CN107356572A - 利用核酸作为载体的荧光共振能量转移方法 - Google Patents

利用核酸作为载体的荧光共振能量转移方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用核酸作为荧光分子载体实现共振能量转移的方法，包括以下步骤：（1）荧光分子能与核酸非共价的结合，根据结合力和结合方式的不同将供体荧光分子和受体荧光分子同时结合在核酸分子上的不同位置；（2）利用激发光将供体荧光分子激发，供体的能量会转移给同一核酸分子邻近位点上的受体荧光分子，从而使受体分子激发，实现荧光共振能量转移。本发明利用核酸作为荧光分子载体，与现有的荧光共振能量转移技术相比，无需荧光分子的标记，方法更简单；通过调节荧光分子与核酸的结合，更容易调控荧光共振能量转移的发生，实现更高效的共振能量转移。

Description

利用核酸作为载体的荧光共振能量转移方法
技术领域
本发明涉及一种荧光共振能量转移的新方法，特别涉及利用核酸分子的骨架结构作为荧光分子载体来实现非标记的荧光共振能量转移的方法。
背景技术
荧光共振能量转移是指当两种不同的荧光团距离很近（一般小于10 nm），并且其中作为供体的荧光团的发射光谱与作为受体荧光团的激发光谱具有相当程度的重叠时，供体由于受外部激发光的激发而到达分子的激发态。由于偶极和偶极之间的相互作用，激发态的供体会将能量转移给受体分子，当受体分子回到基态时将能量以光子的形式释放出来，产生荧光辐射。荧光共振能量转移是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的偶极子相互作用，将供体激发态能量转移到受体激发态的过程，使供体荧光强度降低，而受体可以发射更强于本身的特征荧光（敏化荧光），也可以不发荧光（荧光猝灭），同时也伴随着荧光寿命的相应缩短或延长。能量转移的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等因素有关。
通常能发生有效的荧光共振能量转移的距离只有几个纳米到十几个纳米，因而必须利用可控的标记技术将给体分子和受体分子连接到载体上，或是利用分子之间的反应或构象的变化来实现。本发明以核酸分子作为信号分子载体，荧光给体和受体分子均能与核酸分子非共价的结合。然而，利用核酸分子与信号分子相结合的专利和科研文章多是将此复合物用作免疫分析的标记物。在美国专利US6280933（公开日: 2001-08-28）中，Glazer等人描述了一个用双链核酸作为荧光分子载体对免疫测试进行多标记的方法，其中的荧光分子是核酸嵌入剂并带两个正电荷。在我国专利CN 101255462A（公开日2008-09-03）中描述了一种利用荧光分子和核酸形成的树状复合物用于免疫标记物。然而，将两种或多种荧光分子与核酸相结合用于实现荧光共振能量转移，国内外目前还没有这方面的专利。
发明内容
本发明提供了一种荧光共振能量转移的新方法：利用核酸分子作为荧光分子载体，供体和受体分子同时非共价的结合在核酸分子骨架上，供体被激发后可以将能量转移给核酸上结合的受体荧光而将受体激发，从而实现荧光共振能量转移。为达到上述目的，本发明的技术解决方案是：
a）选择一定链长的核酸分子作为载体；
b）将荧光给体和受体分子中与核酸分子结合比相对较小的先与核酸分子结合，再将另一荧光分子结合到已经结合了一种荧光分子的核酸上。由于两荧光分子与核酸的不同结合力或结合位点，实现两种荧光分子同时结合在核酸骨架上的不同位置；
c）将荧光供体激发，则供体的能量会转移给同一核酸分子上邻近的受体分子从而使受体分子激发，辐射出受体分子的特征荧光。
所述的荧光共振能量转移新方法中，作为载体的核酸为单链脱氧核糖核酸，双链脱氧核糖核酸，单链核糖核酸，双链核糖核酸，双链脱氧核糖核酸/核糖核酸，寡核苷酸，核酸适配体，或肽核糖核酸。
所述的荧光共振能量转移新方法中，荧光分子为无机分子、有机分子、无机/有机复合分子、无机聚合物、有机聚合物、无机/有机复合聚合物、无机颗粒物、有机颗粒物或无机/有机复合颗粒物，无机金属配合物。
所述的荧光共振能量转移新方法中，荧光分子能与核酸以小沟结合、大沟结合、嵌入结合或静电作用等非共价方式结合。
所述的荧光共振能量转移新方法中，供体和受体分子满足共振能量转移对吸收和发射光谱上的基本要求。
本发明与现有的其他荧光共振能量转移方法相比具有以下优点：
（1）目前溶液中的荧光共振能量转移是发生在荧光给体分子和受体分子混合溶液中，在此体系中发生的荧光共振能量转移具有很大的随机性。只有当溶液中的给体分子和受体分子之间的距离接近到10 nm时，才可能发生有效的荧光共振能量转移。本发明中的荧光给体分子和受体分子均以固定的结合模式与核酸载体分子结合，基于此的荧光共振能量转移特异性的发生在核酸链上邻近的有效距离内的荧光分子之间。
（2）传统的表面上的荧光分子发生共振能量转移，必须将荧光给体分子和受体分子邻近的标记，或是标记不同的载体如生物分子上，利用荧光共振能量转移的发生来研究载体分子之间的相互作用等。本发明中的荧光分子以非共价的方式，如嵌入、静电、沟槽结合等方式与载体核酸结合而无需复杂的标记技术与纯化分离。
（3）在传统表面荧光分子的共振能量转移中，荧光给体分子和受体分子的空间距离难于调控，从而影响共振能量转移的效率。本发明中的荧光给体和受体分子与核酸均具有特异性的结合模式，不同的结合能力以及结合比，因而可以有效的调控两种荧光分子与核酸载体的结合，实现最大效率的共振能量转移。
附图说明
（1） 荧光分子A与核酸的结合的荧光信号变化图，激发波长350 nm，图1；
（2） 荧光分子B（受体）与核酸的结合的荧光信号变化图，激发波长460 nm，图2；
（3） 荧光分子A（给体）和B（受体）同时与核酸的结合发生共振能量转移的示意图，图3；
（4） 荧光分子A（给体）和不同浓度的B（受体）同时与核酸的结合的荧光信号变化图，激发波长350 nm，图4。
具体实施方式
下面结合具体实施方式及附图对本发明进行详细说明，但本发明的保护范围并不仅限于下列实施例，应包括权利要求书中的全部内容，以及各个实施例之间的交叉结合。
本发明实施例提供了一种利用核酸作为载体实现荧光分子间的共振能量转移的方法。选用两种能与核酸非共价结合的荧光分子，其吸收光谱和发射光谱满足荧光能量转移的要求。将两荧光分子同时与核酸结合，选用给体分子的最大吸收波长为激发波长，检测受体分子的荧光发射，使用的装置为荧光光谱仪。
以Hoechst33258为荧光给体分子，[Ru(bpy)2dppz](BF4)2（硼氟酸二联吡啶二吡啶并[3,2-a:2',3'-c]吩嗪钌，简称Ru-dppz）为荧光受体分子，小牛胸腺DNA作为载体为例，来说明本发明方法的具体实施流程：
（1）Hoechst33258与核酸分子结合的荧光实验
取1 mL浓度为10-6 g/mL的DNA-Tris溶液于四面通过的石英荧光比色皿中至于荧光光谱仪上进行荧光分析。激发波长350 nm，狭缝宽度 5 nm。在此过程中持续加入浓度分别为2×10-5 mol/L的Hoechst 33258-Tris溶液，每加入一次测定一次，加入后Hoechst33258的最终浓度为0.004、0.008、0.014、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.14、0.16 μmol/L。从而得到Hoechst 33258滴定DNA滴定曲线。根据滴定曲线计算Hoechst33258与DNA的结合常数和结合比，如图1所示。
（2）Ru-dppz与核酸分子结合的荧光实验
取1 mL浓度为10-4 g/mL的DNA-Tris溶液于石英荧光比色皿中置于荧光光谱仪上机进行荧光测定。激发波长460 nm，狭缝宽度 10 nm。在此过程中持续加入浓度10-5，10-4，10-3mol/L的Ru-dppz溶液，每加入一次测定一次。Ru-dppz加入DNA后的最终浓度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.5、5 μmol/L的Ru-dppz溶液，从而得到Ru-dppz滴定DNA滴定曲线。根据滴定曲线计算Ru-dppz与DNA的结合常数和结合比，如图2所示。
（3）Hoechst33258和Ru-dppz同时与DNA结合的荧光实验
取1mL浓度为10-4 mg/mL的DNA-Tris溶液于石英荧光比色皿中置于荧光光谱仪上机做荧光分析。激发波长350 nm，狭缝宽度 10 nm。向其中加入浓度为20 μmol/L 的Hoechst33258的Tris溶液54 μL，得到吸收峰后陆续向其中加入浓度为2 μmol/L的Ru-dppz的Tris溶液，每加入一次测定一次从而得到第二个吸收峰，如图4所示。可见，随着Ru-dppz的加入与DNA的结合，Hoechst 33258的荧光信号逐渐降低，而在620 nm处出现Ru-dppz的荧光信号。
本发明采用核酸作为荧光分子载体，实现两种荧光分子间的共振能量转移。与现有的荧光共振能量转移技术相比较，本方法无需标记荧光分子，方法更简单。同时，可通过分别调节荧光给体和受体分子与核酸的结合，实现更高效的能量转移。

Claims (10)

1.一种以核酸分子作为载体的荧光共振能量转移新方法，其特征在于：
a)以核酸分子作为荧光分子的载体；
b)两种或多种荧光分子以非共价方式同时与核酸结合，并结合在核酸分子的不同位置；
c) 荧光分子与所述核酸结合，形成包含两种或多种荧光分子且具有高结合率的结合物；
d) 将荧光供体激发，则供体的能量会转移给同一核酸分子上邻近的受体分子从而将受体激发，实现基于核酸载体的荧光共振能量转移。
2.如权利要求1所述的荧光共振能量转移新方法，其特征在于：所述的作为载体的核酸分子为单链脱氧核糖核酸，双链脱氧核糖核酸，单链核糖核酸，双链核糖核酸，双链脱氧核糖核酸/核糖核酸，寡核苷酸，核酸适配体，或肽核糖核酸。
3.如权利要求1所述的荧光共振能量转移新方法，其特征在于：所述的荧光分子为无机分子、有机分子、无机/有机复合分子、无机聚合物、有机聚合物、无机/有机复合聚合物、无机颗粒物、有机颗粒物或无机/有机复合颗粒物。
4.根据权利要求3所述的荧光共振能量转移新方法，其中所述荧光分子为核酸结合剂。
5.根据权利要求4所述的荧光共振能量转移新方法，其中所述荧光分子为荧光染料。
6.根据权利要求5所述的荧光共振能量转移方法，其中所述荧光染料为DAPI染料，Pico-Green染料，SYBR、SYTO、Hoechst、Gene Finder系列染料。
7.根据权利要求4所述的荧光共振能量转移新方法，其中所述荧光分子为金属/有机配体的络合物。
8.根据权利要求1-7中任何一项的荧光共振能量转移新方法，其中所述荧光分子与核酸作用的结合方式为小沟结合、大沟结合、嵌入结合或静电作用。
9.根据权利要求1所述利用核酸作为载体的荧光共振能量转移的方法，其特征在于：所述荧光分子非共价的与核酸结合，实现无标记的荧光共振能量转移。
10.根据权利要求1所述利用核酸作为载体的荧光共振能量转移的方法，其特征在于：荧光分子与核酸的结合作用力和结合方式不同，可以通过调控供体和受体分子与核酸的结合比来调节荧光共振能量转移的效率。
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