CN101428788A

CN101428788A - 一种聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管及其复合物、制备方法及用途

Info

Publication number: CN101428788A
Application number: CNA2008102012385A
Authority: CN
Inventors: 于伯章; 马继飞; 黄庆
Original assignee: Shanghai Institute of Applied Physics of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Applied Physics of CAS
Priority date: 2008-10-15
Filing date: 2008-10-15
Publication date: 2009-05-13
Anticipated expiration: 2028-10-15
Also published as: CN101428788B

Abstract

本发明公开了一种聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管及其质粒DNA的复合物，本发明采用的质粒DNA包括：P53DNA，绿色荧光蛋白表达(JPC)以及人未甲基化寡聚脱氧核苷酸质粒DNA。本发明的聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管与质粒DNA的复合物，具有转染效率高和对细胞毒性小的优点，尤其在浓度为30g/ml时，转染效率大于90％，细胞有效性大于80％。该聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管的质粒DNA复合物在制备转染骨肉瘤细胞体外及动物体内的基因治疗的药物中有广阔的应用前景，而聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管/质粒DNA/阿霉素纳米复合物在制备抑制肿瘤生长的药物中也有着广泛应用。

Description

一种聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管及其复合物、制备方法及用途

技术领域

本发明涉及碳纳米管领域，具体涉及一种聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管(PEI-g-MWCNTs)及其复合物，及其制备方法及用途。

背景技术

用碳纳米管作为载体将外源性DNA导入细胞引起人们研究兴趣。用混酸(硫酸:硝酸＝3:1)，硝酸氧化切割的碳纳米管的侧壁或端口带有羧基官能团，寡DNA可以直接吸附在碳纳米管的表面，并能够导入细胞中。端氨基二乙烯基修饰的碳纳米管通过阳离子功能基团与DNA骨架上的负电荷通过静电作用能够浓缩质粒DNA、寡DNA，并能够将质粒DNA有效导入细胞。这种功能化碳纳米管(f-CNT)/DNA复合物的基因表达是裸DNA的10倍。

聚乙烯亚胺(PEI)是最有效的非病毒基因传递载体之一，但是它的体内基因传递的毒性太高。通常，聚乙二醇(PEG)-融合的PEI和低分子量的PEI毒性低，但是转染效率也很低，相反，高分子量的PEI(22kDa或25kDa)转染效率高，毒性也很大。基于这些结果，低分子量的PEI与生物降解物质相互融合，尝试用于基因传递是否在提高转染效率，同时降解成低分子是否能够降低毒性。尽管这些可降解PEI能够降低毒性，但是转染效率仍然比PEI低。据报道PEI的高转染效率是由于它的高氨基密度的内涵体缓冲效应引起的。

基于此，文献[1]报道了氨基功能化的碳纳米管与氨基丙啶反应在碳纳米管表面聚合物生成PEI结构单元，生成聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管(PEI-g-MWCNTs)，凝胶电泳试验证实DNA被安全固定在聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管，聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管传递质粒DNA的转染效率是PEI的数倍(25kDa)，是裸DNA的四个量级。但是，由于该文献是采用PEI单元直接在碳纳米管表面聚合，仅仅通过热分析间接证明PEI在碳纳米管表面的含量为8％(PEI-g-MWCNTs/mg)左右。但是，该文献不能够证实PEI分子量的大小对转染效率和细胞毒性的影响。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种特定分子量范围的聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管及其基因或药物纳米复合物，其在特定浓度范围时，对细胞的转染效率高且细胞毒性小，本文还提供了该聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管及其基因或药物纳米复合物的制备方法和用途。

为了解决以上技术问题，本发明提供的聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管，所述的聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管结构式如下：

其中PEI的数均摩尔质量为22-600kDa。

本发明还提供了一种聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管的复合物，包括：

聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管，其结构式如下

其中聚乙烯亚胺的数均摩尔质量为22-600kDa，以及浓缩结合到聚乙烯亚胺之中的质粒DNA。

本发明还提供了一种聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管的复合物，包括聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管，其结构式如下

其中聚乙烯亚胺的数均摩尔质量为22-600kDa，以及浓缩结合到聚乙烯亚胺之中的质粒DNA，以及吸附在碳纳米管表面的阿霉素。

本发明还提供了一种聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管/质粒DNA/阿霉素纳米复合物在制备抑制肿瘤生长的药物中的应用。

本发明还提供了一种聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管/质粒DNA复合物在制备转染骨肉瘤细胞体外及动物体内的基因治疗的药物中的应用。

本发明再提供了一种聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管的制备方法，在碳纳米管的氧化切割与抛光后包括：

步骤2、PEI嫁接碳纳米管

氧化切割的碳纳米管、盐酸乙基-3-(二甲氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺放入磷酸钠缓冲溶液中，再加入超分子聚乙烯亚胺(Mn＝22-600kDa)，反应24h，反应混合物加入到10倍过量的无水乙醇中，用滤膜过滤，洗涤后得到聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管。

本发明最后提供了一种聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管与质粒DNA复合物的制备方法，在碳纳米管的氧化切割与抛光后包括：

步骤2、PEI嫁接碳纳米管

氧化切割的碳纳米管、盐酸乙基-3-(二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)放入磷酸钠缓冲溶液中，再加入超分子聚乙烯亚胺(Mn＝22-600kDa)，反应混合物加入到10倍过量的无水乙醇中，用0.22μm聚四氟乙烯滤膜过滤，洗涤后得到聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管；

步骤3、PEI-g-MWCNTs与质粒DNA复合

PEI-g-MWCNTs溶解在磷酸钠缓冲溶液中，将该缓冲溶液与质粒DNA按修饰在碳纳米管表面的PEI的氮原子数N与DNA中负电荷数P的比例范围为1～4混合，温浴，静止后，得到所述的复合物。

本发明的PEI-g-MWCNTs与质粒DNA的复合物，具有转染效率高和对细胞毒性小的优点，尤其在浓度为30μg/ml时，转染效率大于90％，细胞有效性大于80％。

具体实施方式

实例1：MWCNTs的氧化切割与抛光

原始MWCNTs(购自深圳纳米港)浸泡在6M HCl七天，依次用氢氧化钠稀溶液，去离子水洗涤并干燥，得到去金属催化剂的纯净MWCNTs。将100mg纯净MWCNTs放入3:1的80ml H₂SO₄/HNO₃混合溶液中，在40-50℃水浴中超声24h。离心分离(7000rpm，5min)，沉淀物加入去离子水稀释，通过0.22μm的聚四氟乙烯膜过滤，用去离子水充分洗涤，放入到4:1的浓50ml H₂SO₄/30％H₂O₂的混合溶液中于70℃条件下搅拌30min.，得到氧化切割与抛光的MWCNTs。

实例2：PEI嫁接MWCNTs

氧化切割的MWCNTs(20mg)、盐酸乙基-3-(二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)放入50ml磷酸钠缓冲溶液(PBS)中，在氮气保护下搅拌24h后，加入聚乙烯亚胺(Mn＝22-600kDa)，继续搅拌24h。反应混合物加入到10倍过量的无水乙醇中，用0.22μm的聚四氟乙烯膜过滤，依次用无水乙醇、去离子水淋洗，得到的PEI-g-MWCNTs在去离子水中分散性好、悬浮稳定1个月。而切割、抛光的MWCNTs在2h后沉淀。

实例3：PEI-g-MWCNTs中聚乙烯亚胺的含量

超分子PEI嫁接到MWCNTs表面的重量通过热分析(TGA)氮气气氛中获得。本发明采用的MWCNTs在600℃时稳定，PEI在500℃完全分解，MWCNTs重量损失约2.5％，而PEI-g-MWCNTs损失10.5％，嫁接的PEI的重量约为8％。PEI嫁接的MWCNTs在去离子水中悬浮稳定1个月，分散性好。而本发明的MWCNTs在2h后发生沉淀。

实例4：紫外光谱

切割、抛光的MWCNTs在250nm有紫外吸收，而PEI-g-MWCNTs在257nm有紫外吸收。

实例5：荧光光谱分析

切割、抛光的MWCNTs在500nm有弱发射峰，PEI-g-MWCNTs没有发射峰。

实例6：扫描电镜和透射电镜特征

用透射电镜(TEM)和扫描电镜试验证实PEI嫁接到MWCNTs的表面。PEI-g-MWCNTs的透射电镜图像显示嫁接的PEI在MWCNTs表面黑色斑点，而不是均匀的结合在碳纳米管的表面，，这是由于弯曲的碳纳米管表面的缺陷，氧化切割后生成不均匀的分布的羧基，嫁接的PEI也不会均匀的缠绕在MWCNTs表面。

而扫描电镜显示弯曲的MWCNTs表面缺陷多，氧化切割后形成不均匀分布的羧基，PEI在MWCNTs表面的嫁接是非均匀覆盖。

实例7：激光拉曼试验

PEI-g-MWCNTs与切割、抛光的MWCNTs的拉曼光谱类似，表明PEI-g-MWCNTs用PEI修饰后仍然保留了MWCNTs的固有特性。即：1591cm^-1的G带，1282cm^-1的D带，D带来自MWCNTs壁的碳缺陷。

实例8：PEI-g-MWCNTs的核磁共振试验

PEI-g-MWCNTs的¹HNMR光谱与PEI相比较，重水(D₂O)作溶剂，PEI-g-MWCNTs的¹H NMR光谱在＝3.1ppm是由于嫁接PEI的信号，但是PEI-g-MWCNTs信号峰宽，表明嫁接到MWNTs表面的PEI自由度降低。PEI的部分氨基被质子化(PEI的pKa大于8.0)。质子化或部分质子化的PEI促使PEI-g-MWCNTs形成稳定的悬浮液，调节pH≥9时，PEI-g-MWCNTs在5h内沉淀。

实例9：PEI-g-MWNTs/质粒DNA纳米复合物的ζ电位研究

ζ电位显示PEI-g-MWCNTs/质粒DNA纳米复合物带正电性，易于结合带负电性的细胞膜，促进细胞的胞吞作用。

实例10：PEI-g-MWCNTs/质粒DNA纳米复合物

PEI-g-MWCNTs溶解在磷酸钠缓冲溶液(pH＝7.2)中，质粒p53DNA被稀释到选择的浓度为2μg/ml，将该缓冲溶液与质粒DNA按一定比例(修饰在碳纳米管表面的PEI的氮原子数(N)与DNA中负电荷数(P)的比例范围是：1-4)混合，在50℃水浴中0.5h，静止后，用于细胞转染和检验细胞毒性。具体的，取N:P分别为1.0，1.5，2.5，4四个比值分别进行上述操作。

实例11：PEI/质粒DNA纳米复合物

将溶解在磷酸钠(PBS)缓冲溶液中PEI与质粒基因按一定的N:P比例(修饰在碳纳米管表面的PEI的氮原子数(N)与DNA中负电荷数(P)的比例范围是：1-4，在50℃水浴中0.5h，静止后，用于细胞转染和检验细胞毒性。具体的，取N:P分别为1.0，1.5，2.5，4四个比值分别进行上述操作。

实例12：PEI-g-MWCNTs/质粒DNA纳米复合物在十二烷基硫酸钠和氯化钠溶液中的稳定性

PEI-g-MWCNTs/质粒DNA纳米复合物对盐溶液的稳定性用凝胶电泳试验证明。对比研究裸质粒DNA、PEI-g-MWCNTs/质粒DNA纳米复合物的1％十二烷基硫酸钠(SDS)、PEI-g-MWCNTs/质粒DNA纳米复合物的水溶液、PEI-g-MWNTs/质粒DNA纳米复合物的0.5M氯化钠溶液、PEI-g-MWCNTs/质粒DNA纳米复合物的1M氯化钠溶液以及PEI-g-MWCNTs/质粒DNA纳米复合物的1.5M氯化钠溶液。凝胶电泳在磷酸钠缓冲溶液(20mM，pH＝7.2)中室温条件下运行，电压80V，60min。观察DNA带(UV，λ＝254nm)。结果显示PEI-g-MWCNTs/质粒DNA纳米复合物在大于1M氯化钠溶液或1％十二烷基硫酸钠溶液中稳定性差。

实例13：PEI/质粒DNA纳米复合物对Hela和293T细胞的毒性

两万个Hela细胞和293T细胞分别种植在96孔板中，孵育24h，在100μLDMEM/10％胎牛血清(FBS)溶液中PEI/质粒DNA纳米复合物的浓度为5-100μg/ml，N/P比为4，再孵育24h后除去培养介质，用100μL新鲜DMEM代替，每孔分别加入20μLMTT。在37℃，CO₂培养箱中细胞孵育4h，加入100μL二甲基亚砜溶解结晶物。通过570nm每孔吸光率测定细胞的有效性，测试细胞的存活率。具体的，如上表所示，PEI/质粒DNA纳米复合物的浓度依次为每毫升10μg、20μg、30μg、100μl，进行上述操作，存活率分别如上表所示。

实例14：PEI-g-MWCNTs/质粒DNA纳米复合物对Hela细胞的毒性

两万个Hela细胞种植在96孔板中，孵育24h，在100μLDMEM/10％胎牛血清(FBS)溶液中PEI-g-MWCNTs/质粒DNA纳米复合物的浓度分别为10-100μg/ml，N/P比为4，再孵育24h后除去培养介质，用100μL新鲜DMEM代替，每孔分别加入20μLMTT。在37℃，CO₂培养箱中细胞孵育4h，加入100μL二甲基亚砜溶解结晶物。通过570nm每孔吸光率测定细胞的有效性，测试细胞的存活率。具体的，如上表所示，取PEI-g-MWCNTs/质粒DNA纳米复合物的浓度依次为每毫升10μg、20μg、30μl、100μg，进行上述操作，存活率分别如上表所示。

实例15：PEI-g-MWCNTs对Hela和HEK293T细胞的毒性

两万个Hela和HEK 293T细胞种植在96孔板中，孵育24h，在100μLDMEM/10％胎牛血清(FBS)溶液中PEI-g-MWCNTs浓度为10-100μg/ml，再孵育24h后除去培养介质，用100μL新鲜DMEM代替，每孔分别加入20μLMTT。在37℃，CO₂培养箱中细胞孵育4h，加入100μL二甲基亚砜溶解结晶物。通过570nm每孔吸光率测定细胞的有效性，测试细胞的存活率。具体的，如上表所示，取PEI-g-MWCNTs的浓度依次为每毫升10μg、20μg、30μg、100μg进行上述操作，存活率分别如上表所示。

实例16：PEI-g-MWCNTs/质粒DNA纳米复合物的转染细胞试验

本发明使用Hela细胞和HEK 293T细胞的绿色荧光蛋白表达(JPC)定量研究转染效果。将实例10-中构建的N:P分别为1.0，1.5，2.5，4的PEI-g-MWCNTs/质粒DNA纳米复合物溶液加入到平面培养的细胞中，转染时间分别是4h。然后更换新鲜培养基，继续培养24h，在荧光显微镜下计数细胞绿色荧光蛋白表达。荧光酶标仪检测显示其转染效率分别是47％，66％，84％，95％。

实例17：PEI/质粒DNA纳米复合物的转染细胞试验

将实例11中构建的N：P分别为1.0，1.5，2.5，4的PEI/质粒DNA纳米复合物溶液加入到平面培养的细胞中，转染时间分别是4h。然后更换新鲜培养基，继续培养24h，在荧光显微镜下计数细胞绿色荧光蛋白表达。荧光酶标仪检测显示其转染效率分别是17％，22％，34％，45％。

实例18：PEI-g-MWCNTs/质粒DNA纳米复合物对小鼠肺和脊髓内鞘的体内转染

PEI-g-MWCNTs与质粒DNA的N:P比例为2.5和4，质量浓度为30μg/ml。对小鼠尾静脉注射PEI-g-MWCNTs/质粒DNA复合物，48h后处死小鼠，取小鼠肺和脊髓进行切片，在荧光显微镜下计数转染效率分别约92％和95％。

实例19：PEI-g-MWCNTs/人未甲基化寡聚脱氧核苷酸(CpG-ODN)纳米复合物对小鼠脾细胞和胰腺细胞的体外免疫活性

PEI-g-MWCNTs与CpG-ODN的N:P比例分为1.0，1.5，2.5，4.0，质量浓度为30μg/ml。对小鼠脾细胞和胰腺细胞分别用上述不同比例的PEI-g-MWCNTs/CpG-ODN复合物孵育3天，对脾细胞免疫活性分别增加25％，31％，45％，58％，对胰腺细胞免疫活性分别增加33％，37％，46％，67％。

实例20：PEI-g-MWCNTs/质粒p53DNA纳米复合物对鼠骨肉瘤细胞的体外基因治疗

PEI-g-MWCNTs与质粒p53基因的N:P比例分别为2，4，质量浓度为30μg/ml。鼠骨肉瘤细胞用PEI-g-MWCNTs/质粒p53DNA复合物孵育3天，体外基因治疗显示肿瘤增长受抑制分别为35％，43％。

实例21：PEI-g-MWCNTs/质粒p53DNA纳米复合物与阿霉素混合物转染鼠骨肉瘤细胞的体内基因治疗

PEI-g-MWCNTs与p53基因的N:P比例为2，质量浓度为30μg/ml。与质量浓度为10μg/ml的阿霉素混合。鼠骨肉瘤细胞用PEI-g-MWCNTs/p53基因复合物与阿霉素混合液孵育3天，鼠骨肉瘤细胞增长受抑制率为47％。

实例22：PEI-g-MWCNTs/质粒p53DNA纳米复合物与阿霉素混合物转染鼠骨肉瘤细胞的体内基因治疗

PEI-g-MWCNTs与p53基因的N:P比例为4，质量浓度为30μg/ml，与质量浓度为20μg/ml的阿霉素混合。鼠骨肉瘤细胞用PEI-g-MWCNTs/p53基因复合物与阿霉素混合液孵育3天，鼠骨肉瘤细胞增长受抑制率为63％。

实例23：PEI-g-MWCNTs/质粒p53DNA/阿霉素纳米复合物转染鼠骨肉瘤细胞的体外基因治疗

PEI-g-MWCNTs与p53基因的N:P比例分别为2和4，阿霉素吸附在PEI-g-MWCNTs/p53基因复合物上的分子数为6×10¹⁶个，质量浓度为30μg/ml。鼠骨肉瘤细胞用PEI-g-MWCNTs/p53基因复合物孵育3天，鼠体内实验显示肿瘤增长受抑制分别为55％和70％。

结论及分析

PEI嫁接到MWCNTs含量在8％左右；PEI在MWCNTs表面的局域分布是由于碳纳米管表面的羧基不均匀分布的结果；PEI-g-MWCNTs浓缩质粒DNA的复合物的形貌特征是质粒DNA被PEI-g-MWCNTs中的PEI浓缩，在MWCNTs表面形成纳米颗粒；PEI-g-MWCNTs/质粒DNA复合物在十二烷基硫酸钠中不稳定，在高浓度氯化钠溶液中不稳定，在去离子水或磷酸钠缓冲溶液中稳定；PEI-g-MWCNTs/质粒DNA复合物对细胞的绿色荧光蛋白表达结果显示转染效率大于95％(细胞为Hela细胞，HEK293T细胞，293T细胞，K562细胞)。体内试验显示转染效率也高于90％，其转染效率比裸DNA大4个量级，比单独PEI高20倍。本发明的效果显示PEI-g-MWCNTs/质粒DNA复合物对上述细胞的有效性大于80％，比单独PEI对细胞的有效性高4-5倍。人未甲基化寡聚脱氧核苷酸(CpG-ODN)是对人体具有免疫活性的核酸，但是，对人体直接注射CpG-ODN的免疫效果很差。本发明利用PEI-g-MWCNTs与CpG-ODN构成PEI-g-MWCNTs/CpG-ODN纳米复合物有利于保护CpG-ODN在细胞酸性环境中的稳定性，提高其利用度，实验表明，PEI-g-MWCNTs/CpG-ODN纳米复合物对脾细胞免疫活性最高为58％，对胰腺细胞免疫活性最高为67％。

上述PEI，MWCNTs，PEI-g-MWCNTs/质粒p53DNA纳米复合物细胞毒性结果表明，MWCNTs没有细胞毒性，PEI600K毒性很高。PEI-g-MWCNTs/质粒p53DNA纳米复合物转染鼠骨肉瘤细胞的体外抑制率最高为43％。PEI-g-MWCNTs/质粒p53DNA纳米复合物与阿霉素混合物对鼠骨肉瘤细胞的体内抑制率最高为63％。PEI-g-MWCNTs/质粒p53DNA/阿霉素纳米复合物转染鼠骨肉瘤细胞的体外基因治疗效率最高为70％。(1)Y.Liu，D.C.Wu，W.D.Zhang，X.Jiang，C.B.He，T.S.Chung，S.H.Goh，and K.W.Leong，聚乙烯亚胺嫁接的多壁碳纳米管用于非共价键固定和有效传递DNA，Angew.Chem.Int.Ed.，2005，44，4782-4785。

Claims

1、一种聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管，所述的聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管结构式如下：

其特征在于，其中聚乙烯亚胺的数均摩尔质量为22-600kDa。

2、一种聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管的复合物，包括：

聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管，其结构式如下

3、根据权利要求2所述的聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管的复合物，其特征在于，所述的质粒DNA包括：P53DNA，绿色荧光蛋白表达，以及人未甲基化寡聚脱氧核苷酸质粒DNA。

4、根据权利要求3所述的聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管的复合物，其特征在于，所述的碳纳米管表面的PEI的氮原子数(N)与所述的质粒p53DNA中负电荷数(P)的比值范围为1-4，在磷酸钠缓冲溶液中的质量浓度为10-100μg/ml。

5、根据权利要求4所述的聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管的复合物，其特征在于，所述的碳纳米管表面的PEI的氮原子数(N)与所述的质粒p53DNA中负电荷数(P)的比值为1.0，1.5，2.5，4，所述的磷酸钠缓冲溶液中的质量浓度为30μg/ml。

6、根据权利要求3所述的聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管的复合物，其特征在于，所述的聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管表面的PEI的氮原子数(N)与人未甲基化寡聚脱氧核苷酸质粒DNA中负电荷数(P)的比值范围为1-4，在磷酸钠缓冲溶液中的质量浓度为10-100μg/ml。

7、根据权利要求6所述的聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管的复合物，其特征在于，所述的聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管表面的PEI的氮原子数(N)与人未甲基化寡聚脱氧核苷酸质粒DNA中负电荷数(P)的比值为1.0，1.5，2.5，4，所述的磷酸钠缓冲溶液中的质量浓度为30μg/ml。

8、根据权利要求2所述的碳纳米管的复合物在制备转染骨肉瘤细胞体外及动物体内的基因治疗的药物中的应用。

9、根据权利要求2或3所述的聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管的复合物，其特征在于，在碳纳米管表面吸附阿霉素后构成聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管/质粒DNA/阿霉素的复合物。

10、根据权利要求9所述的聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管/质粒DNA/阿霉素纳米复合物在制备抑制肿瘤生长的药物中的应用。

11、一种聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管的制备方法，其特征在于，在步骤1的碳纳米管的氧化切割与抛光之后包括：

步骤2、PEI嫁接碳纳米管

氧化切割的碳纳米管、盐酸乙基-3-(二甲氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺放入磷酸钠缓冲溶液中，再加入分子量为22-600kDa的超分子聚乙烯亚胺，反应24h，反应混合物加入到10倍过量的无水乙醇中，用滤膜过滤，洗涤后得到聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管。

12、根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，步骤2中所述的过滤用0.22μm聚四氟乙烯滤膜来完成。

13、一种聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管与质粒DNA的复合方法，其特征在于，在步骤1的碳纳米管的氧化切割与抛光后包括：

步骤2、PEI嫁接碳纳米管

氧化切割的碳纳米管、盐酸乙基-3-(二甲氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺放入磷酸钠缓冲溶液中，再加入分子量为22-600kDa超分子聚乙烯亚胺，反应混合物加入到10倍过量的无水乙醇中，用0.22μm聚四氟乙烯滤膜过滤，洗涤后得到聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管；

步骤3、聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管与质粒DNA复合

聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管溶解在磷酸钠缓冲溶液中，质粒DNA被稀释到选择的浓度为2μg/ml，将该缓冲溶液与质粒DNA按修饰在碳纳米管表面的PEI的氮原子数(N)与DNA中负电荷数(P)的比例范围为1～4混合，温浴，静止后，得到所述的复合物。

14、根据权利要求13的一种聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管与质粒DNA的复合方法，其特征在于，在步骤3中的所述的PEI的氮原子数(N)与DNA中负电荷数(P)的比值为1.0或1.5或2.5或4。