JP7441953B2 - 変性エポキシ樹脂固定化酵素、製造方法及び使用 - Google Patents
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Description
IDA:Iminodiacetic acid disodium salt hydrate、イミノ二酢酸二ナトリウム塩水和物。
GA:Glutaraldehyde、グルタルアルデヒド
PEI:polyethyleneimine、ポリエチレンイミン
PEG:polyethylene glycol、ポリエチレングリコール
過ヨウ素酸ナトリウムで酸化した後に、酸化したエポキシ樹脂をPEI(ポリエチレンイミン)又はPEIと他の補因子でさらに修飾し、樹脂のアルデヒド基とPEIのアミノ基を介して各種の酵素を共有結合し、次に、二重機能性試薬であるグルタルアルデヒドで活性化させることによって、空間における樹脂分岐を増やし、網状構造を形成し、共有結合によって酵素をより容易に結合させることができ、空間上の制限が減少するため、酵素担持も改善される。固定化をより強固なものとするために、追加のリンカー(linker)として例えばグルタルアルデヒド又はデキストランアルデヒドを二次架橋用に添加してもよい。
His標識酵素を金属変性エポキシ樹脂に固定化することが報告されており、まず、エポキシ樹脂とイミノ二酢酸を反応させて担体表面上の一部のエポキシ化物を転化し、次に、適切な金属イオン溶液で処理することにより樹脂に錯化した。次に、Hisタグ付き酵素を添加し、Hisタグと金属との間の選択的相互作用により迅速な錯化を可能とし、次に、タンパク質の表面上の求核性残基(Lys、Cys又はSer)と担体上の未反応エポキシ残基とを反応させ、共有結合による連結を完了した。次に、EDTA溶液で洗浄して金属イオンを除去した。反応性エポキシ化物が残留されないように、最後に、グリシンをエンドキャッピング剤として担体を処理した。酵素は樹脂上に特異的に結合できるが、安定性が不十分であり、6サイクルした結果、残留活性は10%未満である。金属とイミノ二酢酸変性樹脂との錯化の強度が不十分であり、酵素の漏洩が発生しやすい。
過ヨウ素酸ナトリウムで酸化されたエポキシ樹脂への酵素の固定化
エポキシ樹脂ECR8285又はLX1000EP 5gを1M酢酸20mLにそれぞれ加え、室温で12時間軽く撹拌し、蒸留水20mLを用いて酢酸で処理された担体を3回洗浄し、処理された担体を50mM過ヨウ素酸ナトリウム20mlに懸濁させ、室温で2時間軽く撹拌し、ろ過して蒸留水で洗浄した。
変性エポキシ樹脂5gを0.1Mリン酸緩衝液で再懸濁させ、最終濃度が1%となるようにPEIを加え、pHを7.0に調整し、2時間軽く撹拌した後に、50~100mMグルタルアルデヒドを加え、室温で1~2時間軽く撹拌した。次に、担体樹脂をろ過して水10mlで洗浄した。洗浄した担体を酵素溶液(5mg/mL補因子を含有する10ml酵素であって、100mMリン酸塩緩衝液40mLに溶解させ、pH7.0とした。)に加えて、10~25℃で4時間撹拌し、一晩冷蔵庫に放置した。一晩静置後に、酵素をろ過して、0.1M PB緩衝液(pH7.0)で洗浄した。必要に応じて、一晩静置後に、過量のグルタルアルデヒド(20~50mM)又はデキストランアルデヒド(10~50mM)を溶液に加え、10~25℃で1時間軽く撹拌し、次に、ろ過して0.1M PB緩衝液(pH7.0)で洗浄した。
過ヨウ素酸ナトリウムで酸化されたエポキシ樹脂への酵素の固定化
エポキシ樹脂ビーズ5gを1M酢酸50mLに加え、室温で12時間軽く撹拌し、蒸留水50mLを用いて酢酸で処理された担体を3回洗浄し、毎回10分間軽く撹拌し、処理した担体を過ヨウ素酸ナトリウム100mlに懸濁させ、室温で2時間軽く撹拌し、ろ過して蒸留水で洗浄した。
変性エポキシ樹脂5gを0.1Mリン酸緩衝液で再懸濁させ、最終濃度が1%となるようにPEIを加え、pHを7.0に調整し、2時間軽く撹拌した。次に、担体をろ過して水10mlで洗浄した。洗浄した担体を酵素溶液(5mg/mL補因子を含有する10ml酵素であって、100mMリン酸塩緩衝液40mLに溶解させ、pH7.0とした。)に加え、室温で4時間撹拌し、一晩冷蔵庫に放置した。一晩静置後に、20~100mMグルタルアルデヒドを溶液に加え、10~25℃で1時間軽く撹拌した後に、ろ過して0.1M PB緩衝液(pH7.0)で洗浄した。
イミノ二酢酸変性エポキシ樹脂への酵素の固定化
担体4gを担体修飾緩衝液(0.1Mホウ酸ナトリウム、1Mイミノ二酢酸、pH8.5)8mLに加え、室温で2時間振とうさせた。2時間後、担体をろ別して担体修飾緩衝液を除去し、再蒸留水で洗浄し、次に、リン酸塩緩衝液で再懸濁させ、PEI最終濃度が1%となるようにPEIを加え、pHを8.0~11.0に調整し、3時間軽く撹拌した。担体をろ過して水30mlで3回洗浄し、次に、リン酸緩衝液20mLで再懸濁させ、金属イオンの濃度が10~30mMとなるように金属イオンを加えた。金属イオンはCoCl2又はNiCl2・6H2O又はCuSO4・5H2O又はFeCl2又はFeCl2から選択される。
室温で2時間振とうさせた。樹脂をさらに再蒸留水でリンスし、0.1M PB緩衝液(pH8.0)で洗浄した。さらに50mMグルタルアルデヒド含有緩衝液(0.1M PB pH=8.0)で再懸濁させ(酵素のそれぞれに従って補因子で前処理した。)、室温で1時間軽く撹拌した。ろ過して0.1M PB pH=7.0で3回洗浄した。
前処理した樹脂を0.1M PB pH=7.0 16mLで再懸濁させ、酵素溶液(50~100mg/mLタンパク質含有量で、補因子3~10mg/mLであった。)を4~8mL加え、30分間軽く撹拌し、一晩放置した後に、ろ過した。0.05M PB緩衝液(pH7.5で、0.05M EDTA及び0.5M NaClを含有した。)20mlで2回洗浄し、毎回10分間軽く撹拌した。その後、水20mlで3回洗浄し、次に、0.1M PB緩衝液(pH7.5)で洗浄した。
イミノ二酢酸変性エポキシ樹脂への酵素の固定化
担体4gを担体修飾緩衝液(0.1Mホウ酸ナトリウム、1Mイミノ二酢酸、pH8.5)8mLに加え、室温で2時間振とうさせた。2時間後、担体をろ別して担体修飾緩衝液を除去し、再蒸留水で洗浄し、次に、リン酸塩緩衝液で再懸濁させ、PEI最終濃度が1%となるまでPEIを加え、pHを8.0~11.0に調整し、3時間軽く撹拌した。
担体をろ過して水30mlで3回洗浄し、次に、リン酸緩衝液20mLで再懸濁させ、金属イオンの濃度が10~30mMとなるように、金属イオンを加えた。金属イオンはCoCl2又はNiCl2・6 H2O又はCuSO4・5H2O又はFeCl2又はFeCl2から選択される。
室温で2時間振とうさせた。樹脂をさらに再蒸留水でリンスし、0.1M PB緩衝液(pH8.0)で洗浄した。さらに緩衝液(0.1M PB pH=8.0)16mLで再懸濁させ、酵素溶液(50~100mg/mLタンパク質含有量で、補因子3~10mg/mLであった。)4~8mLを加え、30分間軽く撹拌し、一晩放置した後、ろ過した。0.05M PB緩衝液(pH7.5で、0.05M EDTA及び0.5M NaClを含有した。)20mlで2回洗浄し、毎回10分間軽く撹拌した。次に、水20mlで3回洗浄し、次に、用0.1M PB緩衝液(pH7.5)で洗浄した。
イミノ二酢酸変性エポキシ樹脂への酵素の固定化
担体4gを担体修飾緩衝液(0.1Mホウ酸ナトリウム、1Mイミノ二酢酸、pH8.5)8mLに加え、室温で2時間振とうさせた。2時間後、担体をろ別して担体修飾緩衝液を除去し、再蒸留水で洗浄し、次に、リン酸塩緩衝液で再懸濁させ、PEI最終濃度が1%となるようにPEIを加え、pHを8.0~11.0に調整し、再懸濁させて3時間軽く撹拌した。担体をろ過して水30mlで3回洗浄し、次に、リン酸緩衝液20mLで再懸濁させ、金属イオンの濃度が10~30mMとなるように、金属イオンを加えた。金属イオンは、CoCl2又はNiCl2・6 H2O又はCuSO4・5H2O又はFeCl2又はFeCl2から選択される。
担体をろ過して水30mlで3回洗浄し、次に、PB緩衝液(0.1 M pH=8.0)16mLに再懸濁させ、酵素溶液(50~100mg/mLタンパク質含有量で、補因子3~10mg/mLであった。)4~8mLを加え、30分間軽く撹拌し、一晩放置した後、ろ過した。0.1 M PB(pH=8.0)16mL、5mg/ml補因子と50mMグルタルアルデヒドを加え、室温で軽く30分間振とうさせた。0.05M PB緩衝液(pH7.5で、0.05M EDTA及び0.5M NaClを含有した。)20mlで2回洗浄し、毎回10分間軽く撹拌した。次に、水20mlで3回洗浄し、次に、0.1M PB緩衝液(pH7.5)で洗浄した。
イミノ二酢酸変性エポキシ樹脂への酵素の固定化
担体4gを担体修飾緩衝液(0.1Mホウ酸ナトリウム、1Mイミノ二酢酸、pH8.5)8mLに加え、室温で2時間振とうさせた。2時間後、担体をろ別して担体修飾緩衝液を除去し、再蒸留水で洗浄し、次に、リン酸塩緩衝液で再懸濁させ、PEI最終濃度が1%となるようにPEIを加え、pHを8.0~11.0に調整し、3時間軽く撹拌した。担体をろ過して水30mlで3回洗浄し、次に、リン酸緩衝液20mLで再懸濁させ、金属イオンの濃度が10~30mMとなるように、金属イオンを加えた。金属イオンはCoCl2又はNiCl2・6 H2O又はCuSO4・5H2O又はFeCl2又はFeCl2から選択される。
担体をろ過して水30mlで3回洗浄し、前処理した担体をPB緩衝液(0.1 M pH=8.0)16mLに再懸濁させ、酵素溶液(50~100mg/mLタンパク質含有量で、補因子3~10mg/mLであった。)4~8mLを加え、30分間軽く撹拌し、一晩放置した後、ろ過した。0.1 M PB(pH=8.0)16mL、5mg/ml補因子、及び50mMグルタルアルデヒドを加え、室温で30分間軽く振とうさせた。0.05M PB緩衝液(pH7.5で、0.05M EDTA及び0.5M NaClを含有した。)20mlで2回洗浄し、毎回10分間軽く撹拌した。次に、水20mlで3回洗浄し、次に、0.1M PB緩衝液(pH7.5)で洗浄した。
又は、前処理した樹脂を0.1M PB pH=7.0 16mLで再懸濁させ、酵素溶液(50~100mg/mLタンパク質含有量で、補因子3~10mg/mLであった。)4~8mLを加え、30分間軽く撹拌し、一晩放置した後、ろ過した。0.05M PB緩衝液(pH7.5で、0.05M EDTA及び0.5M NaClを含有した。)20mlで2回洗浄し、毎回10分間軽く撹拌した。次に、水20mlで3回洗浄し、次に、0.1M PB緩衝液(pH7.5)で洗浄した。
グルタルアルデヒドを、PEI修飾グルタルアルデヒド、PEG分子量を6000Da、PEGとグルタルアルデヒドの質量比を1:1に変更した以外、実施例2と同様であった。
グルタルアルデヒドをアルデヒド化デキストランに変更した以外、実施例1と同様であった。
グルタルアルデヒドを、PEI修飾グルタルアルデヒド、PEG分子量を6000Da、PEGとグルタルアルデヒドとの質量比を1:1に変更した以外、実施例5と同様であった。
固定化トランスアミナーゼの転化及び繰り返し使用の試験
IDA*-エポキシ担体をIDA及び金属イオンで修飾した後、親和吸着により酵素を結合させる。
IDA1-エポキシ担体をIDAで修飾した後、さらにPEI及び金属イオンで修飾し、酵素を加える前に架橋剤で修飾する。
IDA2-エポキシ担体をIDAで修飾した後、さらにPEI及び金属イオンで修飾し、酵素を結合させてから架橋剤で架橋させる。
IDA3-エポキシ担体をIDAで修飾した後、さらにPEI及び金属イオンで修飾し、酵素を加える前にPEG処理架橋剤で修飾する。
IDA4-エポキシ担体をIDAで修飾した後、さらにPEI及び金属イオンで修飾し、酵素を結合させた後、PEG処理架橋剤でさらに架橋させる。
SP1-エポキシ担体を過ヨウ素酸ナトリウムで酸化し、さらにPEIで修飾し、酵素を加える前に架橋剤で修飾する。
SP2-エポキシ担体を過ヨウ素酸ナトリウムで酸化し、PEIで修飾し、次に、グルタルアルデヒドで修飾し、酵素を加えた後、架橋剤で架橋させる。
SP3-エポキシ担体を過ヨウ素酸ナトリウムで酸化し、PEIで修飾し、酵素を加えた後、さらに架橋剤で架橋させる。
SP4-エポキシ担体を過ヨウ素酸ナトリウムで酸化した後、さらにPEI及び金属イオンで修飾し、酵素を結合させた後、PEG処理架橋剤で架橋させる。
固定化ケトレダクターゼの転化及び繰り返し使用の試験
固定化CHMOsの転化及び繰り返し使用の試験
CHMOエポキシ担体固定化酵素の活性は以下の基質5を用いて反応を行うことによって検出される。
固定化EREDの転化及び繰り返し使用の試験
EREDエポキシ担体固定化酵素の活性は以下の基質6を用いて反応を行うことによって検出される。
固定化NITsの転化及び繰り返し使用の試験
NITアミノ担体固定化酵素の活性は以下の基質7を用いて反応を行うことによって検出される。
固定化IREDの転化及び繰り返し使用の試験
以下の基質8を用いて検出を行った。
0.1 M PB緩衝液(pH7.0~8.0)2mLを10mL反応フラスコに加え、次に、基質8 100mg、NAD+10mg、ギ酸アンモニウム60mg、FDH 10mg及びIRED遊離酵素10mg又は遊離酵素30mgを用いて製造された固定化化酵素を加えた。30℃で20時間反応させた後、転化率を検出し、1回の反応が終了するごとに、固定化酵素を分離して、次の反応に再利用し、繰り返し使用回数を調べた。
固定化PALの転化及び繰り返し使用の試験
固定化酵素の活性及び繰り返し使用回数は以下の基質9を用いて反応を行うことによって検出される。
系についてHPLCにより転化率を検出し、反応データを以下の表15に示す。
固定化AADHの転化及び繰り返し使用の試験
系についてHPLCにより転化率を検出し、反応データを以下の表16に示す。
固定化FDHの転化及び繰り返し使用の試験
10mL反応フラスコに、0.1 M Tris-Cl緩衝液(pH8.0~9.0)5mLを加え、主原料12を100mg溶解し、塩化アンモニウム108mg、アンモニウム塩80mgを加え、pHをpH7.5~8.0に調整し、次に、NAD+10~50mg、AADH-Bc遊離酵素100mg及びFDH 5mg、又は遊離酵素10mgを用いて製造された固定化FDHを加えた。30℃で16~20h撹拌した。系についてHPLCにより転化率を検出し、反応データを以下の表17に示す。
充填層を用いた連続反応におけるトランスアミナーゼアミノ担体固定化酵素の使用
実施例においてトランスアミナーゼTA-Cv-V1をIDA1の方式で担体ECR8285に固定化し、得た固定化酵素をカラム体積の120mLのカラム状反応器に充填し、固定化酵素の使用量を72gとした。
基質1 500gを、エタノール1.5Lで溶解したものに、イソプロピルアミン塩酸塩(6Mイソプロピルアミン塩酸塩水溶液1.8L)4eq及びPLP 5gを加え、PB緩衝液(0.1 M、pH8.0)を加えず、5Lに定容した。
流速を0.6mL/min、即ち、保留時間を200minに設定して、連続反応を行い、出口からの流出液について転化率を検出したところ、転化率>98%であり、さらに260h運転していても、転化率には低下が認められず、280h運転したところ、転化率は90%に低下した。具体的には、表18に示す。
連続撹拌槽を用いた反応におけるトランスアミナーゼ固定化酵素の使用
実施例1と同様な固定化酵素TA-Ac-V1を用いて、担体LX1000HFAにSP2の方式で固定化した。200mL反応器にトランスアミナーゼTA-Ac-V1固定化酵素を50g加え、リン酸緩衝液150mLを加えた。
基質1 500gに、PB(0.1M、pH7.0)3.2L、イソプロピルアミン塩酸塩水溶液(6M)1.8L、及びPLP 5gを加え、スラリー化して懸濁液とした。
0.4mL/minの速度で反応フラスコに基質懸濁液(即ち保留時間500minである。)を連続的に添加し、それと同時に、同じ流速で出口から反応系を抽出した(管路の末端にろ過ヘッドを追加し、固定化酵素の抽出を防止する)。このような条件では、転化率は90%以上に達し、かつ2000h連続して運転していても、転化率にはほぼ低下が認められなかった。結果を表19に示す。
アンモニアリアーゼPAL-Ss固定化酵素を、担体HFA001にIDA4の方式で固定化した。得た固定化酵素6gを10mLカラム状反応器に充填した。
基質9 500gを、アミノ基ギ酸アンモニウム水溶液(4M、pH9.0~9.5)4.5Lで溶解した。
流速を0.03mL/min、即ち、保留時間を330minに設定し、連続反応を行い、出口からの流出液について転化率を検出したところ、転化率は80%であり、300h持続して運転していても、転化率には低下が認められず、310h運転したところ、転化率は70%に低下した。表20に示す。
実施例で製造されたケトレダクターゼKRED-Ac-V1固定化酵素を、担体LX1000EPにIDA4の方式で固定化した。得た固定化酵素6gを10mLカラム状反応器に充填した。
基質3 100gを、イソプロピルアルコール0.3Lで溶解し、PB緩衝液(0.1M、pH7.0)0.7Lを加えて溶解し、次に、NAD+0.1gを加えた。
流速を0.05mL/min、即ち、保留時間を200minに設定して、連続反応を行い、出口からの流出液について転化率を検出したところ、転化率>90%であり、200h持続して運転していても、転化率には低下が認められず、210h運転したところ、転化率は80%に低下した。表21に示す。
過ヨウ素酸ナトリウムで酸化されたエポキシ樹脂の固定化の各パラメータの調査
酢酸の濃度及び使用量、過ヨウ素酸ナトリウムの濃度及び使用量、並びに架橋剤の濃度の調査
実施例4の方法によって、FDHをLX1000HFA担体に固定化し、イミノ二酢酸(IDA)の濃度を0.2~3mol/L、IDA溶液と担体との体積/質量比を2~25:1、金属イオンの濃度を5~100mmol/Lに設定して、架橋剤であるデキストランアルデヒド(DA)の範囲を調べた。その中でも、IDA濃度は、1~2mol/Lである場合に最も好ましく、担体との体積/質量比は、10~20:1である場合に最も好ましく、金属イオンの濃度は、10~100mmol/Lである場合に、活性はいずれも良好であり、コストを考慮して、10~50mmol/Lの濃度としてもよく、架橋剤DAは、0.5%~2%である場合に最も好ましい。具体的なパラメータ及び結果を表22に示す。
実施例3の方法によって、FDHを担体HFAに固定化し、酢酸濃度、酢酸溶液と担体との体積/質量比、過ヨウ素酸ナトリウムの濃度、過ヨウ素酸ナトリウム溶液と担体との体積/質量比、並びに架橋剤GAの濃度をさまざまに設定した。その結果、酢酸濃度は1~2mol/Lが最も好ましく、酢酸溶液と担体との体積/質量比は10~15:1が最も好ましく、過ヨウ素酸ナトリウム濃度は、0.1~0.2mol/Lが最も好ましく、過ヨウ素酸ナトリウムと担体との体積質量比は、5~25では、最も効果に優れており、コストダウンを考慮して、5~15:1が好ましく、架橋剤濃度は、0.5%~2%では、好ましい。具体的なパラメータ及び結果を表23に示す。
実施例2(IDA4)及び実施例5(SP3)の方法によって、FDHを担体ECR8285に固定化し、分子量の様々なPEIを選択し、PEI濃度をさまざまに設定し、PEIの適切な使用量を調べ、さまざまなpH値による固定化酵素への影響を調べた。その結果、PEI分子量が3KDa~70KDaである場合、類似した効果が認められ、PEIの最適な濃度の範囲は1%~2%であり、pH6.0~10.0では、固定化酵素の活性への影響が少なく、pH7~9では、安定性は最も良好である。具体的なパラメータ及び結果を表24に示す。
実施例7(SP4)及び実施例9(IDA4)の方法によって、FDHを担体ECR8285に固定化し、PEGでグルタルアルデヒドを修飾する方法におけるPEGの範囲、及びPEGとGAの比を調べた。その結果、PEG200、PEG2000、PEG6000はいずれもグルタルアルデヒドを修飾することができ、PEGとGAとの比が1:1~10:1の範囲である場合、酵素の繰り返し使用性は良好であり、2:1~4:1では、最も好ましい。具体的なパラメータ及び結果を表25に示す。
Claims (13)
- 変性エポキシ樹脂固定化酵素の製造方法であって、
エポキシ樹脂を変性し、変性エポキシ樹脂にポリエチレンイミンを加えて更なる修飾を行い、次に、固定化対象酵素とグルタルアルデヒドを加えて固定化し、前記変性エポキシ樹脂固定化酵素を得るステップを含み、
前記エポキシ樹脂を変性することは、過ヨウ素酸ナトリウムを用いてエポキシ樹脂を酸化すること、又はイミノ二酢酸を用いてエポキシ樹脂と反応させることを含み、
前記エポキシ樹脂を変性することが、過ヨウ素酸ナトリウムを用いてエポキシ樹脂を酸化することである場合に、過ヨウ素酸ナトリウムを加えるに先立って、先ず酢酸で前記エポキシ樹脂を処理し、そして、固定化対象酵素とグルタルアルデヒドを加えて固定化した後に、架橋剤としてグルタルアルデヒド又はデキストランアルデヒドを添加して二次架橋を行うステップをさらに含む、ことを特徴とする変性エポキシ樹脂固定化酵素の製造方法。 - 前記エポキシ樹脂を変性することが、イミノ二酢酸をエポキシ樹脂と反応させることである場合に、変性エポキシ樹脂にポリエチレンイミンを加えて更なる修飾を行った後に、金属イオン溶液を加えて処理するステップをさらに含み、かつ、前記固定化対象酵素はhisタグを有する、ことを特徴とする請求項1に記載の製造方法。
- 前記金属イオン溶液は塩化コバルト、硫酸コバルト、塩化ニッケル、硫酸銅、塩化第一鉄、硫酸第一鉄から選択される1種又は複数種である、ことを特徴とする請求項2に記載の製造方法。
- 前記金属イオン溶液の濃度は5mmol/L~100mmol/Lである、ことを特徴とする請求項2に記載の製造方法。
- 前記固定化対象酵素及びグルタルアルデヒドの添加順番は、前記固定化対象酵素、グルタルアルデヒド、又はグルタルアルデヒド、前記固定化対象酵素の順である、ことを特徴とする請求項1に記載の製造方法。
- 変性エポキシ樹脂にポリエチレンイミンを加えて更なる修飾を行うステップは、NAD+ である補因子を添加することをさらに含み、
前記ポリエチレンイミンはポリエチレンイミン水溶液の形態で反応に参加し、前記ポリエチレンイミン水溶液中の前記補因子の最終濃度が1mg/mL~10mg/mLで
ある、ことを特徴とする請求項2に記載の製造方法。 - 前記架橋剤であるグルタルアルデヒド又はデキストランアルデヒドは、使用する前にPEGで架橋剤を修飾するステップを受け、前記架橋剤であるグルタルアルデヒド又はデキストランアルデヒドを前記PEGで修飾するステップは、架橋剤を水で溶解し、次にPEGを加えて20℃~30℃で1h~6h撹拌することを含み、PEGは、PEG400~PEG2000から選択され、PEGと架橋剤との質量比が1:1~10:1である、ことを特徴とする請求項2に記載の製造方法。
- 前記酢酸によるエポキシ樹脂処理において、使用される酢酸は、酢酸濃度が0.5M~3Mの酢酸溶液であり、前記酢酸溶液と前記エポキシ樹脂との体積質量比は5~20:1である、ことを特徴とする請求項6に記載の製造方法。
- 前記過ヨウ素酸ナトリウムを用いてエポキシ樹脂を酸化する際に使用される過ヨウ素酸ナトリウム溶液において、過ヨウ素酸ナトリウムの濃度は50mM~500mMであり、前記過ヨウ素酸ナトリウム溶液とエポキシ樹脂との体積質量比は5~20:1である、ことを特徴とする請求項6に記載の製造方法。
- 前記ポリエチレンイミンの分子量は3KDa~70KDaであり、前記ポリエチレンイミン水溶液の濃度は0.5%~3%である、ことを特徴とする請求項6に記載の製造方法。
- 架橋剤であるグルタルアルデヒド又はデキストランアルデヒドの体積/質量最終濃度は0.1%~3%である、ことを特徴とする請求項6に記載の製造方法。
- 前記イミノ二酢酸を用いてエポキシ樹脂と反応させる際に、イミノ二酢酸としては濃度0.5M~3Mのイミノ二酢酸水溶液が使用され、前記イミノ二酢酸水溶液とエポキシ樹脂との体積質量比は5~20:1である、ことを特徴とする請求項6に記載の製造方法。
- 前記固定化対象酵素は、Chromobacteriumviolaceum DSM30191由来のトランスアミナーゼ、Aspergillusfumigatus由来のトランスアミナーゼ、Vibrio fluvialis strain JS17由来のトランスアミナーゼ、Arthrobactercitreus由来のトランスアミナーゼ、Acetobactersp. CCTCC M209061由来のケトレダクターゼ、Candidamacedoniensis AKU4588由来のケトレダクターゼ、Rhodococcussp. Phil由来のシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ、Brachymonas petroleovorans由来のシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ、Rhodococcusruber-SD1由来のシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ、photorhabdusluminescens由来のアンモニアリアーゼ、Solenostemonscutellarioides由来のアンモニアリアーゼ、Saccharomycescerevisiae由来のエンレダクターゼ、ChrySEQbacteriumsp. CA49由来のエンレダクターゼ、Streptomyces sp又はBacillus cereus由来のイミンレダクターゼ、Bacillus cereus由来のロイシンデヒドロゲナーゼ、Bacillussphaericus由来のフェニルアラニンデヒドロゲナーゼ、Aspergillusniger CBS 513.88由来のニトリラーゼ、及びNeurosporacrassa OR74A由来のニトリラーゼからなる群から選択される1種又は複数種であり、
前記Chromobacterium violaceum DSM30191由来のトランスアミナーゼはSEQ ID NO:2配列又はSEQ IDNO:3を有する突然変異体であり、前記Arthrobactercitreus由来のトランスアミナーゼはSEQ ID NO:5配列又はSEQ IDNO:6配列を有する突然変異体であり、前記Acetobactersp. CCTCC M209061由来のケトレダクターゼはSEQIDNO:8配列又はSEQIDNO:9配列を有する突然変異体であり、前記Rhodococcussp. Phil由来のシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼはSEQ ID NO:11配列又はSEQ IDNO:12配列を有する突然変異体であり、前記Rhodococcusruber-SD1由来のシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼはSEQID NO:14配列又はSEQ IDNO:15配列を有する突然変異体である、ことを特徴とする請求項1に記載の製造方法。
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