CN110577948A

CN110577948A - 一种l-苏氨酸醛缩酶及其在对甲砜基苯丝氨酸合成中的应用

Info

Publication number: CN110577948A
Application number: CN201910838613.5A
Authority: CN
Inventors: 林娟; 王力超; 许炼; 陈承滔; 赖凌燕
Original assignee: Fujian Changsheng Biotechnology Development Co Ltd
Current assignee: Fujian Changsheng Biotechnology Development Co Ltd
Priority date: 2019-09-05
Filing date: 2019-09-05
Publication date: 2019-12-17
Anticipated expiration: 2039-09-05
Also published as: CN110577948B

Abstract

本发明提供一种L‑苏氨酸醛缩酶，具有将对甲砜基苯甲醛和甘氨酸不对称催化合成(2S,3R)‑对甲砜基苯丝氨酸的活性，L‑苏氨酸醛缩酶选择自下组中任意一种：(1)具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多肽；(2)具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列≥80％同源性的多肽；(3)将SEQ ID NO：1所示氨基酸序列经过1‑5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且保留催化活性的衍生多肽。本发明还提供L‑苏氨酸醛缩酶在对甲砜基苯丝氨酸合成中的应用，挖掘筛选到来源于Actinocorallia herbida的L‑苏氨酸醛缩酶基因，采用基因工程技术表达重组大肠杆菌来源的L‑苏氨酸醛缩酶，以对甲砜基苯甲醛和甘氨酸为原料，采用全细胞催化的方法，不对称催化合成(2S,3R)‑对甲砜基苯丝氨酸，反应条件温和、对环境友好。

Description

一种L-苏氨酸醛缩酶及其在对甲砜基苯丝氨酸合成中的应用

技术领域

本发明属于生物技术和化学工程领域，具体涉及一种L-苏氨酸醛缩酶及其在对甲砜基苯丝氨酸合成中的应用。

背景技术

β-羟基-α-氨基酸是β-氨基醇类抗生素甲砜霉素和氟苯尼考、糖肽类抗生素万古霉素、抗癌药物紫杉醇以及免疫抑制剂的重要组成成分。对甲砜基苯丝氨酸是β-氨基醇类广谱抗生素甲砜霉素和氟苯尼考合成的关键手性砌块，具有2个手性中心，可形成4种手性异构体，目前已报道的活性中间体几乎都是由(2S,3R)-构型组成。如何通过不对称催化高效构建其结构中的两个相邻手性中心，开发甲砜霉素和氟苯尼考的高效绿色合成新路线一直是有机合成化学研究的重点与难点。

目前，工业上合成甲砜霉素和氟苯尼考手性中间体主要采用基于拆分策略的合成路线。首先以对甲砜基苯甲醛和甘氨酸为原料，在硫酸铜以及氨水的作用下，在70℃条件下经羟醛缩合反应(aldol reaction)合成对甲砜基苯丝氨酸铜盐，并在氯化氢气体作用下，与无水乙醇进行酯化反应得到对甲砜基苯丝氨酸乙酯，再用D-酒石酸对反应混合物进行手性拆分，得到(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸乙酯，最后通过硼氢化钙的还原获得其对应的氨基醇。该路线在合成对甲砜基苯丝氨酸铜盐时会产生大量的硫酸铜废水，另外消旋体的拆分过程也会产生大量的废水，对环境污染严重；而且通过拆分分离单一异构体，目标产物理论产率最高只能达到50％。

相较于化学合成法，生物催化法具有转化条件温和、环境友好、立体选择性强等优点。苏氨酸醛缩酶(EC 4.1.2.5,TA)是磷酸吡哆醛(PLP)依赖型酶，能催化不同取代基的醛与甘氨酸进行羟醛缩合反应，直接形成不对称C-C键，从而得到β-羟基-α-氨基酸。根据产物在C_α的构型，可将TA分成L-TA(L-苏氨酸醛缩酶)和D-TA(D-苏氨酸醛缩酶)两种，L-TA催化的产物之一便是(2S,3R)-β-羟基-α-氨基酸，参见附图4所示。

目前国内外还未见到利用L-苏氨酸醛缩酶催化对甲砜基苯甲醛和甘氨酸合成(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸的文章报道，涉及的相关专利申请文献只有1件：《苏氨酸醛缩酶、突变体及其在制备取代苯丝氨酸衍生物中的应用》(申请公布号CN 109402098 A)。但该发明申请公开了几种微生物来源的苏氨酸醛缩酶基因和氨基酸序列、突变体编码基因、几种异源表达方法(大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、酿酒酵母)；以及以苏氨酸醛缩酶或苏氨酸醛缩酶的突变体为催化剂，以2-/3-/4-位取代的苯甲醛为底物，以5-磷酸吡哆醛为辅酶，以甘氨酸/甘氨酸酯为辅底物，控制温度和搅拌速度的条件下，在反应介质里进行酶催化，制备2-/3-/4-位取代的苯丝酸衍生物。该专利申请涉及的内容繁多，但却缺乏具体的实验数据支撑，2张附图没有标品、不同手性的对甲砜基苯丝氨酸的出峰时间和构型说明，无法判断其ee值、de值和构型；而且该方案需要将成功重组后的大肠杆菌超声破碎并提取纯酶液作为催化剂，流程繁琐且成本很高。

综上所述，现在需要寻找一种β-氨基醇类抗生素手性中间体的不对称生物催化合成方法，解决现有技术中有机合成方法所存在的生产步骤繁琐、反应条件剧烈、生产成本高、环境污染大等技术瓶颈问题。

发明内容：

本发明目的是提供一种β-氨基醇类抗生素手性中间体的不对称生物催化合成方法，解决现有技术中有机合成方法所存在的生产步骤繁琐、反应条件剧烈、生产成本高、环境污染大等技术瓶颈问题。

为实现以上目的，本发明采用如下技术方案：

一种L-苏氨酸醛缩酶，具有将对甲砜基苯甲醛和甘氨酸不对称催化合成(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸的活性，所述L-苏氨酸醛缩酶选择自下组中任意一种：

(1)具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多肽；

(2)具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列≥80％同源性的多肽；

(3)将SEQ ID NO：1所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且保留催化活性的衍生多肽。

优选的，所述L-苏氨酸醛缩酶的编码基因的核心序列为来源于Actinocoralliaherbida的LTA基因，所述核心序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供一种采用所述编码基因所构建的重组表达质粒载体。

本发明还提供一种包含所述重组表达质粒载体的重组大肠杆菌。

本发明还提供上述L-苏氨酸醛缩酶在对甲砜基苯丝氨酸合成中的应用，对甲砜基苯丝氨酸不对称催化合成反应中的催化剂为L-苏氨酸醛缩酶全细胞，所述L-苏氨酸醛缩酶全细胞为通过基因工程手段表达如权利要求2中所述L-苏氨酸醛缩酶编码基因的重组大肠杆菌的全细胞。

优选的，对甲砜基苯丝氨酸合成反应的体系包括：对甲砜基苯甲醛、甘氨酸、磷酸吡哆醛、30％乙腈(v/v)的PBS缓冲液、以及所述L-苏氨酸醛缩酶全细胞，25℃-35℃下反应4-12h。

优选的，对甲砜基苯丝氨酸合成反应体系中各原料的质量摩尔浓度之比为对甲砜基苯甲醛：甘氨酸：磷酸吡哆醛＝1～1.5：2～3：0.0001～0.0002，其中反应体系中所述重组大肠杆菌的全细胞浓度为10～13mg/mL。

优选的，所述L-苏氨酸醛缩酶全细胞的制备方法包括：

S1、构建包含所述L-苏氨酸醛缩酶编码基因序列的重组表达质粒载体；

S2、将步骤S1中的重组表达质粒载体转化至大肠杆菌的感受态细胞中，并培养过夜；

S3、收集步骤S2中培养后的大肠杆菌菌体，即获得所述L-苏氨酸醛缩酶全细胞。

优选的，所述对甲砜基苯丝氨酸不对称催化合成反应体系的配置方法为：在反应容器中先加入磷酸盐缓冲液，然后分别称取对甲砜基苯甲醛、甘氨酸、磷酸吡哆醛并依次投入反应瓶中，充分混匀后，再加入重组大肠杆菌的全细胞，振荡反应。

优选的，所述L-苏氨酸醛缩酶不对称催化合成对甲砜基苯丝氨酸的反应体系达到预定的反应时间后，将反应液在8000-10000rpm离心3-6min，除去细胞沉淀，收集的上清液即为含有对甲砜基苯丝氨酸的催化产物。

本发明的方案至少具有以下有益效果：

本发明通过基因挖掘技术筛选到一种新型的L-苏氨酸醛缩酶基因(GenBankNo.WP_123664127-1)，和已报道的L-苏氨酸醛缩酶氨基酸序列相似性低于70％；采用基因工程手段在大肠杆菌中表达了Actinocorallia herbida来源的L-苏氨酸醛缩酶；以对甲砜基苯甲醛和甘氨酸为底物，采用重组大肠杆菌全细胞不对称催化合成了(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸，参与反应的对甲砜基苯甲醛底物浓度可高达500mM，该催化体系的反应时间短，仅需反应6h，目标产物的ee值>99.9％、de值62.3％、底物转化率可达75.7％；同时催化后的产物对环境友好，是一种绿色生物合成方法。

附图说明

图1为实施例1中L-苏氨酸醛缩酶(GenBank No.WP_123664127-1)与已报道的L-苏氨酸醛缩酶氨基酸序列的相似性比对结果；

图2为实施例1中通过SDS-PAGE检测重组大肠杆菌中L-苏氨酸醛缩酶蛋白的表达结果；

图3为实施例2中反应产物(2S，3R)-对甲砜基苯丝氨酸的HPLC检测图；其中：

(A)：(2S，3R)-对甲砜基苯丝氨酸标品，340nm检测，T_(2S,3R)＝6.489min；

(B)：340nm检测，T_(2S,3R)＝6.496min，T_(2S,3S)＝7.567min；(C)：236nm检测，T_(2S,3R)＝6.498min，T_(2S,3S)＝7.568min，T_{对甲砜基苯甲醛}＝10.977min；

图4为实施例1中对甲砜基苯甲醛和甘氨酸在L-苏氨酸醛缩酶催化下生成(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸的反应路线示意图；

图5为实验例3中反应温度对产物(2S，3R)-对甲砜基苯丝氨酸的转化率和de值的影响；

图6为实验例4中底物浓度对产物(2S，3R)-对甲砜基苯丝氨酸的转化率和de值的影响；

图7为实验例5中细胞浓度对产物(2S，3R)-对甲砜基苯丝氨酸的转化率和de值的影响；

图8为实验例6中反应时间对产物(2S，3R)-对甲砜基苯丝氨酸的转化率和de值的影响。

具体实施方式

以下提供本发明的优选实施例，以助于进一步理解本发明。本领域技术人员应了解到,本发明实施例的说明仅是示例性的，并不是为了限制本发明的方案。

实施例1 L-苏氨酸醛缩酶的重组表达

通过基因挖掘筛选到一种新型的L-苏氨酸醛缩酶基因(GenBank No.WP_123664127-1)，该基因编码的氨基酸序列和已报道的L-苏氨酸醛缩酶(见表1)氨基酸序列相似性低于70％，参见附图1中的比对结果。

表1 已文献报道的L-苏氨酸醛缩酶信息表

本实施例中的L-苏氨酸醛缩酶由Actinocorallia herbida来源的LTA基因(GenBank No.WP_123664127-1)编码，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1。申请人根据L-苏氨酸醛缩酶的氨基酸序列进行密码子优化，获得优化后的LTA碱基序列为SEQ ID NO：2。通过人工合成优化后的LTA基因DNA序列，进一步将LTA基因连接到质粒pET28a上构建重组质粒pET28a-LTA，并将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)进行异源表达。

在平板上挑取含有重组质粒的单克隆接种到25mL LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)中，37℃、200rpm过夜培养。移取5mL种子液转接到500mLLB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)中，37℃、200rpm条件下培养。当重组大肠杆菌培养液的OD600达到0.6～0.8时，加入终浓度为0.2mM IPTG(异丙基硫代半乳糖苷，Isopropylβ-D-Thiogalactoside)，在20℃条件下诱导表达18h。然后将培养液于4℃、6000rpm离心5min，收获菌体。

通过SDS-PAGE检测L-苏氨酸醛缩酶的蛋白表达情况，结果如附图2所示。其中：M为蛋白Marker；Control为未加IPTG诱导的重组大肠杆菌；LTA为添加0.2mM IPTG诱导的重组大肠杆菌。由图2结果可知，LTA组在38kDa附近出现目的蛋白条带，而Control组则未出现该条带，说明LTA蛋白在重组大肠杆菌中表达成功。本实施例中涉及的密码子优化、构建重组表达质粒载体、转化大肠杆菌感受态及培养、诱导等操作属于基因工程技术领域的通用技术操作，因此在此对各个步骤和过程不进行详细阐述。

实施例2(2S，3R)-对甲砜基苯丝氨酸的催化合成

采用实施例1中获得的重组大肠杆菌的全细胞，并配置300mL的对甲砜基苯丝氨酸合成反应体系：分别称取27.6g对甲砜基苯甲醛、37.5g甘氨酸，6.7mg磷酸吡哆醛，投入1L反应瓶中，瓶中预先加入含30％乙腈(v/v)的磷酸盐缓冲液(200mM，pH7)300mL。充分混匀后，称取实施例1中收获重组大肠杆菌细胞3.75g(湿重)，在30℃振荡反应6h。反应结束后，8000rpm离心5min收集含有产物的上清液。在其他实施例中也可以用适量磷酸盐缓冲液(200mM、pH7.0)将实施例1中收获的重组大肠杆菌先进行重悬，然后再加入到反应体系中。

重组大肠杆菌所表达的L-苏氨酸醛缩酶为胞内酶，上述反应体系以全细胞为载体进行催化，因此无需进行细胞破碎以及蛋白纯化。在催化反应过程中，底物会透过细胞膜与酶进行反应，而生成的产物则通过细胞膜排到细胞外，整个催化反应是在细胞内进行，更加高效稳定可靠。

L-苏氨酸醛缩酶全细胞不对称催化合成(2S，3R)-对甲砜基苯丝氨酸的反应路线示意图为附图4所示，为了检验L-苏氨酸醛缩酶全细胞不对称催化合成(2S，3R)-对甲砜基苯丝氨酸的结果，将上述反应后含有产物的上清液采用HPLC检测。操作步骤如下：

配置溶液：A液：称取0.256g邻苯二甲醛(OPA)加入50mL甲醇中，振荡充分溶解；B液：称取0.1g N-乙酰半胱氨酸(NAC)溶解于20mL缓冲液(0.2M硼酸，0.2M氯化钾)；取5mL A液与B液混匀，4℃条件下避光保存。

将反应上清液与OPA/NAC衍生化试剂按1:4(v/v)充分混匀后，室温下避光放置10min后进行HPLC检测。HPLC检测条件为：检测波长：236和340nm；色谱柱：Agilent C18column(250×4.6mm，5μm)；流动相：50mM KH₂PO₄(pH 8.0)/乙腈(79/21，v/v)；流速：1mL/min，温度：30℃；上样：20μL。

标品(2S，3R)-对甲砜基苯丝氨酸乙酯购买自源叶生物，纯度>99％，CAS号：120-47-8，碱性条件下水解获得(2S，3R)-对甲砜基苯丝氨酸，检测结果如附图3所示。产物(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸和(2S,3S)-对甲砜基苯丝氨酸的出峰时间分别为6.496min和7.567min，对映体过量ee>99.9％；非对映体过量de值为62.3％，底物转化率(以参加反应的底物量计算)为75.7％。对映体过量、非对映体过量的计算公式分别为：

其中(2R,3S)和(2R,3R)的含量<0.01％。

设计实验，通过实验例1至6探索L-苏氨酸醛缩酶全细胞催化合成(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸的最优条件。

实验例1 L-苏氨酸醛缩酶催化羟醛缩合反应的底物特异性

为探索L-TA对不同苯环取代基底物的催化活性，设计了以下实验。以不同苯环取代基的苯甲醛和甘氨酸为底物，全细胞催化合成(2S,3R)-苯基丝氨酸衍生物。反应条件为：不同苯环取代基的苯甲醛100mM，细胞浓度50mg/mL，30％乙腈，37℃反应4h，实验结果如表2所示。以苯甲醛(entry1)为底物进行反应，底物的转化率为67％，产物的de值为17％；以硝基苯甲醛(entries2-4)、溴基苯甲醛(entries5-7)、氯基苯甲醛(entries8-10)、氟基苯甲醛(entries11-13)为底物进行反应，当底物苯环上基团的取代位置为邻位时，其底物转化率和产物de值均为最佳，转化率均可达到68％以上，产物de值均可达到40％以上；而当底物的基团取代位置为间位或对位时，产物的de值较低，大都在20％左右，而底物的转化率也随之下降；当苯环上的对位取代基为甲砜基(entry14)时，产物的de值仅为10％，但是转化率可达95％；当苯环取代基为氮(entries16-18)、羟基(entries19-23)以及甲基(entry24)时，则未检测到产物的生成。可见，L-苏氨酸醛缩酶对不同底物的特异性和催化效率是不同的。

表2 L-TA催化合成(2S,3R)-苯基丝氨酸衍生物的底物特异性

实验例2不同有机溶剂对L-TA转化率和de值的影响

为探索不同有机溶剂对L-TA催化合成(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸转化率和de值的影响，设计了以下实验。反应条件为：对甲砜基苯甲醛200mM、细胞浓度50mg/mL、37℃反应4h，实验结果如下表3所示。在没有添加有机溶剂的试验组中，底物转化率仅为21.2％，产物de值为16％，而当在反应体系中加入有机溶剂后，底物的转化率以及产物的de值均有不同程度的提高。其中MeOH、EtOH、DMSO这3组中，转化率随有机溶剂浓度变化明显，而其他3组的变化幅度则较小；在MeOH试验组中，产物de值随有机溶剂浓度提高的变化较明显，而其他5组的变化幅度较小；在30％的有机浓度下，MeOH、EtOH以及CH₃CN的底物转化率均能达到85％以上，其他3组则在80％以下，其中CH₃CN的底物转化率最高，可达到89％，且产物的de值也最佳，为32％。因此后续实验选择有机溶剂为30％乙腈。

表3 有机溶剂对L-TA转化率和de值的影响

实验例3不同温度对L-TA转化率和de值的影响

为探索不同温度对L-TA转化率和de值的影响，设计了以下实验。反应条件为：对甲砜基苯甲醛200mM、细胞浓度50mg/mL、30％乙腈、反应4h，实验结果如附图5所示。随着反应温度的升高，底物转化率并没有明显变化，均维持在92％左右。但产物de值随温度变化明显，当反应温度为20℃时，产物de值仅为10％；随着温度升高，产物de值也随着升高，在反应温度为30℃时，产物de值达到最高，为31.4％；进一步提高温度，产物de值开始下降，在反应温度为45℃时，产物de值仅为8％。因此选择反应温度为30℃。

实验例4对甲砜基苯甲醛浓度对L-TA转化率和de值的影响

为探索底物对甲砜基苯甲醛浓度对L-TA转化率和de值的影响，设计了以下实验。反应条件为：细胞浓度50mg/mL、30％乙腈、30℃反应4h，实验结果如附图6所示。随着底物浓度的升高，在相同时间内底物转化率呈现下降的趋势；当底物浓度在100mM以下时，产物以(2S,3S)-对甲砜基苯丝氨酸为主，即de值为负值；将底物浓度提高到100mM以上时，则以目标产物(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸为主，而且随着底物浓度的增加，产物de值也同样升高，在底物浓度为500mM时产物的de值达到56％，底物的转化率为72％，进一步提高底物浓度产物de值无明显变化。因此选择底物浓度为500mM。

实验例5不同细胞浓度对L-TA转化率和de值的影响

为探索不同细胞浓度对L-TA转化率和de值的影响，设计了以下实验。反应条件为：对甲砜基苯甲醛500mM、30％乙腈、30℃反应4h，实验结果如附图7所示。随着细胞浓度的增加，底物转化率不断上升，当细胞浓度达到12.5mg/mL时，转化率上升趋于平缓；而产物de值在细胞浓度为2.5～12.5mg/mL时呈现上升的趋势，进一步提高细胞浓度，产物de值无明显变化。因此选择细胞浓度为12.5mg/mL。

实验例6不同反应时间对L-TA转化率和de值的影响

为探索不同反应时间对L-TA转化率和de值的影响，设计了以下实验。反应条件为：对甲砜基苯甲醛500mM、细胞浓度12.5mg/mL、30％乙腈、30℃反应，实验结果如附图8所示。随着反应时间的增加，底物转化率以及产物de值均呈上升趋势，当反应时间达到6h后，转化率以及de值则无明显变化，即使将反应时间延长至24h，底物转化率与产物de值也与6h相差无几，底物转化率维持在75％，而de值则维持在60％。因此选择反应时间为6h。

根据以上结果，确定L-TA催化反应条件为：对甲砜基苯甲醛500mM、细胞浓度12.5mg/mL、30％乙腈、30℃反应6h。

综合上述实验可知，优化后的全细胞催化反应体系和条件为：对甲砜基苯甲醛500mM，甘氨酸1M，磷酸吡哆醛50μM，重组大肠杆菌细胞浓度12.5mg/mL，反应缓冲液为含有30％乙腈(v/v)的磷酸盐缓冲液(200mM，pH 7.0)，反应温度和反应时间分别为30℃和6h。

最后应当说明的是，以上实施例仅用于说明本申请的技术方案而非对其保护范围的限制，尽管参照上述实施例对本申请进行了详细的说明，所述领域的普通技术人员应当理解：本领域技术人员阅读本申请后依然可对申请的具体实施方式进行种种变更、修改或等同替换，但以上变更、修改或等同替换，均在本申请的待授权或待批准之权利要求保护范围之内。

序列表

<110> 福建昌生生物科技发展有限公司

<120> 一种L-苏氨酸醛缩酶及其在对甲砜基苯丝氨酸合成中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 349

<212> PRT

<213> Actinocorallia herbida

<400> 1

Met Ser Thr Leu His Asp Pro Ser Ser Arg Gly Phe Ala Ser Asp Asn

1 5 10 15

Tyr Ala Gly Ile His Pro Glu Val Leu Ala Ala Ile Val Ala Ala Asn

20 25 30

Asp Gly His Gln Ile Ala Tyr Gly Asp Asp Val Tyr Thr Ala Arg Leu

35 40 45

Gln Glu Val Val Arg Gly His Phe Gly Glu Ser Ala Glu Ala Phe Pro

50 55 60

Val Phe Asn Gly Thr Gly Ala Asn Val Val Ala Leu Ser Ala Ala Thr

65 70 75 80

Arg Arg Trp Ser Ala Val Ile Ala Ala Glu Thr Ala His Ile Asn Val

85 90 95

Asp Glu Gly Gly Ala Pro Glu Lys Val Ala Gly Ile Lys Ile Trp Thr

100 105 110

Ile Pro Thr Pro Asp Gly Lys Leu Thr Pro Ala Leu Leu Glu Arg Gln

115 120 125

Ala Trp Gly Trp Gly Asp Glu His Arg Ala Gln Pro His Val Val Ser

130 135 140

Ile Thr Gln Thr Thr Glu Leu Gly Thr Arg Tyr Thr Pro Glu Glu Ile

145 150 155 160

Ala Glu Ile Thr Ser Tyr Ala His Glu Arg Asn Met Leu Val His Leu

165 170 175

Asp Gly Ala Arg Ile Ser Asn Ala Ala Ala Thr Leu Asp Leu Pro Ile

180 185 190

His Ala Phe Thr Thr Asp Ala Gly Val Asp Leu Val Ser Leu Gly Gly

195 200 205

Thr Lys Asn Gly Ala Met Leu Gly Glu Ala Val Val Thr Leu Asn Pro

210 215 220

Glu Val Thr Pro Ser Leu Lys Tyr Leu Arg Lys Ser Ala Met Gln Leu

225 230 235 240

Ala Ser Lys Met Arg Phe Val Ser Ala Gln Leu Val Ala Leu Tyr Glu

245 250 255

Gly Asp Leu Trp Leu Arg Asn Ala Arg His Ala Asn Ala Met Ala Arg

260 265 270

Arg Leu Ala Asp Ala Val Thr Gly Leu Pro Gly Met Glu Ile Ser Arg

275 280 285

Pro Val Gln Ala Asn Ala Val Phe Ala Val Leu Pro Arg Asp Val Thr

290 295 300

Glu Arg Leu Gln Lys Arg Phe Arg Phe Tyr Thr Trp Asp Glu Gln Thr

305 310 315 320

Gly Glu Val Arg Trp Met Ala Ser Phe Asp Thr Thr Glu Ser Asp Ile

325 330 335

Asp Thr Phe Ala Ala Ala Val Ala Ala Glu Leu Gly Ala

340 345

<210> 2

<211> 1050

<212> DNA

<213> Actinocorallia herbida

<400> 2

atgagcaccc tgcatgatcc gagcagccgt ggttttgcaa gcgataatta tgcaggtatt 60

catccggaag ttctggcagc aattgttgca gcaaatgatg gtcatcagat tgcctatggt 120

gatgatgttt ataccgcacg tctgcaagaa gttgttcgcg gtcattttgg tgaaagcgca 180

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acaccggcac tgctggaacg tcaggcatgg ggttggggtg atgaacatcg tgcacagccg 420

catgttgtta gcattaccca gaccaccgaa ctgggcaccc gttatacacc ggaagaaatt 480

gccgaaatca ccagctatgc acatgaacgc aatatgctgg ttcatctgga tggtgcacgt 540

attagcaatg cagcagcgac cctggatctg ccgattcatg catttaccac cgatgccggt 600

gttgatctgg ttagcttagg tggcaccaaa aatggtgcaa tgctgggtga agcagttgtt 660

accctgaatc ctgaagttac cccgagcctg aaatatctgc gtaaaagcgc catgcagctg 720

gcaagcaaaa tgcgttttgt tagcgcacag ctggttgcac tgtatgaagg tgatctgtgg 780

ctgcgtaatg cacgtcatgc aaatgcaatg gcacgtcgtc tggcagatgc agttaccggt 840

ctgcctggta tggaaattag ccgtccggtt caggcaaatg cagtttttgc agttctgcct 900

cgtgatgtta ccgaacgcct gcagaaacgt tttcgttttt atacctggga tgaacagacc 960

ggtgaagttc gttggatggc aagctttgat accaccgaaa gcgatattga tacctttgca 1020

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Claims

1.一种L-苏氨酸醛缩酶，具有将对甲砜基苯甲醛和甘氨酸不对称催化合成(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸的活性，其特征在于，所述L-苏氨酸醛缩酶选择自下组中任意一种：

(1)具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多肽；

(2)具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列≥80％同源性的多肽；

2.权利要求1所述的L-苏氨酸醛缩酶的编码基因，其特征在于，所述L-苏氨酸醛缩酶的编码基因的核心序列为来源于Actinocorallia herbida的LTA基因，所述核心序列如SEQID NO：2所示。

3.采用权利要求2中的所述编码基因所构建的重组表达质粒载体。

4.包含权利要求3中所述重组表达质粒载体的重组大肠杆菌。

5.L-苏氨酸醛缩酶在对甲砜基苯丝氨酸合成中的应用，其特征在于，对甲砜基苯丝氨酸不对称催化合成反应中的催化剂为L-苏氨酸醛缩酶全细胞，所述L-苏氨酸醛缩酶全细胞为通过基因工程手段表达如权利要求2中所述L-苏氨酸醛缩酶编码基因的重组大肠杆菌的全细胞。

6.根据权利要求5中所述L-苏氨酸醛缩酶在对甲砜基苯丝氨酸合成中的应用，其特征在于，对甲砜基苯丝氨酸合成反应的体系包括：对甲砜基苯甲醛、甘氨酸、磷酸吡哆醛、30％乙腈(v/v)的PBS缓冲液、以及所述L-苏氨酸醛缩酶全细胞，25℃-35℃下反应4-12h。

7.根据权利要求6所述的L-苏氨酸醛缩酶在对甲砜基苯丝氨酸合成中的应用，其特征在于，对甲砜基苯丝氨酸合成反应体系中各原料的质量摩尔浓度之比为对甲砜基苯甲醛：甘氨酸：磷酸吡哆醛＝1～1.5：2～3：0.0001～0.0002，其中反应体系中所述重组大肠杆菌的全细胞浓度为10～13mg/mL。

8.根据权利要求5所述的L-苏氨酸醛缩酶在对甲砜基苯丝氨酸合成中的应用，其特征在于，所述L-苏氨酸醛缩酶全细胞的制备方法包括：

S3、收集步骤S2中培养后的大肠杆菌菌体，即获得所述的L-苏氨酸醛缩酶全细胞。

9.根据权利要求8所述的L-苏氨酸醛缩酶在对甲砜基苯丝氨酸合成中的应用，其特征在于，所述对甲砜基苯丝氨酸不对称催化合成反应体系的配置方法为：在反应容器中先加入磷酸盐缓冲液，然后分别称取对甲砜基苯甲醛、甘氨酸、磷酸吡哆醛并依次投入反应瓶中，充分混匀后，再加入重组大肠杆菌的全细胞，振荡反应。

10.根据权利要求9所述的L-苏氨酸醛缩酶在对甲砜基苯丝氨酸合成中的应用，其特征在于，所述L-苏氨酸醛缩酶不对称催化合成对甲砜基苯丝氨酸的反应体系达到预定的反应时间后，将反应液在8000-10000rpm离心3-6min，除去细胞沉淀，收集的上清液即为含有对甲砜基苯丝氨酸的催化产物。