CN103212089B - 一种碳纳米材料-免疫刺激序列复合物的制备方法及其应用 - Google Patents

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本发明公开了一种碳纳米材料‑免疫刺激序列复合物的制备方法及其应用,该制备方法为(1)利用多聚赖氨酸修饰碳纳米材料,获得多聚赖氨酸修饰的碳纳米材料;(2)将步骤(1)所得多聚赖氨酸修饰的碳纳米材料与免疫刺激序列混合于水溶液中,20℃~37℃振荡0.5~3小时,离心收集沉淀即得。该碳纳米材料‑免疫刺激序列复合物将碳纳米材料作为免疫刺激序列(CpG DNA)胞内输运的载体,显著提高了CpG DNA的细胞摄取效率,保护CpG DNA不被核酸酶降解,能够长时间地提高机体的免疫活性,具有良好的医学应用前景。

Description

一种碳纳米材料-免疫刺激序列复合物的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种碳纳米材料-免疫刺激序列复合物的制备方法及其应用。
背景技术
CpG基序(CpG motifs)是指含有非甲基化的胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)的核心序列的核苷酸。含有CpG基序的DNA序列称为CpG DNA,或CpG ODN(寡聚脱氧核苷酸,oligodeoxynucleotide),又称为免疫刺激序列。这类包含非甲基化的CpG二核苷酸的ODN在细菌、病毒基因组中的出现频率远高于在脊椎动物中出现频率,并且脊椎动物中80%胞嘧啶是甲基化的,这种显著的差异使脊椎动物可以识别入侵的细菌及病毒,因而CpG基序是哺乳动物免疫刺激信号的基础。人工合成的含有CpG基序的ODN序列可以模仿细菌DNA的刺激作用,激活多种免疫细胞产生多种细胞因子,调节免疫应答向Th1型转换。CpG ODN作为具有治疗性作用的DNA序列,在抗感染免疫、癌症治疗、过敏性疾病以及免疫佐剂等领域显示出广阔的应用前景。但CpG DNA自身易降解且细胞摄取率较低,因此需要很高剂量重复给药才能刺激机体产生有效的免疫应答,这极大的限制了它在医学领域的应用。
目前,常规的免疫刺激试剂为单链CpG寡聚脱氧核苷酸(ssCpG),但是ssCpG在体内易降解,所以注射剂量一般要达到毫克级才能起效果(徐娜,张雪梅,王钦富。增强CpG免疫刺激作用途径的研究进展,中国医药生物技术,2012,7(2),144),致使实际应用中的成本很高。一种替代的试剂是含硫代磷酸酯骨架的寡聚核苷酸(S-CpG),该寡聚核苷酸具有硫代磷酸酯骨架,能有效抵抗核酸酶的降解,短时间内具有较好的免疫刺激效果,但是不能长时间保持免疫刺激活性,另外动物实验表明S-CpG具有较强的肾毒性(文献:Chavany C,ConnellY,Neckers L.Contribution of sequence andphosphorothioate content toinhibition of cell growth and adhesion caused by c-mycantisense oligomers.MolPharmacol1995;48:738–46.Crooke RM.In vitro toxicology and pharmacokinetics ofantisense oligonucleotides.Anticancer Drug Des1991;6:609–46.)。
本世纪,纳米技术在医药领域的应用为解决上述问题提供了新的思路。纳米颗粒的小尺度效应使其很容易被细胞大量摄取,大的比表面积能够大量吸附并输运多种物质如药物,蛋白质,DNA等进入细胞,从而发挥生物学效应。现阶段,纳米颗粒被广泛用于各种药物输运系统的研制中,这其中,纳米金刚石(NDs)显示了独特的优势,首先,NDs通常由爆炸法制备而成,单颗粒直径约2-8nm,合成过程简单且成本较低。其次,NDs有很低的免疫原性和很好的体内外生物相容性。最重要的是,NDs在溶液中通常以自由能较小的团簇形式存在,团簇内部单颗粒之间和团簇表面都可以吸附大量药物分子,并且NDs在溶液中独特的团簇结构使得其上负载的物质能缓慢地释放,从而长时间发挥其生物学活性。因此,NDs是CpGDNA细胞内输运的理想载体。
发明内容
因此,本发明要解决的技术问题就是针对现有免疫刺激序列(CpG)自身易降解且细胞摄取率较低,需要很高剂量重复给药才能刺激机体产生有效的免疫应答的缺陷,提供一种碳纳米材料-免疫刺激序列复合物的制备方法及其应用。发明人经过大量创造性劳动惊喜地发现,利用本发明所述碳纳米材料-免疫刺激序列复合物制备的免疫刺激缓释剂具有很高的细胞摄取效率,能够保护免疫刺激序列不被核酸酶降解,能够长时间地提高机体的免疫活性,具有良好的医学应用前景。
为解决上述技术问题,本发明采取的技术方案之一为:一种碳纳米材料-免疫刺激序列复合物的制备方法,其特征在于,该制备方法包括以下步骤:
(1)利用多聚赖氨酸修饰碳纳米材料,获得多聚赖氨酸修饰的碳纳米材料;
(2)将步骤(1)所得多聚赖氨酸修饰的碳纳米材料与免疫刺激序列混合于水溶液中,20℃~37℃,振荡0.5~3小时,离心收集沉淀,即得。
其中步骤(1)为:利用多聚赖氨酸修饰碳纳米材料,获得多聚赖氨酸修饰的碳纳米材料。
其中所述的利用多聚赖氨酸修饰碳纳米材料为常规方法,所述利用多聚赖氨酸修饰碳纳米材料的方法较佳地为:将碳纳米材料和多聚赖氨酸加入至硼酸中,调节pH值至8~8.5,混合均匀,20℃~37℃摇床振荡300~600rpm8~24小时,13000~15000rpm离心15~30min,洗涤所得沉淀,离心得到多聚赖氨酸修饰的碳纳米材料。其中所述碳纳米材料和多聚赖氨酸的质量比较佳地为2:1~3:1。
其中所述碳纳米材料为常规碳纳米材料,是指分散相尺度至少有一维小于100nm的碳材料,并由此具有某些新特性的碳材料。所述碳纳米材料较佳地为:碳纳米管(CNTs)、石墨烯片(GO)或者纳米金刚石(NDs)。其中所述纳米金刚石为本领域常规纳米金刚石。所述纳米金刚石的纯度较佳地为>99%,所述纳米金刚石的单颗粒直径较佳地为2~10nm,在溶液中较佳地形成直径为100~300nm的团簇结构。所述纳米金刚石的制备方法为本领域常规制备方法,较佳地为爆炸法合成。
其中所述混合为本领域常规技术。所述混合的方法较佳地为超声混匀或者搅拌混匀,优选地为超声混合。
其中所述多聚赖氨酸为常规多聚赖氨酸,其分子量较佳地为30000~70000。所述多聚赖氨酸较佳地为左旋赖氨酸和/或右旋赖氨酸,更佳地为右旋多聚赖氨酸。所述多聚赖氨酸市售可得。
其中步骤(2)为:将步骤(1)所得多聚赖氨酸修饰的碳纳米材料与免疫刺激序列混合于水溶液中,20℃~37℃振荡0.5~3小时,离心收集沉淀,即得。
其中所述免疫刺激序列为常规免疫刺激序列。所述免疫刺激序列较佳地是指包含CpG基序(CpG基序又称CpG motifs,是指含有非甲基化的胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)核心序列的核苷酸)的脱氧核苷酸。所述脱氧核苷酸序列较佳地为寡聚脱氧核苷酸(ODN)序列,所述寡聚脱氧核苷酸序列为只有20个以下碱基的短链脱氧核苷酸的总称。所述免疫刺激序列更佳地为由序列表中SEQ ID NO:1所示序列构成的寡聚核苷酸。所述免疫刺激序列的制备方法为本领域常规制备方法,较佳地为人工合成制备。
其中所述免疫刺激序列较佳地为连接荧光标记物的免疫刺激序列。其中所述荧光标记物为常规荧光标记物,所述荧光标记物较佳地为Cy2、Cy3或Cy5,更佳地为Cy3。所述荧光标记物的制备方法为常规制备方法,较佳地为市售可得。利用所述荧光标记物标记免疫刺激序列的方法为本领域常规方法。
其中所述水溶液较佳地为millipore纯水溶液、双蒸水溶液或去离子水溶液,更佳地为millipore纯水溶液。其中所述震荡的时间较佳地为2小时。
其中所述多聚赖氨酸修饰的碳纳米材料与免疫刺激序列的质量比较佳地为5:1~30:1,更佳地为5:1~10:1,优选的为10:1。
为解决上述技术问题,本发明采取的技术方案之二为:上述制备方法制备所得的碳纳米材料-免疫刺激序列复合物。
其中所述碳纳米材料-免疫刺激序列复合物较佳地为纳米金刚石-免疫刺激序列复合物,碳纳米管-免疫刺激序列复合物或者石墨烯片-免疫刺激序列复合物,更佳地为纳米金刚石-免疫刺激序列复合物。
为解决上述技术问题,本发明采取的技术方案之三为:本发明所述碳纳米材料-免疫刺激序列复合物在制备免疫刺激缓释制剂中的用途。
其中所述免疫刺激缓释制剂较佳地是指能激活多数或全部T或B淋巴细胞克隆,不受T细胞受体(TCR)或B细胞受体(BCR)特异性限制的非特异性刺激物质。其中所述用途更佳地为所述纳米碳材料-免疫刺激序列复合物在制备抗感染免疫制剂、抗癌症药物、抗过敏性疾病药物以及免疫佐剂中的用途。根据需要,本发明所述免疫刺激缓释制剂还包括药学上可接受的载体,所述的药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体,将所述的碳纳米材料-免疫刺激序列复合物与药学上可接受的载体制成各种剂型。在具体使用过程中,还可根据患者的年龄、病情等酌情变化。
在符合本领域常识的基础上,上述各优选条件,可任意组合,即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于:本发明所得碳纳米材料-免疫刺激序列复合物将碳纳米材料作为免疫刺激序列的细胞内输运载体,显著提高了免疫刺激序列(CpG DNA)的细胞摄取效率,有效保护CpG DNA不被核酸酶降解,长时间地提高机体的免疫活性,具有良好的医学应用前景。本发明所述碳纳米材料-免疫刺激序列复合物制备方法简单并且成本很低,只要微克(μg)级的CpG DNA就可以在动物体内有效发挥生物学效应,大大节约了成本。在细胞水平,其免疫刺激效果短时间内和S-CpG相当,并且其免疫刺激活性持续时间长达72小时,在动物整体水平上本发明所述碳纳米材料-免疫刺激序列复合物的免疫刺激时间长达48小时,在临床应用上能有效避免多次给药,大大减少了病人反复注射的痛苦,同时该复合物毒性较低,副作用极小。
附图说明
图1是免疫刺激序列复合物透射电镜成像图。其中(A)是NDs-PDL复合物的透射电镜成像图;(B)是NDs-CpG复合物的透射电镜成像图。
图2是细胞共聚焦显微成像图。其中(A)是ssCPG和RAW264.7细胞孵育6小时的共聚焦显微成像图;(B)是NDs-CpG和RAW264.7细胞孵育6小时的共聚焦显微成像图;(C)是NDs-CpG和RAW264.7细胞孵育24小时的共聚焦显微成像图;(D)是NDs-CpG和RAW264.7细胞孵育48小时的共聚焦显微成像图;(E)是NDs-CpG和RAW264.7细胞孵育72小时的共聚焦显微成像图。
图3是荧光强度的统计结果图。其中(A)是RAW264.7细胞孵育6小时细胞内平均荧光强度的统计结果图,其中1是空白对照,2是ssCpG,3是NDs-PDL,4是NDs-CpG;(B)是ssCpG和NDs-CpG分别和RAW264.7细胞孵育6-72小时细胞内平均荧光强度的统计结果图。
图4是NDs-PDL、NDs-CpG和RAW264.7细胞孵育72h的存活率。
图5是通过尾静脉分别注射NDs-PDL和NDs-CpG到小鼠体内48h后血清中各指标检测结果图。其中(A)是小鼠血清中谷草转氨酶(AST)活性检测结果图;(B)是小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)活性检测结果图,(C)是小鼠血清中碱性磷酸酶(ALP)活性检测结果图。
图6是通过尾静脉分别注射NDs-PDL、NDs-CpG和生理盐水到小鼠体内48h后各主要器官的组织病理切片图。
图7不同免疫刺激复合物细胞水平的免疫刺激活性评估图。其中(A)是和细胞孵育6小时后的TNF-α检测结果图,其中1是空白对照,2是NDs-PDL,3是ssCpG,4是NDs-nonCpG,5是NDs-CpG,6是S-CpG;(B)是所述免疫刺激复合物和细胞孵育6小时后IL-6的检测结果图,其中1是空白对照,2是NDs-PDL,3是ssCpG,4是NDs-nonCpG,5是NDs-CpG,6是S-CpG;(C)是上述免疫刺激复合物和细胞孵育24-72小时后TNF-α的检测结果图;(D)是上述免疫刺激复合物和细胞孵育24-72小时后IL-6的检测结果图。
图8是不同免疫刺激复合物在整体动物水平的免疫刺激活性评估图。其中(A)是尾静脉注射NDs-PDL、ssCpG、NDs-nonCpG、NDs-CpG、S-CpG和生理盐水后3-48小时后IL-12的检测结果图;(B)是注射上述免疫刺激复合物3-48小时后IL-6的检测结果图。
图9不同碳纳米材料-免疫刺激序列复合物对细胞的免疫刺激效果图。其中(A)是各复合物与细胞孵育6小时后平均荧光强度检测结果图,其中1是GO-CpG,2是CNTs-CpG,3是NDs-CpG;(B)是各复合物与细胞孵育6小时后TNF-α检测结果图,其中1是GO-CpG,2是CNTs-CpG,3是NDs-CpG。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明,但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,按照常规方法和条件,或按照商品说明书选择。
实施例1合成免疫刺激序列
所有免疫刺激序列核苷酸均由Invitrogen公司合成,其中ssCpG为单链CpG寡聚脱氧核苷酸,nonCpG为不含CpG基序的寡聚核苷酸,Cy3-CpG为红色荧光标记的寡聚核苷酸,S-CpG为含硫代磷酸酯骨架的寡聚核苷酸,所有寡核苷酸都有一个磷酸二酯键骨架,所述寡聚核苷酸的序列分别如表1和序列表中SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:4所示。
表1 实施例中涉及的免疫刺激序列
实施例2纳米金刚石免疫序列复合物(NDs-CpG复合物)的制备
多聚赖氨酸修饰纳米金刚石(具体见文献L.C. L. Huang and H. C.Chang.Adsorption and Immobilization of Cytochrome c on Nanodiamonds.Langmuir2004, 20, 5879-5884)。
将70mg纳米金刚石(NDs)(甘肃金石纳米材料有限公司,所述纳米金刚石纯度>99%单颗粒直径约2-10nm,在溶液中形成250nm左右的团簇结构)和30mg有右旋结构的多聚赖氨酸(PDL)(sigma,货号:P7280)加入至10mL硼酸中,用1M NaOH调节pH至8.5,超声混合均匀,25oC摇床振荡过夜,13000rpm离心20min,所得沉淀用millipore纯水洗涤5遍,彻底去除游离的PDL,离心得到PDL修饰的NDs(NDs-PDL)。
NDs-PDL和单链CpG(ssCpG)以质量比10:1混合于millipore纯水中,20℃~37℃摇床振荡0.5~3小时,离心得NDs-CpG复合物。结果:紫外分光光度计测得NDs-PDL对DNA的吸附量为99.5%,吸附DNA后,复合物的平均粒径从324.9nm增加到337.5nm,Zeta电位从67.3eV下降到40.6eV,NDs-CpG复合物的透射电镜成像见图1。
实施例3NDs-CpG的细胞摄取行为观察
将实施例1合成的Cy3-CpG(Cy3呈现红色荧光)寡聚核苷酸与实施例2制备所得NDs-PDL吸附,制备方法与实施例2相同,制备荧光标记的NDs-CpG。
Raw264.7细胞购自中科院上海细胞库,培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基(Gibco)中。37°C,5%CO2,饱和湿度培养。细胞以5×104/孔密度接种于激光共聚焦培养皿,贴壁过夜。设置以下实验组:空白对照,ssCpG(5μg/mL),NDs-PDL(50μg/mL),NDs-CpG(50μg/mL),37°C孵育6h,PBS洗涤,莱卡TCS sp5共聚焦荧光显微镜成像(激发波长561nm,发射波长620nm),每组随机选择20-25个细胞,统计每个细胞内的平均荧光强度(MFI/cell)。ssCpG和NDs-CpG组PBS洗涤后分别在37°C孵育24,48和72h,共聚焦荧光显微镜成像并统计细胞内的平均荧光强度,利用莱卡LAS AF Lite软件分析结果数据。
结果:孵育6h后,和ssCpG组相比,NDs-CpG复合物细胞内的荧光强度显著升高,并且NDs上负载的CpG被细胞摄取后能在72h内缓慢释放。细胞共聚焦荧光显微成像见图2,细胞内平均荧光强度的统计结果见和图3。
实施例4NDs-CpG的体内外生物相容性评估
NDs-CpG对细胞存活率的影响
Raw264.7细胞以105/孔密度接种于24孔板,贴壁过夜,分别加入浓度为12.5μg/mL,25μg/mL,50μg/mL,75μg/mL和100μg/mL NDs-PDL和NDs-CpG复合物,以不做任何处理的细胞为对照,孵育72h后用MTT(Sigma)染色4h,加入10%酸性SDS溶解生成的甲瓚结晶,于OD570nm处测定每孔的紫外吸收值,细胞存活率以OD(处理组)/OD(对照组)的百分比表示。
NDs-CpG对小鼠肝功能的影响
ICR小鼠(购自上海斯莱克实验动物公司),随机分成5组,每组6只,分别给予下列制剂:未处理组,生理盐水组,NDs-PDL组(80μg/20g),NDs-CpG组(80μg/20g)和脂多糖组(LPS,4μg/20g),脂多糖组为诱导急性肝损伤的阳性对照组,各组药物均溶于生理盐水,尾静脉给药。LPS组注射6h后眼眶取血,其他各组注射48h后眼眶取血,全血室温静置4小时,3000rpm离心15分钟,收集血清,所有样品按谷丙转氨酶(ALT),谷草转氨酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒(购自南京建成生物医学工程研究所)在紫外分光光度计上分别测定ALT,AST和ALP的活性。
NDs-CpG对小鼠主要脏器病理结构的影响
上述实验中的生理盐水组,NDs-PDL组和NDs-CpG组,每组随机选3只小鼠取血后处死并解剖,取肝,脾,肺,肾组织,10%福尔马林固定,石蜡包埋,切片,固定在载玻片上,苏木精—伊红染色,光学显微镜观察。
结果:NDs-PDL载体和NDs-CpG复合物暴露后,体外实验结果显示在72h内对细胞存活率没有显著影响,结果见图4;体内实验结果显示,48h后,各肝功能指标和对照相比均没有显著变化,结果见图5;并且主要脏器病理结构也未见显著变化,结果见图6;上述结果表明NDs-PDL载体和NDs-CpG复合物具有良好的体内外生物相容性。
实施例5NDs-CpG的体内外免疫刺激活性评估
NDs-CpG的体外免疫刺激活性
Raw264.7细胞以105/孔密度接种于24孔板,贴壁过夜,设置以下实验组,每组3个复孔:空白对照,ssCpG(5μg/mL),NDs-PDL(50μg/mL),NDs-nonCpG(50μg/mL),NDs-CpG(50μg/mL)和S-CpG(50nM)。(注:S-CpG浓度不能过高,否则毒性太大导致细胞迅速死亡)。孵育6h,收集上清,Elisa法检测细胞因子TNF-α和IL-6的含量。各组均用PBS彻底洗涤三次,加入新鲜培养基,24h后收集上清。3天内,每24h重复上述过程一次。Elisa法检测各组上清中细胞因子TNF-α和IL-6的含量。
检测TNF-α含量的具体步骤如下:
(1)96孔板每孔加抗鼠TNF-α一抗(Anti-Mouse/Rat TNF alpha Purified,eBioscience),密封,4℃孵育过夜;
(2)弃掉一抗,用含0.05%Tween-20的磷酸盐缓冲液(PBST)洗涤,加入封闭液(PBST+2%牛血清白蛋白),室温封闭1h;
(3)弃掉封闭液,PBST洗涤,分别加入待测样品和鼠TNF-α标准品(Recombinantmouse TNF alpha,eBioscience,标准品梯度稀释后加样用于绘制标准曲线),密封,室温孵育2h;
(4)弃掉样品,PBST洗涤,加入抗鼠TNF-α生物素二抗(Anti-Mouse/Rat TNF alphaBiotin,eBioscience),密封,室温孵育1h;
(5)弃掉二抗,PBST洗涤,加入辣根过氧化物酶标记亲和素(Avidin/HRP,eBioscience),密封,室温孵育30min;
(6)弃掉HRP,PBST充分洗涤,加入TMB显色液,室温孵育10-15min,加入0.5M H2SO4终止反应,在酶标仪上于OD450检测吸光值。
根据标准曲线计算各组待测样品中TNF-α的含量。各组上清中IL-6含量用MouseIL-6ELISA High Sensitivity(eBioscience,货号BMS603HS)试剂盒检测。
NDs-CpG的体内免疫刺激活性
ICR小鼠随机分成7组,每组24只,分别给予下列制剂:未处理组,生理盐水组,ssCpG(8μg/20g),NDs-PDL组(80μg/20g),NDs-nonCpG组(80μg/20g),NDs-CpG组(80μg/20g)和S-CpG组(8μg/20g注:此处浓度和ssCpG一致),S-CpG作为阳性对照,各组药物均溶于生理盐水,尾静脉给药。注射3h、24h和48h后,每组分别取8只眼眶取血,按实施例4所述方法分离血清,测定血清中细胞因子IL-12和IL-6的含量。IL-12含量用Murine IL-12Mini ELISADevelopment Kit(Pepro Teth,货号900-M97)检测,IL-6含量用Mouse IL-6ELISA HighSensitivity试剂盒检测(eBioscience,货号BMS603HS)。
结果:体外实验结果显示,孵育6h后,和ssCpG组相比,NDs-CpG复合物组对巨噬细胞的免疫刺激活性显著升高,其活性和阳性对照S-CpG相当。更重要的是,NDs-CpG复合物孵育6h洗去之后,细胞内摄取的复合物的免疫刺激活性能持续72h并缓慢降低,但是阳性对照S-CpG孵育6h洗去之后,则对细胞没有任何免疫刺激效果,结果如图7所示。体内实验结果显示,注射3h后,和ssCpG组相比,NDs-CpG对小鼠的免疫刺激活性显著升高,其活性和相同给药剂量的阳性对照S-CpG相当。更重要的是,NDs-CpG复合物的免疫刺激活性能持续48h并缓慢降低,而S-CpG在之后的48h内对小鼠没有任何免疫刺激效果,结果如图8所示。上述体内外实验结果均显示,纳米金刚石(NDs)携带非CpG序列(non-CpG)时不具有任何免疫刺激效应,因此NDs-CpG复合物是通过CpG序列而起到免疫刺激作用的。
实施例6碳纳米管(CNTs)和石墨烯片(GO)免疫刺激序列复合物的制备以及体外免疫刺激活性评估
碳纳米管(CNTs,纯度95%,几十微米长,直径20~40nm)由深圳纳米港有限公司以化学气相沉积法(CVD)处理。CNTs的纯化,超声切割方法和表征数据见文献[XiaoyongZhang,Wenbing Hu,Jing Li,Lei tao,and Yen wei.A comparative study of cellularuptake and cytotoxicity of multi-walled carbon nanotube,graphene oxide,andnanodiamond.Toxicol.Res.,2012,1,62-68]石墨烯片(GO)通过改进的Hummer法制得,具体制备方法及表征数据见文献[Hummers,W.S.and Offeman,R.E.Preparation of GraphiticOxide.J.Am.Chem.Soc.1958,80,1339]。CNTs-CpG和GO-CpG复合物的制备方法与实施例2相同。
CNTs-CpG和GO-CpG的细胞摄取行为观察实验方法与实施例3相同。每组随机选择20~25个细胞,共聚焦荧光显微镜成像后统计细胞内的平均荧光强度。
CNTs-CpG、GO-CpG(50μg/mL)和RAW264.7细胞孵育6h后,收集上清,Elisa法检测细胞因子TNF-α的含量。各组均用PBS彻底洗涤三次,加入新鲜培养基,24h后收集上清,Elisa法检测各组上清中细胞因子TNF-α含量(具体测定方法见实施例5)。
结果:孵育6h后,各复合物对细胞的免疫刺激效果从高到低依次为:NDs-CpG>CNTs-CpG>GO-CpG,结果如图9所示。
应理解,在阅读了本发明的上述内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.一种纳米金刚石-免疫刺激序列复合物的制备方法,其特征在于,该制备方法包括以下步骤:
(1)利用多聚赖氨酸修饰纳米金刚石,获得多聚赖氨酸修饰的纳米金刚石,所述纳米金刚石的单颗粒直径为2~10nm;
(2)将步骤(1)所得多聚赖氨酸修饰的纳米金刚石与免疫刺激序列混合于水溶液中,20℃~37℃,振荡0.5~3小时,离心收集沉淀,即得;步骤(2)所述免疫刺激序列为包含CpG基序的脱氧核苷酸,所述免疫刺激序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。
2.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)所述多聚赖氨酸为右旋多聚赖氨酸。
3.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)所述水溶液中多聚赖氨酸修饰的纳米金刚石与免疫刺激序列的质量比为5:1~30:1。
4.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述免疫刺激序列是连接荧光标记物的免疫刺激序列,所述荧光标记物为Cy2、Cy3或Cy5。
5.一种如权利要求1~4任一项所述制备方法制备所得的纳米金刚石-免疫刺激序列复合物。
6.如权利要求5所述的纳米金刚石-免疫刺激序列复合物在制备免疫刺激缓释制剂中的用途。
7.如权利要求6所述的用途,其特征在于,所述用途为该纳米金刚石-免疫刺激序列复合物在制备抗感染免疫制剂、抗癌症药物、抗过敏性疾病药物和/或免疫佐剂中的用途。
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