CN109777813A - 一种转氨酶-plp共固定化酶及其制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及以环氧树脂为载体，将含有转氨酶与辅酶磷酸吡哆醛(简称PLP)一起共价固定化的获得的转氨酶‑PLP共固定化酶及其制备方法，以及该共固定化转氨酶在制备西他列汀药物手性中间体中的应用。本发明采用转氨酶‑PLP共固定化酶为催化剂，稳定性好，使用寿命长，有机溶剂耐受性好，可多次重复利用，并且反应过程中无需昂贵的外源辅酶添加，大幅度降低生产成本。本方法工艺简单，成本低廉，产品产率与纯度高，在西他列汀手性中间体的工业化生产中具有极高应用价值。

Description

一种转氨酶-PLP共固定化酶及其制备与应用

(一)技术领域

本发明涉及一种转氨酶-PLP共固定化酶及其制备方法，以及其在不对称还原制备西他列汀中间体中的应用。

(二)背景技术

糖尿病是与心血管和恶性肿瘤并列的三大非传染性慢性疾病之一，严重危害人类健康和社会发展。世界卫生组织于2016年首次发布全球糖尿病报告，显示全球糖尿病成年人患者近40年内增加了3倍，其中多数生活在发展中国家。2014年全球18岁以上人群中，糖尿病患者达4.22亿人，占全球总人口的8.5％。中国成年人患糖尿病率接近10％。西他列汀(Sitagliptin)，是一种新型二肽基肽酶-Ⅳ(DPP-4)抑制剂类药物，可有效治疗Ⅱ型糖尿病，与传统药物相比，具有血糖控制稳定、无体重增加及引起水肿等常见副作用的优点。年均全球的销售额均在40亿美元以上，是全球最畅销的Ⅱ型糖尿病治疗药物，市场价值巨大。

西他列汀的合成关键在于手性胺基团的构建，传统的合成方法是以手性铑化物为催化剂不对称氢化烯胺获得手性胺结构，制备西他列汀。该方法存在产物光学纯度低、废液重金属含量高、反应的设备要求较高、能耗大等不足。相比化学合成，利用转氨酶(Aminotransferase，transaminase，ATs，EC 2.6.1.X)催化不对称氨基转换反应制备合成手性胺，具有条件温和、效率高，化学选择性、区域选择性以及对映体选择性高等突出优点。2010年Merck公司开发了ω-转氨酶催化制备西他列汀的绿色合成路线，该路线与不对称氢化法相比提高了53％的产量和10％～13％的转化率，同时减少了19％的废物排放(2010,Savile C K,Science)。2017年程峰等人筛选、改造得到一株新型R型ω-转氨酶，在辅酶磷酸吡哆醛(Pyridoxal 5'-monophosphate，PLP)的参与下，直接催化异丙胺和西他列汀前体酮进行转氨反应生成西他列汀，其转化率可以达到91％，e.e.>99％(CN201710543569.6)。但该技术在工业应用中仍显现诸多不足，如游离转氨酶稳定性低，后期速率下降；酶制剂不可循环利用；反应液中存在大量游离蛋白，萃取困难，产物收率低等问题。

利用固定化技术将酶固定在载体上，可增强酶的稳定性，提高转氨酶对有机溶剂、机械剪切力耐受，避免细胞破裂后内容物释放至反应体系，降低对产物纯化工艺造成的影响，达到生物催化剂循环利用，简化后处理工艺，降低“三废”排放等目标。2007年Yi将转氨酶固定在壳聚糖上，转氨酶的固定化效率为54.3％，在温度37-50℃条件下固定化酶具有良好的热稳定性(Yi，et al.,2007,Process Biochemistry)。2010年Dominik通过溶胶-凝胶/Celite 545固定转氨酶(包埋法)制备固定化转氨酶，重复使用8个批次后，酶活保留78％，固载酶量较少，回收批次较少，无法实现工业化应用(Dominik et al.,2010,Journal ofMolecular Catalysis B:Enzymatic)。2012年Truppo等人采用疏水吸附树脂对转氨酶进行固定化，西他列汀前体酮底物浓度200g/L，反应10个批次，反应时间200h，转化率大于80％，且ee值大于99％，酶活几乎没有损失。但是所用固定化载体价格昂贵，反应批次仍未达到工业应用水平(Truppo et al.,2012,ChenCatChem)。2016年HongHuaJia通过合成了平均粒径在30-40nm之间的磁性PVA-Fe₃O₄纳米粒子作载体，并用戊二醛交联固定转氨酶。在催化R-α-MBA时达到更宽的pH范围为6-8，并且在60℃下也具有更好的热稳定性。但是其制备固定化载体时所用温度较高以及试剂(浓盐酸)比较危险且制备步骤比较繁琐；反应在进行到13批后酶活下降到50％；反应转化率较低只有80％左右(Jia et al.,2016,BiotechnologyReports)。

目前国内外在转氨酶固定化及制备包括西他列汀在内的手性胺中间体合成研究较少，相关研究存在着酶活回收率低、固定化酶制备成本高、催化活力不理想、稳定性差等问题，严重限制了固定化生物催化剂在手性胺药物中间体的生产中的应用。而且用于西他列汀的生物合成的报道过均需添加额外的辅酶PLP，这样就进一步加大了生产成本，增加了工业化生产的难度。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种以环氧树脂为载体，将含有转氨酶与辅酶磷酸吡哆醛(简称PLP)一起共价固定化获得转氨酶-PLP共固定化酶的方法，以及该共固定化转氨酶在制备西他列汀药物手性中间体中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种转氨酶-PLP共固定化酶，其特征在于所述共固定酶由按下方法制备获得：

(1)SEQ ID NO.1所示核苷酸(其编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所2所示)序列转化到宿主菌大肠杆菌中，得到基因工程菌经发酵培养，获得湿菌体悬浮于的pH 7.0～9.0缓冲液中得到菌悬液，菌悬液经细胞破碎、离心，得到转氨酶粗酶液；

(2)环氧树脂用蒸馏水浸泡12～18h，抽滤取滤饼，得到预处理后的环氧树脂备用；

(3)粗酶液中加入0.1～8mM的辅酶磷酸吡哆醛，加入步骤(2)预处理后的环氧树脂，环氧树脂添加量为20～30mg/100mL粗酶液；

(4)在15～45℃、200～300rpm条件下水浴搅拌固定化6～48h，抽滤，滤饼用pH 7.0～9.0缓冲液清洗两次，抽滤去除缓冲液，即得所述转氨酶-PLP共固定化酶。

本发明方法采用共价固定化技术，可实现共固定化转氨酶与辅酶的高效制备，所得共固定化转氨酶酶活回收率高、稳定性好、有机溶剂耐受性强、成本低廉。将所得共固定化转氨酶应用于催化西他列汀前体酮反应体系中，实现了化西他列汀的连续稳定生产，大幅降低反应成本。

所述pH 7.0～9.0缓冲液为Tris-HCl、甘氨酸-NaOH、PB、Na₂CO₃-NaHCO₃或三乙醇胺-HCl缓冲液，优选为pH9.0的Tris-HCl缓冲液。

步骤(1)菌悬液浓度为50～150g/L，优选为100g/L。

步骤(1)湿菌体按如下方法制得：将转氨酶基因工程菌接种至含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃、200rpm下培养8h作为种子液，再以体积浓度10％接种量(种子液占发酵培养基体积百分比)接种至新鲜的含有终浓度50μ/mL卡那霉素抗性的发酵培养基中，于37℃、500rpm下培养至菌体OD₆₀₀达6～8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃下诱导培养11h，发酵液4℃、8000rpm离心10min，弃去上清液，收集沉淀，即获得转氨酶基因工程菌湿菌体。

发酵培养基配方(g/L)：蛋白胨20，酵母粉15，NaCl 10，(NH₄)₂SO₄ 3，甘油20，KH₂PO₄1.36，K₂HPO₄·3H₂O 2.28，MgSO₄·7H₂O 0.7，pH 7.0。

本发明中，所述树脂为西安蓝晓科技公司生产的环氧树脂，型号为LX-1000HFA。

本发明还涉及所述转氨酶-PLP共固定化酶的制备方法，所述方法包括：

(1)SEQ ID NO.1所示核苷酸序列转化到宿主菌大肠杆菌中，得到基因工程菌经发酵培养，获得湿菌体悬浮于的pH 7.0～9.0缓冲液中得到菌悬液，菌悬液经细胞破碎、离心，得到转氨酶粗酶液；

(2)环氧树脂用蒸馏水浸泡12～18h，抽滤取滤饼，得到预处理后的环氧树脂备用；

(3)粗酶液中加入0.1～8mM的辅酶磷酸吡哆醛，加入步骤(2)预处理后的环氧树脂，环氧树脂添加量为20～30mg/100mL粗酶液；

(4)在15～45℃、200～300rpm条件下水浴搅拌固定化6～48h，抽滤，滤饼用pH 7.0～9.0缓冲液清洗两次，抽滤去除缓冲液，即得所述转氨酶-PLP共固定化酶。

本发明还涉及所述的转氨酶-PLP共固定化酶在不对称还原制备西他列汀中间体中的应用，反应式如下：

具体的，所述应用为：以转氨酶-PLP共固定化酶为催化剂，以(3R)-3-酮基-1-[3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮为底物，以二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、乙醇、乙腈、甲醇、异丙醇或四氢呋喃为助溶剂，于pH 9.0、100mM三乙醇胺缓冲液中，以丙氨酸、异丙胺、二乙胺、氨水、甘氨酸、谷氨酸或三乙胺氨基为氨基供体，在20～50℃、400～700rpm条件下反应12～36h，制得西他列汀中间体(3R)-3-氨基-1-[3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮。

助溶剂体积用量为20～80％(助溶剂/助溶剂与缓冲液体积之和)。

所述转氨酶-PLP共固定化酶用量为50～300g/L反应体系，底物终浓度为25～150g/L，氨基供体摩尔浓度为底物的2～16倍。

优选的，所述助溶剂为二甲基亚砜、体积用量为50％，所述氨基供体为异丙胺、摩尔浓度为底物的8倍。

本发明转氨酶-PLP共固定化酶酶活的定义：在45℃，每小时催化底物生成1μmol产物所需要的酶量即为1个酶活力单位，用U表示。

本发明中产物的检测方法：液相色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6*150mm，5-Micron)，流动相为10mM乙酸铵：乙腈(50:50)，流速：1.0mL/min，柱温：40℃，保留时间：产物：2.2min；西他列汀前体酮底物：3.2min，检测波长：205nm。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种转氨酶-PLP共固定化酶，所述共固定化酶的酶活回收>80％。以共固定化酶作为生物催化剂进行西他列汀手性中间体的生物催化制备，底物浓度达150g/L，反应24h，底物转化率在99％以上，产物e.e.＞99％。将共固定化酶填充到填充床生物反应器中进行西他列汀的生物催化，重复进行了700批次，转化率均大于90％，产物e.e.＞99.9％。与现有技术相比，本发明催化西他列汀中间体合成时无需额外辅酶添加，产品产率与纯度高，并且可简化工艺步骤，减少“三废”排放，能够降低生产成本的20％，且具备大规模应用的潜力，在西他列汀手性中间体的工业化生产中具有极高应用价值。

(四)附图说明

图1为PMD18-T-BgTA重组质粒物理图谱；

图2为pET28b-BgTA重组质粒物理图谱；

图3为填充床生物反应器重复反应批次。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：树脂的预处理

a、环氧树脂预处理：取环氧树脂LX-1000HFA(购自西安蓝晓科技新材料股份有限公司)100g，用500mL蒸馏水浸泡12h后抽滤取滤饼，即为预处理后的树脂，4℃保存待用。

b、氨基树脂预处理：

①溶液配制：

0.1M pH 8.0的缓冲液配置(1L)：1L去离子水加入磷酸氢二钾23.8g，磷酸二氢钾2.75g，定容到1000mL，调节pH至7.8～8.2。

2％的戊二醛磷酸缓冲液配置(1L)：40mL戊二醛(50％)，960mL水，磷酸氢二钾4.76g，溶解后用磷酸二氢钾调节pH至7.8-8.2。

②载体活化：

10g载体加入100mL，0.1M pH8.0的缓冲液，25℃、300rpm恒温振荡15min后，测pH，维持pH 7.8～8.2，1h后，滤干后，加入至50mL2％的戊二醛磷酸缓冲液中，25℃恒温振荡1h，过滤，用去离子水洗涤载体至水清，抽滤取滤饼4℃保存备用。

c、大孔吸附树脂预处理：

取树脂100g用200mL无水乙醇浸泡12h，后用去离子水洗涤5次，滤饼4℃保存备用。

实施例2：转氨酶基因工程菌细胞的培养

(1)转氨酶基因工程菌的构建：

根据程峰专利(CN:201710543569.6)的基因序列SEQ ID NO.1设计引物1(CCGCATATGGCTATCA TCCAGGTTCAGC)、引物2(TTGCTCGAGTCAAGCCGGA ACAGAAGAG)，并分别在引物1和引物2中引入了Nde I和Xho I限制性酶切位点(下划线标记)。在引物1和引物2的引发下，利用高保真PfuDNA聚合酶进行扩增，以重组质粒pMD18-T-BgTA(图1)为模板，获转氨酶BgTA基因序列，测序后利用Nde I和Xho I限制性内切酶(TaKaRa)对扩增片段进行处理，并利用T4DNA连接酶(TaKaRa)将该片段同用相同的限制性内切酶处理的商业化载体pET28b(Invitrogen)进行连接，构建表达载体pET28b-BgTA(图2)。将构建的表达载体pET28b-BgTA转化至大肠杆菌BL21(DE3)(Invitrogen)中(42℃，90s)，涂布于含有50μg/ml卡那霉素抗性的LB平板，37℃下培养8-12h，随机挑取克隆抽提质粒进行测序鉴定，筛选获得含有表达重组质粒pET28b-BgTA的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28b-BgTA。

(2)将转氨酶基因工程菌BL21(DE3)/pET28b-BgTA接种至含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，于37℃，200rpm下培养8h作为种子液，种子液再以体积浓度10％接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的发酵培养基中，于37℃，500rpm下培养至菌体OD₆₀₀达6～8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃下诱导培养11h，发酵液于4℃、8000rpm离心10min，弃去上清液，收集沉淀，即获得转氨酶基因工程菌湿菌体。该菌体可直接作为生物催化剂或者用于制备共固定化转氨酶。

发酵培养基配方(g/L)：蛋白胨20，酵母粉15，NaCl 10，(NH₄)₂SO₄ 3，甘油20，KH₂PO₄1.36，K₂HPO₄·3H₂O 2.28，MgSO₄·7H₂O 0.7，pH 7.0。

实施例3：转氨酶粗酶液制备

将菌体按浓度(100g/L)悬浮于pH 9.0Tris缓冲液，在压力30Mpm下用高压匀浆机破碎菌体。破碎后将粗酶液在离心机经9000rpm，10min，离心后取上清液，即为转氨酶粗酶液。

实施例4：西他列汀前体酮、西他列汀的检测方法。

检测底物转化率与产物产率：采用高效液相色谱仪器：Shimadzu LC-16系统-SPD-16紫外检测器和Hitachi 8DD-0801系统-1410紫外检测器。液相色谱柱为ZORBAX EclipseXDB-C18(4.6*150mm，5-Micron)，流动相：10mM乙酸铵：乙腈(50:50)，流速：1.0mL/min，柱温：40℃，保留时间：产物：2.2min；西他列汀前体酮底物：3.2min，检测波长：205nm。

检测产物e.e.值：手性色谱柱为Chiralpak AD-H(150×4.6mm,5μm)，流动相为乙醇/正庚烷/二乙胺＝60:40:0.1，流速0.8mL/min，柱温35℃，检测波长：268nm。西他列汀前体酮和西他列汀的保留时间为10.1min(检测时间是12min)和5.9min。西他列汀的(S)型对映体的保留时间为8.4min。(液相是Shimadzu LC-20AD系统-SPD20A检测器)

产物e.e._p计算公式：

e.e._p＝(C_R-C_S)/(C_R+C_S)×100％

C_R为西他列汀的峰面积，C_S为S-对映体的峰面积。

实施例5：酶活检测

催化体系(10mL)组成及催化条件如下：pH 9.0的0.2M三乙醇胺含浓度1M氨基供体异丙胺为缓冲液，底物的浓度为25g/L，助溶剂DMSO的添加量为50％(v/v)，加入0.5g的酶制剂，在600rpm，45℃下反应2小时，取1mL反应液，盐酸调pH到1-2终止反应，稀释、过滤后进行HPLC检测。同样条件下，以转氨酶粗酶液作为对照。

在上述反应条件下，每小时催化底物生成1μmol产物所需要的酶量即为1个酶活力单位，用U表示。

实施例6：固定化转氨酶的制备及其筛选

取实施例3所得粗酶液，加入2mM PLP，再加入树脂(按1/5＝树脂质量/粗酶液体积)，在25℃下，300rpm条件下水浴搅拌固定24h，抽滤，滤饼用pH 9.0、100mMTris缓冲液清洗两次，抽滤去除缓冲液，即获得共固定化转氨酶。取6g已活化的树脂(按1/5＝树脂质量/粗酶液体积)LX-1000HFA、D5759、ECR1030M、NKA-9、LX-1000HA、ECR8204M(湿重)，在25℃下，300rpm条件下水浴搅拌固定24h，抽滤，滤饼用pH 9.0、100mMTris缓冲液清洗两次，抽滤去除缓冲液，即获得固定化转氨酶。置4℃冰箱保存备用。采用实施例5方法测定相对酶活(以游离酶为100％)结果见表1所示，最优树脂为LX-1000HFA。

表1：不同树脂固定化转氨酶的酶活

实施例7：最佳酶浓度的优化

将湿菌体用pH 9.0Tris缓冲液按25g/L、50g/L、75g/L、100g/L、150g/L重悬浮，获得菌悬液，后经实施例3方法获得粗酶液，加入已活化的实施例6筛选出的树脂LX-1000HFA后再加入2mM的辅酶PLP,在25℃下，300rpm条件下，水浴搅拌24h；固定化结束；抽滤，滤饼用100mM、pH 9.0Tris缓冲溶液清洗两次。取一定固定化上清液并用蛋白浓度试剂盒测定其蛋白浓度计算固定化效率及相对酶活(以酶量相同的游离酶液活性为100％)。由表2可以看出当其为100g/L时相对酶活达到最大，故最优初始菌浓度为100g/L。

表2：不同酶浓度对固定化转氨酶酶活性的影响

实施例8：转氨酶固定化的辅酶添加量优化

取实施例5获得的粗酶液，加入已活化的实施例6筛选出的树脂LX-1000HFA后再加入0mM，1mM，2mM，3mM、4mM、6mM、8mM的辅酶PLP,在25℃下，300rpm条件下，水浴搅拌24h；固定化结束；抽滤除去上清液，滤饼用100mM、pH 9.0Tris缓冲溶液清洗两次，抽滤除去多余水份后，获得固定化转氨酶。采用实施例5方法测定相对酶活。结果见表3所示，所以最佳辅酶添加量为2mM。

表3：不同辅酶添加量对固定化转氨酶酶活的影响

实施例9：转氨酶的固定化温度优化

取实施例3获得的粗酶液，再分别加入已经活化的树脂LX-1000HFA(湿重)，再加入2mM的辅酶PLP。在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，300rpm条件下，水浴搅拌24h；固定化结束；抽滤除去上清液，滤饼用100mM、pH 9.0Tris缓冲溶液清洗两次，抽滤除去多余水份后，获得固定化转氨酶。采用实施例5方法测定相对酶活。结果如表4所述，在温度为15℃时酶活达到最大，但是为了节能环保以及操作难度，选择室温25℃为最终固定化温度。

表4：不同温度固定对固定化转氨酶酶活的影响

实施例10：转氨酶的固定化最佳缓冲液筛选

取Tris-HCl、甘氨酸-NaOH、PB、Na₂CO₃-NaHCO₃、三乙醇胺-HCl缓冲液制成100g/L的菌悬液后，按照实施例3制备成粗酶液，再分别加入已经活化的树脂LX-1000HFA，再加入2mM的辅酶PLP。25℃、300rpm条件下，水浴搅拌24h；固定化结束；抽滤除去上清液，滤饼用100mM、pH 9.0Tris缓冲溶液清洗两次，抽滤除去多余水份后，获得固定化转氨酶。采用实施例5方法测定相对酶活。结果如表5所述，在选择Tris缓冲液时酶活达到最高，故最佳缓冲液为Tris-HCl。

表5：固定化时缓冲液类型对固定化转氨酶的影响

实施例11：转氨酶固定化最佳的pH筛选

取pH 7.0、pH 7.5、pH 8.0、pH 8.5、pH 9.0的Tris缓冲液制成100g/L的菌悬液，按照实施例3制备成粗酶液，再分别加入已经活化的树脂LX-1000HFA，再加入2mM的辅酶PLP。25℃、300rpm条件下，水浴搅拌24h；固定化结束；抽滤除去上清液，滤饼用100mM、pH9.0Tris缓冲溶液清洗两次，抽滤除去多余水份后，获得固定化转氨酶。采用实施例5方法测定相对酶活。由表6可知转氨酶在pH 9固定时酶活最高，最所以佳固定化pH为pH 9.0。

表6：转氨酶固定化时pH对转氨酶固定化的影响

实施例12：转氨酶固化的固定时间优化

取实施例3获得的粗酶液30mL，再分别加入6g已经活化的树脂LX-1000HFA(湿重)，再加入2mM的辅酶PLP。25℃、300rpm条件下，水浴搅拌6h、12h、18h、24h、36h、48h；固定化结束；抽滤除去上清液，滤饼用100mM、pH 9.0Tris缓冲溶液清洗两次，抽滤除去多余水份后，获得固定化转氨酶。采用实施例3方法测定酶活，在第一次酶活检测之后抽滤掉反应液后再投入第二次反应，以第一次反应为100％得到两次反应的相对酶活。由表7得到在固定化时间为24h酶活最高。所以最佳固定化时间为24h。

表7：固定化时间对固定化转氨酶酶活影响

实施例13：固定化转氨酶催化体系中助溶剂的筛选

取实施例6获得的固定化转氨酶用于催化反应，底物的浓度为50g/L，底物溶解于助溶剂DMSO、DMF、乙醇、乙腈、甲醇、异丙醇、四氢呋喃中，添加量为总体积的50％(v/v)，缓冲体系为100mM，pH 9.0三乙醇胺-盐酸的缓冲液，异丙胺添加量为底物浓度(mol/L)的8倍，在600rpm，45℃条件下反应2h，取1mL反应液，盐酸调pH 1-2终止反应，稀释、过滤后进行HPLC检测，结果如表8所示，选用DMSO作为助溶剂，底物转化率最高，故最优助溶剂为DMSO。

表8：不同助溶剂对固定化转氨酶对转化率的影响

实施例14：固定化转氨酶催化体系中DMSO添加量优化

取实施例6获得的固定化转氨酶用于催化反应，底物的浓度为50g/L，底物溶解于助溶剂DMSO，添加量为总体积的80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％(v/v)，缓冲体系为100mM，pH 9.0三乙醇胺-盐酸的缓冲液，异丙胺添加量为底物浓度(mol/L)的8倍，在600rpm，45℃条件下反应2h，取1mL反应液，盐酸调pH1-2终止反应，稀释、过滤后进行HPLC检测，结果如表9所示。所得优选DMSO添加量为50％。

表9：固定化转氨酶催化体系中DMSO添加量对转化率的影响

实施例15：固定化转氨酶催化体系中氨基供体的筛选

取实施例6获得的固定化转氨酶用于催化反应，底物的浓度为50g/L，底物溶解于助溶剂DMSO添加量为总体积的50％(v/v)，缓冲体系为100mM，pH 9.0三乙醇胺-盐酸的缓冲液，氨基供体丙氨酸、异丙胺、二乙胺、氨水、甘氨酸、谷氨酸、三乙胺添加量为底物浓度(mol/L)的8倍，在600rpm，45℃条件下反应2h，取1mL反应液，盐酸调pH1-2终止反应，稀释、过滤后进行HPLC检测。结果如表10所示，最优氨基供体为异丙胺。

表10：固定化转氨酶催化体系中氨基供体对转化率的影响

实施例16：固定化转氨酶催化体系中氨基浓度的优化

取实施例6获得的固定化转氨酶用于催化反应，底物的浓度为50g/L，底物溶解于助溶剂DMSO添加量为总体积的50％(v/v)，缓冲体系为100mM，pH 9.0三乙醇胺-盐酸的缓冲液，异丙胺添加量为底物浓度(mol/L)的2、4、8、12、16倍，在600rpm，45℃条件下反应2h，取1mL反应液，盐酸调pH 1-2终止反应，稀释、过滤后进行HPLC检测。结果如表11所示，优选异丙胺添加量为底物浓度的8倍。

表11：固定化转氨酶催化体系中氨基浓度对转化率的影响

实施例17：固定化转氨酶催化温度优化

取实施例6中的固定化转氨酶用于催化反应，底物的浓度为50g/L，底物溶解于助溶剂DMSO添加量为总体积的50％(v/v)，缓冲体系为100mM，pH 9.0三乙醇胺-盐酸的缓冲液，异丙胺添加量为底物浓度(mol/L)的、8倍，在600rpm，20℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃条件下反应2h，取1mL反应液，盐酸调pH到1-2终止反应，稀释、过滤后进行HPLC检测。结果如表12所示。转氨反应是吸热反应，因此温度的升高有利于反应速率的加快，但随着温度升到50℃其副产物也增多，这些副产物是底物产物变性生成副产物，所以优选反应温度为45℃。

表12：催化温度对转化率的影响

实施例18：固定化转氨酶的催化体系中底物浓度优化

取实施例6获得的固定化转氨酶用于催化反应，底物的浓度分别为25、50、75、100、125、150g/L，底物溶解于助溶剂DMSO中，添加量为总体积的50％(v/v)，缓冲体系为100mM，pH 9.0三乙醇胺-盐酸的缓冲液，异丙胺添加量为底物摩尔浓度的8倍，在45℃，600rpm的条件下反应12h，取1mL反应液，盐酸调pH 1-2终止反应，稀释、过滤后进行HPLC检测，其结果见表13。可见当底物浓度在25-100g/L时，底物转化率均>98％所得优选底物浓度为100g/L。

表13：固定化转氨酶的催化体系中底物浓度对转化率的影响

实施例19：填充床生物反应器高径比的优化

固定化酶反应最佳填充床高径比的研究方案为：分别称取占不同高径比填充床柱体积四分之三的实施例6获得的固定化酶加入填充床(高分别为200mm，100mm，180mm，180mm，对应的直径分别为40mm，10mm，14mm，10mm，高径比∮＝5,10,13,18)中，循环水控温45℃下，通过蠕动泵的作用，含有终浓度为30g/L底物的反应液从填充床底部进入反应器，流速为0.36mL/min，对应的一个批次所需时间分别为30min，25min，21min，18min。分别在这些时间间隔后取样100μL，HPLC检测转化率。从表14可以看出高径比∮＝9的检测转化率最好，故最优选择为高径比∮＝9的填充柱。

表14：填充床生物反应器高径比对转化率的影响

实施例20：填充床生物反应器填充量的优化

固定化酶生物反应器反应最佳填充量优化的研究方案为：分别取实施例6获得的固定化酶5g、10g、15g、20g、25g、30g、34g填入高径比∮＝9的柱子中，循环水控温45℃下，通过蠕动泵的作用，含有终浓度为30g/L底物的反应液从填充床底部进入反应器流速0.36mL/min，待反应液从顶部流出取100μL，HPLC检测转化率。从表15可以看出当填充量为30g/L时转化率达到89％，再增加对转化率没有太大影响了，故最佳填充量为30g。

表15：填充床生物反应器填充量对转化率的影响

实施例21：填充床生物反应器底物最佳流速的优化

固定化酶生物反应器反应底物最佳流速优化的研究方案为：取30g固定化酶填充到∮＝9的柱子中，用0.0 9mL/min、0.18mL/min、0.27mL/min、0.36mL/min、0.45mL/min的流速泵入底物，待反应液从上部流出取100μL，HPLC检测转化率。从表16可以看出当底物流速为0.27mL/min时转化率就达到97％，此时100mL反应液全部反应结束需要6h，所以从节约成本以及提高产率来说，0.27mL/min为底物最佳流速。

表16：填充床生物反应器底物流速对转化率的影响

实施例22：填充床生物反应器重复反应批次

本发明选择∮＝9的柱子，填充30g固定化酶，保温45℃，底物反应液流速为0.27mL/min催化反应。每45min取样检测转化率，反应16批次以后用100mL乙酸乙酯冲洗柱子后继续反应。由图3可以看出当反应进行到700批次后转化率依然达到97％。且残余酶活大于90％。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种转氨酶-PLP共固定化酶及其制备与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 978

<212> DNA

<213> 未知(Unknown)

<400> 1

atggctatcc tccaggttca gcagatcatg cacgaaaacc cgctgcacgc taaggctccg 60

cacgaaccgc gttacgaaga cggctcggcg ttctgcgacg gtaattacgt tccgatcacc 120

gaagctaccg ttccgctggt tgacgctggt ttctataccg ctgacgctgc ttacgacgtt 180

gttaccgttt ctcgtggtaa cttcttccgt ctgggcgacc acctggcccg tatggaagaa 240

tcttctgcta aaattttcct ggaaaacccg ttcaaccgtg accaggttaa agaaatcctg 300

cacaacctgg ttcgtaacgc tggtctgaaa gacgctatgg ttacctggac cgttacccgt 360

ggtccgctga ctgttgactt tcgtgaccgt ggtgctatga aaaacgctat gttcgctagc 420

gcttgcccgt tcttcttcca ggctgacgac gaagttcgta cccgtggttc tcatctgctg 480

atctctagac tgtacaaccg tatctctgct aaagctgttg acccgaccgc taaaaacttc 540

cactggatgg acatgaaact ggctattttc gaagctatga cccaggaaaa agacctggct 600

gttctggttg actgctctaa taacctgacc gaagctgatg gttttaacgt tttcttcgct 660

aaaaacggtg aactgtacac cccggctgaa ggttgcctgc tgggtatcac acgtcagtct 720

gtattcgacg tcgcggctga actgggtatc aaagttaaca tcggtaaata caccccgacc 780

cagctgtatg aagctgacga ggcgttcacc tcttcttcgg gcggtggcat aatgccggta 840

agcgctatcg acgaccagag cctgggtaac cgtaacggtc cgggtccgct ctctgaaaaa 900

atccacaacc tgtactggga aaaacgttgg gctggttggc acgctcagcc ggctgaatac 960

ttctcttctc ttccggct 978

<210> 2

<211> 326

<212> PRT

<213> 未知(Unknown)

<400> 2

Met Ala Ile Leu Gln Val Gln Gln Ile Met His Glu Asn Pro Leu His

1 5 10 15

Ala Lys Ala Pro His Glu Pro Arg Tyr Glu Asp Gly Ser Ala Phe Cys

20 25 30

Asp Gly Asn Tyr Val Pro Ile Thr Glu Ala Thr Val Pro Leu Val Asp

35 40 45

Ala Gly Phe Tyr Thr Ala Asp Ala Ala Tyr Asp Val Val Thr Val Ser

50 55 60

Arg Gly Asn Phe Phe Arg Leu Gly Asp His Leu Ala Arg Met Glu Glu

65 70 75 80

Ser Ser Ala Lys Ile Phe Leu Glu Asn Pro Phe Asn Arg Asp Gln Val

85 90 95

Lys Glu Ile Leu His Asn Leu Val Arg Asn Ala Gly Leu Lys Asp Ala

100 105 110

Met Val Thr Trp Thr Val Thr Arg Gly Pro Leu Thr Val Asp Phe Arg

115 120 125

Asp Arg Gly Ala Met Lys Asn Ala Met Phe Ala Ser Ala Cys Pro Phe

130 135 140

Phe Phe Gln Ala Asp Asp Glu Val Arg Thr Arg Gly Ser His Leu Leu

145 150 155 160

Ile Ser Arg Leu Tyr Asn Arg Ile Ser Ala Lys Ala Val Asp Pro Thr

165 170 175

Ala Lys Asn Phe His Trp Met Asp Met Lys Leu Ala Ile Phe Glu Ala

180 185 190

Met Thr Gln Glu Lys Asp Leu Ala Val Leu Val Asp Cys Ser Asn Asn

195 200 205

Leu Thr Glu Ala Asp Gly Phe Asn Val Phe Phe Ala Lys Asn Gly Glu

210 215 220

Leu Tyr Thr Pro Ala Glu Gly Cys Leu Leu Gly Ile Thr Arg Gln Ser

225 230 235 240

Val Phe Asp Val Ala Ala Glu Leu Gly Ile Lys Val Asn Ile Gly Lys

245 250 255

Tyr Thr Pro Thr Gln Leu Tyr Glu Ala Asp Glu Ala Phe Thr Ser Ser

260 265 270

Ser Gly Gly Gly Ile Met Pro Val Ser Ala Ile Asp Asp Gln Ser Leu

275 280 285

Gly Asn Arg Asn Gly Pro Gly Pro Leu Ser Glu Lys Ile His Asn Leu

290 295 300

Tyr Trp Glu Lys Arg Trp Ala Gly Trp His Ala Gln Pro Ala Glu Tyr

305 310 315 320

Phe Ser Ser Leu Pro Ala

325

Claims (10)

1.一种转氨酶-PLP共固定化酶，其特征在于所述共固定酶由按下方法制备获得：

(1)SEQ ID NO.1所示核苷酸序列转化到宿主菌大肠杆菌中，得到基因工程菌经发酵培养，获得湿菌体悬浮于的pH 7.0～9.0缓冲液中得到菌悬液，菌悬液经细胞破碎、离心，得到转氨酶粗酶液；

(2)环氧树脂用蒸馏水浸泡12～18h，抽滤取滤饼，得到预处理后的环氧树脂备用；

(3)粗酶液中加入0.1～8mM的辅酶磷酸吡哆醛，加入步骤(2)预处理后的环氧树脂，环氧树脂添加量为20～30mg/100mL粗酶液；

(4)在15～45℃、200～300rpm条件下水浴搅拌固定化6～48h，抽滤，滤饼用pH 7.0～9.0缓冲液清洗两次，抽滤去除缓冲液，即得所述转氨酶-PLP共固定化酶。

2.如权利要求1所述的转氨酶-PLP共固定化酶，其特征在于所述pH 7.0～9.0缓冲液为Tris-HCl、甘氨酸-NaOH、PB、Na₂CO₃-NaHCO₃或三乙醇胺-HCl缓冲液。

3.如权利要求1所述的转氨酶-PLP共固定化酶，其特征在于步骤(1)菌悬液浓度为50～150g/L。

4.如权利要求1所述的转氨酶-PLP共固定化酶，其特征在于步骤(1)湿菌体按如下方法制得：将转氨酶基因工程菌接种至含有终浓度50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，37℃、200rpm下培养8h，再以体积浓度10％接种量接种至新鲜的含有终浓度50μ/mL卡那霉素抗性的发酵培养基中，于37℃、500rpm下培养至菌体OD₆₀₀达6～8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃下诱导培养11h，发酵液4℃、8000rpm离心10min，弃去上清液，收集沉淀，即获得转氨酶基因工程菌湿菌体。

5.权利要求1所述转氨酶-PLP共固定化酶的制备方法，所述方法包括：

(1)SEQ ID NO.1所示核苷酸序列转化到宿主菌大肠杆菌中，得到基因工程菌经发酵培养，获得湿菌体悬浮于的pH 7.0～9.0缓冲液中得到菌悬液，菌悬液经细胞破碎、离心，得到转氨酶粗酶液；

(2)环氧树脂用蒸馏水浸泡12～18h，抽滤取滤饼，得到预处理后的环氧树脂备用；

(3)粗酶液中加入0.1～8mM的辅酶磷酸吡哆醛，加入步骤(2)预处理后的环氧树脂，环氧树脂添加量为20～30mg/100mL粗酶液；

(4)在15～45℃、200～300rpm条件下水浴搅拌固定化6～48h，抽滤，滤饼用pH 7.0～9.0缓冲液清洗两次，抽滤去除缓冲液，即得所述转氨酶-PLP共固定化酶。

6.权利要求1～4之一所述的转氨酶-PLP共固定化酶在不对称还原制备西他列汀中间体中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述应用为：以转氨酶-PLP共固定化酶为催化剂，以(3R)-3-酮基-1-[3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮为底物，以二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、乙醇、乙腈、甲醇、异丙醇或四氢呋喃为助溶剂，于pH 9.0、100mM三乙醇胺缓冲液中，以丙氨酸、异丙胺、二乙胺、氨水、甘氨酸、谷氨酸或三乙胺氨基为氨基供体，在20～50℃、400～700rpm条件下反应12～36h，制得西他列汀中间体(3R)-3-氨基-1-[3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氢-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：助溶剂体积用量为20～80％。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述转氨酶-PLP共固定化酶用量为50～300g/L反应体系，底物终浓度为25～150g/L，氨基供体摩尔浓度为底物的2～16倍。

10.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述助溶剂为二甲基亚砜、体积用量为50％，所述氨基供体为异丙胺、摩尔浓度为底物的8倍。