CN111789961B - 一种用于核仁素交联诱导肿瘤细胞凋亡的纳米探针及其制备方法和应用 - Google Patents

一种用于核仁素交联诱导肿瘤细胞凋亡的纳米探针及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于核仁素交联诱导肿瘤细胞凋亡的纳米探针及其制备方法和应用，属于生物技术领域。该纳米探针以乙二醇壳聚糖作为高分子骨架，高分子骨架上接枝胆固醇和A链，A链的5′端修饰有羧基，3′端修饰有染料Cy3，且含有核酸适配体AS1411基因序列，A链与5′端修饰有BHQ2的B链部分杂交。该纳米探针能选择性杀伤核仁素过表达的肿瘤细胞，而对正常细胞影响较小，有望成为一种治疗恶性肿瘤的手段，且为受体交联诱导细胞凋亡思路提供新的可供选择的受体。该纳米探针合成及分离纯化简单，适合扩大化生产。

Description

一种用于核仁素交联诱导肿瘤细胞凋亡的纳米探针及其制备 方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于核仁素交联诱导肿瘤细胞凋亡的纳米探针及其制备方法和应用。
背景技术
恶性肿瘤(癌症)已经成为严重威胁人类健康的主要公共卫生问题之一。虽然现代医疗技术和诊断方法已发展到一定水平，但由于肿瘤生长快、易转移，其发病率和死亡率仍然居高不下，严重威胁患者的健康乃至生命。长期以来，开发新型癌症治疗方法，在不伤害正常组织的情况下有效杀死肿瘤细胞一直都是研究者的目标。
细胞信号传导是生物学系统中非常重要的过程，能通过各种信号分子网络结构交换信息，实现对细胞内外活动的控制。自主装纳米材料能通过模拟免疫效应，细胞交叉连接靶细胞表面受体触发细胞事件，进而诱导细胞凋亡。利用外部因素诱导细胞表面受体相互交联，重建肿瘤细胞的凋亡信号传递系统，触发肿瘤细胞凋亡，可以为癌症治疗提供一种新型有力的手段，对生物医学的发展具有一定的推动作用。例如，通过增强B淋巴瘤中CD20的交联而提高抗癌药物利妥昔单抗的疗效，或者通过磁场作用使其与DLD-1结肠癌细胞死亡受体4(DR4)交联促进细胞凋亡信号通路，以及利用大环分子化合物诱导微管蛋白在细胞环境中交联，从而进一步促进细胞凋亡和提升抗肿瘤效果等。
目前，基于细胞膜受体交联诱导肿瘤细胞凋亡的研究主要存在两个问题：(1)研究的细胞膜受体种类较单一，且不是肿瘤细胞表面特异性表达的受体，无法实现选择性诱导肿瘤细胞凋亡；(2)由于细胞膜的翻转、内在化以及酶降解等，可能引起探针被降解或內吞等，稳定性较差。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种用于核仁素交联诱导肿瘤细胞凋亡的纳米探针；目的之二在于提供一种用于核仁素交联诱导肿瘤细胞凋亡的纳米探针的制备方法；目的之三在于提供一种用于核仁素交联诱导肿瘤细胞凋亡的纳米探针在制备治疗肿瘤细胞药物中的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、一种用于核仁素交联诱导肿瘤细胞凋亡的纳米探针，所述纳米探针以乙二醇壳聚糖作为高分子骨架，所述高分子骨架上接枝胆固醇和A链，所述A链的5′端修饰有羧基，3′端修饰有染料Cy3，且含有核酸适配体AS1411基因序列，所述A链与5′端修饰有BHQ2的B链部分杂交。
优选地，所述A链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述B链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2、所述的一种用于核仁素交联诱导肿瘤细胞凋亡的纳米探针的制备方法，所述方法如下：
(1)将乙二醇壳聚糖和琥珀酰亚胺酯-聚乙二醇-胆固醇分别溶解于PBS缓冲液中，将两种溶液混合后室温下搅拌反应，最后经透析、冻干，制得乙二醇壳聚糖-胆固醇化合物；
(2)将步骤(1)中制得的乙二醇壳聚糖-胆固醇化合物和A链分别溶于PBS缓冲液中，将两种溶液混合后室温下搅拌反应，所述反应结束后加入溶解有B链的PBS缓冲液，室温下继续搅拌反应，最后经透析、冻干，制得用于核仁素交联诱导肿瘤细胞凋亡的纳米探针。
优选地，步骤(1)中，所述乙二醇壳聚糖-胆固醇化合物中胆固醇的质量分数为30％。
优选地，步骤(2)中，所述乙二醇壳聚糖-胆固醇化合物和A链质量摩尔比为100:0.001-0.1，mg:μmol。
优选地，步骤(2)中，所述A链和B链的摩尔比为1:1。
优选地，步骤(2)中，所述搅拌反应的时间为12-14h，所述继续搅拌反应的时间为1-2h。
优选地，步骤(1)和步骤(2)中PBS缓冲液的浓度为0.0067M，pH为7.2-7.4。
优选地，步骤(1)中，所述透析具体为将最终反应液移至截留分子量为8-14KD的透析袋中，于去离子水中透析2-3天；步骤(2)中，所述透析具体为将最终反应液移至截留分子量为20KD的透析袋中，于去离子水中透析2-3天。
3、所述的一种用于核仁素交联诱导肿瘤细胞凋亡的纳米探针在制备治疗肿瘤细胞药物中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种用于核仁素交联诱导肿瘤细胞凋亡的纳米探针及其制备方法和应用，本发明中以乙二醇壳聚糖作为骨架，在其上同时接枝胆固醇和5′端修饰有羧基，3′端修饰有染料Cy3，且含有核酸适配体AS1411基因序列的A链，并且为了降低非特异性吸附细胞膜带来的背景，将A链与5′端修饰有BHQ2的B链部分杂交，根据福斯特共振能量转移(
Figure BDA0002651302880000021
resonance energy transfer，FRET)原理，此时A链上修饰的染料Cy3被BHQ2猝灭，当A链与核仁素结合，释放B链，Cy3荧光恢复。该纳米探针上接枝了胆固醇，形成“多足”结构，在与细胞接触后，胆固醇通过疏水作用插入到细胞膜上，同时A链与核仁素结合，释放B链，Cy3荧光恢复，并且借助整个纳米探针的分子骨架将核仁素拉近，该纳米探针能通过胆固醇锚定作用抑制细胞的内吞作用，能够长时间锚定在细胞膜上使核仁素形成交联状态，由此发生由核仁素交联诱导细胞凋亡的过程(如图1所示)。该纳米探针能选择性杀伤核仁素过表达的肿瘤细胞，而对正常细胞影响较小，有望成为一种治疗恶性肿瘤的手段，且为受体交联诱导细胞凋亡思路提供新的可供选择的受体。该纳米探针合成及分离纯化简单，适合扩大化生产。
本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：
图1为本发明中用于核仁素交联诱导肿瘤细胞凋亡的纳米探针设计原理图；
图2为实施例1中制备的纳米探针(GC-chol-apt-cDNA)、单独的乙二醇壳聚糖(GC)、乙二醇壳聚糖-胆固醇复合物(GC-chol)和A链(apt)的凝胶电泳图；
图3为A链未部分杂交5′端修饰有BHQ2的互补链的纳米探针(GC-chol-apt)、实施例1中制备的纳米探针(GC-chol-apt-cDNA)的荧光光谱图；
图4为实施例1中制备的纳米探针(GC-chol-apt-cDNA)的AFM图；
图5为实施例1中制备的纳米探针(GC-chol-apt-cDNA)与HEp-2细胞(人喉癌上皮细胞)孵育后的荧光共聚焦成像图；
图6为A链(apt)、实施例1中制备的纳米探针(GC-chol-apt-cDNA)与HEp-2细胞(人喉癌上皮细胞)孵育不同时间的荧光共聚焦成像图；
图7为实施例1中制备的纳米探针(GC-chol-apt-cDNA)对A549(人非小细胞肺癌细胞)、MCF-7(人乳腺癌细胞)、Hela(宫颈癌细胞)和HEp-2(人喉癌上皮细胞)四种肿瘤细胞的凋亡作用测试结果图；
图8为实施例1中制备的纳米探针(GC-chol-apt-cDNA)对HEp-2细胞(人喉癌上皮细胞)凋亡定量检测结果图；
图9为实施例1中制备的纳米探针(GC-chol-apt-cDNA)诱导HEp-2细胞(人喉癌上皮细胞)凋亡后期细胞核结构变化测试结果图；
图10为实施例1中制备的纳米探针(GC-chol-apt-cDNA)对HEp-2细胞(人喉癌上皮细胞)和16HBE(人正常支气管上皮细胞)杀伤作用测试结果图；
图11为以不同浓度A链(apt)合成的GC-chol-apt-cDNA对肿瘤细胞杀伤作用测试结果图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
实施例1
制备用于核仁素交联诱导肿瘤细胞凋亡的纳米探针
(1)将乙二醇壳聚糖(GC)和琥珀酰亚胺酯-聚乙二醇-胆固醇(chol，购于美国NANOCS公司)分别溶解于浓度为0.0067M，pH为7.4的PBS缓冲液中，获得浓度为1.34mg/mL的乙二醇壳聚糖溶液和浓度为5.00mg/mL的琥珀酰亚胺酯-聚乙二醇-胆固醇溶液，将两种溶液等体积混合后室温下搅拌反应4h，将最终反应液移至截留分子量为10KD的透析袋中，于去离子水中透析3天，冻干后制得乙二醇壳聚糖-胆固醇化合物，该化合物中胆固醇的质量分数为30％；
(2)将步骤(1)中制得的乙二醇壳聚糖-胆固醇化合物和A链(apt，5′-COOH-tttttttttttttttttggtggtggtggttgtggtggtggtggtgtcgctt-3′-Cy3)分别溶于浓度为0.0067M，pH为7.4的PBS缓冲液中，获得浓度为1mg/mL的乙二醇壳聚糖-胆固醇化合物溶液和浓度为10μM/L的A链溶液，将乙二醇壳聚糖-胆固醇化合物溶液和A链溶液按体积比100:1混合后室温下搅拌反应12h，反应结束后按A链和B链(cDNA，5′-BHQ2-aagcgacacca-3′)的摩尔比为1:1加入溶解有B链的浓度为0.0067M，pH为7.4的PBS缓冲液，室温下继续搅拌反应1h，将最终反应液移至截留分子量为20KD的透析袋中，于去离子水中透析2天，冻干后制得用于核仁素交联诱导肿瘤细胞凋亡的纳米探针(GC-chol-apt-cDNA)。
以单独的乙二醇壳聚糖(GC)、乙二醇壳聚糖-胆固醇复合物(GC-chol)和A链(apt)作为对照，利用2％的聚丙烯酰胺凝胶电泳对实施例1中制备的纳米探针(GC-chol-apt-cDNA)进行验证，结果如图2所示，图2中，条带1-5分别为DNA marker、单独的乙二醇壳聚糖(GC)、乙二醇壳聚糖-胆固醇复合物(GC-chol)、A链(apt)和纳米探针(GC-chol-apt-cDNA)，由图2可知，GC-chol-apt-cDNA的条带相对于单独的apt条带，存在着明显的滞后，表明GC-chol-apt-cDNA已成功合成。
以A链未部分杂交5′端修饰有BHQ2的互补链的纳米探针(GC-chol-apt)作为对照，利用荧光光谱对实施例1中制备的纳米探针(GC-chol-apt-cDNA)进行验证，结果如图3所示，A链与5′端修饰有BHQ2的互补链部分杂交后，Cy3荧光强度得到明显减弱，表明B链成功连接到GC-chol-apt上，形成了GC-chol-apt-cDNA。
图4为实施例1中制备的纳米探针(GC-chol-apt-cDNA)的AFM图，由图4可知，该纳米探针粒径在300nm左右。
实施例2
将HEp-2细胞(人喉癌上皮细胞)接种在成像培养皿中(1×104个/孔)，在37℃和5％CO2的条件下培养24h，然后吸出培养基，用PBS缓冲液清洗3遍，再加入浓度为60μg/mL的实施例1中GC-chol-apt-cDNA溶液，37℃下孵育2h。孵育结束后，用PBS清洗掉未结合的GC-chol-apt-cDNA，再加入DiO细胞膜染料(5μM)，37℃下孵育25min，孵育结束后，用PBS清洗掉未结合的DiO细胞膜染料，并使用共聚焦荧光显微镜(Olympus IX-81)对荧光信号进行采集。结果如图5所示，GC-chol-apt-cDNA与HEp-2细胞作用后，出现了Cy3的红色荧光，并与Dio细胞膜染料具有较高位置共定位现象，表明GC-chol-apt-cDNA能特异性与肿瘤细胞膜表面核仁素结合并锚定在细胞膜上。
实施例3
验证GC-chol-apt-cDNA调控核仁素交联并锚定在细胞膜上的能力
将HEp-2细胞(人喉癌上皮细胞)接种在成像培养皿中(1×104个/孔)，在37℃和5％CO2的条件下培养24h，然后吸出培养基，用PBS缓冲液清洗3遍，再分别加入浓度为60nM的apt溶液和浓度60μg/mL的实施例1中GC-chol-apt-cDNA溶液，37℃下孵育0、0.5、2、4、6h。孵育结束后，用PBS清洗掉未结合的apt和GC-chol-apt-cDNA，并使用共聚焦荧光显微镜(Olympus IX-81)对荧光信号进行采集。结果如图6所示，GC-chol-apt-cDNA可以在膜上停留长达6h，而单独的Cy3标记的A链(apt)在0.5h后就进入到细胞内。
实施例4
验证GC-chol-apt-cDNA对多种肿瘤细胞的杀伤作用
将密度为1×105个/mL的A549(人非小细胞肺癌细胞)、MCF-7(人乳腺癌细胞)、Hela(宫颈癌细胞)和HEp-2(人喉癌上皮细胞)四种肿瘤细胞接种到96孔细胞培养板中(1×104个/孔)，在37℃和5％CO2的条件下培养24h。然后吸出培养基，用PBS缓冲液清洗3遍，再分别加入浓度为0、20、40、60、80、100μg/mL实施例1中制备的GC-chol-apt-cDNA溶液，于培养箱再次孵育24h后，用PBS缓冲液清洗3遍，再用CCK-8试剂显色并测定其吸光度，并进一步计算其细胞毒性。结果如图7所示，GC-chol-apt-cDNA对上述几种肿瘤细胞都有一定程度的杀伤作用，总体呈现出以浓度依耐性方式诱导细胞凋亡，其中，HEp-2细胞的存活率最低。
实施例5
GC-chol-apt-cDNA诱导肿瘤细胞凋亡定量检测
为定量检测GC-chol-apt-cDNA对肿瘤细胞的凋亡作用，采用Annexin v FITC-PI凋亡检测试剂盒，用流式细胞术分析确定凋亡细胞的百分比。将HEp-2细胞(人喉癌上皮细胞)接种在6孔板中(1×105个/孔)，在37℃和5％CO2的条件下培养24h，然后吸出培养基，用PBS缓冲液清洗3遍，再分别加入浓度为0、20、60、100μg/mL的实施例1中GC-chol-apt-cDNA溶液，37℃下孵育12h。孵育结束后，用PBS缓慢清洗3次，并将GC-chol-apt-cDNA作用后的HEp-2细胞经胰蛋白酶消化离心收集后，分别加入5μL Annexin V-FITC和碘化丙啶染色(凋亡检测试剂盒)，最后通过流式细胞术分析对每个样品进行1×104个细胞计数，得到凋亡细胞的数目和比例。结果如图8所示，随着GC-chol-apt-cDNA浓度的增大，显著增加肿瘤细胞的凋亡水平，在浓度达到100μg/mL时，细胞存活率为29％左右，诱导肿瘤细胞凋亡效果明显。
实施例9
GC-chol-apt-cDNA诱导肿瘤细胞凋亡后期细胞核结构变化
将HEp-2细胞(人喉癌上皮细胞)接种在成像培养皿中(1×104个/孔)，在37℃和5％CO2的条件下培养24h。然后吸出培养基，用PBS缓冲液清洗3遍，加入浓度为60μg/mL的实施例1中GC-chol-apt-cDNA溶液，37℃下孵育0、2、4、8、12、24h。孵育结束后，用PBS清洗3次，加入DAPI(4′,6-二脒基-2-苯基吲哚)细胞核染料室温孵育5min。孵育结束后，用PBS清洗掉未结合的DAPI染料，并使用共聚焦荧光显微镜(Olympus IX-81)对荧光信号进行采集。结果如图9所示，随着与GC-chol-apt-cDNA作用时间的延长，细胞核结构出现明显的固缩和破裂现象，表明细胞进入凋亡后期。
实施例10
GC-chol-apt-cDNA对HEp-2细胞(人喉癌上皮细胞)和16HBE(人正常支气管上皮细胞)杀伤作用测试
将HEp-2细胞(人喉癌上皮细胞)和16HBE(人正常支气管上皮细胞)分别接种到96孔细胞培养板中(1×104个/孔)，在37℃和5％CO2的条件下培养24h。然后吸出培养基，用PBS缓冲液清洗3遍，再分别加入浓度为0、20、40、60、80、100μg/mL的实施例1中GC-chol-apt-cDNA溶液，于培养箱再次孵育24h后，用PBS缓冲液清洗3遍，再用CCK-8试剂显色并测定其吸光度，并进一步计算其细胞毒性。结果如图10所示，GC-chol-apt-cDNA对肿瘤细胞HEp-2有明显的杀伤作用，而对正常细胞16HBE的影响较小。
实施例11-13
与实施例1的区别在于，A链(apt，5′-COOH-tttttttttttttttttggtggtggtggttgtggtggtggtggtgtcgctt-3′-Cy3)溶液的浓度分别为1μM/L、50μM/L和100μM/L，相应的B链(cDNA，5′-BHQ2-aagcgacacca-3′)与各自A链的摩尔比为1:1，分别制得用于核仁素交联诱导肿瘤细胞凋亡的纳米探针(GC-chol-apt-cDNA)。
实施例14
将HEp-2(人喉癌上皮细胞)肿瘤细胞接种到96孔细胞培养板中(1×104个/孔)，在37℃和5％CO2的条件下培养24h。然后吸出培养基，用PBS缓冲液清洗3遍，再分别加入60μg/mL实施例1、实施例11至实施例13中制备的GC-chol-apt-cDNA，均于培养箱再次孵育24h后，用PBS缓冲液清洗3遍，再用CCK-8试剂显色并测定其吸光度，并进一步计算各自的细胞毒性。结果如图11所示，以不同浓度apt合成的GC-chol-apt-cDNA均对肿瘤细胞有明显的杀伤作用。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110> 西南大学
<120> 一种用于核仁素交联诱导肿瘤细胞凋亡的纳米探针及其制备方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tttttttttt tttttttggt ggtggtggtt gtggtggtgg tggtgtcgct t 51
<210> 2
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aagcgacacc a 11

Claims (8)

1.一种用于核仁素交联诱导肿瘤细胞凋亡的纳米探针，其特征在于，所述纳米探针以乙二醇壳聚糖作为高分子骨架，所述高分子骨架上接枝胆固醇和A链，所述A链的5′ 端修饰有羧基，3′ 端修饰有染料Cy3，且含有核酸适配体AS1411基因序列，所述A链与5′ 端修饰有BHQ2的B链部分杂交；
所述A链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述B链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.权利要求1所述的一种用于核仁素交联诱导肿瘤细胞凋亡的纳米探针的制备方法，其特征在于，所述方法如下：
(1)将乙二醇壳聚糖和琥珀酰亚胺酯-聚乙二醇-胆固醇分别溶解于PBS缓冲液中，将两种溶液混合后室温下搅拌反应，最后经透析、冻干，制得乙二醇壳聚糖-胆固醇化合物；
(2)将步骤(1)中制得的乙二醇壳聚糖-胆固醇化合物和A链分别溶于PBS缓冲液中，将两种溶液混合后室温下搅拌反应，所述反应结束后加入溶解有B链的PBS缓冲液，室温下继续搅拌反应，最后经透析、冻干，制得用于核仁素交联诱导肿瘤细胞凋亡的纳米探针。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述乙二醇壳聚糖-胆固醇化合物中胆固醇的质量分数为30％。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述乙二醇壳聚糖-胆固醇化合物和A链质量摩尔比为100:0.001-0.1，mg:μmol。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述A链和B链的摩尔比为1:1。
6.如权利要求2-5任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中PBS缓冲液的浓度为0.0067M，pH为7.2-7.4。
7.如权利要求2-5任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述透析具体为将最终反应液移至截留分子量为8-14KD的透析袋中，于去离子水中透析2-3天；步骤(2)中，所述透析具体为将最终反应液移至截留分子量为20KD的透析袋中，于去离子水中透析2-3天。
8.权利要求1所述的一种用于核仁素交联诱导肿瘤细胞凋亡的纳米探针在制备治疗肿瘤细胞药物中的应用。
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