CN103725713B - 聚乙二醇化壳聚糖在作为核酸载体中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种聚乙二醇化壳聚糖的新用途。本发明所提供的聚乙二醇化壳聚糖的新用途，具体为如式Ⅰ所示的聚乙二醇化壳聚糖在制备或作为核酸载体中的应用,所述式Ⅰ中，n为10-20的整数，x为3-7的整数，y为2-10的整数。本发明的聚乙二醇化壳聚糖核酸载体以聚乙二醇作为配基链，不仅增强了壳聚糖的生物相容性，而且有利于载体与细胞的融合，具有毒性低、转染效率高的特点，可以作为体内外的转染试剂使用，进而用于相关疾病的基因治疗。

Description

聚乙二醇化壳聚糖在作为核酸载体中的应用
技术领域
本发明涉及一种聚乙二醇化壳聚糖的新用途，特别涉及O-羟乙基壳聚糖体在作为核酸载体中的应用。
背景技术
基因治疗是指运用DNA技术来实现治疗人类疾病的一种治疗方法。近年来，基因治疗的发展使得一些遗传性疾病或癌症的治愈成为可能。目前，应用最为广泛的用于基因治疗的载体就是病毒载体，如逆转录病毒，腺病毒，痘苗病毒等。但这些病毒类载体在临床应用中存在着很大的安全隐患。因此，寻找安全、有效、无免疫原性的非病毒类载体就成为目前关注的热点之一。
非病毒载体主要分为阳离子聚合物和阳离子脂质体两大类。阳离子聚合物具有如下优点：（1）提供与DNA自组装的动力，有利于保护DNA免受降解；（2）压缩DNA成为比DNA体积小的复合物颗粒，有利于进入细胞；（3）使复合物颗粒之间产生静电排斥作用，稳定复合物；（4）与细胞膜产生静电吸附作用，促进复合物内吞。尽管已有阳离子聚合物聚乙烯亚胺（PEI）应用于体内外转染的应用出现，但是PEI与DNA所形成的复合物由于带有过剩的正电荷，会给细胞带来急性及延迟的毒副作用，而且该转染试剂的转染效率也不够高，这些缺点大大影响了其在临床上的应用。
为解决上述问题，急需一种在转染效率、细胞毒性方面均有改进的非病毒类转染载体的出现。
发明内容
本发明的目的是提供一种聚乙二醇化壳聚糖的新用途。
本发明所提供的聚乙二醇化壳聚糖的新用途，具体为如式Ⅰ所示的聚乙二醇化壳聚糖在制备核酸载体中的应用，
式Ⅰ
所述式Ⅰ中，n为10-20的整数，x为3-7的整数，y为2-10的整数。
当然，如所述式Ⅰ所示的聚乙二醇化壳聚糖在作为核酸载体中的应用也属于本发明的保护范围。
在上述两应用中，所述载体运载所述核酸进入宿主细胞。
本发明的另一个目的是提供一种体外转染细胞的方法。
本发明所提供的体外转染细胞的方法具体可包括如下步骤：
（1）将如所述式Ⅰ所示的聚乙二醇化壳聚糖与待转染核酸按照质量比为0.1-100：1的比例混合形成复合物；
（2）将步骤（1）所得的复合物导入目的细胞。
在上述方法中，所述细胞具体为动物来源的细胞，当然也包括人来源的细胞。在本发明的一个实施例中，所述细胞具体为HEK293细胞（人胚肾细胞）、NIH3T3细胞（小鼠胚胎成纤维细胞）和HeLa细胞（人宫颈癌细胞）。
如所述式Ⅰ所示的聚乙二醇化壳聚糖与核酸所形成的复合物在制备治疗相应疾病的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述相应疾病为用所述核酸进行基因治疗的疾病；所述复合物中，所述聚乙二醇化壳聚糖与所述核酸的质量比为0.1-100：1（如10：1）。
所述聚乙二醇化壳聚糖与核酸所形成的复合物的制备方法也属于本发明的保护范围。
该方法可包括将所述如式Ⅰ所示的聚乙二醇化壳聚糖与核酸按照质量比为0.1-100：1（如10：1）的比例混合后并孵育的步骤。
在上述各应用及方法中，所述式Ⅰ中，x均具体可为5，y均具体可为5，n均具体可为8。
在上述所述聚乙二醇化壳聚糖与核酸所形成的复合物的制备方法中，所述孵育的温度可为20-25℃，所述孵育的时间可为10-30分钟
具体的，所述复合物均可按照包括如下步骤的方法制备：
（1）将所述如式Ⅰ所示的聚乙二醇化壳聚糖的水溶液用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤，获得无菌的聚乙二醇化壳聚糖水溶液；
（2）将步骤（1）获得的聚乙二醇化壳聚糖水溶液与无菌的核酸水溶液，按照所述聚乙二醇化壳聚糖与所述核酸的质量比为0.1-100：1的比例混合，获得混合溶液；
（3）将步骤（2）所得的混合溶液置于20-25℃孵育10-30分钟，获得所述如式Ⅰ所示的聚乙二醇化壳聚糖与核酸所形成的复合物。
在本发明的一个实施例中，步骤（2）中所述聚乙二醇化壳聚糖与所述核酸的质量比具体为10：1；步骤（3）中进行孵育的具体温度为室温（25℃），孵育的具体时间为10分钟。
由上述方法制备得到的所述复合物也属于本发明的保护范围。
所述如式Ⅰ所示的聚乙二醇化壳聚糖与核酸所形成的复合物的颗粒直径为20-100nm，表面电位为+5mV至+60mV。
在转染过程中，表面带正电的所述复合物与细胞表面带负电的蛋白多糖相互作用，并通过内吞作用进入细胞。
在本发明中，上述所有核酸均既可为DNA，也可为RNA，包括治病基因、携带有外源目的基因的重组质粒、小干扰RNA等。在本发明的一个实施例中，所述核酸具体为质粒DNA。
本发明的聚乙二醇化壳聚糖作为核酸载体，以聚乙二醇作为配基链，不仅增强了壳聚糖的生物相容性，而且有利于载体与细胞的融合，具有毒性低、转染效率高的特点，可以作为体内外的转染试剂使用，进而用于相关疾病的基因治疗。
附图说明
图1为聚乙二醇化壳聚糖（羟乙基化壳聚糖）与壳聚糖的红外光谱和核磁谱图。其中，A为红外光谱；B为核磁谱图。B中，a为壳聚糖；b为羟乙基化壳聚糖。
图2为聚乙二醇化壳聚糖核酸载体对Hela细胞的细胞毒性检测结果（MTT法）。
图3为聚乙二醇化壳聚糖/质粒DNA复合物颗粒对Hela细胞的转染效率结果。其中，A为荧光图；B为A和C的叠加图；C为明场图。
图4为聚乙二醇化壳聚糖/质粒DNA复合物颗粒对HEK293细胞的转染效率结果。其中，A为荧光图；B为A和C的叠加图；C为明场图。
图5为聚乙二醇化壳聚糖/质粒DNA复合物颗粒对NIH3T3细胞的转染效率结果。其中，A为荧光图；B为A和C的叠加图；C为明场图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
HeLa细胞：中国协和医科大学基础医学研究所。
HEK293细胞：中国协和医科大学基础医学研究所。
NIH3T3细胞：中国协和医科大学基础医学研究所。
质粒pEGFP-C1：BiovectorInc。
实施例1、聚乙二醇化壳聚糖的制备及鉴定
一、聚乙二醇化壳聚糖的制备
取1.5g壳聚糖，溶于150ml（pH=2）乙酸水溶液，搅拌至完全溶解，将壳聚糖乙酸水溶液转移至三口烧瓶中，加入高硼酸钠0.12g，控温60℃，高速搅拌，反应5h后，加氢氧化钠溶液调整反应体系pH值至11，控温4～5℃，将10ml环氧乙烷分多次加入反应体系，继续控温60℃，1400r/min搅拌反应70h，得20-40nm的高水溶性O-羟乙基壳聚糖自组装纳米颗粒。将高水溶性O-羟乙基壳聚糖自组装纳米颗粒溶液于透析袋内，搅拌透析12h；冷冻干燥后得O-羟乙基壳聚糖固体粉末。
二、聚乙二醇化壳聚糖的鉴定
1、红外光谱检测
将步骤一获得的O-羟乙基壳聚糖固体粉末样品和作为对照的壳聚糖样品通过KBr压片法制得薄片，用傅立叶变换红外光谱仪（BrukerTensor27）测定其红外光谱。
聚乙二醇化壳聚糖（羟乙基化壳聚糖）与壳聚糖的红外光谱如图1中A所示，与对照相比，修饰后的壳聚糖其在2929cm-1左右的CH2伸缩振动峰，以及1060cm-1左右的C-O-C伸缩振动峰出现了明显的增强，这说明PEG链已经连接到了壳聚糖纳米颗粒的表面。
2、核磁及凝胶渗透色谱法检测
通过凝胶渗透色谱法检测修饰前的壳聚糖平均分子量为3488（n=8）。PEG修饰后通过核磁对比其在CH2的峰面积，可以看出CH2的峰面积有了明显的增加，根据核磁图谱计算得出x=y=5（如图1中B）。以上结果显示聚乙二醇已经修饰到了壳聚糖的表面，且产物中x=5，y=5，n=8。
实施例2、聚乙二醇化壳聚糖/质粒DNA复合物颗粒的制备
聚乙二醇化壳聚糖/质粒DNA复合物颗粒的制备过程如下：
（1）取实施例1制备得到的聚乙二醇化壳聚糖核酸载体（O-羟乙基壳聚糖自组装纳米颗粒），加水溶解，配制成浓度为2mg/mL的水溶液，用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，获得均一化且无菌的聚乙二醇化壳聚糖水溶液，待用。
（2）取质粒pEGFP-C1，用水配制成浓度为0.2mg/mL的水溶液。取步骤（1）配制的聚乙二醇化壳聚糖水溶液和质粒DNA水溶液等体积混合得到质量比为10：1的转染复合物载体溶液。
（3）将步骤（2）获得的转染复合物载体溶液置于室温（25℃）下，孵育10min后，获得聚乙二醇化壳聚糖/质粒DNA复合物颗粒，进行下一步转染实验。
其中，质粒可根据实际需要，选择不同的质粒。
所得聚乙二醇化壳聚糖/质粒DNA复合物颗粒的直径为20-100nm，Zeta电位分析表明壳聚糖/质粒DNA复合物颗粒表面电位为+5mV至+60mV。
实施例3、实施例1制备的聚乙二醇化壳聚糖的细胞毒性检测
采用MTT法对实施例1制备的聚乙二醇化壳聚糖载体进行细胞毒性检测，检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT（黄色染料）还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。具体操作如下：
将密度为1.0x105个/ml的HeLa细胞悬液接种于96孔培养板，每孔100μl，贴壁12h后，弃掉旧培养液，每孔加入100μl含有不同浓度（0、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0mg/ml）实施例1制备的聚乙二醇化壳聚糖载体的DMEM完全培养基，其中浓度为0的组作为对照组，另外五个浓度非0的组为实验组。5%CO2，37℃孵育24-72小时，倒置显微镜下观察细胞形态。每孔加入20μl浓度为5mg/ml的MTT溶液；孵育4h后，弃掉细胞培养液，每孔加入150μlDMSO溶解甲臜颗粒。同时设置空白组，即在无Hela细胞的孔内加入DMEM、MTT和DMSO，其加入量和加入时间同其他组。各组加入DMSO后于摇床上振荡10min后，用酶标仪测定各孔在490nm处的吸收值。根据如下公式计算细胞存活率。实验共设3个重复，每个重复中，每个聚乙二醇化壳聚糖载体处理浓度共设8个孔，结果取3次重复的平均值。
细胞存活率=（实验组OD-空白组OD）/（对照组OD-空白组OD）
结果如图2和表1所示，随着聚乙二醇化壳聚糖载体浓度的增大，Hela细胞的存活率呈现略微下降的趋势，但是，即便是聚乙二醇化壳聚糖载体处理浓度最大（2.0mg/ml）时，Hela细胞的存活率仍高于80%。
表1经聚乙二醇化壳聚糖作用后Hela细胞存活率的检测结果
实施例4、实施例1制备的聚乙二醇化壳聚糖的体外转染实验
1、HeLa细胞的培养
用含有10%(v/v)小牛血清的DMEM培养液培养HeLa细胞，置于5%CO2，37℃培养箱中连续培养，取对数生长期细胞，胰酶消化后用DMEM培养液稀释，按每孔4×105细胞的密度接种于6孔板中，培养箱中预培养24小时。
2、体外转染
转染前24h内，将HeLa细胞按4×105/孔接种于6孔培养板中，置于5%CO2、37℃培养箱中培养至80-90%融合，转染时，吸弃培养液，PBS洗涤两次，每孔加入1μl实施例2制备好的聚乙二醇化壳聚糖/质粒DNA复合物颗粒，以无血清的DMEM培养基稀释至0.5mL，混匀后继续培养48h。
3、体外转染效率检测
取出培养板，吸去培养液，PBS洗涤2次，采用荧光显微镜进行荧光测试，得其荧光强度，并计算转染效率。转染效率=（表达绿色荧光蛋白的细胞数/细胞总数）×100%。其中，表达绿色荧光蛋白（GFP）的细胞即为荧光显微镜下观察到绿色荧光的细胞。实验重复三次，结果取平均值。
结果如图3和表2所示，聚乙二醇化壳聚糖/质粒DNA复合物颗粒对Hela细胞的转染效率达65.4%。
表2聚乙二醇化壳聚糖/质粒DNA复合物颗粒对Hela细胞转染效率的检测结果
重复1 重复2 重复3 平均值
Hela细胞 0.6596 0.6248 0.6789 65.4%
实施例5、聚乙二醇化壳聚糖/质粒DNA复合物颗粒对不同细胞的体外转染效率
HEK293细胞和NIH3T3细胞的培养同实施例4中HeLa细胞的培养方法。按照实施例4中的转染方法和检测方法，采用聚乙二醇化壳聚糖/质粒DNA复合物颗粒，对HEK293细胞和NIH3T3细胞进行体外转染。
结果如表3所示，聚乙二醇化壳聚糖/质粒DNA复合物颗粒对HEK293细胞（图4）和NIH3T3细胞（图5）的转染效率分别达到43.9%和57.6%。
表3聚乙二醇化壳聚糖/质粒DNA复合物颗粒对HEK293细胞和NIH3T3转染效率的检测结果
重复1 重复2 重复3 平均值
HEK293细胞 0.4229 0.4544 0.4398 43.9%
NIH3T3细胞 0.5549 0.6024 0.5698 57.6%

Claims (9)

1.如式Ⅰ所示的聚乙二醇化壳聚糖在制备核酸载体中的应用，
所述式Ⅰ中，x为5，y为5，n为8。
2.如式Ⅰ所示的聚乙二醇化壳聚糖在作为核酸载体中的应用，
所述式Ⅰ中，x为5，y为5，n为8。
3.一种体外转染细胞的方法，包括如下步骤：
(1)将如式Ⅰ所示的聚乙二醇化壳聚糖与核酸按照质量比为0.1-100：1的比例混合形成复合物；
(2)将步骤(1)所得的复合物导入目的细胞；
所述式Ⅰ中，x为5，y为5，n为8。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述细胞为动物来源的细胞。
5.如式Ⅰ所示的聚乙二醇化壳聚糖与核酸所形成的复合物在制备治疗相应疾病的产品中的应用；所述相应疾病为用所述核酸进行基因治疗的疾病；所述复合物中，所述聚乙二醇化壳聚糖与所述核酸的质量比为0.1-100：1；
所述式Ⅰ中，x为5，y为5，n为8。
6.聚乙二醇化壳聚糖与核酸所形成的复合物的制备方法，包括将式Ⅰ所示的聚乙二醇化壳聚糖与核酸按照质量比为0.1-100：1的比例混合后并孵育的步骤，
所述式Ⅰ中，x为5，y为5，n为8。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述孵育的温度为20-25℃，所述孵育的时间为10-30分钟。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述复合物按照包括如下步骤的方法制备：
(1)将所述聚乙二醇化壳聚糖的水溶液用孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤，获得无菌的聚乙二醇化壳聚糖水溶液；
(2)将步骤(1)获得的聚乙二醇化壳聚糖水溶液与无菌的核酸水溶液，按照所述聚乙二醇化壳聚糖与所述核酸的质量比为0.1-100：1的比例混合，获得混合溶液；
(3)将步骤(2)所得的混合溶液置于20-25℃孵育10-30分钟，获得所述聚乙二醇化壳聚糖与核酸所形成的复合物。
9.由权利要求6-8中任一所述的方法制备得到的聚乙二醇化壳聚糖与核酸所形成的复合物。
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