CN104132982B - 一种脱氢酶电极及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种脱氢酶电极及其制备方法。该电极包括基底电极、涂敷于所述基底电极上的电子传导层和涂敷于所述电子传导层上的脱氢酶层，所述电子传导层为仿生纳米复合材料；所述脱氢酶层为仿生纳米复合材料/脱氢酶复合物。其制备方法包括：a、将碳纳米材料和生物大分子超声分散的悬浊液滴涂于基底电极上形成电子传导层；b、将脱氢酶加入上述悬浊液超声处理得到固定化脱氢酶体系滴涂于上述电子传导层上形成脱氢酶层。该脱氢酶电极能在低电位下实现辅酶的电化学再生，操作简单、检测灵敏度高、电极稳定性重现性好、酶活损失小。
Description
技术领域
本发明涉及生物传感器领域，尤其涉及一种脱氢酶电极及其制备方法。
背景技术
酶电极自上世纪60年代问世以来，其技术研究和应用获得了巨大的发展，但几乎所有分析元件用酶是氧化酶。脱氢酶也是一类氧化还原酶，与氧化酶的不同之处在于酶催化功能需要依赖容易得失电子的辅酶。由于采用辅酶作为电子和氢的传递体，脱氢酶的催化反应不受体系中氧的影响，这一特点在传感器的实际应用中特别突出。同时，与氧化酶相比，脱氢酶种类繁多，来源广泛，且对底物一般具有更高的选择性，因此，脱氢酶电极具有更广阔的应用前景。
虽然，脱氢酶电极具有广阔的应用前景和市场价值，但是此类电极的研究依然存在很多亟待解决的关键问题。比如，如何在低电位下实现辅酶在电极表面的直接氧化再生；如何将脱氢酶分子固定在载体表面，能持久且高效地保持其活性状态等。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够在低电位下实现辅酶的电化学再生，且操作简单、检测灵敏度高、电极稳定性重现性好、固定化酶活性高的脱氢酶电极及其制备方法。
为了达成上述目的之一，本发明采用如下技术方案：
一种脱氢酶电极，包括基底电极、涂敷于所述基底电极上的电子传导层和涂敷于所述电子传导层上的脱氢酶层，其特征在于，所述电子传导层为仿生纳米复合材料，所述脱氢酶层为仿生纳米复合材料/脱氢酶复合物。
所述仿生纳米复合材料为生物大分子分散的碳纳米材料；所述仿生纳米复合材料/脱氢酶复合物为脱氢酶分散固定于所述仿生纳米复合材料所得的复合物。
所述生物大分子为鱼精蛋白、聚赖氨酸、组蛋白的一种，所述碳纳米材料为碳纳米管、碳纳米纤维、石墨烯、碳纳米片、碳纳米球的一种，所述脱氢酶为乙醇脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、甲醇脱氢酶中的一种。
所述仿生纳米复合材料为鱼精蛋白和碳纳米管复合物；所述仿生纳米复合材料/脱氢酶复合物为碳纳米管/鱼精蛋白/脱氢酶复合物。
为了达成上述目的之二，本发明采用如下技术方案：
一种脱氢酶电极的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
a、取碳纳米材料和生物大分子溶液混合，加入超纯水，超声分散得碳纳米材料和生物大分子复合物的悬浊液，将该悬浊液采用滴涂法涂敷于所述基底电极上，干燥，形成电子传导层；其中，碳纳米材料：生物大分子＝5：(0.1-10)(质量比)；
b、取碳纳米材料和生物大分子溶液混合，加入超纯水，超声分散得悬浊液，将脱氢酶加入上述悬浊液继续超声处理，使脱氢酶松散的包裹在碳纳米材料/生物大分子复合物中得到固定化脱氢酶体系，将该酶体系采用滴涂法涂敷于所述电子传导层上，干燥，形成脱氢酶层；其中，所述碳纳米材料：生物大分子：脱氢酶＝5:(0.1-10)：(0.1-1)(质量比)。
所述超声分散时间为60-65min。
本发明脱氢酶电极能够在低电位下实现辅酶的电化学再生，且操作简单、检测灵敏度高、电极稳定性重现性好、酶活损失小。本发明脱氢酶电极响应速度快，检测浓度范围宽，电极加工简便，基于不同的脱氢酶可以分别实现对发酵液中葡萄糖、乙醇、乳酸、苹果酸、甲醇等物质的选择性电化学传感，为工业生物过程重要生化参数的快速或在线检测提供新的分析技术，为实现过程优化控制、提高生产效率和产品质量奠定基础。
本发明所制备的碳纳米材料/生物大分子复合材料不仅可以高效催化氧化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，而且能够提高修饰电极表面亲水性，降低电极检出限。
本发明将脱氢酶分散包裹在碳纳米材料/生物大分子复合材料中，不仅能够有效降低固定化脱氢酶活性损失，而且能够促进电子传递。
本发明的有益效果：
1.本发明利用生物大分子分散碳纳米材料，尤其采用鱼精蛋白分散碳纳米材料，大大提高电极表面亲水性，还原型辅酶分子(如，NADH)能够更容易在电极表面富集，大大降低电极检出限，提高电极灵敏度。
2.本发明采用生物大分子和碳纳米材料的复合物固定脱氢酶，尤其鱼精蛋白/碳纳米管复合物能够提供类似的生物膜环境，将酶分子所处环境调节至生理状态，不仅大大降低酶活性的损失，而且脱氢酶直接吸附在碳纳米材料表面，能够极大提高电子的传导速率。此外，生物大分子尤其是鱼精蛋白的存在，使得电极表面的亲水性增强，底物分子及辅酶(如，NAD+)能够更容易达到电极表面，进而提高电极灵敏度。
3.本发明电极制作简单，电极响应速度快，检测浓度范围宽，是一种通用型的酶电极的制备方法。
附图说明
图1为本发明电极检测还原型辅酶Ⅰ的原理图；
图2为本发明修饰电极、碳纳米管修饰电极及裸玻碳电极在10-4M NADH中的电极响应曲线；
图3为本发明修饰电极测定NADH的标准工作曲线；
图4为本发明脱氢酶电极测定乙醇的原理图；
图5为本发明脱氢酶电极测定乙醇的电极响应曲线；
图6为双酶电极体系检测发酵液中苹果酸及乳酸的装置图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细说明。
实施例1：
以本电极测试缓冲溶液中还原型辅酶Ⅰ(NADH)为例(电极响应原理参见图1)。其测定步骤如下：
a.以碳纳米管/鱼精蛋白复合材料滴涂于基底电极表面制备的修饰电极作为工作电极，Ag/AgCl(3M KCl)电极为参比电极，箔片电极为对电极，用上海辰华(CHI 760D)电化学工作站进行测定。所述修饰电极、Ag/AgCl(3M KCl)、箔片电极及CHI 760D电化学工作站相连。将工作电极直接插入盛有缓冲溶液的测量池中，记录初始循环伏安曲线。
电极的制备过程：取20mg鱼精蛋白，加入5mL超纯水中，配置4mg/mL的鱼精蛋白水溶液，放置待用。分别取5mg碳纳米管，600μL鱼精蛋白水溶液加入5mL超纯水，超声分散1h，得到碳纳米管/鱼精蛋白纳米复合材料，置于冰箱中。取玻碳电极在打磨纸上放少许三氧化二铝粉末，加入水，尽量多一点，然后将电极以圆形画圈方式打磨2到3min，之后用蒸馏水冲洗，再之后用烧杯装入一定的水，将电极放入其中，在超声波机器中超声清洗5min，再换乙醇，超声清洗2min，放置待用。取20μL碳纳米管/鱼精蛋白纳米复合材料物滴涂于清洗干净的玻碳电极表面，自然晾干或红外灯下晾干，得到所述的修饰电极。
b.将修饰电极插入盛有缓冲溶液的测量池中得到初始循环伏安曲线，向测量池中加入已知浓度的NADH，循环伏安曲线上出现氧化峰(如图2)，根据加入NADH后的氧化峰电流大小和NADH浓度绘制标准曲线(如图3)。
检测装置：碳纳米管/鱼精蛋白复合材料修饰电极为工作电极，Ag/AgCl(3M KCl)电极为参比电极，箔片为对电极，通过导线与CHI 760D电化学工作站相连。
实施例2；
首先取缓冲溶液配置了两个加标试样，浓度分别为10-6和10-7,依照实施例1测定氧化峰电流，根据峰电流值，对照标准工作曲线(如图3)计算出相应的浓度。
实施例3:
以脱氢酶电极测试缓冲溶液乙醇的含量(电极响应原理参见图4)。其测定步骤如下：
a.以乙醇脱氢酶电极作为工作电极，Ag/AgCl(3M KCl)电极为参比电极，箔片电极为对电极，用上海辰华(CHI 760D)电化学工作站进行测定。所述酶电极、Ag/AgCl(3MKCl)、箔片电极及CHI 760D电化学工作站相连。将脱氢酶电极直接插入盛有缓冲溶液的测量池中，记录初始循环伏安曲线，向测量池中加入已知浓度的乙醇，循环伏安曲线上出现氧化峰(如图5)，根据加入乙醇后的氧化峰电流大小和乙醇浓度绘制标准曲线。所述脱氢酶酶电极为碳纳米管/乙醇脱氢酶/鱼精蛋白复合材料滴涂于碳纳米管/鱼精蛋白修饰的电极表面所制备的。
b.电极的制备过程为：取20mg鱼精蛋白，加入5mL超纯水中，配置4mg/mL的鱼精蛋白溶液，放置待用。分别取5mg碳纳米管，600μL鱼精蛋白溶液加入5mL水中，超声分散1h，得到碳纳米管/鱼精蛋白复合材料，置于冰箱中。取玻碳电极在打磨纸上放少许三氧化二铝粉末，加入水，尽量多一点，然后将电极以圆形画圈方式打磨2-3min，之后用蒸馏水冲洗，再之后用烧杯装入一定的水，将电极放入其中，在超声波机器中超声清洗5min，再换乙醇，超声清洗2min，放置待用。取15μL碳纳米管/鱼精蛋白复合材料物滴涂于清洗干净的玻碳电极表面，自然晾干或红外灯下晾干，得到所述的修饰电极。取60μL，2mg/mL的乙醇脱氢酶加入500μL碳纳米管/鱼精蛋白复合材料中，超声分散5min，放置待用。取20μL所得的乙醇脱氢酶/碳纳米管/鱼精蛋白复合物滴涂于所述的修饰电极表面，冰箱中放置晾干，得到所述的脱氢酶电极。冰箱中放置待用。
c.检测装置：乙醇脱氢酶电极为工作电极，Ag/AgCl(3M KCl)电极为参比电极，箔片为对电极，通过导线与CHI 760D电化学工作站相连。
实施例4:
采用本发明方法制备苹果酸脱氢酶电极和乳酸脱氢酶电极，集成双酶电极体系，同时测定葡萄发酵液中苹果酸及乳酸的含量(参见图6)。
实施例5:
甲醇酵母发酵的诱导阶段，甲醇浓度控制非常关键，采用本发明方法制备甲醇脱氢酶电极，用于监测发酵液中甲醇浓度的变化。
实施例6
同实施例1，所不同的是：
电极的制备过程：取20mg鱼精蛋白，加入5mL超纯水中，配置4mg/mL的鱼精蛋白水溶液，放置待用。分别取5mg碳纳米管，25μL鱼精蛋白水溶液加入5mL超纯水，超声分散1h，得到碳纳米管/鱼精蛋白纳米复合材料，置于冰箱中。取玻碳电极在打磨纸上放少许三氧化二铝粉末，加入水，尽量多一点，然后将电极以圆形画圈方式打磨2到3min，之后用蒸馏水冲洗，再之后用烧杯装入一定的水，将电极放入其中，在超声波机器中超声清洗5min，再换乙醇，超声清洗2min，放置待用。取20μL碳纳米管/鱼精蛋白纳米复合材料物滴涂于清洗干净的玻碳电极表面，自然晾干或红外灯下晾干，得到所述的修饰电极。
实施例7
同实施例1，所不同的是：
电极的制备过程：取20mg鱼精蛋白，加入5mL超纯水中，配置4mg/mL的鱼精蛋白水溶液，放置待用。分别取5mg碳纳米管，2.5mL鱼精蛋白水溶液加入5mL超纯水，超声分散1h，得到碳纳米管/鱼精蛋白纳米复合材料，置于冰箱中。取玻碳电极在打磨纸上放少许三氧化二铝粉末，加入水，尽量多一点，然后将电极以圆形画圈方式打磨2到3min，之后用蒸馏水冲洗，再之后用烧杯装入一定的水，将电极放入其中，在超声波机器中超声清洗5min，再换乙醇，超声清洗2min，放置待用。取20μL碳纳米管/鱼精蛋白纳米复合材料物滴涂于清洗干净的玻碳电极表面，自然晾干或红外灯下晾干，得到所述的修饰电极。
实施例8
同实施例3，所不同的是：
电极的制备过程为：取20mg鱼精蛋白，加入5mL超纯水中，配置4mg/mL的鱼精蛋白溶液，放置待用。分别取5mg碳纳米管，25μL鱼精蛋白溶液加入5mL水中，超声分散1h，得到碳纳米管/鱼精蛋白复合材料，置于冰箱中。取玻碳电极在打磨纸上放少许三氧化二铝粉末，加入水，尽量多一点，然后将电极以圆形画圈方式打磨2-3min，之后用蒸馏水冲洗，再之后用烧杯装入一定的水，将电极放入其中，在超声波机器中超声清洗5min，再换乙醇，超声清洗2min，放置待用。取15μL碳纳米管/鱼精蛋白复合材料物滴涂于清洗干净的玻碳电极表面，自然晾干或红外灯下晾干，得到所述的修饰电极。取5μL，2mg/mL的乙醇脱氢酶加入500μL碳纳米管/鱼精蛋白复合材料中，超声分散5min，放置待用。取20μL所得的乙醇脱氢酶/碳纳米管/鱼精蛋白复合物滴涂于所述的修饰电极表面，冰箱中放置晾干，得到所述的脱氢酶电极。冰箱中放置待用。
实施例9
同实施例3，所不同的是：
电极的制备过程为：取20mg鱼精蛋白，加入5mL超纯水中，配置4mg/mL的鱼精蛋白溶液，放置待用。分别取5mg碳纳米管，2.5mL鱼精蛋白溶液加入5mL水中，超声分散1h，得到碳纳米管/鱼精蛋白复合材料，置于冰箱中。取玻碳电极在打磨纸上放少许三氧化二铝粉末，加入水，尽量多一点，然后将电极以圆形画圈方式打磨2-3min，之后用蒸馏水冲洗，再之后用烧杯装入一定的水，将电极放入其中，在超声波机器中超声清洗5min，再换乙醇，超声清洗2min，放置待用。取15μL碳纳米管/鱼精蛋白复合材料物滴涂于清洗干净的玻碳电极表面，自然晾干或红外灯下晾干，得到所述的修饰电极。取0.5mL，2mg/mL的乙醇脱氢酶加入500μL碳纳米管/鱼精蛋白复合材料中，超声分散5min，放置待用。取20μL所得的乙醇脱氢酶/碳纳米管/鱼精蛋白复合物滴涂于所述的修饰电极表面，冰箱中放置晾干，得到所述的脱氢酶电极。冰箱中放置待用。
实施例10
以碳纳米纤维/聚赖氨酸复合材料代替碳纳米管/鱼精蛋白复合材料,其他同实施例1-9。
实施例7
以石墨烯/组蛋白复合材料代替碳纳米管/鱼精蛋白复合材料,其他同实施例1-9。
实施例8
以碳纳米片/组蛋白复合材料代替碳纳米管/鱼精蛋白复合材料,其他同实施例1-9。
实施例9
以碳纳米球/聚赖氨酸复合材料代替碳纳米管/鱼精蛋白复合材料,其他同实施例1-9。
Claims (3)
1.一种脱氢酶电极的制备方法，其特征在于，该脱氢酶电极包括基底电极、涂敷于所述基底电极上的电子传导层和涂敷于所述电子传导层上的脱氢酶层，其特征在于，所述电子传导层为仿生纳米复合材料；所述脱氢酶层为仿生纳米复合材料/脱氢酶复合物；所述仿生纳米复合材料为生物大分子分散的碳纳米材料；所述仿生纳米复合材料/脱氢酶复合物为脱氢酶分散固定于所述仿生纳米复合材料所得的复合物；所述生物大分子为鱼精蛋白、聚赖氨酸、组蛋白的一种，所述碳纳米材料为碳纳米管、碳纳米纤维、石墨烯、碳纳米片、碳纳米球的一种，所述脱氢酶为乙醇脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶或甲醇脱氢酶中的一种；制备方法包括如下步骤：
a、取碳纳米材料和生物大分子溶液混合，加入超纯水，超声分散得碳纳米材料和生物大分子复合物的悬浊液，将该悬浊液采用滴涂法涂敷于所述基底电极上，干燥，形成电子传导层；其中，碳纳米材料：生物大分子=5：（0.1-10）（质量比）；
b、取碳纳米材料和生物大分子溶液混合，加入超纯水，超声分散得悬浊液，将脱氢酶加入上述悬浊液继续超声分散处理，使脱氢酶松散的包裹在碳纳米材料/生物大分子复合物中得到固定化脱氢酶体系，将该酶体系采用滴涂法涂敷于所述电子传导层上，干燥，形成脱氢酶层；其中，所述碳纳米材料：生物大分子：脱氢酶=5:（0.1-10）:（0.1-1）（质量比）。
2.如权利要求1所述的一种脱氢酶电极的制备方法，其特征在于，所述仿生纳米复合材料为鱼精蛋白和碳纳米管复合物；所述仿生纳米复合材料/脱氢酶复合物为碳纳米管/鱼精蛋白/脱氢酶复合物。
3.如权利要求1所述的一种脱氢酶电极的制备方法，其特征在于，所述超声分散时间为60-65min。
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