JP2023505967A - 共固定化酵素、その製造方法及びその使用 - Google Patents
共固定化酵素、その製造方法及びその使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2023505967A JP2023505967A JP2022532879A JP2022532879A JP2023505967A JP 2023505967 A JP2023505967 A JP 2023505967A JP 2022532879 A JP2022532879 A JP 2022532879A JP 2022532879 A JP2022532879 A JP 2022532879A JP 2023505967 A JP2023505967 A JP 2023505967A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- enzyme
- immobilized
- coenzyme
- immobilizing
- carrier
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 381
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 381
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 claims abstract description 160
- 229920003180 amino resin Polymers 0.000 claims abstract description 67
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 claims abstract description 61
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 claims abstract description 61
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 49
- 102000005751 Alcohol Oxidoreductases Human genes 0.000 claims abstract description 42
- 108010031132 Alcohol Oxidoreductases Proteins 0.000 claims abstract description 42
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims abstract description 42
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 claims abstract description 40
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 claims abstract description 34
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 34
- 150000002466 imines Chemical class 0.000 claims abstract description 29
- 108010074633 Mixed Function Oxygenases Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 102000008109 Mixed Function Oxygenases Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 238000004064 recycling Methods 0.000 claims abstract description 17
- 108010050375 Glucose 1-Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 107
- 108090000698 Formate Dehydrogenases Proteins 0.000 claims description 97
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 76
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims description 72
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 56
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 50
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 39
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 claims description 39
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 claims description 36
- VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N ammonium formate Chemical compound [NH4+].[O-]C=O VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- 108010058646 cyclohexanone oxygenase Proteins 0.000 claims description 30
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 25
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 102100031126 6-phosphogluconolactonase Human genes 0.000 claims description 21
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 21
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 13
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 13
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 13
- 230000002210 biocatalytic effect Effects 0.000 claims description 9
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 7
- 241000589234 Acetobacter sp. Species 0.000 claims description 6
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 claims description 6
- 241000193386 Lysinibacillus sphaericus Species 0.000 claims description 6
- 150000003949 imides Chemical class 0.000 claims description 6
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 6
- 241000222124 [Candida] boidinii Species 0.000 claims description 5
- 108010001539 D-lactate dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 4
- 102100023319 Dihydrolipoyl dehydrogenase, mitochondrial Human genes 0.000 claims description 4
- 240000002605 Lactobacillus helveticus Species 0.000 claims description 4
- 235000013967 Lactobacillus helveticus Nutrition 0.000 claims description 4
- 241000316848 Rhodococcus <scale insect> Species 0.000 claims description 4
- 241001261184 Rhodococcus sp. Phi1 Species 0.000 claims description 4
- 241001147775 Thermoanaerobacter brockii Species 0.000 claims description 4
- 229940054346 lactobacillus helveticus Drugs 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 claims description 3
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 claims description 3
- 241000972318 Brachymonas petroleovorans Species 0.000 claims description 3
- 241000187562 Rhodococcus sp. Species 0.000 claims description 3
- 241000228393 Sporidiobolus salmonicolor Species 0.000 claims description 3
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 claims description 3
- 241000607291 Vibrio fluvialis Species 0.000 claims description 3
- 108010029645 galactitol 2-dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 3
- 241000485314 Chryseobacterium sp. CA49 Species 0.000 claims description 2
- 108010000445 Glycerate dehydrogenase Proteins 0.000 claims 18
- 102100039077 Cytosolic 10-formyltetrahydrofolate dehydrogenase Human genes 0.000 claims 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 claims 1
- 108010051015 glutathione-independent formaldehyde dehydrogenase Proteins 0.000 claims 1
- 125000000879 imine group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 31
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 33
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 25
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-O NAD(+) Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-O 0.000 description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 8
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 8
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 8
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 8
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 208000001901 epithelial recurrent erosion dystrophy Diseases 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101000823183 Alcaligenes faecalis Aralkylamine dehydrogenase heavy chain Proteins 0.000 description 4
- 101000823182 Alcaligenes faecalis Aralkylamine dehydrogenase light chain Proteins 0.000 description 4
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101001110310 Lentilactobacillus kefiri NADP-dependent (R)-specific alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N pyridoxal 5'-phosphate Chemical compound CC1=NC=C(COP(O)(O)=O)C(C=O)=C1O NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- POSWICCRDBKBMH-UHFFFAOYSA-N 3,3,5-trimethylcyclohexan-1-one Chemical compound CC1CC(=O)CC(C)(C)C1 POSWICCRDBKBMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710197852 Baeyer-Villiger monooxygenase Proteins 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 101710137307 FAD-containing monooxygenase EthA Proteins 0.000 description 2
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 2
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000057234 Acyl transferases Human genes 0.000 description 1
- 108700016155 Acyl transferases Proteins 0.000 description 1
- 102000004092 Amidohydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000531 Amidohydrolases Proteins 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000191338 Candida methylica Species 0.000 description 1
- 241000056141 Chryseobacterium sp. Species 0.000 description 1
- 108030000430 Cyclohexanone monooxygenases Proteins 0.000 description 1
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000568397 Lysinibacillus Species 0.000 description 1
- ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N NADPH Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241001524203 Thermocrispum municipale Species 0.000 description 1
- 241000204673 Thermoplasma acidophilum Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 108700014220 acyltransferase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 125000003916 ethylene diamine group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N glyoxal Chemical class O=CC=O LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 239000012450 pharmaceutical intermediate Substances 0.000 description 1
- -1 polyethylenemine Chemical compound 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000005891 transamination reaction Methods 0.000 description 1
- WCTAGTRAWPDFQO-UHFFFAOYSA-K trisodium;hydrogen carbonate;carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].OC([O-])=O.[O-]C([O-])=O WCTAGTRAWPDFQO-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- PAPBSGBWRJIAAV-UHFFFAOYSA-N ε-Caprolactone Chemical class O=C1CCCCCO1 PAPBSGBWRJIAAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/18—Multi-enzyme systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
- C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
- C12N11/091—Phenol resins; Amino resins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
- C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
- C12N9/0016—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1096—Transferases (2.) transferring nitrogenous groups (2.6)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
本発明は、共固定化酵素、その製造方法及びその使用を提供する。当該共固定化酵素は、アミノ樹脂担体と主酵素及び補酵素とを含み、主酵素と補酵素は、アミノ樹脂担体に共固定化され、ここで、主酵素は、アミノ樹脂担体に共有結合で固定され、補酵素は、共有結合及び/又は非共有結合でアミノ樹脂担体に固定される。主酵素は、アミノ基転移酵素、アミノ酸脱水素酵素、イミン還元酵素、ケトン還元酵素、アルケン還元酵素及びモノオキシゲナーゼのうちのいずれか１つから選ばれ、主酵素及びその補酵素をアミノ樹脂担体に共固定化して共固定化し、酵素の活性及びリサイクル効率を向上させる。
Description
本発明は、固定化酵素分野に関し、具体的には、共固定化酵素、その製造方法及びその使用に関する。
微生物細胞又は単離された酵素又は工程酵素の使用を通じて、生物触媒に対し、大きな進展を遂げ、かつ製造方式を転換させた。多くの種類の酵素、例えば、アシル基転移酵素、アミダーゼ、アミノ基転移酵素、ケトン還元酵素、酸化酵素、モノオキシゲナーゼ及び水解酵素などは、抗生物質、除草剤、医薬中間体及び新時代治療剤の製造に関する反応に用いられる。
遊離酵素が生物触媒として機能する場合、大量の酵素を浪費する可能性があり、水可溶性酵素の回収が非常に困難であるからである。一方、水不溶性固定化酵素は、循環ごとに非常に簡単なろ過を通じて容易に回収できる。
従来技術では、既に単一酵素の固定化方法が報告されているが、酵素によって、適用な固定化方法が異なる。例えば、Bolivarら(Biomacromol.2006,7,669-673)は、改質アガロース、ＣＮＢｒ活性化のアガロース、Sepabeads(デキストラン)及びアルデヒドアガロースの様々な担体に共有結合で固定されることを含む、シュードモナス菌ＳＰ１０１に由来するＦＤＨの共有結合による固定化について研究を行った。
研究上の結論に関して、臭化物、ポリエチレンミン、グルタルアルデヒドなどの活性化の担体に固定化されることは、熱不活性化下での酵素のいかなる安定作用を促進できない。しかしながら、高度活性化されたグリオキサールアガロースの最適化酵素は、非常に強い熱安定性、ｐＨ安定性を有し、そして強化された安定性を有する場合に５０％を超えた活性を有することが証明された。
Kim et al(J.Mol.Catal B:Enzy 97(2013)209-214)は、架橋酵素凝集物(ＣＬＥＡ)の方法を用いて、Candida boidinii.に由来するギ酸脱水素酵素(formate dehydrogenase、ＦＤＨ)を固定することを報告し、グルタルアルデヒド(glutaraldehyde)の代わりにデキストランパラホルムアルデヒド(dextran polyaldehyde)を架橋剤として、固定化酵素にとってより優れ、１０回のリサイクル後の残存活性は９５％を超えると考えられた。また、デキストランパラホルムアルデヒドにより形成された架橋酵素凝集物(Dex-CLEA)の熱安定性は、遊離酵素の熱安定性より３.６倍向上した。
Binay et al(Beilstein J.Org.Chem.2016,12,271-277)は、Candida methylicaに由来する高活性のＦＤＨの固定化酵素を報告した。ＦＤＨは、エポキシ活性化Ｉｍｍｏｂｅａｄ １５０担体に共有結合で固定され、Immobead 150担体は、先にエチレンジアミン(ethylenediamin)で修飾され、そして、順次グルタルアルデヒド活性化(ＦＤＨＩＧＬＵ)及びアルデヒド官能化(ＦＤＨＩＡＬＤ)された。担体としてアルデヒド官能化されたImmobead 150を用いた場合、それぞれ最高９０％及び１３２％の固定化収率及び活性化収率を得た。３５℃で、遊離ＦＤＨ、ＦＤＨＩ１５０、ＦＤＨＩＧＬＵ及びＦＤＨＩＡＬＤの半減期(ｔ１/２)の計算結果は、それぞれ１０.６、２８.９、２２.４及び３８.５時間であった。ＦＤＨＩ１５０、ＦＤＨＩＧＬＵ及びＦＤＨＩＡＬＤは、１０回のリサイクル後にその初期活動の６９％、３８％及び５１％をそれぞれ保留した。
Ｊａｃｋｏｎら(Process Biochem.Vol.1,9,Sep 2016,1248-1255)は、グリオキサール－アガロースを用いてＬＤＨを固定化することを報告した。その可溶性対応物に比べて、固定化ＬＤＨが得た熱安定化因子は１６００倍大きい。
２種類の酵素の共固定化に関する報告もあり、例えばValikhaniら(Biotech.Bioengg.2018;115:2416-2425)は、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ(色素Ｐ４５０ｓ)とB.megateriumに由来するグルコース脱水素酵素との共固定化を報告した。Delgroveら(Appl.Catal.A:Gen.Vol.572,25 Feb.2019,134-141)は、共固定化されたBaeyer-Villigerモノオキシゲナーゼ(ＢＶＭＯ)及びグルコース脱水素酵素をε－カプロラクトン誘導体の合成に用いることを発表した。
Thermocrispum municipaleに由来する熱安定シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ(ＴｍＣＨＭＯ)とThermoplasma acidophilumに由来するグルコース脱水素酵素(ＧＤＨ)(ＧＤＨ－Ｔａｃ)をアミノ官能性アガロースマトリックス担体(ＭＡＮＡ－アガロース)に共固定化する。共固定化は、最も有効な生物触媒であることが証明され、３,３,５－トリメチルシクロヘキサノンの合成では、１５回の繰り返し循環で平均転化率は８３％であった。
以上から分かるように、従来技術では、有効な固定化酵素形態がない酵素、特に同一生物触媒反応に共同参与するある酵素がまだ大量に存在しており、これらの酵素を共固定化することにより、酵素のリサイクル性を向上させることが早急な解決の待たれる問題となっている。
本発明の主な目的は、従来技術のこのような酵素のリサイクルが困難であるという問題を解決するために、共固定化酵素、その製造方法及びその使用を提供することである。
上記目的を実現するために、本発明の一態様によれば、アミノ樹脂担体と主酵素及び補酵素とを含む共固定化酵素を提供し、補酵素は、１つ又は複数の種類であり、主酵素と補酵素は、アミノ樹脂担体に共固定化され、ここで、主酵素は、アミノ樹脂担体に共有結合で固定され、補酵素は、共有結合及び/又は非共有結合でアミノ樹脂担体に固定される。主酵素は、アミノ基転移酵素、アミノ酸脱水素酵素、イミン還元酵素、ケトン還元酵素、アルケン還元酵素及びモノオキシゲナーゼのうちのいずれか１つから選ばれる。
さらに、アミノ基転移酵素は、B.thuringiensis又はVibrio fluvialis strain JS17に由来するアミノ基転移酵素であり、好ましくは、アミノ酸脱水素酵素は、Bacillus cereus又はBacillus sphaericusに由来するアミノ酸脱水素酵素であり、好ましくは、イミン還元酵素は、Streptomyces sp又はBacillus cereusに由来するイミン還元酵素であり、好ましくは、ケトン還元酵素は、Sporobolomyces salmonicolorに由来するケトン還元酵素又はAcetobacter sp.CCTCC M209061に由来するケトン還元酵素であり、より好ましくは、Acetobacter sp.CCTCC M209061に由来するケトン還元酵素は、SEO ID NO:1又はSEO ID NO:2配列を有する変異体であり、好ましくは、アルケン還元酵素は、Chryseobacterium sp.CA49又はSewanella oneidensis MR-1に由来するアルケン還元酵素であり、好ましくは、モノオキシゲナーゼは、Rhodococcus sp.Phi1に由来するシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ、又はBrachymonas petroleovoransに由来するシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ、又はRhodococcus ruber-SD1に由来するシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼであり、より好ましくは、Rhodococcus sp.Phi1に由来するシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼは、SEO ID NO:4配列又はSEO ID NO:5配列を有する変異体であり、Rhodococcus ruber-SD1に由来するシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼは、SEO ID NO:7配列又はSEO ID NO:8配列を有する変異体である。
さらに、補酵素は、乳酸脱水素酵素(ＬＤＨ)、ギ酸アンモニウム脱水素酵素(ＦＤＨ)、グルコース脱水素酵素(ＧＤＨ)及びアルコール脱水素酵素のうちの少なくとも１つから選ばれ、好ましくは、乳酸脱水素酵素は、Lactobacillus helveticusに由来するＤ－乳酸脱水素酵素であり、好ましくは、ギ酸アンモニウム脱水素酵素は、Candida boidiniiに由来するギ酸脱水素酵素であり、好ましくは、グルコース脱水素酵素は、Lysinibacillus sphaericus G10に由来するグリコース１－脱水素酵素であり、好ましくは、アルコール脱水素酵素は、Thermoanaerobium brockiiに由来するアルコール脱水素酵素であり、好ましくは、共固定化酵素のリサイクル回数は、４～２５回である。
さらに、アミノ樹脂担体は、グルタルアルデヒド活性化のアミノ樹脂担体であり、好ましくは、アミノ樹脂担体は、Ｃ２又はＣ４リンカーを有するアミノ樹脂担体であり、より好ましくは、アミノ樹脂担体は、ＳＥＰＬＩＴＥ(R) ＬＸ１０００ＥＡ、ＬＸ１０００ＨＡ、ＬＸ１０００ＮＨ、ＨＦＡ、ＬＸ１０００ＥＰＮ、ＨＭ１００Ｄ、Ｐｕｒｏｌｉｔｅ(R) ＬｉｆｅｔｅｃｈTM ＥＣＲ８３０９、ＥＣＲ８４０９、ＥＣＲ８３０５、ＥＣＲ８４０４、ＥＣＲ８３１５、ＥＣＲ８４１５、ＨＥＣＨＥＮＧ(R) ＥＳＲ－１、ＥＳＲ－３、ＥＳＲ－５及びＥＳＲ－８のうちのいずれか１つから選ばれる。
さらに、共固定化酵素において、主酵素と補酵素との質量比は、１～２０:１～１０であり、好ましくは、主酵素と補酵素との質量合計をＮ１とし、アミノ樹脂担体の質量をＮ２とする場合、Ｎ１/Ｎ２は、５０～２００mg:１ｇ、さらに、８０～１２０mg:１ｇである。
さらに、主酵素と補酵素は、いずれもアミノ樹脂担体に共有結合で固定され、又は主酵素は、アミノ樹脂担体に共有結合で固定され、補酵素は、イオン吸着でアミノ樹脂担体に非共有結合で固定され、好ましくは、ＰＥＩを介してアミノ樹脂担体に補酵素が吸着される。
さらに、補酵素は、第１の酵素と、第２の酵素とを含み、主酵素と第２の酵素は、アミノ樹脂担体に共有結合で固定され、第１の酵素は、イオン吸着でアミノ樹脂担体に固定される。
本願の第２の態様では、上記いずれか１つの共固定化酵素の製造方法を提供し、当該製造方法は、アミノ樹脂担体を活性化し、活性化アミノ基担体を得るステップと、主酵素を活性化アミノ基担体に共有結合で固定し、主酵素に対応する補酵素を共有結合及び/又は非共有結合で活性化アミノ基担体に固定し、共固定化酵素を得るステップであって、主酵素に対応する補酵素の数は１つ又は複数であるステップと、を含む。
さらに、主酵素及び補酵素を活性化アミノ基担体に固定し、共固定化酵素を得るステップは、主酵素を補酵素と混合し、第１の混合酵素を得るステップと、第１の混合酵素を活性化アミノ基担体に固定し、共固定化酵素を得るステップと、を含む。
さらに、補酵素は、第１の酵素を含み、主酵素及び補酵素を活性化アミノ基担体に固定し、共固定化酵素を得るステップは、主酵素を活性化アミノ基担体に固定し、初固定化酵素を得るステップと、第１の酵素を初固定化酵素と固定し、共固定化酵素を得るステップと、を含む。
さらに、補酵素は、第２の酵素をさらに含み、主酵素及び補酵素を活性化アミノ基担体に固定し、共固定化酵素を得るステップは、主酵素と第２の酵素を活性化アミノ基担体に共固定化し、初固定化酵素を得るステップと、第１の酵素を初固定化酵素と固定し、共固定化酵素を得るステップと、を含む。
さらに、ＰＥＩを表面被覆するように、第１の酵素を初固定化酵素と固定し、共固定化酵素を得、好ましくは、初固定化酵素にＰＥＩの最終濃度が０.５ｗ/ｖ％～５ｗ/ｖ％になるまでＰＥＩを加えてＰＥＩ－初固定化酵素を得、次いで第１の酵素をＰＥＩ－初固定化酵素と結合し、共固定化酵素を得る。
さらに、第１の混合酵素を質量比が５０～１５０mg:１ｇである質量比に従って活性化アミノ基担体に固定し、共固定化酵素を得る。
さらに、主酵素と第１の酵素との質量比は、１～２０:１～１０である。
さらに、主酵素と第２の酵素との質量比は、１～２０:１～１０である。
さらに、主酵素は、アミノ基転移酵素であり、補酵素は、２種類の補助因子を有し、２種類の補助因子は、ＬＤＨ(乳酸脱水素酵素)とＦＤＨ(ギ酸アンモニウム脱水素酵素)、又はＬＤＨ(乳酸脱水素酵素)とＧＤＨ(グルコース脱水素酵素)であり、上記製造方法は、
(１)アミノ基転移酵素、ＬＤＨをＦＤＨと混合し、第１の酵素ブレンドを得、第１の酵素ブレンドを活性化アミノ基担体に固定し、共固定化酵素を得ること、
(２)アミノ基転移酵素、ＬＤＨをＧＤＨと混合し、第２の酵素ブレンドを得、第２の酵素ブレンドを活性化アミノ基担体に固定し、共固定化酵素を得ること、
(３)アミノ基転移酵素をＬＤＨと混合し、第３の酵素ブレンドを得、第３の酵素ブレンドを活性化アミノ基担体に固定し、初固定アミノ基転移酵素を得、初固定アミノ基転移酵素に対してＰＥＩ表面被覆を行うように、さらにＧＤＨ又はＦＤＨを固定し、共固定化酵素を得ることのうちのいずれか１つを含む。
(１)アミノ基転移酵素、ＬＤＨをＦＤＨと混合し、第１の酵素ブレンドを得、第１の酵素ブレンドを活性化アミノ基担体に固定し、共固定化酵素を得ること、
(２)アミノ基転移酵素、ＬＤＨをＧＤＨと混合し、第２の酵素ブレンドを得、第２の酵素ブレンドを活性化アミノ基担体に固定し、共固定化酵素を得ること、
(３)アミノ基転移酵素をＬＤＨと混合し、第３の酵素ブレンドを得、第３の酵素ブレンドを活性化アミノ基担体に固定し、初固定アミノ基転移酵素を得、初固定アミノ基転移酵素に対してＰＥＩ表面被覆を行うように、さらにＧＤＨ又はＦＤＨを固定し、共固定化酵素を得ることのうちのいずれか１つを含む。
さらに、主酵素は、アミノ酸脱水素酵素であり、補酵素は、ＦＤＨ又はＧＤＨであり、製造方法は、
(１)アミノ酸脱水素酵素をＦＤＨ又はＧＤＨと混合し、アミノ酸脱水素酵素ブレンドを得、アミノ酸脱水素酵素ブレンドを活性化アミノ基担体に固定し、共固定化酵素を得ること、
(２)アミノ酸脱水素酵素を活性化アミノ基担体に固定し、初固定アミノ酸脱水素酵素を得、初固定アミノ酸脱水素酵素に対してＰＥＩ表面被覆を行うように、さらにＧＤＨ又はＦＤＨを固定し、共固定化酵素を得ることのうちのいずれか１つを含む。
(１)アミノ酸脱水素酵素をＦＤＨ又はＧＤＨと混合し、アミノ酸脱水素酵素ブレンドを得、アミノ酸脱水素酵素ブレンドを活性化アミノ基担体に固定し、共固定化酵素を得ること、
(２)アミノ酸脱水素酵素を活性化アミノ基担体に固定し、初固定アミノ酸脱水素酵素を得、初固定アミノ酸脱水素酵素に対してＰＥＩ表面被覆を行うように、さらにＧＤＨ又はＦＤＨを固定し、共固定化酵素を得ることのうちのいずれか１つを含む。
さらに、主酵素は、イミン還元酵素であり、補酵素は、ＦＤＨ又はＧＤＨであり、製造方法は、
(１)イミン還元酵素、ＦＤＨ又はＧＤＨを混合し、イミド酵素ブレンドを得、イミド酵素ブレンドを活性化アミノ基担体に固定し、共固定化酵素を得ること、
(２)イミン還元酵素を活性化アミノ基担体に固定し、初固定イミン還元酵素を得、初固定イミン還元酵素に対してＰＥＩ表面被覆を行うように、さらにＧＤＨ又はＦＤＨを固定し、共固定化酵素を得ることのうちのいずれか１つを含む。
(１)イミン還元酵素、ＦＤＨ又はＧＤＨを混合し、イミド酵素ブレンドを得、イミド酵素ブレンドを活性化アミノ基担体に固定し、共固定化酵素を得ること、
(２)イミン還元酵素を活性化アミノ基担体に固定し、初固定イミン還元酵素を得、初固定イミン還元酵素に対してＰＥＩ表面被覆を行うように、さらにＧＤＨ又はＦＤＨを固定し、共固定化酵素を得ることのうちのいずれか１つを含む。
さらに、主酵素は、ケトン還元酵素であり、補酵素は、ＦＤＨ又はＧＤＨであり、製造方法は、
(１)ケトン還元酵素、ＦＤＨ又はＧＤＨを混合し、ケトン還元酵素ブレンドを得、ケトン還元酵素ブレンドを活性化アミノ基担体に固定し、共固定化酵素を得ること、
(２)ケトン還元酵素を活性化アミノ基担体に固定し、初固定ケトン還元酵素を得、初固定ケトン還元酵素に対してＰＥＩ表面被覆を行うように、さらにＧＤＨ又はＦＤＨを固定し、共固定化酵素を得ることのうちのいずれか１つを含む。
(１)ケトン還元酵素、ＦＤＨ又はＧＤＨを混合し、ケトン還元酵素ブレンドを得、ケトン還元酵素ブレンドを活性化アミノ基担体に固定し、共固定化酵素を得ること、
(２)ケトン還元酵素を活性化アミノ基担体に固定し、初固定ケトン還元酵素を得、初固定ケトン還元酵素に対してＰＥＩ表面被覆を行うように、さらにＧＤＨ又はＦＤＨを固定し、共固定化酵素を得ることのうちのいずれか１つを含む。
さらに、主酵素は、アルケン還元酵素であり、補酵素は、ＦＤＨ又はＧＤＨであり、製造方法は、
(１)アルケン還元酵素、ＦＤＨ又はＧＤＨを混合し、アルケン還元酵素ブレンドを得、アルケン還元酵素ブレンドを活性化アミノ基担体に固定し、共固定化酵素を得ること、
(２)アルケン還元酵素を活性化アミノ基担体に固定し、初固定アルケン還元酵素を得、初固定アルケン還元酵素に対してＰＥＩ表面被覆を行うように、さらにＧＤＨ又はＦＤＨを固定し、共固定化酵素を得ることのうちのいずれか１つを含む。
(１)アルケン還元酵素、ＦＤＨ又はＧＤＨを混合し、アルケン還元酵素ブレンドを得、アルケン還元酵素ブレンドを活性化アミノ基担体に固定し、共固定化酵素を得ること、
(２)アルケン還元酵素を活性化アミノ基担体に固定し、初固定アルケン還元酵素を得、初固定アルケン還元酵素に対してＰＥＩ表面被覆を行うように、さらにＧＤＨ又はＦＤＨを固定し、共固定化酵素を得ることのうちのいずれか１つを含む。
さらに、主酵素は、シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼであり、補酵素は、ＦＤＨ又はＧＤＨであり、製造方法は、
(１)シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ、ＦＤＨ又はＧＤＨを混合し、モノオキシゲナーゼブレンドを得、モノオキシゲナーゼブレンドを活性化アミノ基担体に固定し、共固定化酵素を得ること、
(２)シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼを活性化アミノ基担体に固定し、初固定シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼを得、初固定シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼに対してＰＥＩ表面被覆を行うように、さらにＧＤＨ又はＦＤＨを固定し、共固定化酵素を得ることのうちのいずれか１つを含む。
(１)シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ、ＦＤＨ又はＧＤＨを混合し、モノオキシゲナーゼブレンドを得、モノオキシゲナーゼブレンドを活性化アミノ基担体に固定し、共固定化酵素を得ること、
(２)シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼを活性化アミノ基担体に固定し、初固定シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼを得、初固定シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼに対してＰＥＩ表面被覆を行うように、さらにＧＤＨ又はＦＤＨを固定し、共固定化酵素を得ることのうちのいずれか１つを含む。
さらに、アミノ樹脂担体をグルタルアルデヒドで活性化し、活性化アミノ基担体を得る。
本願の第３の態様によれば、生物触媒反応における上記いずれか１つの共固定化酵素、又は上記いずれか１つの共固定化酵素の製造方法によって製造された共固定化酵素の使用を提供する。
さらに、生物触媒反応は、間欠的な生物触媒反応又は連続的な生物触媒反応であり、好ましくは、共固定化酵素は、連続的な流動床又は固定床の生物触媒反応に適用され、好ましくは、連続的な生物触媒反応における共固定化酵素のリサイクル回数は、４～２５回である。
本発明の技術案を応用して、本願は、上記主酵素及びその補酵素をアミノ樹脂担体に共固定化することにより、これらの主酵素及びその補酵素の共固定化を実現し、それによって酵素の活性及びリサイクル効率の向上に有利である。
なお、矛盾しない限り、本願の実施例及び実施例における特徴を組み合わせることができる。以下、実施例を参照しながら、本発明について詳しく説明する。
Polyethylene imineは、ＰＥＩと略称され、ポリエチレンミンである。
本願の典型的な一実施形態では、アミノ樹脂担体と主酵素及び補酵素とを含む共固定化酵素を提供し、主酵素と補酵素は、アミノ樹脂担体に共固定化され、ここで、主酵素は、アミノ樹脂担体に共有結合で固定され、補酵素は、共有結合及び/又は非共有結合でアミノ樹脂担体に固定される。主酵素は、アミノ基転移酵素、アミノ酸脱水素酵素、イミン還元酵素、ケトン還元酵素、アルケン還元酵素及びモノオキシゲナーゼのうちのいずれか１つから選ばれる。
本願は、上記主酵素及びその補酵素をアミノ樹脂担体に共固定化することにより、これらの主酵素及びその補酵素の共固定化を実現し、それによって酵素の活性及びリサイクル効率の向上に有利である。
上記様々な主酵素の由来によって、具体的な種類及び活性が異なる。好適な一実施例では、アミノ基転移酵素は、B.thuringiensis又はVibrio fluvialis strain JS17に由来するアミノ基転移酵素であり、好ましくは、アミノ酸脱水素酵素は、Bacillus cereus又はBacillus sphaericusに由来するアミノ酸脱水素酵素であり、好ましくは、イミン還元酵素は、Streptomyces sp又はBacillus cereusに由来するイミン還元酵素であり、好ましくは、ケトン還元酵素は、Sporobolomyces salmonicolorに由来するケトン還元酵素又はAcetobacter sp.CCTCC M209061に由来するケトン還元酵素であり、より好ましくは、Acetobacter sp.CCTCC M209061に由来するケトン還元酵素は、SEO ID NO:1又はSEO ID NO:2配列を有する変異体であり、好ましくは、アルケン還元酵素は、Chryseobacterium sp.CA49又はSewanella oneidensis MR-1に由来するアルケン還元酵素であり、好ましくは、モノオキシゲナーゼは、Rhodococcus sp.Phi1に由来するシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ、又はBrachymonas petroleovoransに由来するシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ、又はRhodococcus ruber-SD1に由来するシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼであり、より好ましくは、Rhodococcus sp.Phi1に由来するシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼは、SEO ID NO:4配列又はSEO ID NO:5配列を有する変異体であり、Rhodococcus ruber-SD1に由来するシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼは、SEO ID NO:7配列又はSEO ID NO:8配列を有する変異体である。
上記主酵素の種類によって、それぞれに対応する補酵素を選択し、好ましくは、これらの補酵素は、ＮＡＤ(Ｐ)＋とＮＡＤＰＨ循環再生を行う可能な補酵素である。好適な一実施例では、補酵素は、乳酸脱水素酵素、ギ酸アンモニウム脱水素酵素、グルコース脱水素酵素及びアルコール脱水素酵素のうちの少なくとも１つから選ばれ、好ましくは、乳酸脱水素酵素は、Lactobacillus helveticusに由来するＤ－乳酸脱水素酵素であり、好ましくは、ギ酸アンモニウム脱水素酵素は、Candida boidiniiに由来するギ酸脱水素酵素であり、好ましくは、グルコース脱水素酵素は、Lysinibacillus sphaericus G10に由来するグリコース１－脱水素酵素であり、好ましくは、アルコール脱水素酵素は、Thermoanaerobium brockiiに由来するアルコール脱水素酵素である。別の好適な実施例では、共固定化酵素のリサイクル回数は、４～２５回である。
上記好適な実施例では、アミノ基転移酵素に対応する補酵素は、乳酸脱水素酵素とギ酸アンモニウム脱水素酵素、又は乳酸脱水素酵素とグルコース脱水素酵素である。アミノ酸脱水素酵素に対応する補酵素は、ギ酸アンモニウム脱水素酵素又はグルコース脱水素酵素である。イミン還元酵素に対応する補酵素は、ギ酸アンモニウム脱水素酵素又はグルコース脱水素酵素である。ケトン還元酵素に対応する補酵素は、ギ酸アンモニウム脱水素酵素又はグルコース脱水素酵素である。アルケン還元酵素に対応する補酵素は、ギ酸アンモニウム脱水素酵素又はグルコース脱水素酵素である。モノオキシゲナーゼに対応する補酵素は、アルコール脱水素酵素又はギ酸アンモニウム脱水素酵素又はグルコース脱水素酵素である。
好適な一実施例では、乳酸脱水素酵素は、Lactobacillus helveticusに由来するＤ－乳酸脱水素酵素(略称ＬＤＨ)であり、好ましくは、ギ酸アンモニウム脱水素酵素は、Candida boidiniiに由来するギ酸脱水素酵素(略称ＦＤＨ)であり、好ましくは、グルコース脱水素酵素は、Lysinibacillus sphaericus G10に由来するグリコース１－脱水素酵素(略称ＧＤＨ)であり、好ましくは、アルコール脱水素酵素は、Thermoanaerobium brockiiに由来するアルコール脱水素酵素である。
従来技術では、上記好適な実施例における各由来の主酵素及び補酵素を共固定化する酵素はなく、これらの主酵素と補酵素を共固定化することは、これらの酵素のリサイクル効率の向上に役立つ。
上記共固定化酵素の担体は、アミノ樹脂担体であり、既存の様々なアミノ樹脂担体を採用してもよい。好適な一実施例では、アミノ樹脂担体は、グルタルアルデヒド活性化のアミノ樹脂担体であり、好ましくは、アミノ樹脂担体は、Ｃ２又はＣ４リンカーを有するアミノ樹脂担体であり、より好ましくは、アミノ樹脂担体は、ＳＥＰＬＩＴＥ(R) ＬＸ１０００ＥＡ、ＬＸ１０００ＨＡ、ＬＸ１０００ＮＨ、ＬＸ１０００ＥＰＮ、ＨＦＡ、ＨＭ１００Ｄ、Ｐｕｒｏｌｉｔｅ(R) ＬｉｆｅｔｅｃｈTM ＥＣＲ８３０９、ＥＣＲ８４０９、ＥＣＲ８３０５、ＥＣＲ８４０４、ＥＣＲ８３１５、ＥＣＲ８４１５、ＨＥＣＨＥＮＧ(R) ＥＳＲ－１、ＥＳＲ－３、ＥＳＲ－５及びＥＳＲ－８のうちのいずれか１つから選ばれる。上述した固定された主酵素と補酵素によって、異なるアミノ樹脂担体を選択してもよい。
上記共固定化酵素において、主酵素と補酵素の使用量比は、触媒される基質によって異なる。好適な一実施例では、上記共固定化酵素において、主酵素と補酵素との質量比は、１～２０:１～１０である。好ましくは、主酵素と補酵素との質量合計をＮ１とし、アミノ樹脂担体の質量をＮ２とする場合、Ｎ１/Ｎ２は、５０～２００mg:１ｇ、さらに、８０～１２０mg:１ｇである。
主酵素と補酵素との質量比を上記範囲内に制御することで、上記全ての主酵素と補酵素との共固定化酵素が大部分の基質を触媒させることができる。かつ酵素と担体との質量比を５０～２００mg:１ｇの範囲内に制御することで、上記全ての主酵素と補酵素との共固定化を実現することができる。
いくつかのより好適な実施例では、アミノ基転移酵素とその補酵素である乳酸脱水素酵素との質量比は、５～７:１であり、アミノ基転移酵素とその補酵素であるギ酸アンモニウム脱水素酵素との質量比は、５～７:１～３であり、アミノ基転移酵素とその補酵素であるグルコース脱水素酵素との質量比は、５～７:１～２であり、アミノ酸脱水素酵素とその補酵素であるギ酸アンモニウム脱水素酵素との質量比は、８～１０:１であり、アミノ酸脱水素酵素とその補酵素であるグルコース脱水素酵素との質量比は、５～６:１であり、イミン還元酵素とその補酵素であるギ酸アンモニウム脱水素酵素との質量比は、４～８:１であり、イミン還元酵素とその補酵素であるグルコース脱水素酵素との質量比は、６～８:１であり、ケトン還元酵素とその補酵素であるギ酸アンモニウム脱水素酵素との質量比は、４～８:１であり、ケトン還元酵素とその補酵素であるグルコース脱水素酵素との質量比は、１:３～１０であり、アルケン還元酵素とその補酵素であるギ酸アンモニウム脱水素酵素との質量比は、６～１０:１であり、アルケン還元酵素とその補酵素であるグルコース脱水素酵素との質量比は、１２～２０:１であり、及びモノオキシゲナーゼとその補酵素であるアルコール脱水素酵素との質量比は、２～３:２～３であり、モノオキシゲナーゼとその補酵素であるグルコース脱水素酵素との質量比は、２～３:１である。
上記各主酵素とそれに対応する異なる補酵素との質量比を上記範囲内に制御することで、主補酵素を可能な限り化学量論比に従って配分させることができ、それによって共固定化酵素の触媒活性及び効率を向上させる。
上記共固定化酵素において、主酵素と補酵素は、いずれも担体に固定され、両者の担体への具体的な固定方式は限定されない。好適な一実施例では、主酵素と補酵素は、いずれもアミノ樹脂担体に共有結合で固定される。別の好適な実施例では、主酵素は、アミノ樹脂担体に共有結合で固定され、補酵素は、イオン吸着でアミノ樹脂担体に非共有結合で固定され、好ましくは、ＰＥＩを介してアミノ樹脂担体に補酵素が吸着される。上記２種類の異なる共固定化方式は、異なる共固定化方法で得ることができる。
上記共固定化酵素において、主酵素に１種類の補酵素しかないものもあれば、主酵素に２種類の補酵素があるものもある。両者の共固定化方式は、上記と同じであり、同じであっても異なっていてもよく、具体的な補酵素の性質特徴に応じて決定される。好適な一実施例では、補酵素は、第１の酵素と、第２の酵素とを含み、主酵素と第２の酵素は、アミノ樹脂担体に共有結合で固定され、第１の酵素は、イオン吸着でアミノ樹脂担体に固定される。ここで、第１の酵素は、共固定化過程におけるある試薬、例えば架橋剤であるグルタルアルデヒドなどに対して感受性のある酵素であり、共固定化過程において第１の酵素の活性が低下し、それによって共固定化酵素の活性及び後続のリサイクル効率に影響を与えることを減少させるために、上記好適な実施例では、第１の酵素をイオン吸着でアミノ樹脂担体に非共有結合で固定する。
アミノ基転移酵素ＴＡ－Ｂｔ(具体的には、表１参照)とＬＤＨ及びＦＤＨとは最適割合で担体ＬＸ１０００ＨＡに共固定化され、最高使用回数は１５回に達し、アミノ基転移酵素ＴＡ－ＢｔとＬＤＨ及びＧＤＨとは最適割合で担体ＬＸ１０００ＨＡに共固定化され、最高使用回数は２０～２５回に達し、モノオキシゲナーゼＣＨＭＯ－ＲｓとＧＤＨとは最適割合で担体ＬＸ１０００ＨＡに共固定化され、最高使用回数は１３回に達し、モノオキシゲナーゼＣＨＭＯ－ＲｓとＡＤＨとは最適割合で担体ＬＸ１０００ＨＡに共固定化され、最高使用回数は１３～１５回に達し、ＥＣＲ８４０９担体に共固定化され、最高使用回数は１６回に達し、ＣＨＭＯ－Ｒｓの変異体Ｖ１とＡＤＨとは担体ＬＸ１０００ＨＡに共固定化され、最高使用回数は１７回に達し、変異体Ｖ２とＡＤＨとは担体ＬＸ１０００ＨＡに共固定化され、最高使用回数は１７回に達し、ＣＨＭＯ－ＢｐとＡＤＨ又はＧＤＨとはＬＸ１０００ＨＡ担体に共固定化され、使用回数は１４－１５回に達し、ＣＨＭＯ－Ｂｐ変異体Ｖ１とＡＤＨとはＬＸ１０００ＨＡ担体に共固定化され、使用回数は１９回に達し、ＣＨＭＯ－Ｂｐ変異体Ｖ１とＡＤＨとはＬＸ１０００ＨＡ担体に共固定化され、使用回数は２１回に達し、ＡＡＤＨ－ＢｃとＦＤＨとは最適割合で担体ＬＸ１０００ＨＡに共固定化され、最高使用回数は１２回に達し、ＡＡＤＨ－ＢｓとＧＤＨとは最適割合で担体ＬＸ１０００ＨＡに共固定化され、最高使用回数は１５回に達し、ＫＲＥＤ－ＡｃとＦＤＨとは担体ＥＣＲ８４０９に共固定化され、最高使用回数は１８回に達し、ＫＲＥＤ－Ａｃ－Ｖ１とＦＤＨとは担体ＥＣＲ８４０９に共固定化され、最高使用回数は２４回に達し、ＫＲＥＤ－ＡｃとＧＤＨとは担体ＥＣＲ８４０９に共固定化され、最高使用回数は１４回に達し、ＥＲＥＤ－ＳｃとＦＤＨとは最適割合で担体ＬＸ１０００ＨＡに固定化され、最高使用回数は１７回に達し、ＥＲＥＤ－ＳｃとＧＤＨとは最適割合で担体ＬＸ１０００ＨＡに固定化され、最高使用回数は２１回に達し、ＥＲＥＤ－Ｃｈｒは最適割合で担体ＬＸ１０００ＥＰＮに固定化され、最高使用回数は２１回に達し、ＩＲＥＤ－ＳｔｒとＦＤＨとは最適割合で担体ＬＸ１０００ＥＰＮに固定化され、最高使用回数は１７回に達し、ＩＲＥＤ－ＢｃとＧＤＨとは最適割合で担体ＬＸ１０００ＥＰＮに固定化され、最高使用回数は１９回に達する。
本願の第２の典型的な実施形態では、上記いずれか１つの共固定化酵素の製造方法を提供し、当該製造方法は、アミノ樹脂担体を活性化し、活性化アミノ基担体を得るステップと、主酵素を活性化アミノ基担体に共有結合で固定し、主酵素に対応する補酵素を共有結合及び/又は非共有結合で活性化アミノ基担体に固定し、共固定化酵素を得るステップと、を含む。
上記共固定化酵素の方法は、まず、アミノ樹脂担体を活性化し、さらに上記いずれか１つの主酵素及びその補酵素を活性化アミノ基担体に共固定化することにより、共固定化酵素を得ることができる。
上記主酵素及び補酵素を活性化のアミノ基担体に共固定化する具体的な方法は、補酵素の種類及び性質に応じて適切なステップを選んで行ってもよい。
好適な一実施例では、主酵素及び補酵素を活性化アミノ基担体に固定し、共固定化酵素を得るステップは、主酵素を補酵素と混合し、第１の混合酵素を得るステップと、第１の混合酵素を活性化アミノ基担体に固定し、共固定化酵素を得るステップと、を含む。
この好適な方法では、補酵素の数にかかわらず、いずれも主酵素と混合した後、担体に固定されることができる。主酵素及び補酵素によって、それぞれ混合割合が異なる。好ましくは、前述主酵素と補酵素との質量比が１～２０:１～１０である割合に従って、主酵素を補酵素と混合し、第１の混合酵素を得、前述Ｎ１/Ｎ２の割合に従って、第１の混合酵素を活性化アミノ基担体に固定し、共固定化酵素を得る。
好適な一実施例では、補酵素は、第１の酵素を含み、主酵素及び補酵素を活性化アミノ基担体に固定し、共固定化酵素を得るステップは、主酵素を活性化アミノ基担体に固定し、初固定化酵素を得るステップと、第１の酵素を初固定化酵素と固定し、共固定化酵素を得るステップと、を含む。
補酵素が１つしかない場合には、上記主酵素と混合して共に固定する方法を採用してもよいし、上記段階的固定の方法を採用してもよい。アミノ基担体を活性化するステップにおけるグルタルアルデヒドに感受性のあるなんらかの補酵素の共固定化にとって、段階的固定の方法を採用することが好ましく、このように、補酵素の活性をより大きい程度で保留することができ、それによって共固定化酵素のリサイクル効率を向上させる。
好適な一実施例では、補酵素は、第２の酵素をさらに含み、主酵素及び補酵素を活性化アミノ基担体に固定し、共固定化酵素を得るステップは、主酵素と第２の酵素を活性化アミノ基担体に共固定化し、初固定化酵素を得るステップと、第１の酵素を初固定化酵素と固定し、共固定化酵素を得るステップと、を含む。
補酵素が１つだけではない場合には、補酵素及びグルタルアルデヒドなどの活性化剤の感受性程度に基づいて、上述した一部を主酵素とともに混合して活性化アミノ基担体に固定し、第２ステップで感受性の高い補酵素を担体に固定する工程を採用してもよく、このように、感受性酵素の活性を向上させることができ、それによって製造された共固定化酵素の全体活性及び循環回収効率を向上させる。上記好適な実施例では、第１の酵素がグルタルアルデヒドに対して感受性のある酵素であり、第２の酵素の感受性が相対的に低いため、第２の酵素を主酵素と混合固定し、第１の酵素を個別固定する。
上記段階的固定化のステップでは、２回目の固定化は、いずれも固定所望補酵素の活性を向上させることを考慮して行われることであり、そのため、この補酵素の活性向上を実現でき、かつその固定を実現できるいかなる方式も本願に適用可能である。好適な一実施例では、ＰＥＩを用いて第１の酵素を初固定化酵素と固定し、共固定化酵素を得る。別の好適な実施例では、初固定化酵素にＰＥＩの最終濃度(質量体積濃度)が０.５％～５％になるまでＰＥＩを加えてＰＥＩ－初固定化酵素を得、ＰＥＩ－初固定化酵素に第１の酵素を加えて温置し、共固定化酵素を得る。
ＰＥＩは、ポリエチレンミンであり、被固定補酵素をイオン吸着で担体に吸着させる非中実形態の支持体として機能することができ、具体的には、添加されるＰＥＩの量は、実際需要に応じて合理的に調整してもよい。ＰＥＩの添加の最終濃度が０.５％～５％に達すると、上記全ての種類の補酵素の固定化を実現することができる。
主酵素がアミノ基転移酵素である場合、補酵素は、ＬＤＨ及びＦＤＨ、又はＬＤＨ及びＧＤＨである２種類の補助因子を有し、その製造方法は、ワンステップ固定法又は段階的固定法を含む。ワンステップ固定法は、異なる組み合わせの２種類の補助因子をアミノ基転移酵素と混合することにより、それぞれ第１の酵素ブレンド又は第２の酵素ブレンドを得、次いで第１の酵素ブレンド又は第２の酵素ブレンドを活性化アミノ基担体に固定し、共固定化酵素を得ることである。段階的固定法は、アミノ基転移酵素をＬＤＨと混合し、第３の酵素ブレンドを得、第３の酵素ブレンドを活性化アミノ基担体に固定し、初固定アミノ基転移酵素を得、初固定アミノ基転移酵素に対してＰＥＩ表面被覆を行うように、さらにＧＤＨ又はＦＤＨを固定し、共固定化酵素を得ることである。
主酵素がアミノ酸脱水素酵素である場合、補酵素は、ＦＤＨ又はＧＤＨであり、製造方法は、アミノ酸脱水素酵素をＦＤＨ又はＧＤＨと混合し、アミノ酸脱水素酵素ブレンドを得、アミノ酸脱水素酵素ブレンドを活性化アミノ基担体に固定し、共固定化酵素を得ること、又は、アミノ酸脱水素酵素を活性化アミノ基担体に固定し、初固定アミノ酸脱水素酵素を得、初固定アミノ酸脱水素酵素に対してＰＥＩ表面被覆を行うように、さらにＧＤＨ又はＦＤＨを固定し、共固定化酵素を得ることのうちのいずれか１つを含む。
主酵素がイミン還元酵素である場合、補酵素は、ＦＤＨ又はＧＤＨであり、製造方法は、イミン還元酵素、ＦＤＨ又はＧＤＨを混合し、イミド酵素ブレンドを得、イミド酵素ブレンドを活性化アミノ基担体に固定し、共固定化酵素を得ること、又は、イミン還元酵素を活性化アミノ基担体に固定し、初固定イミン還元酵素を得、初固定イミン還元酵素に対してＰＥＩ表面被覆を行うように、さらにＧＤＨ又はＦＤＨを固定し、共固定化酵素を得ることのうちのいずれか１つを含む。
主酵素がケトン還元酵素である場合、補酵素は、ＦＤＨ又はＧＤＨであり、製造方法は、ケトン還元酵素、ＦＤＨ又はＧＤＨを混合し、ケトン還元酵素ブレンドを得、ケトン還元酵素ブレンドを活性化アミノ基担体に固定し、共固定化酵素を得ること、又は、ケトン還元酵素を活性化アミノ基担体に固定し、初固定ケトン還元酵素を得、初固定ケトン還元酵素に対してＰＥＩ表面被覆を行うように、さらにＧＤＨ又はＦＤＨを固定し、共固定化酵素を得ることのうちのいずれか１つを含む。
主酵素がアルケン還元酵素である場合、補酵素は、ＦＤＨ又はＧＤＨであり、製造方法は、アルケン還元酵素、ＦＤＨ又はＧＤＨを混合し、アルケン還元酵素ブレンドを得、アルケン還元酵素ブレンドを活性化アミノ基担体に固定し、共固定化酵素を得ること、又は、アルケン還元酵素を活性化アミノ基担体に固定し、初固定アルケン還元酵素を得、初固定アルケン還元酵素に対してＰＥＩ表面被覆を行うように、さらにＧＤＨ又はＦＤＨを固定し、共固定化酵素を得ることのうちのいずれか１つを含む。
主酵素がシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼである場合、補酵素は、ＦＤＨ又はＧＤＨであり、製造方法は、シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ、ＦＤＨ又はＧＤＨを混合し、モノオキシゲナーゼブレンドを得、モノオキシゲナーゼブレンドを活性化アミノ基担体に固定し、共固定化酵素を得ること、又は、シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼを活性化アミノ基担体に固定し、初固定シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼを得、初固定シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼに対してＰＥＩ表面被覆を行うように、さらにＧＤＨ又はＦＤＨを固定し、共固定化酵素を得ることのうちのいずれか１つを含む。
上記様々な主酵素及びその補酵素の共固定化の製造方法において、ＰＥＩ表面被覆の方式は、「初固定化酵素にＰＥＩの最終濃度が０.５w/v%～５w/v%になるまでＰＥＩを加えてＰＥＩ－初固定化酵素複合体を得、次いで第１の酵素をＰＥＩ－初固定化酵素複合体と結合し、共固定化酵素を得る」という前述した操作と同様であるので、ここで説明を省略する。
上述したアミノ基担体を活性化するステップでは、既存の活性化剤を用いて活性化してもよい。好適な一実施例では、アミノ樹脂担体をグルタルアルデヒドで活性化し、活性化アミノ基担体を得る。グルタルアルデヒドの応用範囲は広く、かつ最も一般的なものである。
上記共固定化のステップでは、共固定化方法及び共固定化した補酵素の種類及び数によって、共固定化した酵素の総質量と活性化アミノ基担体の総質量との比が異なる。それに応じて、主酵素と補酵素との質量比も異なり、かつ補酵素が２種類ある場合、主酵素と第１種補酵素及び第２種補酵素との質量比も異なり、実際需要に応じて合理的に調整してもよい。
好適な一実施例では、第１の混合酵素を質量比が５０～１５０mg:１ｇである質量比に従って活性化アミノ基担体に固定し、共固定化酵素を得る。
好適な一実施例では、主酵素と第１の酵素との質量比は、１～２０:１～１０である。
好適な一実施例では、主酵素と第２の酵素との質量比は、１～２０:１～１０である。
好ましくは、上記共固定化のステップでは、アミノ基転移酵素とその補酵素である乳酸脱水素酵素との質量比は、５～７:１であり、アミノ基転移酵素とその補酵素であるギ酸アンモニウム脱水素酵素との質量比は、５～７:１～３であり、アミノ基転移酵素とその補酵素であるグルコース脱水素酵素との質量比は、５～７:１～２であり、アミノ酸脱水素酵素とその補酵素であるギ酸アンモニウム脱水素酵素との質量比は、８～１０:１であり、アミノ酸脱水素酵素とその補酵素であるグルコース脱水素酵素との質量比は、４～６:１であり、イミン還元酵素とその補酵素であるギ酸アンモニウム脱水素酵素との質量比は、４～６:１であり、イミン還元酵素とその補酵素であるグルコース脱水素酵素との質量比は、５～６:１であり、ケトン還元酵素とその補酵素であるギ酸アンモニウム脱水素酵素との質量比は、４～６:１であり、ケトン還元酵素とその補酵素であるグルコース脱水素酵素との質量比は、１:５～１０であり、アルケン還元酵素とその補酵素であるギ酸アンモニウム脱水素酵素との質量比は、６～８:１であり、アルケン還元酵素とその補酵素であるグルコース脱水素酵素との質量比は、１８～２０:１であり、及びモノオキシゲナーゼとその補酵素であるアルコール脱水素酵素との質量比は、２～３:２～３であり、モノオキシゲナーゼとその補酵素であるグルコース脱水素酵素との質量比は、２～３:１である。
上記各主酵素とそれに対応する異なる補酵素との質量比を上記範囲内に制御することで、主補酵素を可能な限り化学量論比に従って配分させることができ、それによって共固定化酵素の触媒活性及び効率を向上させる。
本願の第３の典型的な実施形態では、生物触媒反応における上記いずれか１つの共固定化酵素、又は上記いずれか１つの共固定化酵素の製造方法によって製造された共固定化酵素の使用をさらに提供する。好ましくは、生物触媒反応は、連続的な生物触媒反応である。
以下、具体的な実施例を結び付けながら、本願の有益な効果についてさらに説明する。
以下の実施例で用いる酵素及びその由来を表１に示し、表２～表４に一部の酵素の配列を示す。
次の実施例におけるＰＢは、リン酸緩衝液を意味する。
(実施例１)
アミノ樹脂１ｇを０.１Ｍ リン酸緩衝液(ｐＨ７.５)４～５mLで洗浄し、０.１Ｍ リン酸緩衝液(ｐＨ７.５)４mLで再懸濁させ、２５％～５０％(ｗ/ｖ)グルタルアルデヒド水溶液を滴加し、グルタルアルデヒド最終濃度を２％(ｗ/ｖ)とし、２０℃温和振動下で１時間温置し、ろ過し、０.１Ｍ リン酸緩衝液(ｐＨ７.５)で３回洗浄した。
アミノ樹脂１ｇを０.１Ｍ リン酸緩衝液(ｐＨ７.５)４～５mLで洗浄し、０.１Ｍ リン酸緩衝液(ｐＨ７.５)４mLで再懸濁させ、２５％～５０％(ｗ/ｖ)グルタルアルデヒド水溶液を滴加し、グルタルアルデヒド最終濃度を２％(ｗ/ｖ)とし、２０℃温和振動下で１時間温置し、ろ過し、０.１Ｍ リン酸緩衝液(ｐＨ７.５)で３回洗浄した。
タンパク１００～１２０mgを含有する酵素溶液４mL(適切な割合に調整したＴＡとＬＤＨ)をグルタルアルデヒド活性化樹脂に加え、２０－２５℃温和振動下で温置した後、０.１Ｍ リン酸緩衝液(ｐＨ７.５)でろ過し、３回洗浄した。
イミド二重結合をホウ水素化物で還元することにより、より安定した結合を実現することができる。固定化酵素１ｇを緩衝液４mL(５０mM ＮａＨＣＯ3－Ｎａ2ＣＯ3、ｐＨ８.０～１０.０)で再懸濁し、ＮａＢＨ4最終濃度が１mg/mLとなるように５－１５℃でＮａＢＨ4を加えた。５－１５℃で１－２時間撹拌した後、ろ過し、０.１Ｍ リン酸緩衝液(ｐＨ７.５)で３回洗浄した。
ＴＡとＬＤＨの共固定化活性度試験は、遊離のＦＤＨを用いてＮＡＤＨの再生を実現することで試験を行った。以下の基質１を用いて試験を行った。
０.１Ｍ リン酸緩衝液(ｐＨ８.０)５mLを１０mLの反応器に加え、次いで、１００mgの上記基質１、８０mgのギ酸アンモニウム(ＦＤＨ)、５mgのＰＬＰを加え、ｐＨをｐＨ７.５－８.０に調整した後、５mgのＮＡＤ＋、３０mgのＦＤＨ遊離酵素、及び１００mgの共固定化酵素(湿式酵素、５０～８０％の水を含有する)を加えた。３０℃で１６－２０時間反応させ、ＨＰＬＣにより転化率を測定し、測定結果を表に示す。
実施例２ ＴＡ－Ｂｔ、ＬＤＨ及びＦＤＨの共固定化
方法１:ワンステップ共固定化
アミノ樹脂１ｇを０.１Ｍ ＰＢ(ＰＨ７.５)１－２mLで洗浄し、０.１Ｍ ＰＢ(ＰＨ７.５)４mLで再懸濁し、濃度が２５(ｗ/ｖ)％～５０(ｗ/ｖ)％であるグルタルアルデヒド水溶液を再懸濁液に滴加してグルタルアルデヒドの最終濃度が２(ｗ/ｖ)％となるようにした。２０℃温和振動下で１時間温置し、その後、ろ過し、０.１Ｍ ＰＢ(ＰＨ７.５)で３回洗浄した。タンパク１００－１２０mgを含有する酵素溶液４mL(適切な割合に調整したＴＡとＬＤＨ及びＦＤＨ)をグルタルアルデヒド活性化樹脂に加え、２０－２５℃温和振動下で温置した後、ろ過し、０.１Ｍ ＰＢ(ｐＨ７.５)で３回洗浄した。
方法１:ワンステップ共固定化
アミノ樹脂１ｇを０.１Ｍ ＰＢ(ＰＨ７.５)１－２mLで洗浄し、０.１Ｍ ＰＢ(ＰＨ７.５)４mLで再懸濁し、濃度が２５(ｗ/ｖ)％～５０(ｗ/ｖ)％であるグルタルアルデヒド水溶液を再懸濁液に滴加してグルタルアルデヒドの最終濃度が２(ｗ/ｖ)％となるようにした。２０℃温和振動下で１時間温置し、その後、ろ過し、０.１Ｍ ＰＢ(ＰＨ７.５)で３回洗浄した。タンパク１００－１２０mgを含有する酵素溶液４mL(適切な割合に調整したＴＡとＬＤＨ及びＦＤＨ)をグルタルアルデヒド活性化樹脂に加え、２０－２５℃温和振動下で温置した後、ろ過し、０.１Ｍ ＰＢ(ｐＨ７.５)で３回洗浄した。
方法２:ツーステップ共固定化
ＦＤＨの活性と安定性を向上させるために、共固定化したＴＡ及びＬＤＨ１ｇを０.１ＭのＰＢ(ｐＨは７.０－７.５である)で再懸濁し、ＰＥＩ溶液(最終濃度２％)を加え、その後、ＦＤＨ２０mgを加え、２０－２５℃で温和振動温置した後、ろ過し、０.１Ｍ ＰＢ(ｐＨ７.５)で３回洗浄した。
ＦＤＨの活性と安定性を向上させるために、共固定化したＴＡ及びＬＤＨ１ｇを０.１ＭのＰＢ(ｐＨは７.０－７.５である)で再懸濁し、ＰＥＩ溶液(最終濃度２％)を加え、その後、ＦＤＨ２０mgを加え、２０－２５℃で温和振動温置した後、ろ過し、０.１Ｍ ＰＢ(ｐＨ７.５)で３回洗浄した。
共固定化したＴＡ、ＬＤＨ及びＦＤＨの活性は、以下の反応により検出した。
０.１Ｍ ＰＢ(ｐＨ８.０)５mLを１０mlの反応器に入れ、その後、１００mgの上記基質１、８０mgのギ酸アンモニウム、及び５mgのＰＬＰを加えることにより、ｐＨをｐＨ７.５－８.０に調整した後、５mgのＮＡＤ＋、及び１００mgの共固定化酵素(湿式、５０～８０％の水を含有する)を加えた。３０℃で１６－２０時間反応させ、転化率を測定した。測定結果を次の表に示す。
実施例３ ＴＡ－Ｂｔ、ＬＤＨ及びＧＤＨの共固定化
方法１と方法２では、ＦＤＨの代わりにＧＤＨを用いた以外に、他のステップが実施例２と同様であった。
方法１と方法２では、ＦＤＨの代わりにＧＤＨを用いた以外に、他のステップが実施例２と同様であった。
共固定化したＴＡ、ＬＤＨ及びＧＤＨの活性は、以下の反応により検出した。
０.１Ｍ ＰＢ(ｐＨ８.０)５mLを１０mlの反応器に入れ、その後、１００mgの上記基質１、１２０mgのグリコース、及び５mgのＰＬＰを加えることにより、ｐＨをｐＨ７.５－８.０に調整した後、５mgのＮＡＤ＋、及び１００mgの共固定化酵素(湿式、５０～８０％の水を含有する)を加えた。３０℃で１６－２０時間反応させ、転化率を測定した。測定結果を表７に示す。
実施例４ ＣＨＭＯとＡＤＨ及びＧＤＨとの共固定化
実施例２における方法１と方法２を採用し、主酵素と補酵素をＣＨＭＯ及びＡＤＨ、ＧＤＨに置き換えた以外に、他のステップは同様であった。
実施例２における方法１と方法２を採用し、主酵素と補酵素をＣＨＭＯ及びＡＤＨ、ＧＤＨに置き換えた以外に、他のステップは同様であった。
ＣＨＭＯとＡＤＨ、ＧＤＨとの共固定化酵素の活性は、以下の基質２を用いた反応により検出した。
ＣＨＭＯとＧＤＨとの共固定化酵素の活性は、以下の反応により検出した。
０.１Ｍ ＰＢ(ｐＨ８.０)３mLを１０mlの反応瓶に入れ、その後、５０ミリグラムの基質２、１００mgのグリコース、及び５mgのＮＡＤＰ＋を加え、次いでＣＨＭＯとＧＤＨとの共固定化酵素(湿式、５０～８０％の水を含有する)２００－３００mgを加えた。３０℃で１６－２０時間反応させ、転化率を測定した。
ＣＨＭＯとＡＤＨとの共固定化酵素の活性は、以下の反応により検出した。
イソプロピルアルコール０.３mLを１０mlの反応瓶に入れ、その後、５００mgの基質２を加え、次いで、５mgのＮＡＤＰ＋を含有する０.１Ｍ ＰＢ(ｐＨ８.０)３mL及びＣＨＭＯとＡＤＨとの共固定化酵素(湿式、５０～８０％の水を含有する)１００－２００mgを加えた。３０℃で１６－２０時間反応させ、転化率を測定した。測定結果を表８に示す。
実施例５ ＡＡＤＨとＦＤＨ/ＧＤＨとの共固定化
方法１:
酵素が異なる以外に、他のステップは、実施例２における方法１と同様であった。
方法１:
酵素が異なる以外に、他のステップは、実施例２における方法１と同様であった。
方法２:
アミノ樹脂１ｇを０.１Ｍ ＰＢ(ＰＨ７.５)１－２mLで洗浄し、０.１Ｍ ＰＢ(ＰＨ７.５)４mLで再懸濁し、質量濃度が２５％～５０％であるグルタルアルデヒド水溶液を再懸濁液に滴加してグルタルアルデヒドの最終濃度が２％となるようにした。２０℃温和振動下で１時間温置し、その後、ろ過し、０.１Ｍ ＰＢ(ＰＨ７.５)で３回洗浄した。
アミノ樹脂１ｇを０.１Ｍ ＰＢ(ＰＨ７.５)１－２mLで洗浄し、０.１Ｍ ＰＢ(ＰＨ７.５)４mLで再懸濁し、質量濃度が２５％～５０％であるグルタルアルデヒド水溶液を再懸濁液に滴加してグルタルアルデヒドの最終濃度が２％となるようにした。２０℃温和振動下で１時間温置し、その後、ろ過し、０.１Ｍ ＰＢ(ＰＨ７.５)で３回洗浄した。
タンパク(ＡＡＤＨのみ)５０－１００mgを含有する酵素溶液４mLをグルタルアルデヒド活性化樹脂に加え、２０－２５℃温和振動下で温置した後、ろ過し、０.１Ｍ ＰＢ(ｐＨ７.５)で３回洗浄した。０.１ＭのＰＢ(ｐＨは７.０－７.５である)で再懸濁した後、ＰＥＩ溶液(最終濃度２％)を加え、その後、ＧＤＨ/ＦＤＨ２０－５０mgを加え、２０－２５℃で温和振動温置した後、ろ過し、０.１Ｍ ＰＢ(ｐＨ７.５)で３回洗浄した。
ＡＡＤＨ及びＦＤＨ共固定化酵素の活性は、以下の基質の反応により検出した。
０.１Ｍ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ緩衝液(ｐＨ８.０－９.０)５mLを１０mLの反応器に加え、次いで、１００mgの基質３又は４、又は１、１０８mgの塩化アンモニアを加え、ｐＨをｐＨ７.５－８.０に調整した後、１０－５０mgのＮＡＤ+、８０mgのギ酸アンモニウム、及び１００mgの共固定化酵素を加えた。３０℃で１６－２０時間反応させた後、転化試験を行った。
ＡＡＤＨ及びＦＤＨ共固定化酵素の活性測定方法は、以下のとおりである。
０.１Ｍ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ緩衝液(ｐＨ８.０－９.０)５mLを１０mLの反応器に加え、次いで、１００mgの基質５又は６、又は７、１０８mgの塩化アンモニアを加え、ｐＨをｐＨ７.５－８.０に調整した後、１０－５０mgのＮＡＤ＋、１５０mgのグリコース、及び１００mgの共固定化酵素を加えた。３０℃で１６－２０時間反応させた後、転化試験を行った。測定結果を表９に示す。
実施例６ ＫＲＥＤとＦＤＨ/ＧＤＨとの共固定化
酵素が異なる以外に、他の方法１と２のステップは、いずれも実施例５と同様であった。
酵素が異なる以外に、他の方法１と２のステップは、いずれも実施例５と同様であった。
ＫＲＥＤとＦＤＨとの共固定化酵素の活性は、以下の基質５又は６の反応により検出した。
０.１Ｍ ＰＢ(ｐＨ７.０－８.０)３mLを１０mlの反応器に入れ、その後、１００mgの基質５又は６を加え、続いて１０－５０mgのＮＡＤ(Ｐ)＋、８０mgのギ酸アンモニウム、及び１００mgの共固定化酵素を加えた。３０℃で１６－２０時間反応させ、転化率を測定した。
ＫＲＥＤとＧＤＨとの共固定化酵素の活性は、以下の反応により検出した。
０.１Ｍ ＰＢ(ｐＨ７.０－８.０)３mLを１０mlの反応器に入れ、その後、１００mgの基質５又は６を加え、続いて１０－５０mgのＮＡＤ(Ｐ)＋、１２０mgのグリコース、及び１００mgの共固定化酵素を加えた。３０℃で１６－２０時間反応させ、転化率を測定した。
測定結果を表１０に示す。
実施例７ ＥＲＥＤとＦＤＨ/ＧＤＨとの共固定化
酵素が異なる以外に、他の方法１と２のステップは、いずれも実施例５と同様であった。
酵素が異なる以外に、他の方法１と２のステップは、いずれも実施例５と同様であった。
ＥＲＥＤとＦＤＨとの共固定化酵素の活性は、基質７との反応により検出した。
０.１Ｍ ＰＢ(ｐＨ７.０－８.０)３mLを１０mlの反応器に入れ、その後、１００mgの基質７を加え、続いて１０－５０mgのＮＡＤ(Ｐ)＋、８０mgのギ酸アンモニウム、及び１００mgの共固定化酵素を加えた。３０℃で１６－２０時間反応させ、転化率を測定した。
ＥＲＥＤとＧＤＨとの共固定化酵素の活性は、以下の反応により検出した。
０.１Ｍ ＰＢ(ｐＨ７.０－８.０)３mLを１０mlの反応器に入れ、その後、１００mgの基質７を加え、続いて１０－５０mgのＮＡＤ(Ｐ)＋、１２０mgのグリコース、及び１００mgの共固定化酵素を加えた。３０℃で１６－２０時間反応させ、転化率を測定した。
測定結果を表１１に示す。
測定結果を表１１に示す。
実施例８ ＩＲＥＤとＦＤＨ/ＧＤＨとの共固定化
酵素が異なる以外に、他の方法１と２のステップは、いずれも実施例５と同様であった。
酵素が異なる以外に、他の方法１と２のステップは、いずれも実施例５と同様であった。
ＩＲＥＤとＦＤＨとの共固定化酵素の活性は、以下の基質８を用いて、以下の方法で試験した。
０.１Ｍ ＰＢ緩衝液(ｐＨ７.０－８.０)２mLを１０mLの反応器に入れ、次いで、１００mgの上記基質を加えた後、１０－５０mgのＮＡＤ(Ｐ)＋、６０mgのギ酸アンモニウム、及び１００mgの共固定化酵素を加えた。３０℃で１６－２０時間反応させた後、転化試験を行った。
ＩＲＥＤとＧＤＨとの共固定化酵素の活性は、以下の方法で試験した。
ＩＲＥＤとＧＤＨとの共固定化酵素の活性は、以下の方法で試験した。
０.１Ｍ ＰＢ緩衝液(ｐＨ７.０－８.０)３mLを１０mLの反応器に入れ、その後、１００mgの基質を加え、１０－５０mgのＮＡＤ(Ｐ)＋、１００mgのグリコース、及び１００mgの共固定化酵素を加えた。３０℃で１６－２０時間反応させた後、転化試験を行った。
測定結果を表１２に示す。
実施例９ 充填床連続反応における共固定化酵素の使用
実施例２における方法２に従って、アミノ基転移酵素ＴＡ－Ｂｔと補酵素ＬＤＨ及びＦＤＨを担体ＬＸ１０００ＨＡに共固定化し、得られた共固定化酵素を１０mLカラム体積の柱状反応器に充填し、固定化酵素の使用量は５.９ｇであった。
実施例２における方法２に従って、アミノ基転移酵素ＴＡ－Ｂｔと補酵素ＬＤＨ及びＦＤＨを担体ＬＸ１０００ＨＡに共固定化し、得られた共固定化酵素を１０mLカラム体積の柱状反応器に充填し、固定化酵素の使用量は５.９ｇであった。
５００ｇの基質５、１０８mgの塩化アンモニアをＰＢ緩衝液(０.１Ｍ、ｐＨ８.０)４.５Ｌで溶解し、ｐＨを水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７.５－８.０に調整した後、１０－５０mgのＮＡＤ＋、８０mgのギ酸アンモニウムを加え、最後にＰＢ緩衝液で５Ｌに定容した。
流速０.１mL/min、即ち保持時間１００minを設定し、連続化反応を行い、転化率を出口端流出液で測定し、転化率＞９８％、３００ｈ持続運行し、転化率は低下せず、３４８ｈ運行し、転化率低下値は８８.４％であった。具体的には、表１３に示す。
実施例１０ 連続撹拌槽反応における共固定化酵素の使用
実施例９と同じ共固定化酵素を用いて、２００mLの反応器にアミノ基転移酵素ＴＡ－Ｂｔと補酵素ＬＤＨ、ＦＤＨの共固定化酵素５０ｇを加え、リン酸緩衝液１５０mLを加えた。
実施例９と同じ共固定化酵素を用いて、２００mLの反応器にアミノ基転移酵素ＴＡ－Ｂｔと補酵素ＬＤＨ、ＦＤＨの共固定化酵素５０ｇを加え、リン酸緩衝液１５０mLを加えた。
５００ｇの基質５、１０８mgの塩化アンモニアをＰＢ緩衝液(０.１Ｍ、ｐＨ８.０)４.５Ｌで溶解し、ｐＨを水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７.５－８.０に調整した後、１０－５０mgのＮＡＤ+、８０mgのギ酸アンモニウムを加え、最後にＰＢ緩衝液で５Ｌに定容した。
連続撹拌槽に基質を０.８mL/min(即ち保持時間２５０min)の速度で連続的に加えるとともに、出口にて反応系(配管末端にろ過ヘッドを追加し、固定化酵素の抽出を防止する)から同様の流速で抽出した。この条件下で、転化率は９２％以上に達し、かつ４００ｈ連続運行し、転化率もほとんど低下しなかった。結果を表１４に示す。
実施例１１ １グラム当たり担体へのタンパク担持量の調査
実施例１と同様に、アミノ基担体を活性化した後、１グラム当たり担体へのタンパクの添加量を検討し、アミノ基転移酵素ＴＡ－Ｂｔとその補酵素である乳酸脱水素酵素ＬＤＨとの共固定化を例にして、異なるタンパク量を加え、タンパク担持量と反応リサイクル回数を検出した。結果を表１５に示す。
実施例１と同様に、アミノ基担体を活性化した後、１グラム当たり担体へのタンパクの添加量を検討し、アミノ基転移酵素ＴＡ－Ｂｔとその補酵素である乳酸脱水素酵素ＬＤＨとの共固定化を例にして、異なるタンパク量を加え、タンパク担持量と反応リサイクル回数を検出した。結果を表１５に示す。
実施例４と同様に、モノオキシゲナーゼＣＨＭＯ－Ｒｓとその補酵素であるＡＤＨ及びＧＤＨとの共固定化を例にして、異なるタンパク量を加え、タンパク担持量と反応リサイクル回数を検出し、結果を表１６に示す。結果から分かるように、１グラム当たり選択された担体の担持可能なタンパクの範囲は５０～２００mgであり、タンパク担持率は５０％～１００％であった。
大多数の担体に対して、タンパクサンプリング量が５０－１００mgである場合、タンパク担持率は９０％以上であることが、表１５、１６のデータから分かった。同じタンパク担持率の場合には、異なる担体によって形成された共固定化酵素のリサイクル回数が異なる。ＬＸ１０００ＨＡ、ＬＸ１０００ＥＰＮ及びＥＣＲ８４０９といういくつかの担体が示す固定化酵素活性と安定性は比較的良いことが、この表から分かった。
実施例１２ ＰＥＩ最終濃度の調査
実施例２と同様に、方法２(ツーステップ法)で、アミノ基転移酵素ＴＡ－Ｂｔとその補酵素である乳酸脱水素酵素ＬＤＨ及びギ酸アンモニウム脱水素酵素ＦＤＨとの共固定化酵素を調製し、ＴＡ－ＢｔとＬＤＨとの混合酵素を担体に結合させた後、異なる量のＰＥＩを加え、第２の補酵素ＦＤＨを加えてＰＥＩの濃度範囲を検討し、結果を表１７に示す。
実施例２と同様に、方法２(ツーステップ法)で、アミノ基転移酵素ＴＡ－Ｂｔとその補酵素である乳酸脱水素酵素ＬＤＨ及びギ酸アンモニウム脱水素酵素ＦＤＨとの共固定化酵素を調製し、ＴＡ－ＢｔとＬＤＨとの混合酵素を担体に結合させた後、異なる量のＰＥＩを加え、第２の補酵素ＦＤＨを加えてＰＥＩの濃度範囲を検討し、結果を表１７に示す。
ＰＥＩの濃度は１％～５％の範囲内での効果がほぼ一致するが、この範囲を超えると、固定化酵素の安定性が低下することが、表１７のデータから分かった。
前述の説明から、本発明の上述した実施例は、以下の技術的効果を達成することが分かった。本願は、上記主酵素及びその補酵素をアミノ樹脂担体に共固定化することにより、これらの主酵素及びその補酵素の共固定化を実現し、それによって酵素の活性及びリサイクル効率の向上に有利である。
上述したのが本発明の好適な実施例に過ぎず、本発明を限定するためのものではなく、当業者にとっては、本発明に様々な変更や変化が可能である。本発明の技術的解決策に基づいて行われる修正、同等な置き換え、改善などは、いずれも本発明の保護範囲に含まれるものとする。
Claims (24)
- アミノ樹脂担体と
主酵素及び補酵素と、を含み、
前記補酵素は、１つ又は複数の種類であり、前記主酵素と前記補酵素は、前記アミノ樹脂担体に共固定化され、ここで、前記主酵素は、前記アミノ樹脂担体に共有結合で固定され、前記補酵素は、共有結合及び/又は非共有結合で前記アミノ樹脂担体に固定され、
前記主酵素は、アミノ基転移酵素、アミノ酸脱水素酵素、イミン還元酵素、ケトン還元酵素、アルケン還元酵素及びモノオキシゲナーゼのうちのいずれか１つから選ばれる、ことを特徴とする共固定化酵素。 - 前記アミノ基転移酵素は、B.thuringiensis又はVibrio fluvialis strain JS17に由来するアミノ基転移酵素であり、
好ましくは、前記アミノ酸脱水素酵素は、Bacillus cereus又はBacillus sphaericusに由来するアミノ酸脱水素酵素であり、
好ましくは、前記イミン還元酵素は、Streptomyces sp又はBacillus cereusに由来するイミン還元酵素であり、
好ましくは、前記ケトン還元酵素は、Sporobolomyces salmonicolorに由来するケトン還元酵素又はAcetobacter sp.CCTCC M209061に由来するケトン還元酵素であり、より好ましくは、前記Acetobacter sp.CCTCC M209061に由来するケトン還元酵素は、SEO ID NO:1又はSEO ID NO:2配列を有する変異体であり、
好ましくは、前記アルケン還元酵素は、Chryseobacterium sp.CA49又はSewanella oneidensis MR-1に由来するアルケン還元酵素であり、
好ましくは、前記モノオキシゲナーゼは、Rhodococcus sp.Phi1に由来するシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ、又はBrachymonas petroleovoransに由来するシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ、又はRhodococcus ruber-SD1に由来するシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼであり、より好ましくは、前記Rhodococcus sp.Phi1に由来するシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼは、SEO ID NO:4配列又はSEO ID NO:5配列を有する変異体であり、前記Rhodococcus ruber-SD1に由来するシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼは、SEO ID NO:7配列又はSEO ID NO:8配列を有する変異体である、ことを特徴とする請求項１に記載の共固定化酵素。 - 前記補酵素は、乳酸脱水素酵素、ギ酸アンモニウム脱水素酵素、グルコース脱水素酵素及びアルコール脱水素酵素のうちの少なくとも１つから選ばれ、
好ましくは、前記乳酸脱水素酵素は、Lactobacillus helveticusに由来するＤ－乳酸脱水素酵素であり、
好ましくは、前記ギ酸アンモニウム脱水素酵素は、Candida boidiniiに由来するギ酸脱水素酵素であり、
好ましくは、前記グルコース脱水素酵素は、Lysinibacillus sphaericus G10に由来するグリコース１－脱水素酵素であり、
好ましくは、前記アルコール脱水素酵素は、Thermoanaerobium brockiiに由来するアルコール脱水素酵素であり、
好ましくは、前記共固定化酵素のリサイクル回数は、４～２５回である、ことを特徴とする請求項１に記載の共固定化酵素。 - 前記アミノ樹脂担体は、グルタルアルデヒド活性化のアミノ樹脂担体であり、
好ましくは、前記アミノ樹脂担体は、Ｃ２又はＣ４リンカーを有するアミノ樹脂担体であり、より好ましくは、前記アミノ樹脂担体は、ＳＥＰＬＩＴＥ(R) ＬＸ１０００ＥＡ、ＬＸ１０００ＨＡ、ＬＸ１０００ＮＨ、ＨＦＡ、ＬＸ１０００ＥＰＮ、ＨＭ１００Ｄ、Ｐｕｒｏｌｉｔｅ(R) ＬｉｆｅｔｅｃｈTM ＥＣＲ８３０９、ＥＣＲ８４０９、ＥＣＲ８３０５、ＥＣＲ８４０４、ＥＣＲ８３１５、ＥＣＲ８４１５、ＨＥＣＨＥＮＧ(R) ＥＳＲ－１、ＥＳＲ－３、ＥＳＲ－５及びＥＳＲ－８のうちのいずれか１つから選ばれる、ことを特徴とする請求項１～３のいずれか１項に記載の共固定化酵素。 - 前記共固定化酵素において、前記主酵素と前記補酵素との質量比は、１～２０:１～１０であり、
好ましくは、前記主酵素と前記補酵素との質量合計をＮ１とし、前記アミノ樹脂担体の質量をＮ２とする場合、Ｎ１/Ｎ２は、５０～２００mg:１ｇ、さらに、８０～１２０mg:１ｇである、ことを特徴とする請求項１に記載の共固定化酵素。 - 前記主酵素と前記補酵素は、いずれも前記アミノ樹脂担体に共有結合で固定され、又は、
前記主酵素は、前記アミノ樹脂担体に共有結合で固定され、前記補酵素は、イオン吸着で前記アミノ樹脂担体に非共有結合で固定され、好ましくは、ＰＥＩを介して前記アミノ樹脂担体に前記補酵素を吸着させる、ことを特徴とする請求項１又は５に記載の共固定化酵素。 - 前記補酵素は、第１の酵素と、第２の酵素とを含み、前記主酵素と前記第２の酵素は、前記アミノ樹脂担体に共有結合で固定され、前記第１の酵素は、イオン吸着で前記アミノ樹脂担体に固定される、ことを特徴とする請求項６に記載の共固定化酵素。
- 請求項１～７のいずれか１項に記載の共固定化酵素の製造方法であって、前記製造方法は、
アミノ樹脂担体を活性化し、活性化アミノ基担体を得るステップと、
主酵素を共有結合で前記活性化アミノ基担体に固定し、前記主酵素に対応する補酵素を共有結合及び/又は非共有結合で前記活性化アミノ基担体に固定し、前記共固定化酵素を得るステップと、
を含み、
前記主酵素に対応する前記補酵素の数は１つ又は複数である、ことを特徴とする製造方法。 - 前記主酵素及び前記補酵素を前記活性化アミノ基担体に固定し、前記共固定化酵素を得るステップは、
請求項５に記載の共固定化酵素における前記主酵素と前記補酵素との質量比に従って、前記主酵素を前記補酵素と混合し、第１の混合酵素を得るステップと、
請求項５に記載の共固定化酵素における前記Ｎ１/Ｎ２の割合に従って、前記第１の混合酵素を前記活性化アミノ基担体に固定し、前記共固定化酵素を得るステップと、を含む、ことを特徴とする請求項８に記載の製造方法。 - 前記補酵素は、第１の酵素を含み、前記主酵素及び前記補酵素を前記活性化アミノ基担体に固定し、前記共固定化酵素を得るステップは、
前記主酵素を前記活性化アミノ基担体に固定し、初固定化酵素を得るステップと、
前記第１の酵素を前記初固定化酵素と固定し、前記共固定化酵素を得るステップと、を含む、ことを特徴とする請求項８に記載の製造方法。 - 前記補酵素は、第２の酵素をさらに含み、前記主酵素及び前記補酵素を前記活性化アミノ基担体に固定し、前記共固定化酵素を得るステップは、
前記主酵素と前記第２の酵素を前記活性化アミノ基担体に共固定化し、前記初固定化酵素を得るステップと、
前記第１の酵素を前記初固定化酵素と固定し、前記共固定化酵素を得るステップと、を含む、ことを特徴とする請求項１０に記載の製造方法。 - ＰＥＩを表面被覆するように、前記第１の酵素を前記初固定化酵素と固定し、前記共固定化酵素を得、
好ましくは、前記初固定化酵素にＰＥＩの最終濃度が０.５w/v%～５w/v%になるまで前記ＰＥＩを加えてＰＥＩ－初固定化酵素複合体を得、次いで前記第１の酵素を前記ＰＥＩ－初固定化酵素複合体と結合し、前記共固定化酵素を得る、ことを特徴とする請求項１１に記載の製造方法。 - 前記第１の混合酵素を質量比が５０～１５０mg:１ｇである質量比に従って前記活性化アミノ基担体に固定し、前記共固定化酵素を得る、ことを特徴とする請求項１０に記載の製造方法。
- 前記主酵素と前記第１の酵素との質量比は、１～２０:１～１０である、ことを特徴とする請求項１１に記載の製造方法。
- 前記主酵素と前記第２の酵素との質量比は、１～２０:１～１０である、ことを特徴とする請求項１１に記載の製造方法。
- 前記主酵素は、アミノ基転移酵素であり、前記補酵素は、２種類の補助因子を有し、２種類の前記補助因子は、ＬＤＨ及びＦＤＨ、又はＬＤＨ及びＧＤＨであり、前記製造方法は、下記の
(１)前記アミノ基転移酵素、前記ＬＤＨをＦＤＨと混合し、第１の酵素ブレンドを得、前記第１の酵素ブレンドを前記活性化アミノ基担体に固定し、前記共固定化酵素を得ること、
(２)前記アミノ基転移酵素、前記ＬＤＨをＧＤＨと混合し、第２の酵素ブレンドを得、前記第２の酵素ブレンドを前記活性化アミノ基担体に固定し、前記共固定化酵素を得ること、
(３)前記アミノ基転移酵素を前記ＬＤＨと混合し、第３の酵素ブレンドを得、前記第３の酵素ブレンドを前記活性化アミノ基担体に固定し、初固定アミノ基転移酵素を得、前記初固定アミノ基転移酵素に対してＰＥＩ表面被覆を行うように、さらに前記ＧＤＨ又は前記ＦＤＨを固定し、前記共固定化酵素を得ることのうちのいずれか１つを含む、ことを特徴とする請求項８に記載の製造方法。 - 前記主酵素は、アミノ酸脱水素酵素であり、前記補酵素は、ＦＤＨ又はＧＤＨであり、前記製造方法は、下記の
アミノ酸脱水素酵素をＦＤＨ又はＧＤＨと混合し、アミノ酸脱水素酵素ブレンドを得、前記アミノ酸脱水素酵素ブレンドを前記活性化アミノ基担体に固定し、前記共固定化酵素を得ること、
又は、
前記アミノ酸脱水素酵素を前記活性化アミノ基担体に固定し、前記初固定アミノ酸脱水素酵素を得、
前記初固定アミノ酸脱水素酵素に対してＰＥＩ表面被覆を行うように、さらに前記ＧＤＨ又は前記ＦＤＨを固定し、前記共固定化酵素を得ることのうちのいずれか１つを含む、ことを特徴とする請求項８に記載の製造方法。 - 前記主酵素は、イミン還元酵素であり、前記補酵素は、ＦＤＨ又はＧＤＨであり、前記製造方法は、下記の
前記イミン還元酵素、前記ＦＤＨ又は前記ＧＤＨを混合し、イミド酵素ブレンドを得、
前記イミド酵素ブレンドを前記活性化アミノ基担体に固定し、前記共固定化酵素を得ること、
又は、
前記イミン還元酵素を前記活性化アミノ基担体に固定し、初固定イミン還元酵素を得、
前記初固定イミン還元酵素に対してＰＥＩ表面被覆を行うように、さらに前記ＧＤＨ又は前記ＦＤＨを固定し、前記共固定化酵素を得ることのうちのいずれか１つを含む、ことを特徴とする請求項８に記載の製造方法。 - 前記主酵素は、ケトン還元酵素であり、前記補酵素は、ＦＤＨ又はＧＤＨであり、前記製造方法は、下記の
前記ケトン還元酵素、前記ＦＤＨ又は前記ＧＤＨを混合し、ケトン還元酵素ブレンドを得、
前記ケトン還元酵素ブレンドを前記活性化アミノ基担体に固定し、前記共固定化酵素を得ること、
又は、
前記ケトン還元酵素を前記活性化アミノ基担体に固定し、初固定ケトン還元酵素を得、
前記初固定ケトン還元酵素に対してＰＥＩ表面被覆を行うように、さらに前記ＧＤＨ又は前記ＦＤＨを固定し、前記共固定化酵素を得ることのうちのいずれか１つを含む、ことを特徴とする請求項８に記載の製造方法。 - 前記主酵素は、アルケン還元酵素であり、前記補酵素は、ＦＤＨ又はＧＤＨであり、前記製造方法は、下記の
前記アルケン還元酵素、前記ＦＤＨ又は前記ＧＤＨを混合し、アルケン還元酵素ブレンドを得、
前記アルケン還元酵素ブレンドを前記活性化アミノ基担体に固定し、前記共固定化酵素を得ること、
又は、
前記アルケン還元酵素を前記活性化アミノ基担体に固定し、初固定アルケン還元酵素を得、
前記初固定アルケン還元酵素に対してＰＥＩ表面被覆を行うように、さらに前記ＧＤＨ又は前記ＦＤＨを固定し、前記共固定化酵素を得ることのうちのいずれか１つを含む、ことを特徴とする請求項８に記載の製造方法。 - 前記主酵素は、シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼであり、前記補酵素は、ＦＤＨ又はＧＤＨであり、前記製造方法は、下記の
前記シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ、前記ＦＤＨ又は前記ＧＤＨを混合し、モノオキシゲナーゼブレンドを得、
前記モノオキシゲナーゼブレンドを前記活性化アミノ基担体に固定し、前記共固定化酵素を得ること、
又は、
前記シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼを前記活性化アミノ基担体に固定し、初固定シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼを得、
前記初固定シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼに対してＰＥＩ表面被覆を行うように、さらに前記ＧＤＨ又は前記ＦＤＨを固定し、前記共固定化酵素を得ることのうちのいずれか１つを含む、ことを特徴とする請求項８に記載の製造方法。 - 前記アミノ樹脂担体をグルタルアルデヒドで活性化し、前記活性化アミノ基担体を得る、ことを特徴とする請求項８に記載の製造方法。
- 請求項１～７のいずれか１項に記載の共固定化酵素、又は請求項８～２２のいずれか１項に記載の共固定化酵素の製造方法によって製造された共固定化酵素の、生物触媒反応への使用。
- 前記生物触媒反応は、間欠的な生物触媒反応又は連続的な生物触媒反応であり、
好ましくは、前記共固定化酵素は、連続的な流動床又は固定床の生物触媒反応に適用され、
好ましくは、前記連続的な生物触媒反応における前記共固定化酵素のリサイクル回数は、４～２５回である、ことを特徴とする請求項２３に記載の使用。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/CN2019/122447 WO2021108957A1 (zh) | 2019-12-02 | 2019-12-02 | 共固定化酶、其制备方法及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2023505967A true JP2023505967A (ja) | 2023-02-14 |
| JP7420944B2 JP7420944B2 (ja) | 2024-01-23 |
Family
ID=76221298
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2022532879A Active JP7420944B2 (ja) | 2019-12-02 | 2019-12-02 | 共固定化酵素、その製造方法及びその使用 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20230025239A1 (ja) |
| EP (1) | EP4071246A4 (ja) |
| JP (1) | JP7420944B2 (ja) |
| WO (1) | WO2021108957A1 (ja) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105063010A (zh) * | 2015-07-03 | 2015-11-18 | 厦门大学 | 一种聚乙烯亚胺金属配位固定化的多酶体系及其制备方法 |
| CN109777813A (zh) * | 2019-01-25 | 2019-05-21 | 浙江工业大学 | 一种转氨酶-plp共固定化酶及其制备与应用 |
| CN110423741A (zh) * | 2019-07-16 | 2019-11-08 | 浙江工业大学 | 羰基还原酶-辅酶nadp+共固定化酶及其制备与应用 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4518692A (en) * | 1983-09-01 | 1985-05-21 | Genetics Institute, Inc. | Production of L-amino acids by transamination |
| ES2531290T3 (es) * | 2008-01-03 | 2015-03-12 | Basf Enzymes Llc | Transferasas y oxidorreductasas, ácidos nucleicos que las codifican y métodos para prepararlas y usarlas |
| US9587229B2 (en) * | 2011-06-24 | 2017-03-07 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Immobilized transaminases and process for making and using immobilized transaminase |
| WO2014133928A1 (en) * | 2013-02-28 | 2014-09-04 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Immobilized transaminases and process for making and using immobilized transaminase |
| CN106676142B (zh) * | 2016-11-01 | 2021-01-22 | 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司 | 一种手性氨基杂环化合物及其衍生物的制备方法 |
| CN109825538B (zh) * | 2017-11-23 | 2022-05-24 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种手性2-氨基-1-丁醇的合成方法 |
| CN110452942B (zh) * | 2019-08-23 | 2021-01-12 | 华南师范大学 | 固定化酶催化法制备d-核酮糖 |
-
2019
- 2019-12-02 JP JP2022532879A patent/JP7420944B2/ja active Active
- 2019-12-02 US US17/781,823 patent/US20230025239A1/en active Pending
- 2019-12-02 WO PCT/CN2019/122447 patent/WO2021108957A1/zh unknown
- 2019-12-02 EP EP19955387.6A patent/EP4071246A4/en active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105063010A (zh) * | 2015-07-03 | 2015-11-18 | 厦门大学 | 一种聚乙烯亚胺金属配位固定化的多酶体系及其制备方法 |
| CN109777813A (zh) * | 2019-01-25 | 2019-05-21 | 浙江工业大学 | 一种转氨酶-plp共固定化酶及其制备与应用 |
| CN110423741A (zh) * | 2019-07-16 | 2019-11-08 | 浙江工业大学 | 羰基还原酶-辅酶nadp+共固定化酶及其制备与应用 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| APPLIED CATALYSIS A GENERAL, 2018(ONLINE), VOL.572, PP.134-141, JPN6023023203, ISSN: 0005170851 * |
| BICHEMICAL ENGINEERING JOURNAL, 2015, VOL.93, PP.173-178, JPN6023023204, ISSN: 0005170852 * |
| BIOSCI. BIOTECHNOL. BIOCHEM., 2001, VOL.65, NO.8, PP.1782-1788, JPN6023023207, ISSN: 0005170855 * |
| BIOTECHNOL. BIOENG., 2005, VOL.92, NO.2, PP.137-146, JPN6023023206, ISSN: 0005170854 * |
| LANGMUIR, 2007, VOL.23, PP.7127-7133, JPN6023023205, ISSN: 0005170853 * |
| 化学と生物, 1997, VOL.35, NO.7, PP.496-504, JPN6023023208, ISSN: 0005170856 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP4071246A1 (en) | 2022-10-12 |
| US20230025239A1 (en) | 2023-01-26 |
| EP4071246A4 (en) | 2023-04-19 |
| JP7420944B2 (ja) | 2024-01-23 |
| WO2021108957A1 (zh) | 2021-06-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110951718B (zh) | 共固定化酶、其制备方法及其应用 | |
| CN110964710B (zh) | 固定化酶、其制备方法及其应用 | |
| El‐Zahab et al. | Particle‐tethered NADH for production of methanol from CO2 catalyzed by coimmobilized enzymes | |
| CN111235140B (zh) | 固定化酶、其制备方法及其应用 | |
| CN112662656B (zh) | 酶固定化载体及其制备方法、固定化酶及其制备方法 | |
| CN111117995A (zh) | 改性环氧树脂固定化酶、制备方法及应用 | |
| EP4183878A1 (en) | Pva membrane immobilized enzyme and preparation method therefor | |
| García-García et al. | Co-localization of oxidase and catalase inside a porous support to improve the elimination of hydrogen peroxide: Oxidation of biogenic amines by amino oxidase from Pisum sativum | |
| JP7441953B2 (ja) | 変性エポキシ樹脂固定化酵素、製造方法及び使用 | |
| WO2021128086A1 (zh) | 固定化酶、其制备方法及其应用 | |
| JP7420944B2 (ja) | 共固定化酵素、その製造方法及びその使用 | |
| CN114369583B (zh) | 固定化酶及其在连续化生产中的应用 | |
| Atia | Co-immobilization of cyclohexanone monooxygenase and glucose-6-phosphate dehydrogenase onto polyethylenimine-porous agarose polymeric composite using γ irradiation to use in biotechnological processes | |
| CN115537410A (zh) | 酶固定化载体及其制备方法、固定化酶及其制备方法和应用 | |
| CN111117996A (zh) | 固定化酶、其制备方法及应用 | |
| EP4394036A1 (en) | Enzyme immobilization carrier and preparation method therefor, and immobilized enzyme and preparation method therefor | |
| WO2021142617A1 (zh) | 固定化酶、其制备方法及应用 | |
| JPH0314433B2 (ja) | ||
| Shamir et al. | Glucose Isomerase Membrane Reactor | |
| JPH0314431B2 (ja) | ||
| JPH0417635B2 (ja) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20220601 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230613 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230913 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20231010 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20231120 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20240109 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20240111 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7420944 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |