CN115607680A - 金团簇-核酸适体及其衍生物组装体的制备及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明记载了一种金团簇‑核酸适体及其衍生物组装体的制备及应用，包含合成与纯化、设计与制备金团簇‑核酸适体及其衍生物等步骤。金团簇‑核酸适体纳米材料包含至少一个核酸适体和/或其衍生物，和金纳米团簇(GNCs)；所述核酸适体和/或其衍生物与所述金纳米团簇(GNCs)自组装的方式形成纳米材料，所述衍生物包括但不限于，核酸适体与药物、荧光分子、以及造影剂如铁(Fe)、锰(Mn)、铜(Cu)等偶联物。本发明中所用的纳米材料的制备步骤简单、可控重复性好，且GNCs因尺寸较小，可通过肾脏排出体外，大大提升了靶向肿瘤细胞效果并减少其副作用。

Description

金团簇-核酸适体及其衍生物组装体的制备及应用
技术领域
本发明涉及生物医药肿瘤诊断与治疗领域，特别是涉及一种基于金纳米团簇制备的稳定、尺寸可调、可生物降解的适体、适体药物偶联物(ApDCs)及其衍生物的自组装纳米材料的制备方法及应用。
背景技术
癌症是严重影响全人类健康和生命的严重疾病。在癌症的早期阶段对其进行准确的诊断并且及时采取有效的治疗措施是成功治疗癌症的关键因素。传统检测癌症的方法存在特异性差、灵敏度低、对病人造成伤害等缺点，难以满足肿瘤早期检测的要求，从而导致癌症的扩散和转移,错过治疗的最佳时机。近年来,系列针对肿瘤标志物的新型分子不断被开发出来,为肿瘤早期诊断的临床应用提供了新的机遇。另一方面，诊断出癌症后进行及时有效的治疗对提高病人的生存率具有十分重要的意义。
核酸适体(Aptamer)是从人工合成的DNA/RNA文库中筛选得到的能够高度特异性、高亲和性结合靶标分子的单链寡核苷酸。其分子识别的基础不是碱基互补配对，而是折叠成二级和三级结构，借助静电引力、疏水作用力、范得华力等分子间的作用力，通过空间结构与靶分子构象的匹配，从而特异地识别靶分子。核酸适体具有与抗体相似的分子识别功能，但与抗体相比具有更多的应用优势，例如可不依赖生物体在体外筛选，靶分子范围广(金属离子、毒素、病毒、细菌、细胞、组织等)，分子量小，低免疫原性、易固相合成与标记，化学稳定性好、可常温保存等。核酸适体在疾病标志物的发现、分子诊断、靶向分子医药、分子病理等领域显示出巨大的临床应用前景。为了满足“靶向治疗”的要求，人工寡核苷酸适体被用作新的靶向配体，以构建可特异性结合多种靶标的适体药物偶联物(ApDCs)。与抗体药物偶联物(ADCs)相比，适体药物偶联物(ApDCs)具有多个潜在优势。例如，核酸适体可进行化学或酶修饰，与治疗剂进行生物缀合优化生物稳定性。核酸适体和适体药物偶联物(ApDCs)的分子量相对较小，它们有望比抗体药物偶联物(ADCs)更快、更深地穿透组织。因此，核酸适体在靶向给药中的应用以其优异的选择性和亲和力、低免疫原性、易合成而受到广泛关注。
然而，核酸适体及适体药物偶联物(ApDCs)治疗的主要问题之一是血浆稳定性较差及其在血清中的半衰期短，所以在医学影像诊断方面往往会有明显劣势。同时，单纯的核酸适体稳定性较差,易受复杂的生理环境中的酶的降解。适体和ApDCs诊疗的主要问题之一是血浆稳定性及其在血清中的半衰期。
近年来，金纳米材料因其具有尺寸可调和表面易功能化修饰等优点，成为核酸递送的诱人材料。金纳米团簇(GNCs)是近年来合成的一种新型的纳米材料，粒径为2nm左右，具有良好的荧光性能，在体内可以通过多种途径排泄到体外，体内毒性可忽略不计。此外，GNCs有优异的X射线衰减特性，可用于电子计算机断层扫描(CT)成像。CT成像能够提供高的空间分辨率、三维断层扫描信号和足够的组织穿透深度。因此，可将GNCs与适体或ApDCs结合用于药物的靶向递送和肿瘤的CT诊断，并尝试用GNCs诱导适体或ApDCs自组装形成纳米材料从而提高适体或ApDCs的稳定性并解决纳米材料在体内难以排泄的问题。研究结果对于提高适体或ApDCs的稳定性以及肿瘤的靶向精准诊疗具有重要科学意义和临床价值。
发明内容
本发明一方面涉及通过自组装的方式将核酸适体和ApDCs组装成纳米材料的方法，克服传统制备条件复杂的问题，并且此方法不影响核酸适体的构象或结构，适用性强。具体地，本发明涉及的一种金团簇-核酸适体及其衍生物组装体纳米材料的制备方法，所述方法包含以下步骤：
1)合成与纯化金纳米团簇(GNCs)：
氯金酸与GSH和多肽)在25～70℃反应24-36小时后，用透析除去未反应的物质，得到纯化的GNCs；
2)设计与制备核酸适体和/或适体药物偶联物(ApDCs)或其衍生物；
3)金纳米团簇和核酸适体和/或适体药物偶联物或其衍生物在4～37℃搅拌1.5～2小时后自组装形成GNCs与核酸适体纳米组装体(GNCs@核酸适体和/或ApDCs或其衍生物)。
所述核酸适体选自Sgc8、PD-L1、XQ-2D、c-Met、As1411等核酸适体中的一个或多个或其组合；例如，其中Sgc8参照文献J Am Chem Soc,2019.141(10):p.4282-4290记载；PD-L1核酸适体如文献Angew Chem Int Ed Engl,2020.59(12):p.4800-4805记载；XQ-2D核酸适体如文献J Am Chem Soc,2019.141(27):p.10760-10769记载；c-Met适体如文献J AmChem Soc,2019.141(32):p记载。12673-12681.As1411核酸适体如文献Nanomedicine,2019.21:p.102060.记载。
所述适体药物偶联物(ApDCs)选自5-Fu(5-氟尿嘧啶)适体药物偶联物、吉西他滨适体药物偶联物、阿霉素(DOX)适体药物偶联物、顺铂适体药物偶联物中的一个或多个或其组合，优选地，所述适体药物偶联物来自核酸适体Sgc8、PD-L1、XQ-2D、c-Met、As1411等；优选地，所述适体药物偶联物来自核酸适体Sgc8，优选地，所述适体药物偶联物为5-Fu修饰的Sgc8核酸适体。
所述氯金酸、GSH和多肽的摩尔比例为1:5:5
本申请将核酸适体和ApDCs与GNCs自组装形成纳米颗粒，因为核酸适体和ApDCs位于颗粒内部，避免了其被核酸酶的快速降解，延长核酸适体和ApDCs在血液中循环时间和肿瘤滞留时间。
所述衍生物包括但不限于，核酸适体与药物、荧光分子、以及造影剂如铁(Fe)、锰(Mn)、铜(Cu)等偶联物。
本发明另一方发涉及金团簇-核酸适体纳米材料，其包含，
至少一个核酸适体和/或其衍生物,和
金纳米团簇(GNCs)；
所述核酸适体和/或其衍生物与所述金纳米团簇(GNCs)自组装的方式形成纳米材料，其中所述核酸适体与所述金纳米团簇通过非共价键的相互作用；
所述金团簇-核酸适体纳米材料和/或其衍生物纳米材料具有生物相容性、靶向性和特异性以及稳定性；
所述衍生物包括，核酸适体与药物、荧光分子、以及造影剂如铁(Fe)、锰(Mn)、铜(Cu)的偶联物。
所述衍生物为经化学药物或抗体药物修饰的核酸适体；所述衍生物为经化学药物、抗体药物修饰的核酸适体；其中所述衍生物为适体药物偶联物(ApDCs)及用于影像诊断的适体偶联物；所述适体药物偶联物中的药物分子为5-Fu、吉西他滨、阿霉素、顺铂的一个或多个；
所述适体药物偶联物衍生自Sgc8、PD-L1、XQ-2D、c-Met、As1411等核酸适体，和/或核酸适体与荧光分子、以及造影剂如铁(Fe)、锰(Mn)、铜(Cu)的偶联物；优选地，所述适体药物偶联物为5-Fu修饰的核酸适体Sgc8、XQ-2D。
单独ApDCs由于稳定性差，易降解，因此在治疗时效果受到显著影响。增强5-Fu治疗效果也是亟待解决的问题。ApDCs和金纳米团簇的组装，可以提高ApDCs的稳定性，有助于延长ApDCs在血液中的循环时间和肿瘤滞留时间。而ApDCs在肿瘤的长期滞留有助于提高疗效，促进药物诱导肿瘤细胞死亡。解决纳米材料在体内滞留问题。在GNCs@ApDCs组装体解体后，ApDCs可被生物降解，金纳米团簇可通过肾脏排出体外。
本发明具体涉及了一种金纳米团簇-核酸适体Sgc8组装体，其包括，
至少一个核酸适体Sgc8，和
金纳米团簇(GNCs)，
所述核酸适体Sgc8与所述金纳米团簇(GNCs)自组装的方式形成纳米材料；
所述核酸适体Sgc8经不同含量的5-氟尿嘧啶修饰，并且不改变所述核酸适体Sgc8的靶向性；
金纳米团簇-核酸适体Sgc8组装体具有靶向性、稳定性和生物相容性。
其中，上述的金纳米团簇-核酸适体Sgc8组装体，一个或多个所述5-氟尿嘧啶插入或替换所述核酸适体Sgc8的核苷酸，或者修饰所述核酸适体Sgc8的两端；优选地，所述5-氟尿嘧啶修饰所述核酸适体Sgc8的两端；
优选地，所述5-氟尿嘧啶修饰所述核酸适体Sgc8的5’端；所述优选地，所述5-氟尿嘧啶修饰的核酸适体Sgc8的5’端的序列为：5-Fu、(5-Fu)T(5-Fu)-、(5-Fu)T(5-Fu)T(5-Fu)-、(5-Fu)(5-Fu)(5-Fu)(5-Fu)(5-Fu)-。
上述的金纳米团簇-核酸适体Sgc8组装体，可以通过更换适体的方式，可实现对多种肿瘤的靶向诊断治疗，普适性强，解决了传统化学方法位点特异性的问题以及复杂的制作步骤。所述适体药物偶联物衍生自Sgc8、PD-L1、XQ-2D、c-Met、As1411等核酸适体；优选地，所述适体药物偶联物为5-Fu修饰的核酸适体Sgc8。
本发明的另一方面涉及金团簇-核酸适体纳米材料用于肿瘤的PET和/或CT成像的用途，所述金纳米团簇-核酸适体纳米材料如上任一项所述；所述核酸适体经过造影分子、显影分子或荧光分子等修饰，以能够用于肿瘤的PET成像和/或CT成像等；优选地，所述核酸适体为经过NOTA修饰后的核酸适体。用于肿瘤诊疗的自组装纳米材料中的核酸适体可用NOTA修饰后，用于肿瘤的PET成像，同时，自组装纳米材料中的GNCs可用于肿瘤的CT成像。
本发明还涉及金团簇-核酸适体纳米材料用于肿瘤治疗的用途。所述金纳米团簇-核酸适体纳米材料如上任一项所述；所述核酸适体包含化疗药物或抗体药物，并且能够靶向递送至肿瘤位置。
所述化疗药物可以为5-Fu、吉西他滨、顺铂、阿霉素；优选地，所述药物组合物的使用剂量低于只包含单独核酸适体的药物组合物。在一种具体实施例中，用于肿瘤诊疗的自组装纳米材料用于动物诊断和治疗时采用尾静脉注射的方式。
本发明以GNCs为载体，固相合成的5-FuSgc8适体以及其他适体如PD-L1、XQ-2D、C-MET等，通过自组装的方式组装成生物相容性良好的纳米材料用于动物的近红外成像、CT成像、PET成像及治疗。GNCs与核酸适体的自组装条件简单，通过更换核酸适体即可实现对多种肿瘤的靶向诊治，因而具备很强的普适性。
有益效果：
1.本发明中所用的纳米材料的制备条件温和、步骤简单、可控且重复性好。
2.本发明中所制备的纳米药物载体具有良好的生物相容性，且自组装纳米材料在解体后，核酸适体可被核酸酶降解，而GNCs因尺寸较小，可通过肾脏排出体外。
3.本发明中所制备的纳米材料含有靶向适体，靶向肿瘤细胞效果好。
4.本发明中所制备的纳米材料的靶向适体可进一步带领纳米药物载体进入肿瘤细胞，因此治疗效果好。
5.本发明中所制备的纳米药物载体中的化疗药物5-Fu可更换为吉西他滨、顺铂、阿霉素等。
6.本发明中所制备的纳米药物载体中的核酸适体可更换为PD-L1、XQ-2D、C-MET、As1411等，因而具有很强的普适性。
7.本发明中所制备的纳米材料可用于肿瘤的PET/CT成像，背景低，干扰好，穿透深度和灵敏度高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是金纳米团簇适体药物偶联物纳米药物递送载体的结构示意图；
图2是金纳米团簇及金纳米团簇适体药物偶联物纳米药物递送载体的TEM表征图；
图3是金纳米团簇适体药物偶联物纳米药物递送载体的紫外吸收图片和荧光光谱图；
图4是金纳米团簇适体药物偶联物纳米药物递送载体的水动力学粒径分布图片和ζ电位图；
图5是金纳米团簇适体药物偶联物纳米药物递送载体稳定性和核酸适体稳定性实验结果图；
图6是金纳米团簇适体药物偶联物纳米药物递送载体与结肠癌HCT116细胞的结合能力实验结果图；
图7是金纳米团簇核酸适体(PD-L1，XQ-2D)纳米递送载体的测试实验结果图；
图8是金纳米团簇适体药物偶联物纳米药物递送载体用于结肠癌HCT116治疗的CCK-8实验结果图；
图9是金纳米团簇适体药物偶联物纳米药物递送载体的PET/CT影响诊断图。
具体说明
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
纳米材料
本发明记载了一种纳米材料，此种纳米材料包含核酸适体,和金纳米团簇(GNCs)，其中，核酸适体与所述金纳米团簇(GNCs)通过非共价键的相互作用自组装结合。例如，如图1所示，金纳米团簇所带正电荷(NH3+)与核酸适体的磷酸根(PO4-)所携带的负电荷形成离子键自组装成纳米材料。
本发明涉及的纳米材料，可以适用于多种核酸适体。例如，本发明的某具体实施例中，核酸适体为Sgc8；在可替换性实施例中，核酸适体为PD-L1或XQ-2D；在另外实施例中，核酸适体为c-Met或As1411核酸适体。上述自组装而成的纳米材料可用GNCs@核酸适体/ApDCs进行表示，如GNCs@Sgc8、GNCs@PD-L1、GNCs@XQ-2D等。
上文所述的核酸适体也可用其衍生物替换，其衍生物包括但不限于，核酸适体与药物、荧光分子、以及造影剂如铁(Fe)、锰(Mn)、铜(Cu)等偶联物。
纳米材料的用途
影像诊断
上文中所记载的金团簇-核酸适体及其衍生物组装体的核酸适体经过与造影分子、显影分子或荧光分子的修饰，形成与荧光分子、造影剂如铁(Fe)、锰(Mn)、铜(Cu)的偶联物后，可用于肿瘤的近红外成像、MRI、PET成像、CT成像等，对肿瘤细胞进行影像诊断。
肿瘤治疗
当上文中所记载的金团簇-核酸适体及其衍生物组装体的核酸适体中结合了化疗药物或抗体药物(例如，5-Fu、吉西他滨、顺铂、阿霉素)时，其可同时与适当赋形剂结合，形成一种药物组合物，此种药物组合物能够被靶向递送至肿瘤位置用于肿瘤治疗。在一种具体实施例中，作为优选方案，药物组合物的使用剂量可低于只包含单独核酸适体的药物组合物。
适体药物偶联物(ApDCs)
核酸适体，能在实际应用中进行修饰，比如经过药物基团修饰或荧光基团修饰等。本发明的某具体实施例中，核酸适体与化疗药物偶合，形成适体药物偶联物(ApDCs)。本发明所选用的化疗药物包括5-氟尿嘧啶(5-Fu)、吉西他滨、顺铂、阿霉素(DOX)，本发明所记载的实施方案可选自以上化疗药物的一个或多个。
适体药物偶联物衍生自Sgc8、PD-L1、XQ-2D、c-Met、As1411等核酸适体，和/或核酸适体与荧光分子、以及造影剂如铁(Fe)、锰(Mn)、铜(Cu)的偶联物；优选地，所述适体药物偶联物为5-Fu修饰的核酸适体Sgc8、XQ-2D。
通过自组装的方式组装而成的、生物相容性良好的纳米材料也可用于动物的CT成像、PET成像及治疗，核酸适体可使用能够用于PET以及CT成像的造影分子、显影分子或荧光分子进行修饰。作为一种优选方案，用于肿瘤诊疗的纳米材料中的核酸适体可通过NOTA修饰后用于肿瘤的PET成像。同时，上文所述，纳米材料中的金纳米团簇(GNCs)可用于肿瘤的CT成像，本领域技术人员也可以用相似原理使得本发明所记载的方法将其应用于近红外成像、MRI成像。
金纳米团簇-核酸适体
本发明所记载的Sgc8核酸适体可特异性识别酪氨酸蛋白激酶7(PTK7)，例如表达在人急性淋巴细胞白血病T淋巴细胞(CCRF-CEM)中。在其中一种实施例中，核酸适体Sgc8与所述金纳米团簇(GNCs)通过非共价键的相互作用自组装结合，自组装形成一种金团簇-核酸适体Sgc8纳米材料，在此种实施例中，核酸适体Sgc8可经5-氟尿嘧啶修饰，同时确保修饰后核酸适体Sgc8的靶向性能不受影响，此纳米材料用GNCs@5-FuSgc8表示。
在一种实施例中，将一个或多个5-氟尿嘧啶插入核酸适体Sgc8的核苷酸中，或直接进行替换，也可以将其用于修饰核酸适体Sgc8的两端，作为优选方案，将5-氟尿嘧啶用于修饰核酸适体Sgc8的两端。进一步优选地，将5-氟尿嘧啶用于修饰该核酸适体Sgc8的5’端，此时，经5-氟尿嘧啶修饰的核酸适体Sgc8的5’端的序列为：5-Fu、(5-Fu)T(5-Fu)-、(5-Fu)T(5-Fu)T(5-Fu)-、(5-Fu)(5-Fu)(5-Fu)(5-Fu)(5-Fu)-。在一种实施例中，可将本发明所记载的Sgc8核酸适体与化疗药物DOX化学偶连形成一个酸不稳定的腙键，在特异性靶向CCRF-CEM细胞后，偶联物被内吞至肿瘤细胞内含体内，腙键在低pH条件下断裂从而释放药物。
本发明所记载的PD-L1核酸适体为识别特异性结合高表达PD-L1蛋白的细胞的核酸适体，与细胞的结合力很强，其可以特异性识别高表达PDL1蛋白的细胞。程序性死亡分子1(programmed death-1，PD1)及其适体(programmed death ligand，PDL)属于B7家族的共刺激分子，介导免疫反应的负性调节信号，在肿瘤发生、病毒感染以及自身免疫病中都发挥了特异性的调节作用。
本发明所记载的XQ-2D核酸适体可以特异性识别胰腺癌等癌症细胞，核酸适体XQ-2D可与CD71糖蛋白进行特异性结合，装载化疗药物DOX，从而实现了化疗药物的靶向递送和胰腺癌的靶向治疗。
本发明所记载的核酸适体c-Met为受体酪氨酸激酶的一种，其为间质表皮转化因子(c-Mesenchymal-epithelial transition factor,c-Met)。Met基因位于人类7号染色体长臂(7q21-31)，长度约125kb，同时含有21个外显子。c-Met是Met基因编码产生的具有自主磷酸化活性的跨膜受体，属于酪氨酸激酶受体(receptor tyrosine kinases,RTKs)超家族，由膜外Sema域、PSI域、IPT域和膜内JM域、催化TK域、C末端组成，主要表达于上皮细胞。c-Met的结构由α链和β链通过二硫键连接组成，分为胞外域、跨膜螺旋结构域和胞内域。其胞外域包含3个不同的功能区：覆盖整个α链和部分β链N端的SEMA结构域(semaphorin，氨基酸残基25～514)，有4个二硫键的胱氨酸富集域(plexins-semaphorins-integrins，PSI，氨基酸残基515～561)和4个免疫球蛋白区域(immunoglobulin-plexin-transcription，IPT，氨基酸残基562～922)，在螺旋结构的跨膜区域(氨基酸残基923～956)之后，胞内域(氨基酸残基957～1390)也由3个调控区组成，即含有Tyr1003和Ser985磷酸位点的近膜结构域、含有Tyr1234和Tyr1235磷酸化位点的催化结构域、含有Tyr1349和Tyr1356的C端多功能结合区。胞外的SEMA结构域是配体结合的关键区域。近膜结构域对c-Met信号传导通常起到负调节的功能，催化结构域主要是发生自身磷酸化活化下游信号，起到正向调节酪氨酸激酶催化活性的作用。C端多功能结合区域主要是募集胞质中的各种蛋白因子和接头分子，起到传递信号的作用。
本发明所记载的As1411是富含鸟嘌呤的DNA核酸适体，含有26个核苷酸片段，被认为是第一个进入临床研究的抗肿瘤核酸适体。As1411是基于细胞筛选得到的，它的作用机制并不十分清楚，通常认为它高选择性、高特异性地与位于肿瘤细胞表面的核仁蛋白结合，而后被细胞内吞，与细胞质内的核仁蛋白结合，抑制核因子kB，使抗细胞凋亡的BCL-2蛋白(B-cell Lymphoma protein)的mRNA去稳，从而使肿瘤细胞死亡。Reyesreyes等研究了As1411的作用机制，他们认为As1411与核仁蛋白结合，持续激活Rac1蛋白，过度刺激巨胞饮，引起细胞死亡。
金团簇-核酸适体的制备及应用本发明所记载的一种实施例下的纳米材料可通过以下方法进行制备。
1)金纳米团簇(GNCs)的合成与纯化：氯金酸与GSH和多肽以一定的比例在一定的温度下反应24小时后，反应产物用去离子水透析3天除去未反应的物质后终产物GNCs通过冷冻干燥机冻干后放到-20℃冰箱储存。终产物GNCs的形貌相同，粒径约2nm。
2)核酸适体的设计与制备：
设计不同核酸适体，同时确保修饰后核酸适体的靶向性能不受影响。本项目设计通过固相合成的方法合成不同的适体药物。通过质谱、红外吸收光谱等进行表征。
3)具有靶向功能的自组装纳米材料GNCs@核酸适体/ApDCs的制备：探索GNCs与核酸适体/ApDCs的组装条件和比例，筛选出最优组装比例和条件。通过GNCs与核酸适体/ApDCs的质量比例控制GNCs@核酸适体/ApDCs的尺寸大小以及带电性能。
4)自组装纳米材料GNCs@PD-L1的制备：选择靶向肿瘤细胞的PD-L1核酸适体，GNCs@PD-L1的制备方法同3)。
5)自组装纳米材料GNCs@XQ-2D的制备：选择靶向胰腺癌细胞的适体XQ-2D，GNCs@XQ-2D的制备方法同3)。
6)具有靶向功能的自组装纳米材料GNCs@ApDCs，GNCs@PD-L1和GNCs@XQ-2D等用于肿瘤的诊断和治疗。
进一步地，步骤2)中的核酸适体/ApDCs可提高自组装纳米材料GNCs@5-FuSgc8的靶向性能。
进一步地，步骤3)中的组装条件温和简单，无需复杂的实验步骤，对实验操作者要求较低，可实现量化生产。
步骤3)中的化疗药物可用于肿瘤的治疗，且化疗药物可以是5氟尿嘧啶(5-Fu)、吉西他滨、顺铂、阿霉素(DOX)等。
其中，步骤3)中单独的核酸适体/ApDCs由于稳定性差，易降解，因此在治疗时效果受到显著影响。ApDCs(5-FuSgc8)与金纳米团簇自组装形成纳米材料GNCs@核酸适体/ApDCs后，因部分适体/ApDCs位于纳米材料内部，避免了其被核酸酶的快速降解，延长了核酸适体/ApDCs在血液中的循环时间和肿瘤滞留时间，而核酸适体/ApDCs在肿瘤的长期滞留有助于提高疗效，促进药物诱导肿瘤细胞死亡。
步骤4)和步骤5)可通过更换核酸适体的方式实现对不同肿瘤的靶向诊断和治疗。因为核酸适体合成制备的易操作性和批次稳定性，通过此组装方法和步骤可通过更换核酸适体的方式实现对多种肿瘤的靶向诊断和治疗。
步骤6)中用于肿瘤细胞治疗的GNCs@核酸适体/ApDCs的剂量低于单独药物的用量。
步骤6)中用于肿瘤诊疗的自组装纳米材料用于动物诊断和治疗时采用尾静脉注射的方式。
步骤6)中用于肿瘤诊疗的自组装纳米材料中的核酸适体可用NOTA修饰后，用于肿瘤的PET成像。同时，自组装纳米材料中的GNCs可用于肿瘤的CT成像，例如PET成像如图9所示。
步骤6)中用于肿瘤的靶向诊断和治疗时，可针对不同适体的特异性，通过更换核酸适体的方式实现对特定肿瘤的靶向诊断和治疗。且步骤操作简单，无需过多的条件摸索。
上文所述的核酸适体、适体药物偶联物(ApDCs)均可使用其衍生物进行替代。
实施例
实施例1
金纳米团簇(GNCs)的制备：
将1mL去离子水加入到1.5mL离心管中，然后继续加入新鲜配置的95mM氯金酸，随后加入新配置的150mM的谷胱甘肽和巯基多肽在500rpm的转速下，加热到70℃，继续搅拌24小时。
金纳米团簇(GNCs)的纯化：
在合成的金纳米团簇(GNCs)中加入甲醇，然后9000rpm离心10分钟，除去不溶的杂质，完成初次纯化。随后将初步纯化的金纳米团簇置于透析袋中用去离子水透析3天并用冷冻干燥剂冷冻真空干燥。干燥后置于-20℃冰箱保存备用。
自组装：
金纳米团簇(GNCs)与经5-氟尿嘧啶修饰的核酸适体Sgc8自组装形成如前文所述的纳米材料GNCs@5-FuSgc8。设计不同含量的5-Fu修饰的核酸适体，同时确保修饰后核酸适体的靶向性能不受影响；其中Sgc8的序列为:
ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA(SEQ ID NO.:1)。
本项目设计通过固相合成的方法合成不同含量的5-Fu修饰的Sgc8核酸适体药物(5-FuSgc8)。5-FuSgc8通过质谱、红外吸收光谱等进行表征。
1-1(5-Fu)Sgc8 (FAM)(5-Fu)ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA
2-2(5-Fu)Sgc8 (FAM)(5-Fu)T(5-Fu)ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA
3-3(5-Fu)Sgc8 (FAM)(5-Fu)T(5-Fu)T(5-Fu)ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA
4-5(5-Fu)Sgc8 (FAM)(5-Fu)(5-Fu)(5-Fu)(5-Fu)(5-Fu)ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA
5-5(5-Fu)Sgc8 (Cy5)(5-Fu)(5-Fu)(5-Fu)(5-Fu)(5-Fu)ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA
表1.ApDCs(5-FuSgc8)的设计
金纳米团簇(GNCs)与(5-FuSgc8)的组装条件和组装方法的探索：
首先将预先制备好的带正电的金纳米团簇溶于pH7.4的水溶液中并超声分散。随后，将5-FuSgc8在95°处理5min，冰浴一段时间后缓慢加入到含金纳米团簇的水溶液中在室温搅拌15min后(GNCs与5-FuSgc8按照一定的质量比例)。收集制备的产物置于4°保存备用。通过透射电镜表征发现金纳米团簇(GNCs)与5-FuSgc8可以组装成球状的纳米材料GNCs@5-FuSgc8。为探索金纳米团簇(GNCs)与5-FuSgc8的最优组装比例，设置了不同梯度质量比的金纳米团簇(GNCs)与5-FuSgc8，通过透射电镜和纳米粒度仪测试GNCs@5-FuSgc8的尺寸大小以及带电性质。最终发现GNCs@5-FuSgc8的尺寸和带电性能可通过GNCs与5-FuSgc8的质量比例控制。考虑到其生物应用以及核酸适体的稳定性，我们选取了大小为100nm左右的自组装粒子用于后续生物学实验及应用。通过HRTEM观察GNCs在GNCs@5-FuSgc8纳米材料中的分布情况，发现金纳米团簇(GNCs)均匀分布在纳米材料GNCs@5-FuSgc8中。
图1显示了实施例1中需要制作的产物的结构示意图和制备方法流程图。金纳米团簇(GNCs)与5-FuSgc8氨离子(NH3+)所带的正电荷与磷酸根(PO4-)携带的负电荷所形成的的离子键而组装成纳米材料GNCs@5-FuSgc8。图2为金纳米团簇(GNCs)与GNCs@5-FuSgc8的TEM结果图片，由图片可以看出，GNCs为球形的纳米材料，其粒径约为2nm。而与5-FuSgc8组装成纳米材料GNCs@5-FuSgc8后，形貌仍然为球形的纳米材料，然而粒径明显增大，且尺寸因两者的组装比例而有所区别。图3-4分布展示了Sgc8、5-FuSgc8、金纳米团簇(GNCs)以及GNCs@5-FuSgc8的紫外吸收和水动力学粒径分布和ζ电位图。由图片4可以看出，合成的GNCs@5-FuSgc8纳米材料在组装后粒径约为129nm，明显大于未组装的金纳米团簇(GNCs)的粒径。图3(左侧图)表明GNCs@5-FuSgc8具有5-FuSgc8的紫外吸收特征峰，充分表明了自组装GNCs@5-FuSgc8含有5-FuSgc8的特征吸收峰。图3(右侧图)表明GNCs@5-FuSgc8含有5-FuSgc8上的FAM的荧光。图5显示了Sgc8、GNCs@5-FuSgc8在存在Dnase下的稳定性检测结果。
实施例2
GNCs@5-FuSgc8对白血病细胞CEM和结肠癌细胞HCT116的靶向结合能力的评价：
首先以Scramble和Library文库为负对照链，以Sgc8为正对照链，以5-FuSgc8链为5-Fu修饰实验组链，加入结合缓冲液后与HCT116细胞共同孵育30分钟，然后用洗涤液洗去未结合的核酸适体。通过流式和共聚焦探索5-Fu修饰实验组链与PTK7表达阳性细胞如白血病CEM细胞，人结肠癌HCT116细胞的特异性结合能力。测试所有5-Fu修饰的链不影响其靶向性能后，再通过流式和共聚焦测定GNCs@5-FuSgc8以及GNCs@Library与HCT116细胞和CEM细胞的结合能力。同时以结肠癌PTK7表达含量低的FHC细胞为负对照。如图6所示，结果发现GNCs@5-FuSgc8能够很好的与PTK7表达阳性细胞(CEM细胞和HCT116细胞)靶向结合。
实施例3
纳米材料自组装普适性实验研究：
金纳米团簇(GNCs)与PD-L1，XQ-2D核酸适体自组装分别形成GNCs@PD-L1以及GNCs@XQ-2D。其中PD-L1核酸适体结构信息如文献Angew Chem Int Ed Engl,2020.59(12):p.4800-4805记载，XQ-2D核酸适体如J Am Chem Soc,2019.141(27):p.10760-10769记载。经过实验探索发现，金纳米团簇(GNCs)与任何核酸适体均可形成均一球状的纳米材料，因此将金纳米团簇(GNCs)与PD-L1以及XQ-2D按照实施例2的方式进行自组装，形成了均一的GNCs@PD-L1以及GNCs@XQ-2D纳米材料。且大小和带电性质均可按照实施例2的方式通过质量比例控制。充分说明了实验方法的普适性。可用于多种靶向核酸适体的自组装。以PD-L1替代5-Fu修饰的Sgc8核酸适体，将PD-L1核酸适体与GNCs自组装成纳米材料GNCs@PD-L1。然后测试自组装纳米材料与PD-L1高表达细胞株的结合能力，并以随机序列为负对照链。
实验结果如图7所示，结果表明含有金纳米团簇(GNCs)的核酸适体PD-L1和药物偶联物(ApDCs)纳米药物递送载体具有普适性，所以其可针对不同癌症治疗选取不同的核酸适体及化疗药物进行自组装。
以此类推，将XQ-2D核酸适体代替5-Fu修饰的Sgc8核酸适体(5-FuSgc8)与金纳米团簇(GNCs)组装，形成自组装纳米材料GNCs@XQ-2D并测试其靶向乳腺癌细胞的能力。GNCs@PD-L1以及GNCs@XQ-2D对乳腺癌细胞的靶向结合能力测试。同实施例二步骤相同，将GNCs@PD-L1以及GNCs@XQ-2D在结合缓冲液中混匀后加入到MDR-231细胞中共同孵育30分钟，然后通过洗涤液洗去未结合的核酸适体。通过流式和共聚焦测试GNCs@PD-L1以及GNCs@XQ-2D对乳腺癌细胞的和胰腺癌细胞的靶向结合能力。结果发现GNCs@PD-L1对乳腺癌细胞具有特异的靶向结合能力。GNCs@XQ-2D对胰腺癌细胞的靶向结合能力效果优于单独的核酸适体XQ-2D。
结果如图8所示，GNCs@PD-L1对高表达PD-L1的细胞株的靶向能力明显优于单独的核酸适体PD-L1，GNCs@XQ-2D的靶向能力均优于单独的核酸适体XQ-2D。此实验结果充分说明了金纳米团簇(GNCs)与不同的核酸适体自组装后可用于不同肿瘤的靶向治疗，因此该组装方法的普适性强，易于推广使用。
实施例4
GNCs@5-FuSgc8纳米材料在血清中的稳定性测试：
GNCs@5-FuSgc8在自组装完成后置于4℃冰箱放置，每隔一段时间测试其水动力学粒径分布，通过粒径大小判断GNCs@5-FuSgc8在水溶液中的稳定性。GNCs@5-FuSgc8纳米组装体的稳定性测试：
将5-FuSgc8与GNCs@5-FuSgc8与不同含量的酶37℃孵育，通过琼脂糖凝胶电泳判断5-FuSgc8与GNCs@5-FuSgc8的稳定性。结果如图5所示，组装后的核酸适体的稳定性明显高于5-FuSgc8。
实施例5
金纳米团簇(GNCs)的生物相容性及GNCs@5-FuSgc8对HCT116细胞的疗效实验：
a.GNCs的生物相容性；
b.GNCs@5-FuSgc8对HCT116细胞的疗效，通过CCK-8实验进行检测：
将HCT116细胞以5000个细胞每孔的密度种植到96孔板中。培养24小时后，加入含5-Fu(0-30μM)、5-FuSgc8(0-30μM)、GNCs@5-FuSgc8(0-30μM，5-FuSgc8)和GNCs(与GNCs@5-FuSgc8的GNCs含量相同)以及PBS(对照组)的新鲜培养基并培养一段时间。通过酶标仪测定在450nm处的吸光度并计算GNCs@5-FuSgc8对HCT116细胞的疗效。结果如图8所示，GNCs@5-FuSgc8的疗效明显优于5-FuSgc8。
对所公开的实施例的上述说明，以便本技术领域的专业技术人员能够实现或使用本申请。针对这些实施例的多种修改，对本技术领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本申请的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本申请将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海交通大学医学院附属仁济医院
<120> 金团簇-核酸适体及其衍生物组装体的制备及应用
<130> DPC.RJ.0021
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
<400> 1
atctaactgc tgcgccgccg ggaaaatact gtacggttag a 41

Claims (10)

1.金团簇-核酸适体及其衍生物组装体的制备方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：
1)合成与纯化金纳米团簇(GNCs)：
氯金酸与GSH和多肽在25～70反应24-36小时后，用透析除去未反应的物质，得到纯化的GNCs；；
2)设计与制备核酸适体和/或适体药物偶联物(ApDCs)或其衍生物；
3)金纳米团簇和核酸适体和/或适体药物偶联物或其衍生物在4～37搅拌1.5～2小时后自组装形成GNCs与核酸适体纳米组装体(GNCs@核酸适体和/或ApDCs或其衍生物)。
2.如权利要求1所述的基于金纳米团簇(GNCs)-核酸适体纳米材料的自组装的制备方法，其特征在于，所述核酸适体选自Sgc8、PD-L1、XQ-2D、c-Met、As1411等核酸适体中的一个或多个或其组合；
所述适体药物偶联物(ApDCs)选自5-Fu(5-氟尿嘧啶)适体药物偶联物、吉西他滨适体药物偶联物、阿霉素(DOX)适体药物偶联物、顺铂适体药物偶联物中的一个或多个或其组合，优选地，所述适体药物偶联物来自核酸适体Sgc8、PD-L1、XQ-2D、c-Met、As1411；优选地，所述适体药物偶联物来自核酸适体Sgc8，优选地，所述适体药物偶联物为5-Fu修饰的Sgc8核酸适体。
所述氯金酸、GSH和多肽的摩尔比为1:(1～5):(1～5)。
3.金团簇-核酸适体纳米材料，其特征在于，其包含，
至少一个核酸适体和/或其衍生物,和金纳米团簇(GNCs)；
所述核酸适体和/或其衍生物与所述金纳米团簇(GNCs)自组装的方式形成纳米材料，其中所述核酸适体与所述金纳米团簇通过非共价键的相互作用；
所述金团簇-核酸适体纳米材料和/或其衍生物纳米材料具有生物相容性、靶向性和特异性以及稳定性；
所述衍生物包括但不限于，核酸适体与药物、荧光分子、以及造影剂如铁(Fe)、锰(Mn)、铜(Cu)等偶联物。
4.如权利要求3所述的金团簇-核酸适体纳米材料，其中，所述核酸适体选自Sgc8、PD-L1、XQ-2D、c-Met、As1411核酸适体中的一个或多个；更优选地，所述核酸适体为Sgc8、PD-L1、XQ-2D。
5.如权利要求4所述的金团簇-核酸适体纳米材料，其中，所述衍生物为经化学药物、抗体药物修饰的核酸适体；其中所述衍生物为适体药物偶联物(ApDCs)及用于影像诊断的适体偶联物；所述适体药物偶联物中的药物分子为5-Fu、吉西他滨、阿霉素、顺铂的一个或多个；
所述适体药物偶联物衍生自Sgc8、PD-L1、XQ-2D、c-Met、As1411等核酸适体，和/或核酸适体与荧光分子、以及造影剂如铁(Fe)、锰(Mn)、铜(Cu)等偶联物；优选地，所述适体药物偶联物为5-Fu修饰的核酸适体Sgc8、XQ-2D。
6.金纳米团簇-核酸适体Sgc8组装体，其特征在于，其包括，
至少一个核酸适体Sgc8，和金纳米团簇(GNCs)，
所述核酸适体Sgc8与所述金纳米团簇(GNCs)自组装的方式形成纳米组装体；
优选地，所述核酸适体Sgc8经不同含量的5-氟尿嘧啶修饰，并且不改变所述核酸适体Sgc8的靶向性；
金纳米团簇-核酸适体Sgc8纳米材料具有靶向性、稳定性和生物相容性。
7.如权利要求6所述的金纳米团簇-核酸适体Sgc8组装体，其特征在于，一个或多个所述5-氟尿嘧啶插入或替换所述核酸适体Sgc8的核苷酸，或者修饰所述核酸适体Sgc8的两端；优选地，所述5-氟尿嘧啶修饰所述核酸适体Sgc8的两端；
优选地，所述5-氟尿嘧啶修饰所述核酸适体Sgc8的5’端；所述优选地，所述5-氟尿嘧啶修饰的核酸适体Sgc8的5’端的序列为：5-Fu、(5-Fu)T(5-Fu)-、(5-Fu)T(5-Fu)T(5-Fu)-、(5-Fu)(5-Fu)(5-Fu)(5-Fu)(5-Fu)-。
8.金团簇-核酸适体纳米材料用于肿瘤成像的用途，其特征在于，所述金团簇-核酸适体纳米材料如权利要求3-6任一项所述；所述核酸适体经过造影分子、显影分子或荧光分子修饰，以能够用于肿瘤的近红外成像、MRI、PET成像和/或CT等成像；优选地，所述核酸适体为经过NOTA修饰后的核酸适体。
9.金团簇-核酸适体纳米材料用于肿瘤治疗的用途，其特征在于，所述金团簇-核酸适体纳米材料如权利要求3-6任一项所述；所述核酸适体包含化疗药物或抗体药物，并且能够靶向递送至肿瘤位置。
10.如权利要求9所述的金团簇-核酸适体纳米材料，其特征在于，所述化疗药物可以为5-Fu、吉西他滨、顺铂、阿霉素等；优选地，所述药物组合物的使用剂量低于只包含单独核酸适体的药物组合物。
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