 2019-09-24 江南大学 一种表达d-苏氨酸醛缩酶的重组菌及其构建方法与应用
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