CN101974510B - 一种对辅酶和辅酶依赖性酶进行偶联固定的方法 - Google Patents
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Abstract
一种对辅酶和辅酶依赖性酶进行偶联固定的方法，涉及酶。提供一种对辅酶和辅酶依赖性酶进行偶联固定的方法，包括以下步骤：将辅酶加入缓冲液中得溶液A，将辅酶辅酶依赖性酶加入缓冲液中得溶液B；将携带活性基团的载体加入到所述溶液A中，得溶液C；将所述溶液C离心，收集载体并将所得载体加入所述溶液B中，混匀得溶液D；将溶液D进行孵育，离心或过滤、洗涤、冷冻干燥即得固定化酶。此固定方法可最大限度的保护酶的活性位点，提高辅酶与酶的结合率，减小传质位阻。有效避免传统固定方法中出现的辅酶丢失、随机固定、活性位点堵塞、回收率低和稳定性差等问题。
Description
技术领域
本发明涉及酶，尤其是涉及一种对辅酶和辅酶依赖性酶进行偶联固定的方法。
背景技术
酶作为高效专一的生物催化剂被广泛应用于化工、食品、医药等领域。但由于酶在强酸强碱、加热及有机溶剂中易于失活，并且其分离和重复利用也难于实施，因此回收和稳定性是影响其工业化中连续化和自动化应用的重要因素。合适的酶的固定化方法可以有效地解决这些问题。
辅酶作为第二底物可以被许多酶利用，仅利用烟酰胺辅酶的酶就有700多种。约有51.2％氧化还原酶催化底物氧化还原需要价格昂贵的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)作为反应过程中氢或电子的传递体。目前，如何循环使用辅酶成为限制氧化还原酶大规模工业化应用的“瓶颈”。因此，将辅酶及其氧化还原酶固定化能够极大地提高其回收率，是一种高效节约的方法。
传统的酶的固定化方法主要有物理吸附法、包埋法、交联法和共价结合法。前两种方法易于泄漏，后两种方法易于堵塞酶活中心。为了使氧化还原酶能够与载体牢固结合、同时保持酶活，常用方法是对载体进行表面修饰引入羧基、羟基、氨基、巯基、酰基或环氧基等，进而加入戊二醛、己二胺、异氰酸衍生物、双偶氮联苯或碳二亚胺等双功能试剂或者交联剂与酶进行直接联接，但其反应不同程度的影响到酶的活性。这些传统的酶的固定化方法普遍存在以下局限性：
1)酶的活性中心可能因为附近的位点被固定从而造成一定程度的位阻；
2)辅酶与相应的酶可能都被刚性固定化，从而无法结合；
3)辅酶和相应的酶与载体的亲和力有时会有很大差异从而导致两者比例失调；
4)对于多酶偶联固定化系统，酶之间的距离随机性大：距离较大时易于造成底物、产物和辅酶的传质阻力，距离太小时又会阻碍反应位点。
徐俊等(徐俊，楼一心，等.华东化工学院学报.1989；15(4)：430-440)报道了将辅酶和依赖辅酶的醇脱氢酶同时加入含有活性载体的溶液，使酶与辅酶同时共固定到琼脂糖载体上的方法。
Wang等(El-Zahab B，Jia H，Wang P.Enabling multienzyme biocatalysis using nanoporousmaterials.Biotechnol Bioeng 2004；87：178-183)报道了建立在辅酶穿梭理论上的随机共固定法，该法也是先固定辅酶再固定相应的依赖性酶，但是依赖性酶不是固定在辅酶上，而是和辅酶一样直接固定在活性载体上。
发明内容
本发明的目的在于提供一种对辅酶和辅酶依赖性酶进行偶联固定的方法。
所述方法包括以下步骤：
1)将辅酶加入缓冲液中得溶液A，将辅酶辅酶依赖性酶加入缓冲液中得溶液B；将携带活性基团的载体加入到所述溶液A中，得溶液C；将所述溶液C离心，收集载体并将所得载体加入所述溶液B中，混合后得溶液D；
2)将溶液D进行孵育，离心或过滤后，洗涤，冷冻干燥即得固定化酶。
在步骤1)中，所述辅酶可为辅酶I、辅酶II、核黄素、硫胺素、维生素B6、维生素B12、生物素、四氢叶酸、泛酸、辅酶A、辅酶Q、硫辛酸、S-腺苷蛋氨酸、谷胱甘肽等中的至少一种。
所述辅酶依赖性酶可为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、乙醇脱氢酶、乳酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶、甘油脱氢酶、二氢硫辛酰胺脱氢酶、胆碱脱氢酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、胍乙酸转甲基酶、组蛋白转甲基酶、胆碱乙酰化酶、磷酸转乙酰化酶、硫辛酸乙酰转移酶、乙酰CoA羧化酶、丙酮酸羧化酶、苯丙氨酸羧化酶、1，3-丙二醇氧化还原酶、赖氨酸脱羧酶、丙酮酸氧化酶、转酮醇酶、NADH-Q还原酶、甲基丙二酰辅酶A变位酶乙二醛酶、顺丁烯二酸单酰乙酰乙酸异构酶等中的至少一种。
所述缓冲液可为三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液、磷酸缓冲液、硼酸缓冲液、碳酸缓冲液、醋酸缓冲液、2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液、焦磷酸钠缓冲液等中的一种。
所述活性基团可为羟基、氨基、羧基、环氧基、巯基或醛基等中的至少一种。
所述载体可为壳聚糖、葡聚糖、琼脂糖、硅胶、明胶、藻酸盐、多孔玻璃、聚乙烯亚胺PEI、聚乙二醇PEG、聚丙烯胺PAA、聚苯乙烯、环氧树脂、尼龙、碳纳米管、淀粉、白蛋白、纤维素、有机染料、多溶素、石墨烯、Fe2O3、Fe3O4、MnFe2O4、ZnFe2O4、CoFe2O4、Ni微粒等中的至少一种。
所述溶液A的摩尔浓度可为0.001mmol/L～10mol/L；所述载体与所述溶液A的比例可为1g∶(0.001～1L)，其中载体以质量计算，溶液A以体积计算。
所述溶液B中辅酶依赖性酶与缓冲液的比例可为(0.01mg～0.5g)∶(0.1～100mL)，其中辅酶依赖性酶以质量计算，缓冲液以体积计算。
所述溶液A中可加入偶联剂，所述偶联剂可为己二胺、异氰酸衍生物、双偶氮联苯、二缩水石油醚、戊二醛、碳二亚胺等中的一种；所述载体与所述偶联剂的比例可为1g∶(0.01～10mL)，其中载体以质量计算，偶联剂以体积计算。
在步骤2)中，所述孵育的条件可为：温度4～65℃，时间15min～64h。
本发明所述一种对辅酶和辅酶依赖性酶进行偶联固定的方法是通过首先固定化辅酶，再利用辅酶和相应辅酶依赖性酶的特异性结合，实现辅酶和辅酶依赖性酶的偶联固定。此法可最大限度地保护酶的活性位点，提高辅酶与酶的结合率，减小传质位阻。可有效避免传统固定方法中出现的辅酶丢失、随机固定、活性位点堵塞、回收率低和稳定性差等问题。通过控制载体、辅酶和酶的合适比例，可获得稳定性好、催化性能可控的多酶耦联固定化体系。
在已有的将辅酶和相应依赖性酶的共固定方法中，未见有通过固定辅酶与相应依赖性酶的特异性结合实现共固定化的报道。相近的固定方法有徐俊等报道的将辅酶和依赖辅酶的醇脱氢酶同时加入含有活性载体的溶液，使酶与辅酶同时共固定到琼脂糖载体上的方法(参见文献：徐俊，楼一心，等.华东化工学院学报.1989；15(4)：430-440)。该法与本发明在固定化操作顺序上有本质不同：该方法用的是随机共固定方法，酶及其所依赖的辅酶结合几率较低，以致催化效果欠佳；本发明根据定向固定的原理，利用酶及其所依赖的辅酶的亲和作用力使二者有效地结合，并使氢离子能够自由地就近迁移，易于辅酶再生。另一篇相近的报道(El-Zahab B，Jia H，Wang P.Enabling multienzyme biocatalysis using nanoporous materials.Biotechnol Bioeng 2004；87：178-83)建立在辅酶穿梭理论上的随机共固定法，该法也是先固定辅酶再固定相应的依赖性酶，但是依赖性酶不是固定在辅酶上，而是和辅酶一样直接固定在活性载体上，与本发明不同。
本发明所述一种对辅酶和辅酶依赖性酶进行偶联固定的方法有望广泛应用于利用依赖辅酶的氧化还原酶生物催化制备生物化学品、手性药物，以及环境修饰、食品医疗和理化性能检测等领域。
附图说明
图1为实施例1中通过磷分析得到的不同辅酶浓度下的偶联率。在图1中，横坐标为辅酶初始浓度(mmol/L)，纵坐标为偶联率。
图2为实施例1所得固定化乳酸脱氢酶与等量游离乳酸脱氢酶催化反应后底物的液相色谱图。在图2中，A为固定化酶，B为游离酶，横坐标为时间(min)。
图3为未偶联辅酶的载体扫描电镜图。在图3中，标尺为200μm。
图4为偶联辅酶后的载体扫描电镜图。在图4中，标尺为200μm。
图5为偶联辅酶和固定乳酸脱氢酶后的载体扫描电镜图。在图5中，标尺为200μm。
图6为实施例2和实施例4中游离辅酶和固定化辅酶的紫外可见吸收光谱图。在图6中，横坐标为波长(nm)，纵坐标为吸光度；曲线1为固定化NAD+(λmax245nm)，曲线2为固定化NADP+(λmax265nm)，曲线3为游离NAD+(λmax260nm)，曲线4为游离NADP+(λmax260nm)。
具体实施方式
在实施本申请技术方案时，根据催化体系的组成，合理组合载体、辅酶、酶的配比，选择合适的缓冲系统。传统理论认为在使用酶法再生法实现辅酶再生时，当还原性辅酶与还原性辅酶依赖性酶共同催化底物反应后转化为氧化性辅酶，为了实现还原性辅酶再生，氧化性辅酶将与还原性辅酶依赖性酶分离，然后与氧化性辅酶依赖性酶结合，催化另一种底物的反应后重新转化为还原性辅酶，还原性辅酶再次与还原性辅酶依赖性酶结合，如此循环，从而实现辅酶在不同酶之间的穿梭和再生。本申请提出一种经实验验证的依赖辅酶的氧化还原酶催化机理：辅酶与酶结合后不再分离，溶液中的氢离子在还原态和氧化态辅酶之间传递，从而实现辅酶的再生。基于这一理论，反应后，酶依然结合在辅酶上不会脱离。本申请技术方案中，辅酶首先固定，再利用辅酶与相应酶的特异结合来实现共固定，因此不用担心反应结束后酶的丢失问题；此外，酶与其所依赖的辅酶保持结合状态可以减少辅酶的传质阻力，相对于酶与其辅酶各自固定更利于催化反应进行。
现通过具体实施例说明本申请的技术方案，但该申请的应用不仅限于以下实施例。
实施例1
1)各称取1g壳聚糖载体，溶于含有100mL 1％(w/w)醋酸溶液的烧杯中，在搅拌下滴加5mL偶联剂戊二醛，调pH值为7，超声15min，使之充分分散；
2)往分散液中加入1mmol还原性辅酶I(NAD+)，混合均匀；
3)将步骤2)所得溶液离心，过滤，洗涤或膜分离除去未偶联的辅酶，保留亲和载体，根据壳聚糖不含元素磷而辅酶含有，取部分亲和载体进行消化反应测磷含量并计算偶联率，取部分亲和载体研碎，用分光光度计进行紫外可见光谱扫描，其余转移到烧杯中。
4)将100mg乳酸脱氢酶溶于1mL磷酸盐缓冲液，慢速滴加到烧杯中，过程伴随搅拌。
5)步骤4)所得溶液在4℃下偶联反应24h后，将其过滤、洗涤、冷冻真空干燥得固定化酶；同时，将过滤后的滤液和洗涤后的洗液收集、合并，用Bradford法测定剩余蛋白量为22mg，即酶的残留量为22mg，计算得出酶的固定率为78％。
6)测固定化酶酶活力：将步骤5)所得的固定化酶分散于9mL含有0.25mmol/L丙酮酸盐pH为7.0的0.05mol/L磷酸盐缓冲液启动反应，室温下200rpm震荡，周期性取样对丙酮酸盐浓度进行液相色谱(HPLC)分析。
液相条件为：柱子为有机酸离子交换柱Aminex Hpx-87H Exclusion column，7.8mm×300mm；流动相选择pH为2.1的4.5mmoL/L稀硫酸溶液；流速为0.8mL/min；使用紫外可见检测器在215nm检测。使用与固定化酶等量的游离酶测乳酸脱氢酶的酶活，测法与固定化酶酶活测法相同。
7)未偶联辅酶的载体、偶联辅酶后和固定乳酸脱氢酶后的载体取样进行环境扫描，得表面形貌的扫描电镜图。
结果表明：辅酶(NAD+)浓度在0.5～4mmoL/L时通过磷分析算出的辅酶偶联率在38％～90％之间，表明辅酶被成功固定在载体上，且辅酶浓度会影响偶联率(参见图1)。底物丙酮酸的保留时间在15.172min左右，图2中B的丙酮酸检测峰面积约为A的丙酮酸检测峰面积的74％，表明固定化酶的酶活保留率达到74％(参见图2)；未偶联辅酶的载体、偶联辅酶后和固定乳酸脱氢酶后的载体取样进行环境扫描，得表面形貌的扫描电镜图，表明辅酶和乳酸脱氢酶先后被固定在载体上(参见图3～5)。
实施例2
1)各称取1g琼脂糖载体，溶于含有100mL去离子水的烧杯中，在搅拌下滴加5mL偶联剂二缩水石油醚，调pH值为6，超声15min，使之充分分散。
2)往分散液中加入10mmol氧化型辅酶I，混合均匀。
3)将步骤2)所得溶液离心，过滤，洗涤或膜分离除去未偶联的辅酶，保留亲和载体，取部分进行消化反应测磷含量，其余转移到烧杯中。
4)将L-谷氨酸脱氢酶和乳酸脱氢酶各50mg溶于1mL PBS缓冲液，慢速滴加到烧杯中，过程伴随搅拌。
5)步骤(4)所得溶液在4℃下偶联反应24h后，将其过滤、洗涤、冷冻真空干燥得固定化酶；同时，将过滤后的滤液和洗涤后的洗液收集、合并，用Bradford法测定剩余蛋白量为23mg，即酶的残留量为23mg，计算得出酶的固定率为77％。
6)测固定化多元酶酶活：将步骤4)所得的固定化酶分散于9mL含有100mmol/L L-乳酸，10mmol/Lα-酮戊二酸盐pH为7.0的0.05mol/L磷酸铵-磷酸氢二铵盐缓冲液启动反应，室温下200rpm震荡，周期性取样对丙酮酸盐浓度进行HPLC分析。
液相条件为：柱子Waters C-18，4.6×250mm；流动相选择50/50(v/v)的乙腈和水溶液；流速为1mL.min-1；用硫酸保持流动相pH为2.1；使用紫外可见检测器在215nm检测。
实施例3
1)各称取1g壳聚糖载体，溶于含有10mL1％(w/w)醋酸溶液的烧杯中，在搅拌下滴加5mL偶联剂戊二醛，调pH值为8，超声15min，使之充分分散。
2)往分散液中加入100mmol还原性辅酶I，混合均匀。
3)将步骤2)所得溶液离心，过滤，洗涤或膜分离除去未偶联的辅酶，保留亲和载体，根据壳聚糖不含元素磷而辅酶含有，取部分亲和载体进行消化反应测磷含量并计算偶联率，其余转移到烧杯中。
4)将lmL含有100mg乳酸脱氢酶和0.25mmol/L丙酮酸盐的磷酸盐缓冲液慢速滴加到烧杯中，过程伴随搅拌。
5)考察在含有底物丙酮酸盐的情况下乳酸脱氢酶和辅酶的偶联效果：步骤4)所得溶液在4℃下偶联反应24h后，将其过滤、洗涤、冷冻真空干燥得固定化酶；同时，将过滤后的滤液和洗涤后的洗液收集、合并，用Bradford法测定剩余蛋白量为13mg，即酶的残留量为13mg，计算得出酶的固定率为87％。
实施例4
1)各称取1g琼脂糖载体，溶于含有100mL去离子水的烧杯中，在搅拌下滴加5mL偶联剂二缩水石油醚，调pH值为6，超声15min，使之充分分散。
2)往分散液中加入0.001mmol氧化型辅酶II(NADP+)，混合均匀。
3)将步骤2)所得溶液离心，过滤，洗涤或膜分离除去未偶联的辅酶，保留亲和载体，取部分进行消化反应测磷含量，取部分亲和载体研碎，用分光光度计进行紫外可见光谱扫描，其余转移到烧杯中。
4)将100mg L-谷氨酸脱氢酶溶于1mL PBS缓冲液，慢速滴加到烧杯中，过程伴随搅拌。
5)步骤4)所得溶液在4℃下偶联反应24h后，将其过滤、洗涤、冷冻真空干燥得固定化酶；同时，将过滤后的滤液和洗涤后的洗液收集、合并，用Bradford法测定剩余蛋白量为25mg，即酶的残留量为25mg，计算得出酶的固定率为75％。
6)测固定化酶酶活：将步骤4)所得的固定化酶分散于9mL含有10mmol/Lα-酮戊二酸盐pH为7.0的0.05mol/L磷酸铵-磷酸氢二铵盐缓冲液启动反应，室温下200rpm震荡，周期性取样对谷氨酸盐浓度进行HPLC分析。液相条件为：柱子Waters C-18，4.6×250mm；流动相选择50/50(v/v)的乙腈和水溶液；流速为1mL.min-1；用硫酸保持流动相pH为2.1；使用紫外可见检测器在254nm检测。
分析结果：固定化后的辅酶I和辅酶II的最大吸收峰分别从260nm变成245nm和265nm，表明辅酶被成功固定在载体上(参见图6)。
实施例5
1)各称取1g葡聚糖载体，溶于含有100mL1％(w/w)醋酸溶液的烧杯中，在搅拌下滴加lmL偶联剂溴化氰，调pH值为6，超声30min，使之充分分散。
2)往分散液中加入100mmol的黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)，混合均匀。
3)将步骤2)所得溶液离心，过滤，洗涤或膜分离除去未偶联的辅酶，保留亲和载体，取部分进行消化反应测磷含量，其余转移到烧杯中。
4)将25mg琥珀酸脱氢酶溶于10mL碳酸盐缓冲液，慢速滴加到烧杯中，过程伴随搅拌。
5)步骤4)所得溶液在35℃下偶联反应32h后，将其过滤、洗涤、冷冻真空干燥得固定化酶；同时，将过滤后的滤液和洗涤后的洗液收集、合并，用Bradford法测定剩余蛋白量为5mg，即酶的残留量为5mg，计算得出酶的固定率为80％。
实施例6
1)各称取1g聚苯乙烯载体，溶于含有100mL去离子水的烧杯中，在搅拌下滴加10mL偶联剂异氰酸，调pH值为5，超声15min，使之充分分散。
2)往分散液中加入10mol焦磷酸硫胺素(TPP)，混合均匀。
3)将步骤2)所得溶液离心，过滤，洗涤或膜分离除去未偶联的辅酶，保留亲和载体，取部分进行消化反应测磷含量，其余转移到烧杯中。
4)将500mg赖氨酸脱羧酶溶于100mL Tris-盐酸缓冲液，慢速滴加到烧杯中，过程伴随搅拌。
5)步骤4)所得溶液在4℃下偶联反应48h后，将其过滤、洗涤、冷冻真空干燥得固定化酶；同时，将过滤后的滤液和洗涤后的洗液收集、合并，用Bradford法测定剩余蛋白量为295mg，即酶的残留量为295mg，计算得出酶的固定率为41％。
实施例7
1)各称取1g环氧树脂载体，溶于含有1mL去离子水的烧杯中，调pH值为7，超声45min，使之充分分散。
2)往分散液中加入0.1mmol维生素B6，混合均匀。
3)将步骤2)所得溶液离心，过滤，洗涤或膜分离除去未偶联的辅酶，保留亲和载体，转移到烧杯中。
4)将400mg谷丙转氨酶溶于80mL硼酸-硼砂缓冲液，慢速滴加到烧杯中，过程伴随搅拌。
5)步骤4)所得溶液在25℃下偶联反应56h后，将其过滤、洗涤、冷冻真空干燥得固定化酶；同时，将过滤后的滤液和洗涤后的洗液收集、合并，用Bradford法测定剩余蛋白量为244mg，即酶的残留量为244mg，计算得出酶的固定率为39％。
实施例8
1)各称取1g碳纳米管，溶于含有50mL去离子水的烧杯中，在搅拌下滴加0.01mL活化剂碳二亚胺，调pH值为8，超声60min，使之充分分散。
2)往分散液中加入0.01mmol维生素B12，混合均匀。
3)将步骤2)所得溶液离心，过滤，洗涤或膜分离除去未偶联的辅酶，保留亲和载体，转移到烧杯中。
4)将0.01mg甲基丙二酰辅酶A变位酶溶于0.1mL磷酸盐缓冲液，慢速滴加到烧杯中，过程伴随搅拌。
5)步骤4)所得溶液在20℃下偶联反应24h后，将其过滤、洗涤、冷冻真空干燥得固定化酶；同时，将过滤后的滤液和洗涤后的洗液收集、合并，用Bradford法测定剩余蛋白量为0.0005mg，即酶的残留量为0.0005mg，计算得出酶的固定率为95％。
实施例9
1)各称取1g Fe3O4纳米载体，溶于含有10mL去离子水的烧杯中，在搅拌下滴加3mL偶联剂戊二醛，调pH值为10，搅拌使之充分分散。
2)往分散液中加入25mg辅酶A，混合均匀。
3)将步骤2)所得溶液离心，过滤，洗涤或膜分离除去未偶联的辅酶，保留亲和载体，转移到烧杯中。
4)将100mg胆碱乙酰化酶溶于15mL PBS缓冲液，慢速滴加到烧杯中，过程伴随搅拌。
5)步骤4)所得溶液在35℃下偶联反应16h后，将其过滤、洗涤、冷冻真空干燥得固定化酶；同时，将过滤后的滤液和洗涤后的洗液收集、合并，用Bradford法测定剩余蛋白量为27mg，即酶的残留量为27mg，计算得出酶的固定率为73％。
实施例10
1)各称取1g多孔玻璃载体，溶于含有100mL去离子水的烧杯中，在搅拌下滴加0.1mL偶联剂戊二醛，调pH值为8，超声15min，使之充分分散。
2)往分散液中加入10mg辅酶Q，混合均匀。
3)将步骤2)所得溶液离心，过滤，洗涤或膜分离除去未偶联的辅酶，保留亲和载体，转移到烧杯中。
4)将10mg NADH-Q还原酶溶于1mL PBS缓冲液，慢速滴加到烧杯中，过程伴随搅拌。
5)步骤4)所得溶液在55℃下偶联反应8h后，将其过滤、洗涤、冷冻真空干燥得固定化酶；同时，将过滤后的滤液和洗涤后的洗液收集、合并，用Bradford法测定剩余蛋白量为4mg，即酶的残留量为4mg，计算得出酶的固定率为60％。
实施例11
1)各称取1g聚乙二醇(PEG)载体，溶于含有100mL去离子水的烧杯中，在搅拌下滴加7mL活化剂表氯醇，调pH值为7，超声15min，使之充分分散。
2)往分散液中加入1mol四氢叶酸，混合均匀。
3)将步骤2)所得溶液离心，过滤，洗涤或膜分离除去未偶联的辅酶，保留亲和载体，转移到烧杯中。
4)将300mg丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)溶于30mL磷酸盐缓冲液，慢速滴加到烧杯中，过程伴随搅拌。
5)步骤4)所得溶液在4℃下偶联反应24h后，将其过滤、洗涤、冷冻真空干燥得固定化酶；同时，将过滤后的滤液和洗涤后的洗液收集、合并，用Bradford法测定剩余蛋白量为171mg，即酶的残留量为171mg，计算得出酶的固定率为43％。
实施例12
1)各称取1g聚乙烯亚胺(PEI)载体，溶于含有1L去离子水的烧杯中，在搅拌下滴加5mL偶联剂双偶氮联苯，调pH值为7，超声15min，使之充分分散。
2)往分散液中加入10mol泛酸，混合均匀。
3)将步骤2)所得溶液离心，过滤，洗涤或膜分离除去未偶联的辅酶，保留亲和载体，转移到烧杯中。
4)将500mg胆碱乙酰化酶溶于50mL磷酸盐缓冲液，慢速滴加到烧杯中，过程伴随搅拌。
5)步骤4)所得溶液在50℃下偶联反应64h后，将其过滤、洗涤、冷冻真空干燥得固定化酶；同时，将过滤后的滤液和洗涤后的洗液收集、合并，用Bradford法测定剩余蛋白量为320mg，即酶的残留量为320mg，计算得出酶的固定率为36％。
实施例13
1)各称取1g硅胶载体，溶于含有500mL去离子水的烧杯中，在搅拌下滴加9mL偶联剂己二胺，调pH值为7，超声15min，使之充分分散。
2)往分散液中加入5mol硫辛酸，混合均匀。
3)将步骤2)所得溶液离心，过滤，洗涤或膜分离除去未偶联的辅酶，保留亲和载体，转移到烧杯中。
4)将10mg丙酮酸脱氢酶溶于0.1mL磷酸盐缓冲液，慢速滴加到烧杯中，过程伴随搅拌。
5)步骤4)所得溶液在35℃下偶联反应24h后，将其过滤、洗涤、冷冻真空干燥得固定化酶；同时，将过滤后的滤液和洗涤后的洗液收集、合并，用Bradford法测定剩余蛋白量为2mg，即酶的残留量为2mg，计算得出酶的固定率为80％。
实施例14
1)各称取1g明胶载体，溶于含有100mL去离子水的烧杯中，在搅拌下滴加5mL偶联剂戊二醛，调pH值为7，超声15min，使之充分分散。
2)往分散液中加入过量的生物素，混合均匀。
3)将步骤2)所得溶液离心，过滤，洗涤或膜分离除去未偶联的辅酶，保留亲和载体，转移到烧杯中。
4)将50mg乙酰CoA羧化酶溶于15mL磷酸盐缓冲液，慢速滴加到烧杯中，过程伴随搅拌。
5)步骤4)所得溶液在25℃下偶联反应24h后，将其过滤、洗涤、冷冻真空干燥得固定化酶；同时，将过滤后的滤液和洗涤后的洗液收集、合并，用Bradford法测定剩余蛋白量为9mg，即酶的残留量为9mg，计算得出酶的固定率为82％。
实施例15
1)各称取1g藻酸盐载体，溶于含有100mL去离子水的烧杯中，在搅拌下滴加1mL偶联剂戊二醛，调pH值为7，超声15min，使之充分分散。
2)往分散液中加入100mmol谷胱甘肽，混合均匀。
3)将步骤2)所得溶液离心，过滤，洗涤或膜分离除去未偶联的辅酶，保留亲和载体，转移到烧杯中。
4)将0.1mg乙二醛酶溶于1mL磷酸盐缓冲液，慢速滴加到烧杯中，过程伴随搅拌。
5)步骤4)所得溶液在65℃下偶联反应15min后，将其过滤、洗涤、冷冻真空干燥得固定化酶；同时，将过滤后的滤液和洗涤后的洗液收集、合并，用Bradford法测定剩余蛋白量为0.007mg，即酶的残留量为0.007mg，计算得出酶的固定率为93％。
实施例16
1)各称取1g聚丙烯胺载体，溶于含有100mL去离子水的烧杯中，在搅拌下滴加0.1mL偶联剂戊二醛，调pH值为7，超声15min，使之充分分散。
2)往分散液中加入10mmol S-腺苷蛋氨酸(SAM)，混合均匀。
3)将步骤2)所得溶液离心，过滤，洗涤或膜分离除去未偶联的辅酶，保留亲和载体，转移到烧杯中。
4)将200mg胍乙酸转甲基酶溶于40mL焦磷酸钠缓冲液，慢速滴加到烧杯中，过程伴随搅拌。
5)步骤4)所得溶液在25℃下偶联反应24h后，将其过滤、洗涤、冷冻真空干燥得固定化酶；同时，将过滤后的滤液和洗涤后的洗液收集、合并，用Bradford法测定剩余蛋白量为76mg，即酶的残留量为76mg，计算得出酶的固定率为62％。
实施例17
1)各称取1g石墨烯载体，溶于含有100mL去离子水的烧杯中，在搅拌下滴加5mL偶联剂戊二醛，调pH值为7，超声15min，使之充分分散。
2)往分散液中加入10mmol S-腺苷蛋氨酸(SAM)，混合均匀。
3)将步骤2)所得溶液离心，过滤，洗涤或膜分离除去未偶联的辅酶，保留亲和载体，转移到烧杯中。
4)将200mg胍乙酸转甲基酶溶于40mL 2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液，慢速滴加到烧杯中，过程伴随搅拌。
5)步骤4)所得溶液在25℃下偶联反应24h后，将其过滤、洗涤、冷冻真空干燥得固定化酶；同时，将过滤后的滤液和洗涤后的洗液收集、合并，用Bradford法测定剩余蛋白量为24mg，即酶的残留量为24mg，计算得出酶的固定率为88％。
以上实施例详述了本发明的各个特征的各种替代方案，可以理解为这些特征各自可以以任何可能的组合方式组合，因此，每个特征的各种替代方式可以与一些或所有其他特征的任何或所有替代方式组合。
以上实施例只是用于进一步说明本发明，而不是用来限制本发明的保护范围。凡是在本发明保护范围内所做出的具体实施方式及应用范围上的些许变动，也属于本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种对辅酶和辅酶依赖性酶进行偶联固定的方法，其特征在于包括以下步骤：
1）将辅酶加入缓冲液中得溶液A，将辅酶依赖性酶加入缓冲液中得溶液B；将携带活性基团的载体加入到所述溶液A中，得溶液C；将所述溶液C离心，收集载体并将所得载体加入所述溶液B中，混匀得溶液D；所述辅酶为辅酶Ⅰ、辅酶Ⅱ、核黄素、硫胺素、维生素B6、维生素B12、生物素、四氢叶酸、泛酸、辅酶A、辅酶Q、硫辛酸、S-腺苷蛋氨酸、谷胱甘肽中的一种；
所述辅酶依赖性酶为乳酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、谷丙转氨酶、胍乙酸转甲基酶、胆碱乙酰化酶、乙酰CoA羧化酶、赖氨酸脱羧酶、NADH-Q还原酶、甲基丙二酰辅酶A变位酶、乙二醛酶中的一种；
所述缓冲液为磷酸缓冲液、硼酸缓冲液、碳酸缓冲液、醋酸缓冲液、2-（N-吗啉代）乙磺酸缓冲液、焦磷酸钠缓冲液中的一种；
所述活性基团为羟基、氨基、羧基、环氧基、巯基、醛基中的一种；
所述载体为壳聚糖、葡聚糖、琼脂糖、硅胶、明胶、藻酸盐、多孔玻璃、聚乙烯亚胺PEI、聚乙二醇PEG、聚丙烯胺PAA、聚苯乙烯、环氧树脂、碳纳米管、石墨烯、Fe3O4中的一种；
所述溶液A的摩尔浓度为0.001mmol/L～10mol/L；所述载体与所述溶液A的比例为1g∶（0.001～1）L，其中载体以质量计算，溶液A以体积计算；所述溶液B中辅酶依赖性酶与缓冲液的比例为（0.01mg～0.5g）∶（0.1～100）mL，其中辅酶依赖性酶以质量计算，缓冲液以体积计算；所述溶液A中加入偶联剂，所述偶联剂为己二胺、异氰酸衍生物、双偶氮联苯、二缩水石油醚、戊二醛或碳二亚胺；所述载体与所述偶联剂的比例为1g∶（0.01～10）mL，其中载体以质量计算，偶联剂以体积计算；
2）将溶液D进行孵育，离心或过滤、洗涤、冷冻干燥即得固定化酶；所述孵育的条件为：温度4～65℃，时间15min～64h。
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